專利名稱：：生產(chǎn)氨基羥基苯甲酸鹽類化合物的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)生氨基羥基苯甲酸類化合物的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及方便并廉價地生產(chǎn)可用作染料、農(nóng)藥、藥物和其他合成有機化合物中間體，以及用作高性能耐熱聚合物聚苯并噁唑的單體的氨基羥基苯甲酸類化合物的方法。具體而言，本發(fā)明提供使用具有使用磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛作為底物形成3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的酶活性的棒狀桿菌型細菌來產(chǎn)生3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法。本發(fā)明進一步涉及從氨基羥基苯甲酸類化合物產(chǎn)生聚苯并噁唑聚合物的方法。
背景技術：
：傳統(tǒng)上，作為可用作染料、農(nóng)藥、藥物和其他合成有機化合物中間物，以及聚苯并噁唑的單體的氨基羥基苯甲酸類化合物的生產(chǎn)方法，當所述氨基羥基苯甲酸類化合物是3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物時，一種已知的方法包括將作為原料的4-羥基苯甲酸或其酯用硝酸硝化以制備3-硝基-4-羥基苯甲酸或其衍生物，隨后將該中間體的硝基用還原劑(如鈀/碳)還原，作為磷酸鹽加以分離(參見專利文獻1)。此外，當使用4-鹵代苯甲酸或其酯作為原料時，一種已知方法包括將其用硝酸硝化以獲得3-硝基-4-氯代苯甲酸，然后用堿金屬氫氧化物處理所述鹵素基團以制備3-硝基-4-羥基苯甲酸，再將其還原(參見專利文獻2)。然而，在這些方法中，需要多個分離、純化等反應步驟以避免在硝化時產(chǎn)生的多硝基化合物的危險性并提高產(chǎn)物的純度，從而導致費用高昂。另一個問題是由于異構體的產(chǎn)生，產(chǎn)率大幅度下降。已知氨基羥基苯甲酸類化合物產(chǎn)物中雜質(zhì)的存在會阻礙聚合物的形成反應。眾所周知聚苯并噁唑是具有高強度的剛性聚合物，并被意圖用于印刷線路板用的薄膜和半導體元件的保護薄膜。然而，產(chǎn)生聚苯并噁唑的常規(guī)方法使用化學催化劑，是使用危險的催化劑的劇烈反應，且并無可用的方法來廉價地產(chǎn)生高純度的單體前體。這些因素導致了這些聚合物應用的滯后。已報道了多種3-氨基-4-羥基苯甲酸的化學合成方法。合成法需要多步反應，且費用高昂，因止此并不適用。通常，通過生物合成來生產(chǎn)物質(zhì)與化學合成相比具有許多優(yōu)點。例如，可使用廉價而可再生的原材料，且生物合成可在溫和的反應條件下進行。利用生物合成反應在微生物中產(chǎn)生氨基羥基苯甲酸類化合物的方法是已知的。例如，已有報道稱放線菌生物合成3-氨基-4-羥基苯甲酸(參見非專利文獻1)。然而，該3-氨基-4-羥基苯甲酸在弱酸性到弱堿性附近的條件下不穩(wěn)定，因此很容易在培養(yǎng)基中氧化并二聚化，而產(chǎn)率變低。通過放線菌培養(yǎng)獲得2-氨基-3-羥基苯甲酸(3-羥基鄰氨基苯甲酸)也是已知的(例如，參見專利文獻3)。在此情況下，2-氨基-3-羥基苯甲酸并不直接由培養(yǎng)產(chǎn)生，而是通過培養(yǎng)獲得2，3-二羥基-3-鄰氨基苯甲酸，再將其用鈀/碳催化劑脫氫以產(chǎn)生2-氨基3-羥基苯甲酸。所用的鈀/碳催化劑價格不菲，且反應高效進行需要大量催化劑。因此該方法在產(chǎn)業(yè)上不適用。最近，在放線菌中發(fā)現(xiàn)了一種參與3-氨基-4-羥基苯甲酸生物合成的基因，且闡明了其生物合成途徑。具體而言，發(fā)現(xiàn)了3-氨基-4-羥基苯甲酸是用磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛作為底物，在GriI和GriH作用下通過兩步反應而生物合成的，其中GriI是催化在具有氨基基團的C4化合物與C3或C4化合物之間發(fā)生碳-碳結合反應的酶，GriH是催化C7化合物或C8化合物脫羧同時環(huán)化的酶(非專利文獻2~)。還已知用組入有gril基因和griH基因的重組載體轉(zhuǎn)化的一種放線菌——淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyceslividans),可產(chǎn)生3-氨基-4-羥基苯甲酸(參見專利文獻4)。然而，盡管對產(chǎn)生培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)方法進行了研究，但其產(chǎn)率最高僅為5g/L培養(yǎng)基，就實際生產(chǎn)而言仍存在許多問題。所得的3-氨基-4-羥基苯甲酸產(chǎn)物是與其在生物合成過程中產(chǎn)生的乙?；问剿傻幕旌衔?，不可避免地要進行脫乙酰處理。由于這些問題，還不能說有效的通過生物合成的產(chǎn)生方法已經(jīng)確立?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1特許第33M568號專利文獻2特公平8-11745號公報專利文獻3特開平7-309946號公報專利文獻4特開2004-283163號公報非專利文獻非專利文獻1=YongfuLi等，TetrahedronLetters,41,p5181_5185(2000)非專利文獻2J.Biol.Chem.，281，48，36944-36951，2006.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題本發(fā)明是考慮了常規(guī)技術的實際現(xiàn)狀而作出的，且本發(fā)明的目標是提供一種方便而廉價地生產(chǎn)氨基羥基苯甲酸類化合物，如3-氨基-4-羥基苯甲酸的方法。解決問題的手段本發(fā)明人以解決上述問題為主要目的進行了深入研究。