專利名稱：循環(huán)的組織因子的體外測定方法及其用于檢測凝血性疾病的用途的制作方法
循環(huán)的組織因子的體外測定方法及其用于檢測凝血性疾病
的用途本發(fā)明涉及止血領(lǐng)域，特別是與組織因子的異常表達(dá)相關(guān)的凝血病癥以及與該因子的超表達(dá)相關(guān)的生理病理學(xué)現(xiàn)象。本發(fā)明涉及測定生物學(xué)樣本中循環(huán)的組織因子活性的方法。本發(fā)明的方法在體外進(jìn)行，特別是對取自患者的血樣或者由所獲取的血樣制備的樣本進(jìn)行。本發(fā)明的方法優(yōu)選地在血漿介質(zhì)中進(jìn)行。有利地，本發(fā)明方法使用顯色類型的測定。組織因子是體內(nèi)凝血的主要激活物，為一種47kDa的跨膜糖蛋白，它與因子VII或 VIIa結(jié)合而形成組織因子-因子VIIa復(fù)合物，該復(fù)合物通過激活因子IX和X，引發(fā)凝血的激活，從而導(dǎo)致凝血酶的產(chǎn)生和纖維蛋白的形成。真正凝血的開始需要因子VII與其特異性表面蛋白受體即組織因子結(jié)合，組織因子由一定數(shù)量的細(xì)胞或其組件表達(dá)(血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、細(xì)胞來源的微粒，從單細(xì)胞來源的微粒分子轉(zhuǎn)移后的血小板、贅生性細(xì)胞)。組織因子-因子VIIa復(fù)合物的活性不僅與正常的止血相關(guān)，而且也與由惡性疾病、急性冠狀動脈綜合征和重度膿毒癥引起的血栓形成的發(fā)作相關(guān)。組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)保證了維持止血平衡中的這一關(guān)鍵活性的調(diào)控。這種抑制劑TFPI并不是使組織因子失活，而是使組織因子-因子VIIa復(fù)合物的催化活性失活。首先，TFPI與因子結(jié)合，然后抑制因子敘；接著，Xa/TFPI復(fù)合物可與因子Vila-組織因子復(fù)合物結(jié)合而形成四聚體的因子fe/ TFPI/因子VIIa/組織因子復(fù)合物，其中，因子敘、因子VIIa和組織因子不再具有活性。這樣，TFPI就限制了由組織因子(TF)的表達(dá)所誘導(dǎo)的凝血的激活，在凝血的初始分子事件之前，強(qiáng)加一種初始階段來克服，實(shí)際上能夠誘導(dǎo)凝血級聯(lián)反應(yīng)的激活。因此，TFPI使得組織因子可以低噪音地暴露而不會有促凝血后果。TFPI由內(nèi)皮細(xì)胞和血小板合成。在生理?xiàng)l件下，組織因子的表達(dá)很廣泛，它存在于多種類型的細(xì)胞表面上，但是不存在于與循環(huán)血直接接觸的細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞和成形血液成分(elements figres du sang)) 的表面上。血管、心肌、粘液組織和表皮組織的外膜中富含組織因子。動脈粥樣硬化斑塊上的血栓形成會導(dǎo)致急性缺血性動脈疾病，它與組織因子的病理性暴露有很密切的關(guān)系。動脈粥樣硬化斑塊的血栓發(fā)生與存在的組織因子的數(shù)量相關(guān)， 在斑塊破裂的情況下，所述存在的組織因子在相當(dāng)程度上促進(jìn)了血栓發(fā)生的過程。類似地， 在膿毒癥中，組織因子可由單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，并導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血。還在來源于細(xì)胞膜的微粒表面識別到了組織因子。已在動脈粥樣硬化斑塊中識別到了這種來源于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的微粒。它們具有促凝血活性，來源于凋亡的細(xì)胞。除了其促凝血活性之外，現(xiàn)在還認(rèn)為組織因子是對多種細(xì)胞群具有與激素相似的功能的蛋白(1)。因此，例如，已表明組織因子能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，并能在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)血管生成。
