專利名稱：參與生物合成的新基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及參與生物合成的新基因。特別地，本發(fā)明涉及編碼控制關(guān)鍵基因表達(dá) 的調(diào)控因子的基因，所述關(guān)鍵基因參與產(chǎn)生植物中的黃酮類，包括縮合單寧。
背景技術(shù)：
苯基丙酸類分子途徑苯基丙酸類(phenylpropanoid)途徑(在圖1中顯示)產(chǎn)生一系列次級(jí)代謝產(chǎn)物， 包括黃酮、花青素、黃酮類、縮合單寧和異黃酮類(Dixon等人1996 ;200幻。特別地，縮合單 寧(CT)生物合成途徑在分叉至原花青素生物合成之前與花青素途徑共有其早期步驟。花青素是黃烷-3-醇類(f lavan-3-ols)(即(-)-表兒茶精)的前體，黃烷_3_醇 類是CT的重要結(jié)構(gòu)單元。這些順式黃烷-3-醇類通過花青素還原酶(ANR)從花青素中形 成，花青素還原酶已經(jīng)從許多物種包括擬南芥(A. thaliana)和蒺藜苜蓿(M. truncatula) 中克隆出來(Xie等人2003 ； 2004)。在擬南芥中，(_)_表兒茶精是獨(dú)有的CT單體(Abrahams 等人.，2002)，但是在許多其它物種中，包括豆類，(+)-和(-)_黃烷-3-醇類被聚合至CT。 這些交替的(+)_黃烷-3-醇類(兒茶精)的生物合成由無色花青素還原酶(LAR)催化。該 酶已經(jīng)從豆類包括富含CT的豆科喬木銀葉山綠豆(Desmodium uncinatum)中(Tanner等 人2003)以及從其它物種如葡萄和蘋果中(Pfeiffer等人2006)克隆出來并得到鑒定。該 酶分別催化還原無色蹄紋天竺素、無色矢車菊素和無色翠雀花素至阿夫兒茶精、兒茶精和 沒食子兒茶精。在擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)LAR的同源物，這與該植物中(-)_表兒茶精衍生的CT 結(jié)構(gòu)單元的獨(dú)有存在相一致。然而，擬南芥種子中關(guān)于該途徑的TF調(diào)控的信息是定義明確的。還沒有鑒定出控 制車軸草(Trifolieae)族內(nèi)的葉CT生物合成的TF。TF蛋白質(zhì)的重要家族即MYB家族控 制不同范圍的功能，包括調(diào)控植物中的次級(jí)代謝，如花青素和CT途徑。MYB TF AtTT2的表 達(dá)協(xié)調(diào)地打開或關(guān)閉擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的晚期結(jié)構(gòu)基因，最終控制了 CT 途徑的表達(dá)。已經(jīng)制備了一系列擬南芥透明種皮(TT)突變體(Winkel-Shirley，2002 ； Debeaujon等人，2001)和單寧缺陷種子(TDS)突變體(Abrahams等人2002 ；2003)-所有的 都在種皮中缺乏CT的積聚。對(duì)這些突變體的分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)允許鑒定擬南芥中許多 結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(TF)以及花青素和CT合成的組織特異性(Walker等人.， 1999 ；Nesi 等人，2000 ；2002)。雖然CT途徑中的大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)在豆類范圍內(nèi)得到鑒定，通過工程化這些 單個(gè)基因的表達(dá)而操作葉內(nèi)CT生物合成的嘗試迄今為止是失敗的。其主要原因在于不是 一個(gè)酶(或幾個(gè)酶)是限制速率的，而在于事實(shí)上途徑中所有的酶活性不得不被增加以便 獲得進(jìn)入特異的終產(chǎn)物如縮合單寧的總流量(flux)增加。轉(zhuǎn)錄因子(TF)是作為代謝途徑的抑制劑或激活劑的調(diào)控蛋白質(zhì)。因此TF可以用 作操作植物中整個(gè)代謝途徑的有力工具。許多MYB TF是苯基丙酸類途徑包括花青素和縮合單寧生物合成中的重要調(diào)節(jié)子(Debauion等人，2003 ；Davies andSchwinn，2003)。例如， 當(dāng)縮合單寧生物合成發(fā)生時(shí)，擬南芥TT2 (AtTD)基因編碼在胚胎發(fā)生早期階段只表達(dá)在 種皮中的R2R3-MYB TF因子(Nesi等人，2001)。已經(jīng)顯示TT2在CT的生物合成和儲(chǔ)存過 程中調(diào)控黃酮類晚期生物合成結(jié)構(gòu)基因TT3 (DFR)、TT18、TT12 (MATE蛋白)和ANR的表達(dá)。 AtTT2與兩種其它TF即TT8(bHLH蛋白)和TTGl (WD-40重復(fù)蛋白；Baudry等人，2004)結(jié) 合部分確定了基因空間和時(shí)間的嚴(yán)格表達(dá)。近期還報(bào)道了參與CT生物合成調(diào)控的葡萄(Vitis vinifera)；葡萄(VvMYBPAl) 百脈根(Birdsfoot trefoil)和甘藍(lán)型油菜(Brassica napus) (BnTT2)中的其它的 MYB TF (Wei 等人，2007 ；Bogs 等人，2007 ；Yoshida 等人，2008)。還顯示AtTT2 基因與水稻(Oryza sativa) 0sMYB3、玉米(Zea mays) ZmCl、來自金 魚草(Antirrhinum majus)的 AmMYBROSEA 和來自矮牽牛(Petunia hybrida)的 PhMYBAN2 共有一定程度的相似性，已經(jīng)顯示這些基因調(diào)控花青素的生物合成(Stracke等人，2001 ； Mehrtens 等人，2005)。縮合單寧也稱為原花青素(PA)的縮合單寧(CT)是無色的聚合物，是幾種次級(jí)植物代謝產(chǎn) 物中的一種。CT是通過碳-碳鍵連接的2至50個(gè)(或更多)黃酮單元的聚合物(請(qǐng)參見 下文的化合物(I))，所述碳-碳鍵對(duì)水解切割不敏感。黃酮類的基本結(jié)構(gòu)是
O
化合物(I)
縮合單寧位于植物部分的范圍內(nèi)，例如；葉、莖、花、根、木產(chǎn)物、樹皮、芽中。CT一 般在植物的液泡中或表面外皮上可以找到。飼料植物中的縮合單寧飼料植物如飼料豆類在基于牧草的家畜系統(tǒng)中是有益的，因?yàn)槠渫瑫r(shí)改善了動(dòng) 物膳食的攝入和質(zhì)量。另外，其對(duì)于牧草的氮(N)經(jīng)濟(jì)和對(duì)于反芻生產(chǎn)的價(jià)值是可觀的 (Caradus等人，2000)。但是，雖然牧草為放牧的反芻動(dòng)物產(chǎn)生了有成本效益的飼料來源，但 當(dāng)為了同時(shí)滿足反芻微生物群和動(dòng)物本身的營(yíng)養(yǎng)需要時(shí)，它經(jīng)常是欠佳的。因此，用于肉、 毛或奶生產(chǎn)的放牧反芻動(dòng)物的遺傳潛力很少依賴飼料膳食獲得。新西蘭牧草含有多達(dá)20%的白三葉草，雖然在牧草中增加白三葉草水平有助于解 決這一不足，但其也加重了氣脹(bloat)的發(fā)生率。由于在以下物種中缺乏植物多酚類化 合物如CT，白三葉草(Trifolium r印ens)、紅三葉草(Trifolium pratense)和紫花苜蓿 (Medicago sativa)被充分證明造成氣脹。因此，開發(fā)在植物組織中產(chǎn)生高水平單寧的飼料 栽培品種將是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中減少氣脹發(fā)生率的重要進(jìn)展(Burggraaf等人，2006)。特別地，縮合單寧(如果以足夠的量存在)，不僅幫助消除氣脹，還強(qiáng)烈影響飼料豆類的植物質(zhì)量、適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并因此可以幫助改善動(dòng)物的行為。報(bào)道的來源于CT 水平增加的動(dòng)物健康和生產(chǎn)力好處包括羊排卵率的增加、增加活重獲得、毛生長(zhǎng)和奶產(chǎn)生 的增加、奶組成的改變和胃腸寄生蟲驅(qū)蟲效果的改善(Rumbaugh，1985 ；Marten等人，1987 ； Niezen 等人，1993 ； 1995 ；Tanner 等人，1994 ；McKenna, 1994 ；Douglas 等人，1995 ；Waghorn 等人，1998 ;Aerts et al，1999 ;McMahon 等人，2000 ;Molan 等人，2001 ;Sykes and Coop, 2001)。較高水平的縮合單寧還代表了減少由放牧反芻動(dòng)物釋放進(jìn)入環(huán)境的溫室氣體 (甲烷、一氧化二氮)的可行解決方案(Kingston-Smith and Thomas，2003)。反芻家畜產(chǎn) 生至少80%的新西蘭總甲烷排放，是主要的溫室氣體排放貢獻(xiàn)者(Clark，2001)。家畜甲烷 的主要來源是反芻動(dòng)物消化道中的腸發(fā)酵物。代表了反芻動(dòng)物約3至9%總能量攝入的能 量損失的甲烷產(chǎn)生(Blaxter and Clapperton，196 可以通過改善飼料質(zhì)量減少多達(dá)5%。 已經(jīng)顯示CT高的飼料減少了來自放牧動(dòng)物的甲烷排放(Woodward，et al 2001 ；Puchala, et al.，2005)。因此增加牧草植物的CT含量可以直接有助于減少來自家畜的甲烷排放。因此，可以源自觸發(fā)飼料植物包括白三葉草中甚至中等量的縮合單寧積聚的環(huán)境 和農(nóng)業(yè)益處在反芻動(dòng)物的保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)中是相當(dāng)重要的(Damiani等人，1999)。豆類本發(fā)明人的理解是包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(TF)與途徑相互作用的三葉草屬豆類中對(duì) CT葉特異性途徑的調(diào)控仍然是未知的。已經(jīng)探究了對(duì)影響CT量的這一途徑的修飾或操作， 但是由于該過程不是簡(jiǎn)單的，在理解這一途徑中鮮有牢靠的成功。例如，三葉草屬，三葉草屬(Trifolium)，是豆科(D豆科(Fabaceae))中最大的屬， 具有約255個(gè)種(Ellison等人，2006)。已知只有兩種三葉草種類三葉草(T. affine)(也 稱為Trifolium preslianum Boiss. Is)和Τ. arvense (也稱為兔足三葉草)積聚高水平的 葉CT(Fay and Dale，1993)。雖然顯著水平的CT存在于白三葉草的花頭中(Jones等人， 1976)，在葉毛茸中只能檢測(cè)到痕量(Woodfield等人，1998)。幾個(gè)方法包括基因庫(kù)篩選和 隨機(jī)突變均沒有成功地提供具有增加水平的葉CT的白或紅三葉草植物(Woodfield等人， 1998)。縮合單寧的遺傳操作與US2006/012508相關(guān)的發(fā)明人使用TT2MYB調(diào)控基因創(chuàng)建了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植 物，并設(shè)法令人驚訝地組成型產(chǎn)生了貫穿根組織的CT。但重要的是，該發(fā)明人未能在這一飼 料豆類的葉中獲得CT的積聚。先前已經(jīng)報(bào)道了沒有已知的可以誘導(dǎo)紫花苜蓿飼料中原花 青素(CT)的環(huán)境存在(Ray等人，200 。該文的作者評(píng)估了在其他東西中，來自玉米的LC myc樣調(diào)控基因(TF)或來自玉米的Cl myb調(diào)控基因(TF)是否可以刺激紫花苜蓿飼料和種 皮中的黃酮類途徑。該文的作者發(fā)現(xiàn)只有LC基因，而不是Cl可以刺激紫花苜蓿飼料中的 花青素和原花青素的生物合成，但是刺激只在未知應(yīng)激反應(yīng)性紫花苜蓿因子存在時(shí)發(fā)生。使用玉米bHLH調(diào)控基因(TF)評(píng)估百脈根屬(Lotus)植物中縮合單寧產(chǎn)生的研究 發(fā)現(xiàn)，將這一 TF轉(zhuǎn)化進(jìn)入百脈根屬植物僅引起非常小(1%)的葉中縮合單寧水平CT增加 (Robbins 等人，2003)。改變和增加農(nóng)業(yè)上重要的白三葉草中的化合物的先前嘗試包括改變?cè)醋员交?酸類途徑的花青素生物合成。雖然有使用幾個(gè)異源myc和MYB TF激活這一途徑的嘗試，只報(bào)道了一例使用玉米myc TF B-Peru的成功(de Majnik等人，2000)。所有其它研究的TF 引起不良的再生或沒有再生，暗示了來自其過表達(dá)的有害效應(yīng)。最近，源自高CT豆類百脈根(Lotus japonicus)的TT2同源物已經(jīng)有報(bào)道 (Yoshida等人，2008)。將這些基因轟擊進(jìn)入擬南芥葉細(xì)胞中已經(jīng)顯示瞬時(shí)表達(dá)引起可檢 測(cè)的ANR表達(dá)和通過DMACA檢測(cè)的有限的CT積聚。但是，這些基因還未在任何豆類物種中 得到轉(zhuǎn)化和分析。僅當(dāng)植物在非生物應(yīng)激下，玉米LC基因的表達(dá)才會(huì)引起紫花苜蓿中PA樣化合物 的積聚(Ray等人，2003)。