結果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了通過培養(yǎng)具有編碼消除了反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的基因、并且用組入有gril和griH基因的重組載體所轉(zhuǎn)化過的棒狀桿菌型細菌，來大量生產(chǎn)未乙?；?-氨基-4-羥基苯甲酸的方法，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供下述發(fā)明1.一種生產(chǎn)3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法，該方法包括培養(yǎng)具有編碼消除了反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的基因、且用組入有編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸的活性的蛋白質(zhì)的DNA的重組載體轉(zhuǎn)化過的棒狀桿菌型細菌。2.依照(1)的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是增強了編碼突變天冬氨酸激酶的基因的表達的棒狀桿菌型細菌。3.依照(1)或2的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是增強了丙酮酸羧化酶基因表達的棒狀桿菌型細菌。4.依照(1)-(3)任一項所述的方法，其中所述DNA包含gril基因和griH基因。5.依照(1)-(4)任一項所述的方法，其中所述gril基因和griH基因來源于放線菌。6.依照(1)-(5)任一項所述的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是谷氨酸棒桿菌。7.一種生產(chǎn)聚苯并噁唑聚合物的方法，該方法包括使通過(1)-(6)任一項所述的方法生產(chǎn)的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物聚合。附圖簡述圖1是顯示gril基因同源物和共有序列的圖。圖2是顯示gril基因同源物和共有序列比對的圖(續(xù))。圖3是顯示griH基因同源物和共有序列的圖。圖4是顯示griH基因同源物和共有序列比對的圖(續(xù))。圖5是顯示由谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生3-氨基-4-羥基苯甲酸的圖。具體實施例方式下文將詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)用組入有下述DNA的重組載體轉(zhuǎn)化過的棒狀桿菌型細菌來生產(chǎn)3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法，所述DNA編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸的活性的蛋白質(zhì)。3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物在本發(fā)明中包括具有下述結構的3-氨基-4-羥基苯甲酸(在下文中有時簡稱“3，4-AHBA”)，及其衍生物和其鹽。O^OHOH所述衍生物包括，例如，通過將3-氨基-4-羥基苯甲酸中的羧基基團醛化而獲得的3-氨基-4-羥基苯甲醛等。所述鹽包括羧酸的堿式鹽，如堿金屬(鈉、鉀和鋰)鹽和堿土金屬(鈣和鎂)鹽，以及酸加成鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。<1>編碼具有形成3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的活性的蛋白質(zhì)的DNA用于本發(fā)明的DNA包括參與3-氨基_4_羥基苯甲酸類化合物生物合成的基因。換言之，所述DNA包括具有恢復、賦予、促進或調(diào)節(jié)所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物生物合成的功能的基因。具體而言，用于本發(fā)明的DNA包括編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的活性(在下文中有時也稱作“3，4-AHBA形成活性”)的蛋白質(zhì)的DNA。所述DNA包括編碼具有催化磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛之間形成碳-碳鍵的酶活性的蛋白質(zhì)的基因，以及編碼具有催化由磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛之間形成5碳-碳鍵而獲得的C7化合物發(fā)生環(huán)化的酶活性的蛋白質(zhì)的基因(參見專利文獻4)。在下文中，這兩種酶的活性有時統(tǒng)稱為3，4-AHBA生物合成能力。編碼催化磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛之間碳-碳鍵形成的酶活性的基因包括來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的gril基因(SEQIDNO:8和9)，以及gril基因同源物。gril基因同源物是指來源于其他微生物，與上述來源于灰色鏈霉菌的基因具有高同源性，并編碼具有相同酶活性的蛋白質(zhì)的基因。上述具有高同源性的基因可通過使用SEQIDNO:8和9進行Blast檢索來檢索。舉例而言，所述基因可包括來源于弗蘭克氏菌屬菌種(Frankiasp.)