組織因子還能刺激細(xì)胞遷移，已經(jīng)報(bào)道了組織因子參與腫瘤轉(zhuǎn)移和與腫瘤相關(guān) 的血管生成中的血管壁的組織化和完整性(2)。因此，目前已經(jīng)清楚地知道組織因子與多種生理病理環(huán)境相關(guān)，出于這一原因，必須要有可用的測定方法，該測定方法不僅能夠在血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的條件下追蹤組織因子活性的變化，還能夠監(jiān)測某些病理情況特別是癌癥的進(jìn)程。用于測定血液或血漿中的組織因子的常規(guī)方法為免疫學(xué)方法，例如ELISA類的方法，這類方法僅測量抗原，因此是定量測定而不是定性測定。在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已經(jīng)說明了多種活性測試方法，其中大多數(shù)都是使用利用(3)中所述的原理的精密計(jì)時(shí)方法(測量凝塊形成的時(shí)間)，由細(xì)胞提取物開始而進(jìn)行的。其它TF活性測試方法包括在存在激活的因子VII (FVIIa)和鈣以及因子Xa的特異性底物的條件下評估激活的因子X(FXa)的產(chǎn)生。因此，這種測試包括測量TF-FVIIa復(fù)合物將FX激活為FXa的能力。FX的這種激活可以通過水解的底物的數(shù)量來計(jì)算，例如當(dāng)使用能夠在水解后產(chǎn)生顯色基團(tuán)的底物時(shí)，使用顯色方法。基于該方案的大多數(shù)活性測試均針對被除去纖維蛋白即經(jīng)處理而防止纖維蛋白單體聚合的血漿樣本進(jìn)行，這種聚合會在進(jìn)行測試時(shí)干擾所進(jìn)行的光學(xué)測量。然而，該在先步驟使這類測試的自動化變得復(fù)雜，并且使測試必須分兩個(gè)階段進(jìn)行。而且，現(xiàn)有技術(shù)的活性測試沒有考慮到血漿中TFPI數(shù)量的變化，這也會曲解所測的TF的實(shí)際活性，從而提供關(guān)于與TF計(jì)數(shù)相關(guān)的患者血栓發(fā)生的潛在可能的錯(cuò)誤信息。本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的測試所遇到的問題。為此目的，提出了對循環(huán)的組織因子活性進(jìn)行單步驟測定的方法，在該方法中，消除了 TFPI對組織因子的抑制作用。實(shí)際上，本發(fā)明包括在存在纖維蛋白聚合抑制劑和抑制TFPI對組織因子的作用的化合物的條件下，在生物學(xué)樣本中對循環(huán)的組織因子的活性進(jìn)行體外測定。更準(zhǔn)確地說，當(dāng)向測試生物學(xué)樣本、纖維蛋白聚合抑制劑和TFPI對TF的作用的抑制劑所形成的反應(yīng)介質(zhì)中加入過量的凝血因子VII和X時(shí)，本發(fā)明允許測量循環(huán)的組織因子的活性所產(chǎn)生的因子Xa。本發(fā)明還涉及在生物學(xué)樣本中對循環(huán)的組織因子進(jìn)行單步驟體外測定的方法，所述方法基于循環(huán)的組織因子在存在過量的因子VII和X的條件下產(chǎn)生因子Xa的能力。進(jìn)行本發(fā)明方法所使用的生物學(xué)樣本為從個(gè)體采樣而得到的樣本。所述樣本優(yōu)選地為血液樣本，更優(yōu)選地為血漿樣本。然而，本發(fā)明的方法也可用于尿樣或腦脊液(liquide c印halo-rachidien，LCR) 或其他生物學(xué)樣本。本發(fā)明的方法優(yōu)選地為酶學(xué)方法，其中通過測量該因子對特異性底物的水解活性而測定所形成的Xa的量。特別是，所述底物為酶促底物，可為天然的或合成的。優(yōu)選地，所述底物能夠測定因子Xa的酰胺分解活性。特別是，所述底物為顯色底物或熒光底物。這類顯色底物為，例如Diagnostica Stago的CBS 5244(其他可能的供應(yīng)商 American Diagnostica ；Biopep SA ；Kabi Vitrum ；Biogenic ；Biophen ；Chromogenix)。
通過測定水解底物的量來計(jì)算所產(chǎn)生的因子fe的量(并由此測量循環(huán)的組織因子的活性)。所述測定可以根據(jù)所選擇的底物，通過測量反應(yīng)混合物在讀數(shù)窗中的光密度的變化而進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，在合適的緩沖液中稀釋由取自患者的生物學(xué)樣本所獲得的血漿。所述緩沖液可以是例如止血測試常用的Owren Koller緩沖液。所得的稀釋度依賴于測試樣本的性質(zhì)和所用底物的靈敏度。對于血漿樣本，有利的是，稀釋范圍為1/2至1/20，優(yōu)選范圍為1/2至1/4。鈣離子例如可以以CaCl2的形式提供。纖維蛋白聚合抑制劑選自本領(lǐng)域常用的化合物。具體而言，它為多肽抑制劑，例如寡肽GPRP. AcOH,其商品名為Pefabloc，由 Pentapharm i^i"共。用于該反應(yīng)介質(zhì)中的所述抑制劑的濃度可為5_25g/L，這根據(jù)測試血漿的稀釋度進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)將血漿以1/3稀釋至，有利的是，所用的所述抑制劑的濃度為10g/L，即終濃度范圍為0. 666g/L至3. 33g/L，特別是1. 332g/L。