為了克服PA的細(xì)胞類型特異性表達(dá)，需要共表達(dá)擬南芥屬中的 三種轉(zhuǎn)錄因子TT2、PAPl和Lc，但是PA的這一組成型積聚伴隨著植物的死亡(Sharma and Dixon,2005)。Xie等人Q006)已經(jīng)嘗試了通過結(jié)合表達(dá)MTO家族轉(zhuǎn)錄因子和花青素還原酶而將 PA引入植物，用于將花青素轉(zhuǎn)換成(epi)_黃烷-3-醇類。報(bào)道了通過共表達(dá)PAPl (MYB TF)和ANR增加煙草葉中原花青素(PA)水平的該嘗 試，因?yàn)樵跓煵葜芯哂腥绻g至紫花苜蓿的PA水平有可能提供氣脹的防護(hù)(Xie等人， 2006)。組成型表達(dá)MtANR的轉(zhuǎn)基因蒺藜苜蓿(M. trimcatula)的含花青素的葉含有比相同 發(fā)育階段的那些野生型植物多多達(dá)三倍的PA，且這些化合物是PA寡聚物的特異亞型。另 外，在蒺藜苜蓿中產(chǎn)生的PA的這些水平遠(yuǎn)低于那些改善農(nóng)業(yè)益處所需的水平。作者聲明還 不清楚需要哪些另外的生物合成和非生物合成基因用于工程化任何天然積聚所述化合物 的特異植物組織中的PA。當(dāng)將TT2和/或BAN基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入紫花苜蓿中時(shí)，還遇到了在葉中表達(dá)CT或PA 的相似困難-參見 US 2004/0093632 和 US 2006/0123508o用于天然健康產(chǎn)品的縮合單寧使用任何黃酮類包括原花青素形成食品補(bǔ)充物、組合物或藥物也是廣泛所知的。 例如·美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?003/0180406描述了使用特異性源自可可的多酚組合物從而 改善認(rèn)知功能的方法。 專利公開物WO 2005/044291描述了葡萄籽(Vitus屬)防止退行性腦病的用途， 所述腦病包括中風(fēng)、腦震蕩、亨廷頓氏病、CJD、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和老年癡呆。·專利公開物WO 2005/067915公開了黃酮類和與黃酮、黃酮類、原花青素和花青 素(合成的或來自樹皮提取物)結(jié)合的羥基芪類化合物(合成的或來自綠茶)的協(xié)同結(jié)合 用以減少與疾病狀態(tài)如癡呆、阿爾茨海默氏病、腦血管疾病、年齡相關(guān)的認(rèn)知損害和抑郁癥 相關(guān)的神經(jīng)退化?！?US 5，719，178描述了原花青素提取物治療ADHD的用途。· PCT公開專利號(hào)06/U6895描述了含有來自松屬(Pinus)樹皮提取物的組合物 用以改善或防止人類認(rèn)知能力的降低或改善或防止人類神經(jīng)性障礙的癥狀。上面的考慮中 沒有一個(gè)使用豆類作為CT的原料來源。因此，如果可以提供用于研究參與黃酮類和/或縮合單寧生物合成的代謝途徑的 核酸分子和多肽，那將是有用的。如果提供了能夠改變植物或其部分中黃酮類和/或縮合單寧水平的核酸分子和多肽，那將是有用的。特別地，如果提供了可以用于從頭產(chǎn)生植物或其部分中黃酮類和/或縮合單寧的 核酸分子，那將是有用的。因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供增加飼料豆類物種葉中CT水平的方法。基因的鑒 定還提供了防止在葉或種子中產(chǎn)生有害的高水平CT的豆類物種中CT積聚的方法。如果可以提供可以單獨(dú)使用或與其它核酸分子一起使用從而產(chǎn)生植物特別是飼 料和豆類(具有增加水平的黃酮類和/或縮合單寧)的核酸分子，那將是有用的。本發(fā)明的一個(gè)目的是解決上述的問題或者至少為公眾提供有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及鑒定和使用新MTO基因和相關(guān)多肽，所述多肽已經(jīng)被發(fā)明人稱為 ‘MYB14’，其由申請(qǐng)人分離，并顯示參與黃酮類化合物包括縮合單寧的產(chǎn)生。貫穿本說明書，本發(fā)明的核酸分子和多肽可以用主題詞MYB14命名。本發(fā)明考慮到單獨(dú)使用MYB14或與其它核酸分子一起使用MYB14從而操作植物中 黃酮類/縮合單寧的生物合成途徑。編碼多肽的多核苷酸在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本文定義的MYB14多肽的分離的核酸分子或其功 能變體或片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 15的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 17的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 17的序列， 但沒有SEQ IDNO 16的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有具有與SEQ ID NO :14和46至M任一 個(gè)至少70%同一性的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有具有與SEQ ID NO 14至少70%同一性 的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 14和46至M任一個(gè)的序 列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 14的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中黃酮類的產(chǎn)生。在另外的具體實(shí)施方案中，黃酮類是縮合單寧。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中黃酮類生物合成途徑中的至少
一個(gè)基因。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中縮合單寧生物合成途徑中的至 少一個(gè)基因。在另外的具體實(shí)施方案中，功能片段具有與MYB14多肽基本上相同的活性。在另外的具體實(shí)施方案中，功能片段含有具有與SEQ ID NO 17至少70%同一性 的氨基酸序列。在另外的具體實(shí)施方案中，功能片段含有SEQ ID NO 17的氨基酸序列。
在另外的方面，本發(fā)明提供了編碼含有基本上如SEQ ID NO 17中顯示的氨基酸序 列的多肽的核酸分子。在另外的方面，本發(fā)明提供了編碼具有基本上如SEQ ID NO 17中顯示的氨基酸序 列的多肽的核酸分子。在另外的方面，本發(fā)明提供了編碼含有基本上如SEQ ID NO 14中顯示的氨基酸序 列的多肽的核酸分子。在另外的方面，本發(fā)明提供了編碼具有基本上如SEQ ID NO 14中顯示的氨基酸序 列的多肽的核酸分子。在另外的方面，本發(fā)明提供了編碼含有如SEQ ID NO 17中列出的3’氨基酸序列 基序的多肽的分離的核酸分子。多核苷酸在另外的方面，本發(fā)明提供了具有選自下列的核苷酸序列的分離的核酸分子a) SEQ ID NO 1至13和55至64中的至少一個(gè)或其組合；b) a)中序列的互補(bǔ)物；c) a)或b)中序列的功能片段或變體；d)a)、b)或c)中序列的同源物或直系同源物；e)獲自a)、b)、c)或d)中序列的RNA序列的反義序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，變體具有與特定序列的編碼序列至少70 %的同一性。在另外的具體實(shí)施方案中，變體具有與特定序列至少70%的同一性。在另外的具體實(shí)施方案中，片段含有特定序列的編碼序列。在另外的方面，本發(fā)明提供了具有選自下列的核苷酸序列的分離的核酸分子a)SEQ ID NO :1、2 或 55 ；b) a)中序列的互補(bǔ)物；c) a)或b)中序列的功能片段或變體；d)a)、b)或c)中序列的同源物或直系同源物；e)獲自a)、b)、c)或d)中序列的RNA序列的反義序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，變體具有與特定序列的編碼序列至少70 %的同一性。在另外的具體實(shí)施方案中，變體具有與特定序列至少70%的同一性。在另外的具體實(shí)施方案中，片段含有特定序列的編碼序列。在另外的具體實(shí)施方案中，分離的核酸分子含有SEQ ID NO 2的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，分離的核酸分子含有SEQ ID NO 1的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，分離的核酸分子含有SEQ ID NO 55的序列。探針在另外的方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合至本發(fā)明的核酸上的探針。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在能夠結(jié)合至基本上如上述的MYB14核酸分子的3’ 結(jié)構(gòu)域上的探針。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，探針能夠結(jié)合至編碼SEQ ID NO :17的氨基酸序列的核酸 分子上或結(jié)合至所述核酸分子的互補(bǔ)物上。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，探針能夠在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下結(jié)合至核酸分子上或其互補(bǔ)物上。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了編碼如SEQ ID NO 17中列出的基序的3’序列 的探針。引物在另外的方面，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合至本發(fā)明的核酸上的引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在能夠結(jié)合至基本上如上述的MYB14核酸分子的3’ 結(jié)構(gòu)域上的引物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，探針能夠結(jié)合至編碼SEQ ID NO :15的氨基酸序列的核酸 分子上或結(jié)合至所述核酸分子的互補(bǔ)物上。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，探針能夠在PCR條件下結(jié)合至核酸分子上或其互補(bǔ)物 上。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼3’序列的核酸的引物，所述3’序列編碼如 SEQ ID NO 17中列出的基序。多月太在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本文定義的MYB14多肽，或其功能片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 17的序列， 但沒有SEQ ID NO 16的序列。在另外的方面，本發(fā)明提供了具有選自下列的氨基酸序列的分離的多肽a) SEQ ID NO :14 和 46 至 54 的任一個(gè)；b)a)中列出的序列的功能片段或變體。在另外的具體實(shí)施方案中，變體含有具有與SEQ ID NO 14和46至M的任一個(gè)至 少70%同一性的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，變體含有具有與SEQ ID NO :14至少70%同一性的序 列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 14和46至M的任一個(gè)的 序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽含有SEQ ID NO 14的序列。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中黃酮類的產(chǎn)生。在另外的具體實(shí)施方案中，黃酮類是縮合單寧。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中黃酮類生物合成途徑中的至少