的果糖二磷酸醛縮酶基因(登錄號YP_483^2，SEQIDNOS:10和11)，來源于弗蘭克氏菌屬菌種的果糖二磷酸醛縮酶基因(登錄號YP_481172，SEQIDNOS:12和13)，來源于瘡痂鏈霉菌(Sti^ptomycesscabies)的果糖二磷酸醛縮酶基因(http://www.sanRer.ac.uk/CRi-bin/blast/submitblast/sscabies,SEOIDNOS14禾口15)，來源于伯克霍爾德氏菌菌種(BurWiolderiasp.)383的果糖二磷酸醛縮酶基因(登錄號Q39NQ9，SEQIDNOS和17)，來自詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的果糖二磷酸醛縮酶基因(登錄號NP_247374，SEQIDNOS:18和19)，以及來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)的dhnA基因(登錄號NC_000913，SEQIDNOS:20和21)(JournalofBiochemistryvol.281,NO.48,pp.36944_36951，補充數(shù)據(jù))。編碼具有催化通過在磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛之間形成碳-碳鍵而獲得的C7化合物發(fā)生環(huán)化的酶活性的蛋白質(zhì)的基因包括來源于灰色鏈霉菌的griH基因(SEQIDN0S:22和23)以及griH基因同源物。griH基因同源物是指來源于其他微生物，與上述來源于灰色鏈霉菌的基因具有高同源性，并編碼具有相同酶活性的蛋白質(zhì)的基因。上述具有高同源性基因可通過使用SEQIDNOS22和23的序列進行Blast檢索來檢索。舉例而言，所述基因可包括來源于弗蘭克氏菌屬菌種的3-脫氫奎寧酸合酶(3-dehydroquinatesynthase)基因(登錄號YP_483^3，SEQIDNOS:和25)，來源于弗蘭克氏菌屬的3-脫氫奎寧酸合酶基因(登錄號YP_481171，SEQIDNOSJ6和27)，來源于伯克霍爾德氏菌屬菌種的3-脫氫奎寧酸合酶基因(登錄號YP_366552，SEQIDN0SJ8*^)，來源于伯克霍爾德氏菌屬菌種的3-脫氫奎寧酸合酶基因(登錄號YP_366553，SEQIDNOS30和31)，來源于瘡痂鏈霉菌的3-脫氫奎寧酸合酶基因(http://www.sanRer.ac.uk/cRi-bin/blast/submitblast/sscabies,SEQIDNOS:32和33)，以及來源于詹氏甲烷球菌的3-脫氫奎寧酸合酶基因(登錄號NP_248M4，SEQIDNOS:34和35)(JournalofBiochemistryvol.281,NO.48,pp.369M-3695I,補充數(shù)據(jù))。此外，gril基因同源物包括與SEQIDNO:9、11、13、15、17、19或21的氨基酸序列具有90%或更高，優(yōu)選95%或更高，更優(yōu)選98%或更高，特別優(yōu)選99%或更高的同源性，并編碼具有前述酶活性的蛋白質(zhì)者。gril基因同源物包括與SEQIDNO:23、25、27、四、31、33或35的氨基酸序列具有90%或更高，優(yōu)選95%或更高，更優(yōu)選98%或更高，特別優(yōu)選99%或更高的同源性，并編碼具有前述酶活性的蛋白質(zhì)者。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可使用，例如，由Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(MethodsEnzymol.，183，63(1990))來確定?；谠撍惴˙LAST，已經(jīng)開發(fā)了稱作BLASTIN和BLASTX的程序(參見<http://www.ncbi.nlm.nih.govbi.nlm.nih.govο6SEQIDNO:9、11、13、15、17、19和21的氨基酸序列的比對示于圖1和2，而SEQIDN0:23、25、27J9、31、33和35的氨基酸序列的比對示于圖3和4。此外，其共同序列示于SEQIDN0:36和37。上述gril基因同源物包括編碼SEQIDNO:36氨基酸序列的基因，且所述griH基因同源物包括編碼SEQIDNO:37氨基酸序列的基因。如上所述，已經(jīng)知曉了gril基因和griH基因的數(shù)種序列，因此可使用基于其核苷酸序列而制備的引物來獲得gril基因和griH基因。舉例而言，通過PCR方法(PCR聚合酶鏈式反應，參見White，T.J.等，"TrendsGenet.5，185(1989))，以灰色鏈霉菌的染色體DNA作為模板，使用示于SEQIDNOS:1和2的引物，可同時獲得來源于灰色鏈霉菌的gril和griH的編碼區(qū)及其兩側區(qū)域，包括其調(diào)節(jié)區(qū)。灰色鏈霉菌的具體實例包括IF013350(NRBC13350)菌株。該菌株可從BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation(http://www,nbrc.nite.ro.ip/e/Rene~e.html)獲得?？深愃频孬@得來源于其他微生物的gril或griH的同源物。取決于微生物的菌種和菌株，gril具有或griH基因的核苷酸序列可以有所不同。用于獲得本發(fā)明方法使用的棒狀桿菌型細菌的gril基因和griH基因并不分別限于SEQIDNO:9、11、13、15、17、19或21和SEQIDNO:23、25、27、29、31、33或；35氨基酸序列的編碼基因。只要在棒狀桿菌型細菌中通過共表達所述基因，優(yōu)選提高所述基因的表達，能夠改善產(chǎn)生3，4-AHBA的能力，則所述基因可為編碼具有分別在SEQIDNO:9、11、13、15、17、19或21和SEQIDN0:23、25、27J9、31、33或35的氨基酸序列中一個或多個位置上取代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸而成的序列的蛋白質(zhì)的突變型基因或人工修飾型基因。在此，“幾個氨基酸”中的“幾個”因蛋白質(zhì)三維結構中氨基酸殘基的位置和種類不同而有所不同，優(yōu)選1到50個，更優(yōu)選1到20個，還更優(yōu)選1到10個，特別優(yōu)選1到5個氨基酸。