雖然Pefabloc構(gòu)成了本發(fā)明方法中的優(yōu)選的纖維蛋白聚合抑制劑，但也可以使用其他類型的抑制劑，例如抗纖維蛋白原抗體。 TFPI抑制劑為這樣的化合物，它能夠抑制TFPI對循環(huán)的TF的抑制作用，從而使得 TF的定量測定不致受到樣本中存在的TFPI水平變化的影響。TFPI抑制劑選自具有TFPI拮抗劑作用的任何類型的化合物。它優(yōu)選地為抗-TFPI 抗體或結(jié)合TFPI的抗體片段，所述抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，使用抗體T4E2，該抗體為Diagnostica Stago提供的單克隆抗體。選擇抗體的濃度，以使其能夠抑制測試樣本中含有的所有TFPI。所述濃度可以根據(jù)所研究樣本而在5至500 μ g/mL(在稀釋緩沖液中的濃度)而變化。對于以1/3稀釋的血漿樣本，抗體的終濃度優(yōu)選地為6. 6 μ g/mL。根據(jù)本發(fā)明的方法，反應(yīng)介質(zhì)有利地包含過量的因子VII和X。這些因子可用于測量組織因子的活性，因?yàn)?，如上所解釋的，組織因子與激活的因子VII (FVIIa)結(jié)合而形成復(fù)合物，然后該復(fù)合物會激活因子IX和X。由于是通過所產(chǎn)生的因子fe的量來測量TF的活性，測量的是)(a的特異性底物的水解，所以因子VII和X不能限制反應(yīng)，以便使得所產(chǎn)生的fe的量與TF的活性直接相關(guān)。所以，這些因子被過量地加入，這就意味著避免了它們干擾測量的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)測試樣本的類型，這兩種因子的每一種的終濃度的有利范圍為因子VII為5 至 20PEU/mg/mL，因子 X 為 3 至 16PEU/mg/mL。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，當(dāng)樣本為以1/3稀釋的血漿時(shí)，因子VII的濃度為 137PEU/mg/mL,因子X的濃度為80PEU/mg/mL (PEU =血漿當(dāng)量單位)。這些因子可為人類或動物來源的純化的或重組形式。例如，它們可由Diagnostica Stago> Enzyme Research Laboratories 或 Sigma 提供。
在一個(gè)優(yōu)選的變化的實(shí)施方案中，測試的血漿樣本還含有肝素抑制劑化合物，以便當(dāng)例如測定的樣本來自于接受肝素治療的患者時(shí)，使得測試的結(jié)果獨(dú)立于血漿中存在的肝素。所述化合物例如為在止血測試中常用于抑制肝素效果的聚凝胺。

有利的是，所述化合物所使用的終濃度的范圍為0. 5-10mg/L。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能夠根據(jù)所選擇的試劑調(diào)整濃度和活性。作為舉例說明，應(yīng)注意，對于包含于本發(fā)明內(nèi)的指示，試劑的濃度和活性可以以士50%的量而變化，例如士20%或甚至士 10%。這一變化可以涉及獨(dú)立于其他試劑的每種試齊LU根據(jù)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法按照如下流程進(jìn)行使用來自Diagnostics Stago提供的STA系列的自動設(shè)備進(jìn)行本發(fā)明的方法。將血漿樣本在稀釋緩沖液中以1/3稀釋，所述稀釋緩沖液為Owren Koller緩沖液，添加有12mg/L的聚凝胺和50 μ g/L的抗-TFPI抗體(T4E2)。向50 μ 1該混合物中加入下述試劑·25μ 1的含有80PEU/mg/mL因子X的溶液(裝有純化水的凍干瓶終濃度8PEU/ mg/mL)；· 25μ 1的含有137PEU/mg/mL因子VII的溶液(裝有純化水的凍干瓶終濃度 13.7PEU/mg/mL)；· 50 μ 1 的 25mM 的 CaCl2 溶液。將這一反應(yīng)介質(zhì)在37°C孵育500秒。在孵育步驟后，加入100 μ 1的含有濃度為0. 84 μ M的CBS 5244底物的溶液，得到的終濃度為3. 36 μ Μ(裝有純化水的瓶)。為了建立校準(zhǔn)曲線，從而得到組織因子的功能性活性，使用以下試劑 富含組織因子的正?；旌涎獫{例如通過富集而獲得的含有0. 00至44ρΜ的TF 的混合血漿(圖3)； 或者富含組織因子的Naci-CaCl2溶液(圖3)。每種血漿稀釋液均在1/3的稀釋度下進(jìn)行測試。測定了加入混合血漿的對應(yīng)于44ρΜ、22ρΜ、11ρΜ、5. 50ρΜ、2. 75ρΜ和OpM的活性的 TF的濃度。根據(jù)因子Xa的合成底物CBS 52. 44，測定了組織因子活性。事實(shí)上，在FVII的存在下，TF將FX激活為FXa。通過在405nm的波長下對硝基苯胺的釋放來測量FXa的酰胺分解活性。在405nm的波長下，在6-600秒的讀數(shù)窗中，測量對應(yīng)于組織因子活性的每個(gè)值 (pM)的光密度。然后測量了抗-TFPI抗體對校準(zhǔn)的影響(圖4和表1)。表1校準(zhǔn)(1)士抗-TFPI 抗體