一個(gè)基因。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中縮合單寧生物合成途徑。在另外的具體實(shí)施方案中，MYB14多肽調(diào)控植物中縮合單寧生物合成途徑中的至 少一個(gè)基因。在另外的具體實(shí)施方案中，功能片段具有與MYB14多肽基本上相同的活性。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了具有選自下列的氨基酸序列的分離的多肽a) SEQ ID NO 14 ；b)a)中列出的序列的功能片段或變體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有如SEQ ID NO 17中列出的3’氨基酸序列基序的分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了具有如SEQ ID NO 17中列出的3’氨基酸序列 基序的分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離的MYB14多肽或其功能片段，其中所述 MYB14多肽包括如SEQ ID NO 15中顯示的亞群5的氨基酸序列基序以及如SEQ ID NO 17 中顯示的氨基酸序列3’基序，但沒有如SEQ ID NO: 16中顯示的亞群6的氨基酸序列基序。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用具有核苷酸序列的核酸分子編碼的分離的多 肽，所述核苷酸序列選自如SEQ ID NO :1至13和55至64的任一個(gè)中列出的序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用具有核苷酸序列的核酸分子編碼的分離的多 肽，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO :1、2或55之一列出的序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有編碼本發(fā)明多肽的序列的核酸分子。構(gòu)建體根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包括基本上如上述的核苷酸序列的構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包括下列成分的構(gòu)建體-至少一個(gè)啟動(dòng)子；和-基本上如上述的核酸分子；其中啟動(dòng)子有效地與核酸分子連接從而控制核酸分子的表達(dá)。優(yōu)選地，構(gòu)建體可以包括一個(gè)或多個(gè)其它的目的核酸分子和/或一個(gè)或多個(gè)另外 的調(diào)控序列，如終止子序列和其他序列。最優(yōu)選地，構(gòu)建體中的核酸分子可以具有選自SEQ ID NO :1、2或55的核酸序列。宿主細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了從野生型改變的從而包括基本上如上述的核酸 分子的宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，核酸是本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體中的部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞不形成人類的部分。在另外的具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。植物細(xì)胞和植物根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了用基本上如上述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì) 胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了用基本上如上述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了從野生型改變的從而包括基本上如上述的核酸 分子的植物或其部分。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了通過改變MYB14基因表達(dá)被操作的、相對(duì)于對(duì) 應(yīng)的野生型植物或其部分具有增加的或減少的黃酮類和/或縮合單寧水平的植物或其部 分。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了通過改變MYB14基因表達(dá)被操作的、相對(duì)于對(duì) 應(yīng)的野生型植物細(xì)胞具有增加的或減少的黃酮類和/或縮合單寧水平的植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了通過改變MYB14基因表達(dá)，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生 型植物或其部分具有增加的黃酮類和/或縮合單寧水平的植物的葉。
根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上述的通過改變MYB14基因表達(dá)，相 對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物細(xì)胞或植物具有增加的或減少的黃酮類和/或縮合單寧水平的植 物細(xì)胞或植物的后代。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上述的轉(zhuǎn)基因植物的種子。組合物根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了包括是或獲自植物和/或其部分的成分的組合 物，其中所述植物或其部分通過改變MYB14基因的表達(dá)被操作，從而相對(duì)于那些對(duì)應(yīng)的野 生型植物或其部分具有增加的或減少的黃酮類和/或縮合單寧水平。使用多核苷酸的方法根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上述的核酸分子改變植物或植物細(xì)胞 的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了使用基本上如上述的核酸分子產(chǎn)生改變的植物 或植物細(xì)胞的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，改變了植物或植物細(xì)胞的黃酮類的產(chǎn)生或黃酮類產(chǎn)生中 的中間體的產(chǎn)生。在另外的具體實(shí)施方案中，黃酮類包括至少一種縮合單寧。在另外的具體實(shí)施方案中，縮合單寧選自兒茶精、表兒茶精、表沒食子兒茶精和沒 食子兒茶精。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，改變是增加。在另外的具體實(shí)施方案中，改變植物或植物細(xì)胞中黃酮類生物合成途徑中至少一 種酶的表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，黃酮類生物合成途徑是縮合單寧的生物合成途徑。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，改變的表達(dá)是增加的表達(dá)。在另外的具體實(shí)施方案中，酶是LAR或ANR。在另外的具體實(shí)施方案中，改變植物的LAR和ANR 二者的表達(dá)。植物可以是任何植物，且植物細(xì)胞可以來自任何植物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，植物是飼料作物植物。在另外一個(gè)具體實(shí)施方案中，植物是豆科植物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的產(chǎn)生或表達(dá)基本上在植物的所有組織 中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的產(chǎn)生或表達(dá)在植物的葉組織中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的產(chǎn)生或表達(dá)在植物的營(yíng)養(yǎng)部分中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的產(chǎn)生或表達(dá)在植物的表皮組織中。為了本說明書的目的，表皮組織是指細(xì)胞的外部單層群組，包括葉、莖和根和維管 植物的年幼組織。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的黃酮類的產(chǎn)生在基本上沒有黃酮類的 植物的組織中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如上所述的改變的縮合單寧的產(chǎn)生在基本上沒有縮合單 寧的植物的組織中。
因此，在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，黃酮類或縮合單寧的產(chǎn)生是從頭產(chǎn)生。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，核酸編碼本文定義的MYB14蛋白。在另外的具體實(shí)施方案中，核酸編碼含有如SEQ ID NO 1_13和55至64的任一個(gè) 中列出的氨基酸序列或其片段或變體的蛋白質(zhì)。在另外的具體實(shí)施方案中，核酸含有基本上如SEQ ID NO 1_13和55至64的任一 個(gè)中列出的序列或其片段或變體。在另外的具體實(shí)施方案中，核酸含有基本上如SEQ ID NO 1、2或55中列出的序列 或其片段或變體。在另外的具體實(shí)施方案中，核酸是基本上如上述的構(gòu)建體的部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過用核酸或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物而改變植物。在另外的具體實(shí)施方案中，通過操作植物的基因組而改變植物以便在植物中表達(dá) 相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或其植物中表達(dá)的而言增加的或減少的核酸或其片段或變體的 水平。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了本發(fā)明的核酸分子或多肽用于鑒定其它相關(guān)黃 酮類和/或縮合單寧調(diào)控基因/多肽的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的核酸分子用于改變植物或植 物細(xì)胞的用途，其中所述植物是飼料作物或植物細(xì)胞來自飼料作物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，改變了植物的縮合單寧的產(chǎn)生。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，植物具有增加的縮合單寧的產(chǎn)生。優(yōu)選地，飼料作物可以是飼料豆類。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的核酸分子用于改變豆科植物 或豆科植物細(xì)胞中黃酮類或縮合單寧水平的用途。優(yōu)選地，縮合單寧的水平得到改變。優(yōu)選地，縮合單寧的水平在葉組織中得到改變。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如SEQ ID NO :1_13和55至64的任一 個(gè)中列出的核酸序列信息用于原位(in planta)改變黃酮類或縮合單寧生物合成途徑的用 途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如SEQ ID NO :1、2和55的任一個(gè)中列出 的核酸序列信息用于原位(in planta)改變黃酮類或縮合單寧生物合成途徑的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化豆科植物或 植物細(xì)胞從而改變豆科植物或植物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)部分中的黃酮類和/或縮合單寧水平的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了改變豆科植物或其部分中黃酮類和/或縮合單 寧產(chǎn)生的方法，包括操作植物的基因組以便在植物中表達(dá)相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或植物 中產(chǎn)生的MYB14基因或其片段或變體而言增加的或減少的豆科MYB14基因或其片段或變體 水平的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了改變豆科植物或其部分中黃酮類和/或縮合單 寧產(chǎn)生的方法，包括操作植物的基因組以便在植物中表達(dá)相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或其植 物中產(chǎn)生的MYB14基因或其片段或變體而言增加的或減少的豆科MYB14基因或其片段或變 體水平的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了核酸分子在豆科植物或其部分中從頭原位產(chǎn)生 黃酮類或縮合單寧的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的核酸分子在豆科植物或其部 分中原位操作黃酮類和/或縮合單寧生物合成途徑的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的構(gòu)建體原位操作黃酮類和/ 或縮合單寧生物合成途徑的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了具有基本上對(duì)應(yīng)于本發(fā)明核酸分子的核酸序列 的MYB14基因用于原位操作生物合成途徑的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了基本上如上所述的核酸分子產(chǎn)生黃酮類和/或 縮合單寧、酶、中間體或其它與黃酮類和/或縮合單寧生物合成途徑相關(guān)的化合物的用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了操作黃酮類和/或縮合單寧生物合成途徑的方 法，其特征是改變基本上如上所述的核酸從而產(chǎn)生編碼非功能性多肽的基因的步驟。