上述取代、缺失、插入、添加或倒位包括天然出現(xiàn)的突變體或變體，例如，由于攜帶gril基因或griH基因的微生物個體差異或種間差異而產(chǎn)生的那些突變體或變體。上述取代優(yōu)選為保守取代，即不發(fā)生功能性改變的中性突變。當需取代的氨基酸為芳族氨基酸時，所述保守取代為Wie、Trp和Try之間的取代。當需取代的氨基酸為疏水氨基酸時，所述保守取代為Leu、Ile和Val之間的取代。當需取代的氨基酸為極性氨基酸時，所述保守取代為Gln和Asn之間的取代。當需取代的氨基酸為堿性氨基酸時，所述保守取代為Lys、Arg和His之間的取代。當需取代的氨基酸為酸性氨基酸時，所述保守取代為Asp和Glu之間的取代。而當需取代的氨基酸為帶羥基的氨基酸時，所述保守取代為Ser和Thr之間的取代。更具體而言，所述保守取代包括從Ala到Ser或Thr的取代，從Arg到Gin、His或Lys的取代，從Asn到Glu、Gin、Lys、His或Asp的取代，從Asp到Asn、Glu或Gln的取代，從Cys到Ser或Ala的取代，從Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，從Glu到Gly、Asn、Gin、Lys或Asp的取代、從Gly到Pro的取代，從His到Asn、Lys、Gin、Arg或Tyr的取代，從Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，從Lys到Asn、Glu、Gin、His或Arg的取代，從Met到lie、Leu、Val或Phe的取代，從Phe到iTrp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，從Ser到Thr或Ala的取代，從Thr到Ser或Ala的取代，從Trp到Phe或Tyr的取代，從Tyr到His、Phe或Trp的取代和從Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，由于遺傳密碼的簡并性取決于gril基因和griH基因引入的宿主而有所不同，可以通過替換密碼子使其能夠在引入gril基因和griH基因的宿主中方便地應用。同樣，只要所述gril基因和griH基因在棒狀桿菌型細菌中具有通過增強兩種基因的表達而促進3，4-AHBA產(chǎn)生的活性的功能，這些基因可編碼在N端側或C端側有延伸或缺失的蛋白質(zhì)。舉例而言，延伸或缺失的氨基酸殘基的長度為50個或更少、優(yōu)選20個或更少、更優(yōu)選10個或更少，最優(yōu)選5個或更少氨基酸的長度。更優(yōu)選地，所述gril基因和griH基因可以是這樣的基因，其編碼從N端起延伸或缺失50到5個氨基酸或從C端起延伸或缺失由5到50個氨基酸的蛋白質(zhì)。上述與gril和griH基因同源的基因可通過借助定位誘變修飾編碼SEQIDNO:9、11、13、15、17、19或21和SEQIDNO:23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列的基因，使得在所編碼的蛋白質(zhì)的特定位置包含取代、缺失、插入或添加而獲得。所述同源基因還可通過通常已知的誘變處理來獲得。所述誘變處理包括用羥胺等在體外處理gril基因或griH基因的方法，和用誘變劑處理攜帶所述基因的微生物(例如棒狀桿菌型細菌)的方法，所述誘變劑如通常用于誘變處理的紫外線、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS))。此外，編碼所述具有高活性酶的基因還可通過使用易錯PCR(CadWell，R.C.PCRMeth.Appl.2，28(1992))、DNA改組(Stemmer，W.P.Nature370，389(1994))或StEP-PCR(Zhao,H.NatureBiotechnol.16,258(1998))通過基因重組將所述突變?nèi)斯ひ雊ril基因或griH基因來獲取。所述gril基因和griH基因還包括在嚴格條件下與互補于SEQIDNo:8,10,12,14、16、18或20和SEQIDNO:22、對、26、觀、30、32或34的核苷酸序列、或者可從上述序列制備的探針雜交，并編碼具有在棒狀桿菌型細菌中通過表達該兩個基因而促進3，4-AHBA生物合成的能力的蛋白質(zhì)的DNA。在此，“嚴格條件”指所謂特異性雜合體形成但非特異性雜合體不形成的條件。舉例而言，其實例包括這樣的條件，在此條件下成對的具有高同源性的DNA，例如，具有80%或更高，優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高，特別優(yōu)選97%或更高同源性的DNA之間發(fā)生雜交，而同源性較上述為低的DNA不雜交；或者這樣的條件在通常的Southern的洗滌條件(即，在等同于IxSSC和0.1%SDS在60°C，優(yōu)選0.IxSSC和0.1%SDS在60°C，且更優(yōu)選0.IxSSC和0.ISDS在68°C的鹽濃度)下洗滌一次，優(yōu)選兩次到三次。作為探針，可使用互補于SEQIDNo:8、10、12、14、16、18或20，或者SEQIDN0:22、24J6、28、30、32或34的核苷酸序列的部分序列。這樣的探針可用包含該序列的DNA片段作為模板，使用基于這些核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物進行PCR來制備。舉例而言，當長度約300bp的DNA片段用作探針時，雜交的洗滌條件包括在50°C用2XSSC和0.1%SDS的條件。關于上述基因同源物和保守突變的描述同樣也適用于其他本文描述的基因。這些gril和griH同源基因是否編碼促進產(chǎn)生3，4-AHBA能力的蛋白質(zhì)，可通過將這些基因引入具有突變而消除了反饋抑制的天冬氨酸激酶編碼基因的棒狀桿菌型細菌(例如，甘氨酸棒狀菌AJl10135菌株，見特開2004-261150號公報)，并檢查形成3，4_AHBA的能力是否得到促進來驗證。