權(quán)利要求
1.用于在來源于患者的預(yù)先采樣的生物學(xué)樣本中對循環(huán)的組織因子(cTF)進(jìn)行體外測定的方法，其中在反應(yīng)介質(zhì)中測量激活的因子X(Xa)的產(chǎn)生，所述反應(yīng)介質(zhì)包括測試的生物學(xué)樣本、過量的因子VII和因子X、鈣離子、纖維蛋白聚合抑制劑和TFPI (組織因子途徑抑制劑)活性抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的用于對循環(huán)的組織因子(cTF)進(jìn)行體外測定的方法，其特征在于所述生物學(xué)樣本為血液樣本或其衍生性樣本，特別是血漿樣本。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于通過測量因子fe對特異性底物的水解活性，測定所述反應(yīng)介質(zhì)中該因子)(a的產(chǎn)生。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述特異性底物為酶促底物。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于使用顯色底物或熒光底物測定激活的因子 X(FXa)的酰胺分解活性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于測量由合成的顯色底物CBS5244釋放的對硝基苯胺。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)介質(zhì)包含在諸如Owren Koller緩沖液的合適的緩沖液中稀釋的血漿。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在1/2至1/20，例如1/2至1/4的稀釋范圍內(nèi)，稀釋所述血漿；特別是，將所述血漿以1/3稀釋。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述纖維蛋白聚合抑制劑為多肽抑制劑，例如H-GlyProArgPro-OH. AcOH(GPRP. AcOH)或?yàn)榭估w維蛋白原抗體。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于凝血開始所需的鈣離子以 CaCl2的形式提供。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于TFPI對所述循環(huán)的組織因子的活性的抑制劑由能夠抑制TFPI對循環(huán)的組織因子的活性的抗-TFPI抗體和結(jié)合TFPI 的功能性抗體片段構(gòu)成。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述TFPI抑制劑為單克隆抗體T4E2或所述抗體的功能性片段。
13.如權(quán)利要求2至12中任一項(xiàng)所述的方法，包括下述步驟a)使血漿樣本與試劑1接觸，所述試劑1包含纖維蛋白聚合抑制劑、TFPI對cTF的活性的抑制劑，以及如果合適的話，稀釋緩沖液；b)將步驟(a)中獲得的反應(yīng)介質(zhì)與包含過量的因子X、過量的因子VII以及鈣離子溶液的試劑2—起孵育，以便產(chǎn)生激活的因子X(FXa)；c)在孵育后，使步驟(b)中獲得的反應(yīng)介質(zhì)與激活的因子X(FXa)的酶促底物接觸；d)檢測所述因子fe底物的轉(zhuǎn)化。
14.如權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述試劑1還包含肝素抑制劑，例如聚凝胺。
15.如權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于將所述血漿樣本在添加有 1. 2mg/L聚凝胺和50 μ g/L抗-TFPI抗體的Owren Koller緩沖液中以1/3稀釋。
16.如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述因子fe的酶促底物的轉(zhuǎn)化的定量測量通過在預(yù)定窗中讀取光密度而實(shí)現(xiàn)。
17.如權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化的因子fe底物的量通過參照校準(zhǔn)曲線而測定。