根據(jù)另一個(gè)方面，提供了原位分離的本發(fā)明的核酸分子用于操作豆科植物或植物 細(xì)胞中LAR和/或ANR水平的用途。根據(jù)另一個(gè)方面，提供了原位分離的本發(fā)明的核酸分子用于操作豆科植物或植物 細(xì)胞中兒茶精和/或表兒茶精或其它單寧單體(表沒食子兒茶精或沒食子兒茶精)水平的 用途。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了核酸分子或多肽用于鑒定其它相關(guān)的黃酮類和 /或縮合單寧調(diào)控基因/多肽的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以操作整個(gè)植物組織。在另外的具體實(shí)施方案中，可以 操作植物的表皮組織。為了本說明書的目的，表皮組織是指細(xì)胞的外部單層群組、葉、莖和 根和維管植物的年幼組織。最優(yōu)選地，利用本發(fā)明改變的黃酮類和/或縮合單寧的水平足以向消耗了具有改 變的黃酮類和/或縮合單寧水平的植物的受試者提供治療或農(nóng)業(yè)的益處。通過所述方法產(chǎn)生的植物在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物。在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了任何本發(fā)明的植物的部分、種子、果實(shí)、 收獲的材料、繁殖體或后代。在另外的具體實(shí)施方案中，植物的部分、種子、果實(shí)、收獲的材料、繁殖體或后代經(jīng) 遺傳修飾而含有至少一種本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的構(gòu)建體。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的來源本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)可以源自任何如下所述的植物或可以合成產(chǎn)生或重組產(chǎn)生。植物本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物或那些在本發(fā)明的方法和用途中轉(zhuǎn)化的或操作的植物 細(xì)胞和植物可以來自任何物種。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，植物細(xì)胞或植物源自裸子植物物種。在另外的具體實(shí)施方案中，植物細(xì)胞或植物源自被子植物物種。在另外的具體實(shí)施方案中，植物細(xì)胞或植物源自雙子葉植物物種。
在另外的具體實(shí)施方案中，植物細(xì)胞或植物源自單子葉植物物種。優(yōu)選地，植物來自雙子葉物種。其它優(yōu)選的植物是來自含有但不限于下列屬的群組的飼料植物物種黑麥 草屬(Lolium)、羊茅屬O^estuca)、鴨茅屬(Dactylis)、雀麥屬(Bromus)、偃麥草屬 (Thinopyrum)、三葉草屬(Trifolium)、苜蓿屬(Medicago)、梯牧草屬(Pheleum)、薦草 屬(Phalaris)、絨毛草屬(Holcus)、百脈根屬(Lotus)、車前屬(Plantago)和菊苣屬 (Cichorium)。其它優(yōu)選的植物是豆科植物。豆科植物或其部分可以包括植物科豆科 (Leguminosae)或豆科(Fabaceae)中的任何植物。例如，植物可以選自飼料豆類，包括紫花 苜蓿、三葉草；銀合歡；谷類豆類，包括豆類、小扁豆、羽扁豆、豌豆、花生、大豆；開花豆類， 包括羽扁豆，藥學(xué)上或工業(yè)上的豆類；和休耕的或綠肥豆類物種。特別優(yōu)選的屬是三葉草屬。優(yōu)選的三葉草屬物種包括白三葉草(Trifolium repens)、兔足三葉草 (Trifoliumarvense)、類三葉草(Trifolium affine)禾口 西部三葉草(Trifolium occidentale)。特別優(yōu)選的三葉草物種是白三葉草。另一個(gè)優(yōu)選的屬是苜蓿屬。優(yōu)選的苜蓿屬物種包括紫花苜蓿(Medicago sativa)和蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula) 0特別優(yōu)選的苜蓿屬物種是紫花苜蓿，通常稱為紫花苜蓿(alfalfa)。另一個(gè)優(yōu)選的屬是豆屬(Glycine)。優(yōu)選的豆屬物種包括大豆(Glycine max)和威氏大豆(Glycine wightii)(也稱 為爪哇大豆(Neonotonia wightii))。特別優(yōu)選的大豆屬物種是大豆，通常稱為大豆。特別優(yōu)選的大豆屬物種是威氏大豆，通常稱為多年生大豆。另一個(gè)優(yōu)選的屬是豇豆屬(Vigna)。優(yōu)選的豇豆屬物種包括不同地域豇豆(Vigna unguiculata)。特別優(yōu)選的豇豆屬物種是不同地域豇豆，通常稱為牛豆。另一個(gè)優(yōu)選的屬是黧豆屬(Mucana)。優(yōu)選的黧豆屬物種包括貓豆(Mucanapruniens)。特別優(yōu)選的黧豆屬物種是貓豆，通常稱為黎豆(velvetbean)。另一個(gè)優(yōu)選的屬是花生屬(Arachis)。優(yōu)選的花生屬物種包括野花生(Arachis glabrata)。特別優(yōu)選的花生屬物種是野花生，通常稱為多年生花生。另一個(gè)優(yōu)選的屬是豌豆屬(Pisum)。優(yōu)選的豌豆屬物種包括豌豆(Pisum sativum)。特別優(yōu)選的豌豆屬物種是豌豆，通常稱為豌豆(pea)。另一個(gè)優(yōu)選的屬是百脈根屬。優(yōu)選的百脈根屬物種包括百脈根(Lotus corniculatus)、長(zhǎng)柄百脈根(Lotuspedunculatus)、Lotus glabar、細(xì)葉百脈根(Lotus tenuis)禾口 大百脈根 (Lotusuliginosus)。特別優(yōu)選的百脈根屬物種是百脈根，通常稱為百脈根(Birdsfoot Trefoil).特別優(yōu)選的百脈根屬物種是無毛百脈根(Lotus glaber)，通常稱為窄葉百脈根 (Narrow-leaf Birdsfoot Trefoil)。特別優(yōu)選的百脈根屬物種是長(zhǎng)柄百脈根，通常稱為大三葉草(Big trefoil)。特別優(yōu)選的百脈根屬物種是細(xì)葉百脈根，通常稱為細(xì)三葉草(Slender trefoil)。另一個(gè)優(yōu)選的屬是蕓苔屬(Brassica)。優(yōu)選的蕓苔屬物種包括甘藍(lán)(Brassica oleracea)。特別優(yōu)選的蕓苔屬物種是甘藍(lán)，通常稱為飼料羽衣甘藍(lán)(forage kale)和卷心菜。本文使用的術(shù)語‘植物’是指整個(gè)的植物和其任何部分，可以包括但不限于在植 物生命周期中植物的所選部分，如植物的種子、嫩枝、葉、樹皮、莢、根、花、果實(shí)、莖等。優(yōu)選 的‘其部分’是葉。發(fā)明詳述在本說明書中，其中對(duì)專利說明書、其它的外部文獻(xiàn)或其它信息來源做出引用的 地方，一般是為了提供討論本發(fā)明特征的上下文的目的。除非特別地另外聲明，否則對(duì)于這 樣的外部文獻(xiàn)的引用不應(yīng)被理解為是承認(rèn)這樣的文獻(xiàn)或這樣的信息來源在任何司法管轄 范圍內(nèi)是現(xiàn)有技術(shù)或形成本領(lǐng)域中的普通公知常識(shí)的部分。本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“含有”意思是“至少含有一部分”，就是說， 當(dāng)解釋本說明書和權(quán)利要求中的包括“含有”的陳述時(shí)，在每個(gè)陳述中該術(shù)語前的特征都需 要出現(xiàn)但是其它的特征也可以出現(xiàn)。相關(guān)的術(shù)語如“含有”和“含有”以相似的方式解釋。 但是，在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，含有可以用由...組成替代。術(shù)語“MYB14多肽”是指R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子。優(yōu)選地，MYB14多肽含有具有與SEQ ID NO 14和46至M的任一個(gè)至少70%同一 性的序列。優(yōu)選地MYB14多肽含有SEQ ID NO 15的序列基序。優(yōu)選地MYB14多肽含有SEQ ID NO 17的序列基序。更優(yōu)選地MYB14多肽含有SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17的序列，但是沒有SEQ ID NO 16的序列。優(yōu)選地MYB14多肽含有具有與SEQ ID NO 14至少70%同一性的序列?！癕YB14基因”是采用標(biāo)準(zhǔn)的基因定義的編碼MYB14多肽的基因。術(shù)語“MTO轉(zhuǎn)錄因子”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語，是指一類轉(zhuǎn)錄因子，其特征為 由單個(gè)或多個(gè)不完整重復(fù)組成的結(jié)構(gòu)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“R2R3轉(zhuǎn)錄因子”或“帶有R2R3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄”是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的術(shù)語，其是指二重復(fù)類的MTO轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語‘原花青素’和‘縮合單寧’可以貫穿本說明書交換使用。本文使用的術(shù)語“序列基序”意思是一段氨基酸或核苷酸。優(yōu)選地，所述一段氨基 酸或核苷酸是連續(xù)的。關(guān)于具有“改變的產(chǎn)生”或“改變的表達(dá)”的植物的術(shù)語“改變的”意思是相對(duì)于在非轉(zhuǎn)化狀態(tài)中的相同的植物或相同類型的植物的改變。術(shù)語“改變的”可以意味增加或減少。優(yōu)選地改變是增加。多核苷酸和片段本文使用的術(shù)語“多核苷酸”意思是任何長(zhǎng)度的但優(yōu)選是至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度 的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，且包括(作為非限制性例子)基因 的編碼序列和非編碼序列、正義和反義序列互補(bǔ)物、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、前 mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA, tRNA、核酶、重組多肽、分離的和純化的天然存在的DNA或 RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。術(shù)語“多核苷酸”可以與“核苷酸分子”交換使用。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸的 順序。本發(fā)明的片段優(yōu)選含有本發(fā)明的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少30個(gè)核 苷酸，更優(yōu)選至少40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少60個(gè)連續(xù)的核苷酸。 多核苷酸序列的片段可以用于反義、基因沉默、三螺旋或核酶的技術(shù)，或作為包括在微陣列 中的引物、探針，或用于基于多核苷酸的選擇方法中。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸序列的片段含有特定多核苷酸的至少25個(gè)，更優(yōu)選至 少50個(gè)，更優(yōu)選至少75個(gè)，更優(yōu)選至少100個(gè)，更優(yōu)選至少150個(gè)，更優(yōu)選至少200個(gè)，更優(yōu) 選至少300個(gè)，更優(yōu)選至少400個(gè)，更優(yōu)選至少500個(gè)，更優(yōu)選至少600個(gè)，更優(yōu)選至少700 個(gè)，更優(yōu)選至少800個(gè)，更優(yōu)選至少900個(gè)，更優(yōu)選至少1000個(gè)連續(xù)的核苷酸。