在此情況下，通過根據(jù)Suzuki等的方法(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))使用反相色譜對3，4-AHBA定量可明確地驗證其效果。<2>重組載體用于本發(fā)明的重組載體可通過將用于本發(fā)明的DNA弓丨入作為表達載體的質(zhì)粒來獲得?？砂谟糜诒景l(fā)明使用的DNA中的gril和griH可攜帶在不同的重組載體上用于轉(zhuǎn)化，或可通過合適的間隔物(spacer)連接并攜帶在同一個重組載體上用于轉(zhuǎn)化，只要它們以可表達的狀態(tài)包含于轉(zhuǎn)化體中。gril和griH可為來源于同一微生物的基因或可為來源于不同類型微生物的基因。當gril和griH是來源于同一微生物的基因，并在染色體上的位置彼此接近時，可將包含gril和griH兩者的部分DNA切出并攜帶于所述載體。用于本發(fā)明的重組載體通常具有啟動子；前述本發(fā)明的DNA，例如，gril和griH；以及需用于在棒狀桿菌型細菌中表達所述基因的調(diào)節(jié)區(qū)(操縱子和終止子)，它們處于合適的位置使得它們能夠起作用?？捎米髦亟M載體的表達載體并無特別的限制，可以是能在棒狀桿菌型細菌中起作用的載體。其可在染色體外獨立復制，如質(zhì)粒，或可整合入細菌染色體。來源于棒狀桿菌型細菌的質(zhì)粒是特別優(yōu)選的。這樣的質(zhì)粒包括，例如，pHM1519(Agric,Biol.Chem.，48，2901-2903(1984),pAM330(Agric,Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))和對它們改良而得到的具有抗藥性基因的質(zhì)粒?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子并無特別的限制，通?？墒褂媚茉诎魻顥U菌型細菌的微生物細胞中起作用的啟動子。所述啟動子可為來源于其他菌種的啟動子，例如，來源于大腸桿菌的啟動子，如tac啟動子。來源于棒狀桿菌型細菌的啟動子包括編碼細胞表層蛋白PSl、PS2和SlpA的基因的啟動子，以及各種氨基酸生物合成系統(tǒng)中的基因的啟動子。<3>轉(zhuǎn)化體用于本發(fā)明的棒狀桿菌型細菌并無特別的限制，只要該棒狀桿菌型細菌具有編碼消除了反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的基因，并且通過用組入有編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的活性的蛋白質(zhì)的重組載體轉(zhuǎn)化該細菌，可賦予其產(chǎn)生3-氨基-4-羥基苯甲酸的能力。作為親本株的棒狀桿菌型細菌包括通常歸類為短桿菌屬(Brevil^acterium)但現(xiàn)在整合入棒桿菌屬(Corynebacterium)的細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及屬于與棒桿菌屬非常接近的短桿菌屬的細菌。具體而言，可舉出以下為例玫瑰色短桿菌(Brevibacteriumroseum)角軍H短桿菌(Brevibacteriumsaccharolticum)^t^iff'(Brevibacteriumthiogenitalis)白fe短桿菌(Brevibacteriumalbum)蠟狀短桿菌(Brevibacteriumselinum)禾口嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)作為親本株的棒狀桿菌型細菌優(yōu)選為這樣的細菌菌株，其可高效地供應作為3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的生物合成底物的磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛。棒狀桿菌型細菌中的天冬氨酸激酶本來受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制，特別優(yōu)選具有突變而基本上消除所述反饋抑制的天冬氨酸半醛激酶的棒狀桿菌型細菌。棒狀桿菌型細菌中的天冬氨酸激酶是由α-亞基和β-亞基組成的異質(zhì)蛋白(heteroprotein)，α-亞基和β-亞基的編碼區(qū)在基因上部分重疊。來源于谷氨酸棒桿菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC13869的野生型天冬氨酸激酶α-亞基序列示于SEQIDNO:38。通過引入從N端起279位的丙氨酸殘基由蘇氨酸殘基取代的突變，或從N端起311位的蘇氨酸殘基由異亮氨酸殘基取代的突變，或從N端起301位的絲氨酸殘基由酪氨酸殘基取代的突變，或從N端起380位的蘇氨酸殘基由異亮氨酸殘基取代的突變，或從N端起308位的蘇氨酸殘基由異亮氨酸殘基取代的突變，或從N端起320位的精氨酸殘基由甘氨酸殘基取代，或從N端起345位的甘氨酸殘基由天冬氨酸殘基取代的突變(W094/25605公開小冊子、W000/63388公開小冊子、美國專利6，844，176號、W001/0498M公開小冊子等)消除對天冬氨酸激酶反饋抑制。野生型的天冬氨酸激酶甚至還可以是等位變體，其中取決于天冬氨酸激酶所來源的棒狀桿菌型細菌種類和菌株的不同，與示于SEQIDNO:38的序列相比具有幾個氨基酸殘基的差異。這樣的突變的定義與前述對于griI和griH的定義相同?？赏ㄟ^進行本領域技術人員公知的序列比對來鑒定消除所述反饋抑制所需要修飾的位點。消除所述對天冬氨酸激酶反饋抑制的修飾可通過本領域技術人員公知的方法實現(xiàn)，例如，獲得對賴氨酸類似物(如2-氨基乙基半胱氨酸)具有抗性的突變體菌株并利用同源重組通過基因替換進行定點誘變。具有經(jīng)突變而消除反饋抑制的天冬氨酸激酶活性增強的棒狀桿菌型細菌可通過用包含所述經(jīng)突變而消除反饋抑制的天冬氨酸激酶的編碼基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述棒狀桿菌型細菌而獲得。