18.如權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)在下述條件下進(jìn)行 對于步驟a)，使所述在Owren Koller緩沖液稀釋以1/3稀釋的血漿樣本與50 μ g/ L的抗-TFPI抗體和1. 2mg/L的聚凝胺和濃度為10g/L的稱為GPRP. AcOH的纖維蛋白聚合抑制劑接觸； 對于步驟b)，將25 μ 1 80PEU/mg/mL比例的因子Χ、25μ 1 137PEU/mg/mL比例的因子 VII以及50 μ 1 25mM的CaCl2溶液加入到50 μ 1的步驟a)的混合物中，并將所獲得的反應(yīng)混合物在37°C孵育500秒； 對于步驟c)，加入100 μ 1的所述激活的因子X的酶促底物，并通過在405nm的波長下6-600秒的讀數(shù)窗中的光密度讀數(shù)，測定轉(zhuǎn)化的酶促底物的量。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法還包括測定內(nèi)部對照。
20.如權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于將所獲得的光密度值與使用富含組織因子的正?；旌涎獫{或使用富含組織因子的Naci-CaCl2溶液制備的校準(zhǔn)曲線的值進(jìn)行比較。
21.用于在生物學(xué)介質(zhì)中測量生物學(xué)樣本特別是血漿樣本中的循環(huán)的組織因子活性的試劑盒，包含 試劑1，包括用于測試的樣本的稀釋緩沖液、纖維蛋白聚合抑制劑、TFPI抑制劑，以及如果合適的話，肝素抑制劑； 純化的或重組的因子VII，有利地為凍干形式； 純化的或重組的因子X，有利地為凍干形式； 鈣離子，例如為CaCl2的形式； 激活的因子X的酶促底物，有利地為凍干形式； 如果合適的話，校準(zhǔn)試劑，有利地為凍干形式。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于所述樣本稀釋緩沖液為OwrenKoller 緩沖液，所述肝素抑制劑為聚凝胺，且所述纖維蛋白聚合抑制劑為為H-GlyProArgPro-OH. AcOH(GPRP. AcOH)或?yàn)榭估w維蛋白原抗體。
23.如權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內(nèi)部對照。
24.如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含因子fe 活性的校準(zhǔn)曲線。
25.用于在體外檢測異常凝血的方法，包括如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述，測量循環(huán)的組織因子的活性。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，包括將所測量的循環(huán)的組織因子活性與所述活性的正常值進(jìn)行比較。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述正常值通過測定正常血漿樣本的混合物中的循環(huán)的組織因子活性而獲得。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述正常值通過針對單獨(dú)測定的正常血漿樣本而測量的所述循環(huán)的組織因子活性的值來建立。
29.如權(quán)利要求25至觀中任一項(xiàng)所述的方法，用于檢測與血栓形成風(fēng)險(xiǎn)或血栓形成相關(guān)的循環(huán)的組織因子比率的增加，特別是與急性心肌梗塞(AMI)、急性冠狀動脈綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子癇、流產(chǎn)、血栓形成、膿毒癥、炎癥或癌癥的癥狀相關(guān)的循環(huán)的組織因子比率的增加。
30.如權(quán)利要求20至25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，用于檢測與血栓形成風(fēng)險(xiǎn)或血栓形成相關(guān)的循環(huán)的組織因子比率的增加，特別是與急性心肌梗塞(AMI)、急性冠狀動脈綜合征、 彌散性血管內(nèi)凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子癇、流產(chǎn)、血栓形成、膿毒癥、炎癥或癌癥的癥狀相關(guān)的循環(huán)的組織因子比率的增加。
全文摘要
本發(fā)明涉及止血領(lǐng)域，特別是與組織因子的異常表達(dá)相關(guān)的凝血病癥以及與所述因子的超表達(dá)相關(guān)的生理病理學(xué)現(xiàn)象。本發(fā)明提供了測定生物學(xué)樣本中循環(huán)的組織因子活性的方法。本發(fā)明的方法在體外進(jìn)行，特別是對采集自患者的血液樣本進(jìn)行。
文檔編號C12Q1/56GK102159723SQ200980127999
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日
發(fā)明者奧雷莉·盧梭, 巴里·伍德哈姆斯, 帕特里克·萬德丹 申請人:斯塔戈診斷公司