術(shù)語“引物”是指短的多核苷酸，通常具有游離的3' OH基團(tuán)，其與模板雜交并用 于起始與模板互補(bǔ)的多核苷酸的聚合。這樣的引物是優(yōu)選至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，更優(yōu) 選至少7個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)，更優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少11個(gè)，更優(yōu)選至少12個(gè)，更優(yōu) 選至少13個(gè)，更優(yōu)選至少14個(gè)，更優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少16個(gè)，更優(yōu)選至少17個(gè)，更 優(yōu)選至少18個(gè)，更優(yōu)選至少19個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。術(shù)語“探針”是指在基于雜交的分析中用于檢測(cè)與探針互補(bǔ)的多核苷酸序列的短 多核苷酸。探針可以由本文定義的多核苷酸的“片段”組成。優(yōu)選地這樣的探針是至少5 個(gè)，更優(yōu)選至少10個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)，更優(yōu)選至少30個(gè)，更優(yōu)選至少40個(gè)，更優(yōu)選至少 50個(gè)，更優(yōu)選至少100個(gè)，更優(yōu)選至少200個(gè)，更優(yōu)選至少300個(gè)，更優(yōu)選至少400個(gè)和最優(yōu) 選至少500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。多肽和片段本文使用的術(shù)語“多肽”包括任何長(zhǎng)度但是優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸的氨基酸鏈，其包 括全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，其中氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵連接。多肽可以是純化的天然產(chǎn)物或可以 部分或全部使用重組技術(shù)或合成技術(shù)產(chǎn)生。所述術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集體如二聚體 或其它的多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。多肽的“片段”是實(shí)現(xiàn)生物學(xué)活性所需的功能和/或提供多肽三維結(jié)構(gòu)的多肽的 順序。所述術(shù)語可以指能夠?qū)崿F(xiàn)上面活性的多肽、多肽的聚集體如二聚體或其它的多聚體、 融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。應(yīng)用于本文公開的多核苷酸或多肽序列的術(shù)語“分離的”用于指從其天然細(xì)胞環(huán) 境中取出的序列。分離的分子可以通過任何方法或方法的組合獲得，包括生物化學(xué)技術(shù)、重 組技術(shù)和合成技術(shù)。
關(guān)于源自特定屬或種的多核苷酸或多肽的術(shù)語“源自，，意思是序列具有與所述的 屬或種中天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸或多肽序列相同的序列。因此源自特定屬或種的所述序列可 以通過合成或重組產(chǎn)生。變體如本文所用，術(shù)語“變體”是指與具體確定的序列不同的多核苷酸或多肽的序列， 其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基被刪除、置換或添加。變體可以是天然存在的等位基 因變體或非天然存在的變體。變體可以來自相同的物種或來自其它的物種，且可以包括同 源物、旁系同源物和直系同源物。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸和多肽的變體 具有與那些本發(fā)明的多核苷酸或多肽相同或相似的生物學(xué)活性。涉及多核苷酸和多肽的術(shù) 語“變體”包括所有形式的本文定義的多核苷酸和多肽。多核苷酸變體變體多核苷酸序列優(yōu)選顯示與特定多核苷酸序列至少50%，更優(yōu)選至少51%，更 優(yōu)選至少52 %，更優(yōu)選至少53 %，更優(yōu)選至少M(fèi) %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少56 %，更 優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %，更 優(yōu)選至少62 %，更優(yōu)選至少63 %，更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %，更 優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %，更 優(yōu)選至少72 %，更優(yōu)選至少73 %，更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更 優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %，更 優(yōu)選至少82 %，更優(yōu)選至少83 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %，更 優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %，更 優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更 優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%和最優(yōu)選至少99%的同一性。同一性在特定多核苷酸序 列的至少20個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸位置， 更優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸位 置，更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷 酸位置，更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少1000個(gè) 核苷酸位置和最優(yōu)選整個(gè)長(zhǎng)度的比較窗口上找到。多核苷酸序列的同一性可以以下列方式確定。所述主題多核苷酸序列使用 bl2seq(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast 2 sequences-a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences" , FEMS Microbiol Lett. 174 247-250)中的BLASTN (來自BLAST程序組的程序，版本2. 2. 5 [Nov 2002])與候選多核苷酸 序列進(jìn)行比較，所述BLASTN可以從NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公開獲得。除 了低復(fù)雜性部分的過濾應(yīng)該關(guān)掉以外，使用blkeq的缺省參數(shù)。多核苷酸序列的同一性可以使用下列imix命令行參數(shù)檢查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn參數(shù)-F F關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇序列對(duì)的合適算法。blkeq程 序以行“同一性=”中相同核苷酸的數(shù)目和百分比二者報(bào)告序列的同一性。多核苷酸序列的同一性還可以使用整體序列比對(duì)程序在候選和主題多核苷酸 序列之間的重疊全長(zhǎng)上計(jì)算(例如Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol.Biol. 48,443-453)。Needleman-Wunsch整體比對(duì)算法的完全實(shí)現(xiàn)在EMBOSS軟件包中 的 needle 程序中可以找至Ij (Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS =TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol16, No 6. pp. 276-277),所沭稈序可以從 http: //www, hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/ 獲得。 歐洲生物信息學(xué)研究所服務(wù)器還在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/上在線提供在 兩個(gè)序列之間進(jìn)行EMBOSS-needle整體比對(duì)的工具?；蛘?，不對(duì)末端空隙進(jìn)行罰分而計(jì)算兩個(gè)序列的最佳整體比對(duì)的GAP程序可以 用于計(jì)算序列的同一性。GAP在下列文章中有描述Huang，X. (1994)On GlobalSequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。序列同一性還可以使用版本9. O的Vector NTI (其使用Clustal W算法(Thompson et al.，1994，Nucleic Acids Research 24，4876-4882))將待比較序列進(jìn)行比對(duì)，然后使 用版本 9. O 的 Vector NTI (2003 年 9 月 2 日 1994-2003 hforMax，授權(quán)給 Invitrogen) 計(jì)算比對(duì)序列之間的百分比序列同一性而計(jì)算。本發(fā)明的多核苷酸變體還包括那些與一個(gè)或多個(gè)具體確定的序列顯示相似性的 序列，其有可能保留了那些序列的功能等同性且不能被合理地預(yù)期為通過隨機(jī)機(jī)會(huì)已經(jīng)發(fā) 牛。關(guān)于多核苷酸的這樣的序列相似件可以使用可公開獲得的來自NCBI (ftp://ftD.ncbi. nih. gov/blast/)的 BLAST 程序組程序的 blkeq 程序(版本 2. 2. 5 [Nov 2002])確定。多核苷酸序列的相似性可以使用下列imix命令行參數(shù)檢查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx參數(shù)-F F關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇序列對(duì)的合適算法。該程序找 到序列間的相似性的區(qū)域，對(duì)于每個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告“E值”，所述“E值”是一個(gè)人在含有隨 機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中通過隨機(jī)可以預(yù)期見到這樣的匹配的預(yù)期次數(shù)。該數(shù)據(jù) 庫(kù)的大小在blkeq程序中缺省設(shè)置。對(duì)于遠(yuǎn)小于1的小E值，E值約是這樣的隨機(jī)匹配的 概率。當(dāng)變體多核苷酸序列與任一個(gè)具體確定的序列比較時(shí)，其優(yōu)選顯示IxKTki以下的 E值，更優(yōu)選1χ10_2°以下，更優(yōu)選1χ10_3°以下，更優(yōu)選1χ10_4°以下，更優(yōu)選1χ10_5°以下，更 優(yōu)選1x10,以下，更優(yōu)選1x10— 以下，更優(yōu)選1x10,以下，更優(yōu)選1χ10_9°以下和最優(yōu)選 IxlO-100以下的E值?；蛘?，本發(fā)明的變體多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具體確定的序列或其互補(bǔ)物雜交。術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”和其語法等同物是指多核苷酸分子在限定的溫度和 鹽濃度的條件下與靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印跡上，如Southern印跡或 Northern印跡上的靶多核苷酸分子)雜交的能力。在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交的能力可以通過 最初在較不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下雜交，然后增加嚴(yán)謹(jǐn)度至所需的嚴(yán)謹(jǐn)度而確定。