在實施例中，使用具有下述天冬氨酸激酶的谷氨酸棒桿菌AJ110135菌株(特開2004-261150號公報)，其中通過將天冬氨酸激酶中從N端起第279位的丙氨酸殘基取代為蘇氨酸殘基而消除了所述反饋抑制。所述AJ110135缺失了編碼賴氨酸通透酶(lysinepermease)的基因IysI0所述具有經(jīng)突變而消除了反饋抑制的天冬氨酸激酶的棒狀桿菌型細菌可以是進一步增強了丙酮酸羧化酶基因表達的棒狀桿菌型細菌。作為親本株的棒狀桿菌型細菌可使用任何菌株，只要該菌株可有效地供應磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛?？梢砸勒毡绢I域公知的方法用組入有編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸活性的蛋白質(zhì)的DNA的重組載體來轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細菌。舉例而言，可使用原生質(zhì)體方法(Gene，39，281-286(1985))，電穿孔方法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等。當進行消除對天冬氨酸激酶的反饋抑制的轉(zhuǎn)化時，賦予形成3，4-AHBA的轉(zhuǎn)化和消除對天冬氨酸激酶的抑制的轉(zhuǎn)化二者誰先進行都是可以的。<4>生產(chǎn)3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物可通過培養(yǎng)上述獲得的棒狀桿菌型細菌轉(zhuǎn)化體并回收在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物來產(chǎn)生。培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基并無特別的限制，只要宿主細胞生長即可；所述轉(zhuǎn)化體可根據(jù)本領域公知的方法培養(yǎng)。舉例而言，轉(zhuǎn)化體可在包含碳源、單元和無機離子的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如有需要，可添加有機微量營養(yǎng)物如維生素和氨基酸以獲得高增殖。培養(yǎng)溫度通常為25-34°C，最好控制pH于6.5-7.5。培養(yǎng)時間通常為20-90小時。需要在控制氧供應的條件下進行所述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)。具體而言，當細菌生長變?yōu)閷?shù)生長期時，最好保持氧為2.Oppm或更少。從培養(yǎng)基中回收和純化3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的步驟中使用的回收方法可從公知方法中適當選取。舉例而言，優(yōu)選將培養(yǎng)基PH調(diào)整為所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物具有高溶解度的酸性PH，然后通過離心或膜過濾去除微生物細胞，從所得培養(yǎng)基上清進行回收。從去除了微生物細胞的培養(yǎng)基上清回收3-氨基-4-羥基苯甲酸的方法可包括利用多孔吸附劑純化、結晶、和沉淀。用于本發(fā)明的多孔吸附劑是具有大表面積的多孔固體吸附劑，并具體包括親水吸附劑，典型地如硅膠、礬土、沸石、鐵礬土(bauxite)、氧化鎂(magnesia)、活性白土(activatedwhiteearth)和丙烯酸合成吸附劑，以及疏水吸附劑，典型地如木炭(vegetablecharcoal)、骨炭(bonecharcoal)、活性炭和芳族合成吸附劑。在本發(fā)明中，可使用任何吸附劑，而無特別的限制，只要通過吸附雜質(zhì)可提高3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的純度即可。然而，對于這一點，被所述多孔吸附劑吸收的雜質(zhì)含有大量主要在生物化學合成過程中產(chǎn)生的芳族化合物。因此，可容易地吸附這些化合物的疏水吸附劑，典型地如活性炭和芳族合成吸附劑，適用于本發(fā)明。這些疏水吸附劑可單獨使用，或兩種或更多種組合使用。當使用活性炭時，其原材料并無特別的限制，可包括但不僅限于，植物原材料如木粉(vegetablepowder)和椰子殼(palmshell)，基于煤/石油的原材料如無煙煤、石油浙青和焦炭，基于合成樹脂的原材料如丙烯酸樹脂、酚樹脂、環(huán)氧樹脂和聚酯樹脂。所述活性炭的形狀包括粉狀、粒狀和纖維狀，以及二次加工所得的制品，如過濾器和筒(cartridge)狀等，可適當選擇容易操作者。同時，當使用芳族合成吸附劑時，其原材料并無特別的限制，例如，可使用多孔樹脂，如1)未取代的芳族樹脂，幻具有疏水取代基的芳族樹脂，和幻通過對未取代的芳族樹脂進行特別處理所得的芳族樹脂。具體的化合物可包括，例如，基于苯乙烯和二乙烯基苯的樹脂。如上所述，使培養(yǎng)基中的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物與多孔吸附劑相接觸的目的，是使雜質(zhì)吸附至所述多孔吸附劑以提高所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的純度。然而，在一些情況下，作為目標產(chǎn)物的3-氨基-4-羥基苯甲酸也有不少與雜質(zhì)一起被吸附到所述多孔吸附劑。因此，也可通過使培養(yǎng)基中的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物與多孔吸附劑相接觸，然后使所述多孔吸附劑與極性有機溶劑相接觸以將所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物解離并溶解至極性有機溶劑中，來分離并回收所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物。