關(guān)于大于約100個(gè)堿基長(zhǎng)度的多核苷酸分子，通常的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是不超過天然 雙鏈的解鏈溫度(Tm)以下的25至30°C (例如10°C )( 一般見Sambrooket al.，Eds，1987， Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold SpringHarbor Press ；Ausubel et al. , 1987, Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing)。大于 約100個(gè)堿基的多核苷酸分子的Tm可以通過公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)計(jì) ^ (Sambrook et al. , Eds,1987, Molecular Cloning, ALaboratory Manual,2nd Ed.ColdSpring Harbor Press ；Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390)。大于 100 個(gè)堿基長(zhǎng) 度的多核苷酸通常的嚴(yán)謹(jǐn)條件是以下雜交條件如在6X SSC、0. 2% SDS溶液中預(yù)洗滌；在 65°C在6X SSC、0. 2% SDS中雜交過夜；接著是在65°C在IX SSC、0. 1 % SDS中洗滌兩次，每 次30分鐘，和在65°C在0. 2X SSC,0. 1% SDS中洗滌兩次，每次30分鐘。關(guān)于具有長(zhǎng)度在100個(gè)堿基以下的多核苷酸分子，示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為Tm以下 5至10°C。平均地，長(zhǎng)度在IOObp以下的多核苷酸分子的Tm減少了約(500/寡核苷酸長(zhǎng) 度)°C。關(guān)于稱為肽核酸(PNA)的DNA 模擬物(Nielsen et al. , Science. 1991 Dec6 ； 254(5037) :1497-500), Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA雜交體的Tm值，且可以使用 Giesen et al.，Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26 (21) :5004-6 中所述的公式計(jì)算。具 有長(zhǎng)度在100個(gè)堿基以下的DNA-PNA雜交體的示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為Tm以下5至10°C。變體多核苷酸如那些在本發(fā)明的編碼待表達(dá)的蛋白質(zhì)的構(gòu)建體中的變體多核苷 酸還包括與特定的序列不同，但是作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，編碼具有與本發(fā)明多核苷 酸編碼的多肽的相似活性的多肽的多核苷酸。不改變多肽的氨基酸序列的序列改變是“沉 默變異”。除了 ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)外，其它相同氨基酸的密碼子可以通過本 領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)改變，例如在特定的宿主生物中優(yōu)化密碼子表達(dá)。還考慮到引起編碼的多肽序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸保守性置換但沒有顯著改變 其生物學(xué)活性的多核苷酸序列改變。技術(shù)人員知道用于制備表型沉默氨基酸置換的方法 (見例如 Bowie et al.，1990，Science 247，1306)。由于編碼的多肽序列中沉默變異和保守置換引起的變體多核苷酸可以使用可以 公開獲得的來自NCBI的BLAST程序組程序(版本2. 2. 5[Nov 2002]) (ftp://ftp.ncbi. nih. Rov/blast/)的blkeq程序通過先前所述的tblastx算法確定。多肽變體關(guān)于多肽的術(shù)語“變體”包括天然存在的、重組和合成產(chǎn)生的多肽。變體多肽序列 優(yōu)選顯示與本發(fā)明的序列至少50 %，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52 %，更優(yōu)選至少53 %， 更優(yōu)選至少討%，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %， 更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %，更優(yōu)選至少62 %，更優(yōu)選至少63 %， 更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %， 更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %，更優(yōu)選至少72 %，更優(yōu)選至少73 %， 更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選至少78 %， 更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %，更優(yōu)選至少82 %，更優(yōu)選至少83 %， 更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %，更優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選至少88 %， 更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %，更優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選至少93 %， 更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %和 最優(yōu)選至少99%的同一性。同一性在本發(fā)明多肽的至少20個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少50個(gè) 氨基酸位置，更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸位置和最優(yōu)選全長(zhǎng)上的比較窗口上找到。多肽序列的同一性可以以下列方式確定。使用blkeq中的BLASTP(來自BLAST 程序組程序，版本2. 2. 5 [Nov 2002])將主題多肽序列與候選多肽序列比較，所述程序可以 從NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公開獲得。除了應(yīng)該關(guān)掉低復(fù)雜性區(qū)域的過濾外，使用blkeq的缺省參數(shù)。多肽序列同一性可以使用整體序列比對(duì)程序在候選和主題多核苷酸序列之 間的重疊全長(zhǎng)上計(jì)算。上面討論的EMBOSS-needle (可以從http /www. ebi. ac. uk/ emboss/align/獲得)禾口 GAP(Huang，X. (1994)On GlobalSequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10，227-235.)也是用于計(jì)算多肽序列同一性的合適 的整體序列比對(duì)程序。序列同一性還可以使用版本9. O的Vector NTI (其使用Clustal W算法(Thompson et al.，1994，Nucleic Acids Research 24,4876-4882))通過將待比較序列進(jìn)行比對(duì)，然 后使用版本9. O的VectorNTI計(jì)算比對(duì)多肽序列之間的百分比序列同一性(2003年9月2 日 1994-2003hforMax，授權(quán)給 Invitrogen)而計(jì)算。本發(fā)明的多肽變體還包括那些與一個(gè)或多個(gè)具體確定的序列顯示相似性的序列， 其有可能保留了那些序列的功能等同性且其不能被合理地預(yù)期為通過隨機(jī)機(jī)會(huì)已經(jīng)發(fā)生。 關(guān)于多肽的這樣的序列相似件可以使用可公開獲得的來自NCBI (ftp://ftD.ncbi. nih. Rov/blast/)的BLAST程序組程序的blkeq程序(版本2. 2. 5 [Nov2002])確定。多肽序列 的相似性可以使用下列imix命令行參數(shù)檢查bl2seq-i peptideseq l_j peptideseq2_F F_p blastp當(dāng)變體多肽序列與任一個(gè)具體確定的序列比較時(shí)，其優(yōu)選顯示1χ10_6以下的E值， 更優(yōu)選lxlO—9以下，更優(yōu)選lxlO—12以下，更優(yōu)選lxlO—15以下，更優(yōu)選lxlO—18以下，更優(yōu)選 IxlO-21以下，更優(yōu)選lxl(T3°以下，更優(yōu)選lxl(T4°以下，更優(yōu)選1χ1(Γ5°以下，更優(yōu)選1x10, 以下，更優(yōu)選IxKTto以下，更優(yōu)選1x10,以下，更優(yōu)選lxl(T9°以下和最優(yōu)選1x10,°以下 的E值。參數(shù)-F F關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇序列對(duì)的合適算法。該程序找 到序列間相似性的區(qū)域，對(duì)于每個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告“Ε值”，所述“Ε值”是一個(gè)人在含有隨機(jī) 序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中通過隨機(jī)可以預(yù)期見到這樣的匹配的預(yù)期次數(shù)。對(duì)于遠(yuǎn)小 于1的小E值，E值約是這樣的隨機(jī)匹配的概率。本發(fā)明中還包括了不顯著改變所述多肽序列的生物學(xué)活性的所述多肽序列的一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸的保守性置換。技術(shù)人員知道用于制備表型沉默氨基酸置換的方法(見例 如 Bowie et al. ，1990，Science 247,1306)。構(gòu)建體、載體和其成分術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”是指通常是雙鏈DNA的可以插入另一個(gè)多核苷酸分子(插入 性多核苷酸分子)的多核苷酸分子，該另一個(gè)多核苷酸分子如但不限于cDNA分子。遺傳構(gòu) 建體可以含有包括允許轉(zhuǎn)錄插入性多核苷酸分子和可選地將轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽的所需元 件的啟動(dòng)子多核苷酸。插入性多核苷酸分子可以源自宿主細(xì)胞，或可以源自不同的細(xì)胞或 生物和/或可以是合成的或重組的多核苷酸。一旦遺傳構(gòu)建體進(jìn)入宿主細(xì)胞中，其可以整 合進(jìn)入宿主的染色體DNA中。遺傳構(gòu)建體可以與載體連接。術(shù)語“載體”是指通常是雙鏈DNA的用于將遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞中的多核 苷酸分子。載體可以能夠在至少一種另外的宿主系統(tǒng)如大腸桿菌(E.coli.)中復(fù)制。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”是指包括允許轉(zhuǎn)錄插入性多核苷酸分子和可選地將轉(zhuǎn)錄本翻 譯成多肽的所需元件的遺傳構(gòu)建體。
表達(dá)構(gòu)建體通常以5’至3’的方向含有a)在將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)入的宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，b)待表達(dá)的多核苷酸，和c)在將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)入的宿主細(xì)胞中有功能的終止子。術(shù)語“編碼區(qū)”或“開放閱讀框”(ORF)是指在合適的調(diào)控序列控制下能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈。編碼序列通過5’翻譯起始密 碼子和3’翻譯終止密碼子的存在確定。當(dāng)“編碼序列”插入遺傳構(gòu)建體時(shí)，當(dāng)其有效地與 啟動(dòng)子和終止子序列連接時(shí)，其能夠得到表達(dá)。術(shù)語“有效地連接”意思是將待表達(dá)的序列放置在包括啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元 件、暫時(shí)的調(diào)控元件、增強(qiáng)子、抑制子和終止子的調(diào)控元件的控制之下。術(shù)語“非編碼區(qū)”包括翻譯起始位點(diǎn)上游和翻譯終止位點(diǎn)下游的非翻譯序列。這 些序列還分別指5’UTR和3’UTR。這些序列可以包括轉(zhuǎn)錄起始和終止所需的元件和調(diào)控翻 譯效率所需的元件。術(shù)語“非編碼的”還包括基因組克隆中的內(nèi)含子序列。終止子是終止轉(zhuǎn)錄并在被翻譯序列下游的基因3’非翻譯末端中找到的序列。終 止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定因素，且在一些情況中發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)控功能。術(shù)語“啟動(dòng)子”是指能夠在細(xì)胞或無細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中調(diào)控或驅(qū)動(dòng)多核苷酸序列 表達(dá)的多核苷酸序列，啟動(dòng)子與所述多核苷酸序列有效地連接。啟動(dòng)子可以含有指定轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)的順式起始元件和保守盒如TATA盒和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序。分離或產(chǎn)生多核苷酸的方法本發(fā)明的多核苷酸分子可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)得到分離。 通過舉例的方式，這樣的多核苷酸可以通過使用Mullis et al.，Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, BirWiauser (通過引用并入本文)中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到 分離。本發(fā)明的多核苷酸可以使用本文定義的源自本發(fā)明多核苷酸序列的引物得到擴(kuò)增。分離本發(fā)明多核苷酸的另外方法，或本發(fā)明方法中有用的另外方法，包括使用本 文列出的所有或部分多核苷酸作為雜交探針。將標(biāo)記的多核苷酸探針雜交至固定在固體支 持物如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上的多核苷酸的技術(shù)可以用于篩選基因組。示例性的雜交 和洗滌條件是在65°C在5. OX SSC、0. 5%十二烷基硫酸鈉、IX Denhardt氏溶液中雜交20 小時(shí)；在1.0X SSCU % (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌(在55°C洗滌三次，每次20分鐘)和 可選的在60°C在0. 5X SSCU % (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌一次(20分鐘)?？梢栽?0°C 在0. IX SSCU% (w/v)十二烷基硫酸鈉的條件下進(jìn)行可選的進(jìn)一步洗滌(20分鐘)。本發(fā)明的多核苷酸片段可以通過本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，如限制性內(nèi)切酶消化、寡 核苷酸合成和PCR擴(kuò)增產(chǎn)生?？梢栽诒绢I(lǐng)域中熟知的方法中使用部分多核苷酸序列從而鑒定對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)多核 苷酸序列和/或整個(gè)基因和/或啟動(dòng)子。這樣的方法包括基于PCR的方法、5’RACE (Frohman ΜΑ, 1993,Methods Enzymol. 218 :340-56)和基于雜交的方法、基于計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫(kù)的方法。 另外，通過舉例的方式，從基于已知區(qū)域的引物起始，反向PCR允許獲得本文公開的多核苷 酸序列旁側(cè)的未知序列(Triglia et al.，1998，Nucleic Acids Res 16，8186，通過引用并 入本文)。所述方法使用幾個(gè)限制性酶在多核苷酸的已知區(qū)域中產(chǎn)生合適的片段。然后所述 片段通過分子內(nèi)連接被環(huán)化并用作PCR的模板。從已知區(qū)域中設(shè)計(jì)不同的引物。啟動(dòng)子和旁側(cè)序列還可以使用 GenomeWalkerTM試劑盒(Clontech,Mountain View, California)(根 據(jù)制造商的說明書使用)通過PCR基因組步移(genome walking)得到分離。為了完全地 組裝全長(zhǎng)克隆，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning ALaboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987)。當(dāng)從特定物種中制備轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，用序列或源自該物種的序列轉(zhuǎn)化這樣的植物 將是有益的。所述益處可以是減輕關(guān)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物中跨物種轉(zhuǎn)化的公眾關(guān)注。另外， 當(dāng)基因的下調(diào)是所需的結(jié)果時(shí)，需要的是使用與植物中的序列相同的序列(或至少是高度 相似的)，對(duì)于所述序列來說降低表達(dá)是所需的。由于這些原因以及其他原因，期望的是能 夠鑒定和分離幾個(gè)不同植物物種中特定基因的直系同源物。變體(包括直系同源物)可以 通過所述方法鑒定。鑒定變體的方法物質(zhì)的方法變體多核苷酸可以使用基于PCR的方法鑒定(Mullis et al.，Eds. 1994 ThePolymerase Chain Reaction, Birkhauser)?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的文庫(kù)篩選方法(Sambrook et al.， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press，1987)。 當(dāng)鑒定探針序列的變體時(shí)，相對(duì)于當(dāng)尋求完全序列匹配時(shí)，雜交和/或洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)度通常 將降低?；谟?jì)算機(jī)的方法多核苷酸和多肽的變體還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基于計(jì)算機(jī)的方法，使 用公開的結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)算法和序列相似性搜索工具搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)(公共結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù) 庫(kù)包括Genbank、EMBL, Swiss-Prot、PIR等)而得到鑒定。作為在線資源的例子，見例如 Nucleic Acids Res. 29 :1_10和11-16，2001。相似性搜索搜索并比對(duì)用于與待分析的序列 比較的靶序列(即查詢序列)。序列比較算法使用得分陣距給每個(gè)比對(duì)給予總得分。用于鑒定序列數(shù)據(jù)庫(kù)中變體的示例性程序家族是BLAST程序組程序(版本 2. 2. 5[Nov 2002])，其包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和 tBLASTX，其可以從(ftp:// ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)或從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館，38A樓， 8N805室，Bethesda，MD 20894，美國(guó)公開獲得。NCBI服務(wù)器還提供使用程序篩選大量可公 開獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)的工具。BLASTN將核苷酸查詢序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。 BLASTP將氨基酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。BLASTX將以所有閱讀框翻譯的 核苷酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。tBLASTN將蛋白質(zhì)查詢序列與以所有閱讀 框動(dòng)態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。tBLASTX將核苷酸查詢序列的六框翻譯物與核 苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的六框翻譯物進(jìn)行比較?？梢砸匀笔?shù)使用BLAST程序或參數(shù)可以根據(jù) 需要改變從而細(xì)化篩選。BLAST 算法家族包括 BLASTN、BLASTP 和 BLASTX 的使用在 Altschul et al.， Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402，1997 的發(fā)表物中有描述。通過用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法產(chǎn)生的查詢序列 的對(duì)一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的“命中(hits)”，比對(duì)和鑒定序列的相似部分。以序列重疊的 相似性和長(zhǎng)度的程度順序排列命中。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的命中通常代表只在查詢序列的序列長(zhǎng)度的一部分上的重疊。BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX 算法還產(chǎn)生比對(duì)的“預(yù)期”值。所述 預(yù)期值(E)表明，當(dāng)一個(gè)人搜索含有相同大小的隨機(jī)連續(xù)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，其可以隨機(jī)“預(yù) 期”見到的命中數(shù)目。預(yù)期值用作確定對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的命中是否表明真正相似性的顯著性閾值。 例如，指定給多核苷酸命中的0. 1的E值被解釋為意思是指，在被篩選的數(shù)據(jù)庫(kù)大小的數(shù)據(jù) 庫(kù)中，一個(gè)人可以在具有相似得分的序列的比對(duì)部分上簡(jiǎn)單地預(yù)期隨機(jī)見到0. 1的匹配。 對(duì)于在比對(duì)和匹配部分上具有0.01或0.01以下E值的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、 tBLASTN或tBLASTX算法在該數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)找到匹配的概率是或以下。一組相關(guān)序列的多個(gè)序列的比對(duì)可以用使用漸進(jìn)性成對(duì)比對(duì)的 CLUSTALff(Thompson, J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, Τ. J. (1994)CLUSTALff improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673-4680, http://www-iRbmc. u~strasbR. fr/BioInfo/Clustalff/ Top, html)或T-C0FFEE(Cedric Notredame,Desmond G. Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee A novelmethod for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000)302 :205-217))或 PILEUP 實(shí)現(xiàn)(Feng and Doolittle，1987，J. Mol. Evol. 25，351)。模式識(shí)別軟件應(yīng)用是可以獲得的，用于找到基序或特征序列 (signaturesequence)。例如，MEME(用于基序引出的多重Em)在一組序列中找到基序和特 征序列，和MAST (基序比對(duì)和搜索工具)使用這些基序鑒定查詢序列中相似或相同的基序。 