用于本發(fā)明的極性有機溶劑指由具有高介電常數(shù)的極性分子組成的有機溶劑，且其使用并無特別的限制，只要所述3-氨基-4-羥基苯甲酸可從所述多孔吸附劑上解離，并所述3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物可溶解于所述極性有機溶劑。所述極性有機溶劑可單獨使用或以所需的比例兩種或更多種組合使用。本發(fā)明中結晶或沉淀指通過將溶解了目標物質(zhì)的溶劑蒸發(fā)濃縮，或降低溫度，或向溶解了目標物質(zhì)的溶劑添加不良溶劑，使得濃度高于飽和溶解度以產(chǎn)生結晶或沉淀的操作，且沒有特別的限制，包括常規(guī)的和公知的方法。產(chǎn)生的晶體或沉淀可通過沉淀、過濾、離心等進行分離。供在本發(fā)明中產(chǎn)生聚苯并噁唑聚合物的方法，是包括使由前述本發(fā)明方法獲得的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物聚合的步驟的生產(chǎn)方法。對于如上所述從本發(fā)明的棒狀桿菌型細菌的培養(yǎng)基中使用多孔吸附劑或通過結晶、沉淀等提高了純度的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物，通過在非氧化性溶劑酸(如甲磺酸或聚磷酸)中高溫下的縮合聚合來進行聚合(參見專利文獻1)。聚合的方法通過應用多種公知方法加以實施(美國專利5，142，021號，美國專利5，219，981號和美國專利5，422，416號)。實施例在下文中，將更加具體地描述本發(fā)明。[實施例1]用于表達來源于灰色鏈霉菌IF013350的3，4_AHBA合成酶基因的質(zhì)粒的構建(1)來源于灰色鏈霉菌IF013350的3，4_AHBA合成酶基因的獲得。已經(jīng)確定了來源于灰色鏈霉菌IF013350的gril和griH基因的序列(在下文中，兩個基因一起稱作3，4-AHBA合成酶基因)(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))參照該序列合成示于SEQIDN0S:1和2的引物，并從根據(jù)標準方法制備灰色鏈霉菌IF013350染色體DNA通過PCR擴增了編碼3，4-AHBA基因序列的區(qū)域(Saito和Miura的方法[Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963)])。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(由TakaraShuzoCo.，Ltd.提供)，反應在生產(chǎn)商推薦的實驗方法的條件下進行。其結果，通過PCR擴增獲得了約2.11Λ的片段。確定了該片段的核苷酸序列，且確證了該片段是包含所述griH基因的片段。核苷酸序列的測定使用DyeTerminatorCycleSequencingKit(由PEAppliedBiosystems供應)和DNA測序儀373A(由PEAppliedBiosystems供應)。griIH基因的序列示于SEQIDNO:7。(2)3，4-AHBA合成酶基因的啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)換。需要在棒狀桿菌型細菌中有效地表達來源于灰色鏈霉菌IF013350的3，4_AHBA合成酶基因。因此，將來自谷氨酸棒桿菌PS2編碼基因的啟動子引入所述griIH基因的上游。PS2是谷氨酸棒桿菌中的一種細胞表層蛋白，其編碼基因的序列已經(jīng)確定(Mol.Microbiol.，9，97-109(1993))。參照該序列合成了示于SEQIDNOS:3和4的引物，并從谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA通過PCR擴增包括位于所述PS2蛋白的基因起始密碼子5’上游區(qū)域的啟動子在內(nèi)的區(qū)域。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(由TakaraShuzoCo.，Ltd.提供)，反應在生產(chǎn)商推薦的實驗方法的條件下進行。結果，通過PCR擴增獲得了約0.51Λ的片段。確定了該片段的核苷酸序列，且確證了該片段包括含有所述PS2蛋白的基因起始密碼子5’上游區(qū)中的啟動子的區(qū)域。核苷酸序列是根據(jù)前述方法確定的。示于SEQIDNO:6的引物是基于實施例1(1)中確定的griH基因的序列而合成的，示于SEQIDNO:5的引物是基于含有所述PS2蛋白的基因的起始密碼子5’上游區(qū)啟動子的區(qū)域的核苷酸序列合成的。示于SEQIDNOS:5和6的引物是KpnI的盒引物(cassetteprimer)接著，將包含來自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因啟動子的區(qū)域的擴增片段與1μLgriIH基因區(qū)的擴增片段的PCR溶液混合用作模板。使用SEQIDNOS5和6的引物進行交換PCR(crossoverPCR)以擴增與包含來自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細胞表層蛋白基因的啟動子的區(qū)域連接的融合griIH基因。在瓊脂糖膠電泳上確定了約2.61Λ的擴增片段。使用EASYTRAPVer.2(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應)從所述瓊脂糖膠回收該片段，并插入質(zhì)粒PPK4(特開平9-322774-Α中記載)中的KpnI位點，以構建質(zhì)粒pPK4griIH。根據(jù)前述方法確定插入片段的核苷酸序列，確證融合基因的構建一如預期。[實施例2]使用編碼來源于灰色鏈霉菌IF013350的griIH基因的融合基因，通過谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生3，4-AHBA(1)使用編碼來源于灰色鏈霉菌IF013350的griIH基因的融合基因轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌用實施例1中構建的質(zhì)粒pPK4griIH轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌野生型、谷氨酸棒桿菌ATCC13869或谷氨酸棒桿菌AJ110135(啟動子來源于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS基因，而griH基因來源于灰色鏈霉菌IF013350)。將生長的細菌菌株在包含25mg/L卡那霉素的CM2G瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，NaCl5g以及瓊脂15g配于IL水中，然后在120°C滅菌20分鐘)上進行選擇。在谷氨酸棒桿菌AJ110135菌株中，通過如特開2004-261150所述引入將279位的丙氨酸殘基用蘇氨酸殘基取代的突變使天冬氨酸激酶脫敏，并缺失了賴氨酸通透酶。該細菌菌株可從谷氨酸棒桿菌ATCC13869通過描述于特開2004-261150中的方法來構建。(2)使用燒瓶通過谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)3，4_AHBA將在實施例2(1)中選擇的具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌ATCC13869或具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌AJ110135在燒瓶評價培養(yǎng)基(IOOg葡萄糖，Ig七水合硫酸鎂，55g硫酸銨，Ig磷酸二氫鉀，0.Olg七水合硫酸鐵，0.Olg五水合硫酸錳，2mg硫胺素鹽酸鹽，0.5mg生物素，5mg煙酰胺，1.05g大豆?jié)饪s物(水解的大豆蛋白，基于總氮量)和50g碳酸鈣在IL水中調(diào)為pH7.2，并在115°C滅菌15分鐘)中在30°C以120rpm培養(yǎng)71小時。作為對照實驗，還培養(yǎng)了未引入pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌ATCC13869。當培養(yǎng)具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌ATCC13869菌落或具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌AJ110135的菌落時，將卡那霉素以終濃度25mg/L添加至所述燒瓶評價培養(yǎng)基。在培養(yǎng)71小時后，在所有條件下葡萄糖已經(jīng)完全耗盡。具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌ATCC13869和具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌AJl10135分別積累了0.7g/L和1.4g/L的3，4_AHBA(表1)。同時，不具有pPK4griIH的谷氨酸棒桿菌ATCC13869未產(chǎn)生3，4_AHBA。3，4_AHBA根據(jù)Suzuki等的方法(J.Bio.Chem.,281,823-833(2006))使用反相色譜來定量。上述結果顯示3，4-AHBA可通過將來源于灰色鏈霉菌IF013350的griIH基因引入谷氨酸棒桿菌來產(chǎn)生。與野生型谷氨酸棒桿菌相比，具有消除了反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的谷氨酸棒桿菌AJ110135由于權利要求1.一種生產(chǎn)3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法，該方法包括培養(yǎng)具有編碼消除了反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的基因、且用組入有編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸的活性的蛋白質(zhì)的DNA的重組載體轉(zhuǎn)化過的棒狀桿菌型細菌。2.依照權利要求1的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是增強了編碼突變天冬氨酸激酶的基因的表達的棒狀桿菌型細菌。3.依照權利要求1或2的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是增強了丙酮酸羧化酶基因的表達的棒狀桿菌型細菌。4.依照權利要求1-3任一項所述的方法，其中所述DNA包含gril基因和griH基因。5.依照權利要求1-4任一項所述的方法，其中所述gril基因和griH基因來源于放線菌。6.依照權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述棒狀桿菌型細菌是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)07.—種生產(chǎn)聚苯并噁唑聚合物的方法，該方法包括使通過權利要求1-6任一項所述的方法生產(chǎn)的3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物聚合。全文摘要提供了一種通過培養(yǎng)具有編碼經(jīng)突變而消除了反饋抑制的天冬氨酸激酶，并用組入有下述DNA的重組載體轉(zhuǎn)化的棒桿菌有效地產(chǎn)生3-氨基-4-羥基苯甲酸類化合物的方法，所述DNA編碼具有從磷酸二羥丙酮和天冬氨酸半醛形成3-氨基-4-羥基苯甲酸活性的蛋白質(zhì)。文檔編號C12P7/40GK102089437SQ20098012673公開日2011年6月8日申請日期2009年7月7日優(yōu)先權日2008年7月9日發(fā)明者橫山敬一,菊池慶實,鈴木基孝申請人:味之素株式會社