將作為具有合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)的一系列比對(duì)和找到的基序的視覺概況提供為MAST結(jié)果。 MEME和MAST是圣地亞哥的加利福尼亞大學(xué)研發(fā)的。PR0SITE(Bairoch and Bucher,1994, Nucleic Acids Res. 22,3583 ；Hofmann etal. ,1999,Nucleic Acids Res. 27,215)是鑒定從基因組或cDNA序列中翻譯的未賦予特 征的蛋白質(zhì)功能的方法。PR0SITE數(shù)據(jù)庫(kù)(www, expasy. orR/prosite)含有生物學(xué)上重要 的模式和概貌并被設(shè)計(jì)以便其可以與合適的計(jì)算機(jī)工具一起使用從而將新序列分配至已 知的蛋白質(zhì)家族中或確定那個(gè)已知結(jié)構(gòu)域在序列中存在(Falquet et al. ,2002, Nucleic Acids Res. 30，235)。Prosearch是用給定的序列模式或特征搜索SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù) 庫(kù)的工具。變體的功能本發(fā)明的多核苷酸/多肽的功能可以使用本文提供的方法測(cè)試。特別地，參見實(shí) 施例7。制備構(gòu)建體和載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸序列和/或編碼公開的 多肽的多核苷酸，且可以用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或特別地是植物生物。本 發(fā)明的遺傳構(gòu)建體預(yù)期包括本文定義的表達(dá)構(gòu)建體。制備和使用遺傳構(gòu)建體和載體的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，且在Sambrook etal. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ；Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing, 1987)中有一般性描述。
用于制備含有構(gòu)建體和載體的宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以源自例 如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物生物。含有遺傳構(gòu)建體如表達(dá)構(gòu)建體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以用于本領(lǐng)域中熟 知的用于重組產(chǎn)生多肽的方法中(如Sambrook et al.，Molecular Cloning =A LaboratoryManual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ；Ausubel et al., Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing，1987)。這樣的方法可以包括在合 適的介質(zhì)中、在適于或有助于表達(dá)本發(fā)明多肽的條件中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然后，可以可選地 分泌進(jìn)入培養(yǎng)物中的表達(dá)的重組多肽可以通過本領(lǐng)域中熟知的方法從介質(zhì)、宿主細(xì)胞或培 養(yǎng)基中得至Ij分離(例如 Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology, Voll82, Guide to Protein Purification)。用于制備含有構(gòu)建體和載體的植物細(xì)胞和植物的方法本發(fā)明另外提供了含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞和經(jīng)修飾而改變多核苷 酸或多肽表達(dá)的植物細(xì)胞。含有這樣的細(xì)胞的植物也形成本發(fā)明的一個(gè)方面。用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物和其部分的方法在Draper et al.，1988， PlantGenetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci.Pub. Oxford, p. 365 ；Potrykus and Spangenburg,1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；禾口 Gelvin et al. ,1993, Plant Molecular Biol. Manual. KluwerAcad. Pub. Dordrecht中有描述。包括轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物的綜述在feilun andBreiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press，London 中提供。下文是公開了可以用于遺傳轉(zhuǎn)化下列植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化規(guī)程的代表性發(fā)表 物水稻(Alam et al.，1999，Plant Cell Rep. 18，572)；蘋果(Yao et al.，1995，Plant CellReports 14，407-412)；玉米(美國(guó)專利系列號(hào) 5，177，010 和 5，981，840)；小麥 (Ortizet al.，1996，Plant Cell R印.15，1996，877)；番茄(美國(guó)專利系列號(hào) 5，159，135)； 馬鈴薯(Kumar et al.，1996 Plant J. 9，821)；木薯(Li et al.，1996 Nat. Biotechnology 14,736)；萵苣(Michelmore et al.，1987，Plant Cell Rep. 6,439)；煙草(Horsch et al.， 1985，Science 227,1229)；棉花(美國(guó)專利系列號(hào) 5，846，797 和 5，004，863)；多年生黑 麥草(Bajaj et al.，2006，Plant Cell Rep. 25,651)；草(美國(guó)專利系列號(hào) 5，187，073， 6. 020，539)；歐薄荷(Niu et al.，1998，Plant Cell R印.17，165)；柑橘類植物(Pena etal. , 1995,Plant Sci. 104，183)；葛縷子(Krens et al.，1997，Plant Cell Rep, 17,39)； 香蕉(美國(guó)專利系列號(hào)5，792，935)；大豆(美國(guó)專利號(hào)5，416，011 ；5, 569,834 ；5, 824, 877 ； 5，563，04455和5，968，830)；菠蘿(美國(guó)專利系列號(hào)5，952，543)；白楊(美國(guó)專利號(hào) 4，795，855)；一般的單子葉植物(美國(guó)專利號(hào)5，591，616和6，037，522)；蕓苔(美國(guó)專利 號(hào) 5，188，958 ；5，463，174 和 5，750，871)；和谷類(美國(guó)專利號(hào) 6，074，877)；梨(Matsuda et al.，2005，Plant Cell Rep. 24(1) :45-51)；李(Ramesh et al.，2006，Plant Cell Rep.25(8) :821-8 ；Song and Sink 2005，Plant Cell Rep. 2006 ；25 (2) :117-23 ；Gonzalez Padilla et al. ,2003, Plant Cell Rep. 22(1) :38-45)；草莓(Oosumi et al. ,2006, Planta. ；223(6) :1219-30 ；Folta et al. ,2006, Planta. 2006Apr 14 ；PMID :16614818) , 瑰(Li et al. , 2003, Planta. 218(2) :226-32),懸鉤子(Grahamet al.，1995，Methods MolBiol. 1995 ；44 :129-33).三葉草(Voisey et al.，1994，PlantCell Reports 13 :309-314, 和苜蓿(Bingham, 1991,Crop Science 31:1098)。本發(fā)明還考慮到轉(zhuǎn)化其它的物種。轉(zhuǎn)化 其它物種的合適方法和規(guī)程可以在科學(xué)文獻(xiàn)中獲得。遺傳操作植物的方法可以獲得大量遺傳操作植物的對(duì)策(例如Birch，1997，Ann Rev Plant Phys PlantMol Biol，48J97)。例如，可以將對(duì)策設(shè)計(jì)為增加其中/當(dāng)多核苷酸/多肽是正常表 達(dá)的植物細(xì)胞、器官和/或特定發(fā)育階段中的多核苷酸/多肽的表達(dá)，或在/當(dāng)其不是正常 表達(dá)的細(xì)胞、組織和/或特定發(fā)育階段中時(shí)異常表達(dá)多核苷酸/多肽。還可以將對(duì)策設(shè)計(jì) 為增加對(duì)外部刺激如環(huán)境刺激應(yīng)答的多核苷酸/多肽。環(huán)境刺激可以包括環(huán)境應(yīng)激如機(jī)械 應(yīng)激(如食草動(dòng)物活動(dòng))、脫水應(yīng)激、鹽分應(yīng)激和溫度應(yīng)激。表達(dá)的多核苷酸/多肽可以源 自待轉(zhuǎn)化的植物物種或可以源自不同的植物物種?？梢詫⑥D(zhuǎn)化對(duì)策設(shè)計(jì)為減少其中/當(dāng)多核苷酸/多肽是正常表達(dá)的植物細(xì)胞、組 織或特定發(fā)育階段中的多核苷酸/多肽的表達(dá)或減少對(duì)外部刺激應(yīng)答的多核苷酸/多肽的 表達(dá)。這樣的對(duì)策被稱為基因沉默對(duì)策。在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因的遺傳構(gòu)建體通常包括用于驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)克隆的多 核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子，如本發(fā)明的啟動(dòng)子多核苷酸，終止子和檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物中遺傳構(gòu)建體 存在的選擇性標(biāo)記序列。常用于植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建體的示例性終止子包括例如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S 終止子、土壤根瘤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶或章魚堿合成酶終止 子、玉米(Zea mays) zin基因終止子、水稻(Oryza sativa) ADP葡萄糖焦磷酸化酶終止子和 馬鈴薯(Solanum tuberosum) PI-II 終止子。常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記包括給予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II基因(NPT II)、給予壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因、給予Ignite(AgrEvo)和 Basta(Hoechst)抗性的草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar基因)和給予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶基因(hpt)。還考慮到使用含有可以用于植物和植物組織中啟動(dòng)子表達(dá)分析的報(bào)告基因(表 達(dá)對(duì)于宿主而言是異源的活性的編碼序列，通常是酶活性和/或可視信號(hào)(例如熒光素酶、 GUS, GFP)的遺傳構(gòu)建體。報(bào)告基因文獻(xiàn)在 Herrera-Estrella et al.，1993，Nature 303， 209，禾口 Schrott，1995，In :Gene Transfer to Plants (Potrykus, Τ. , Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336 中有綜述。基因沉默對(duì)策可以集中于基因本身或引起編碼的多肽表達(dá)的調(diào)控元件?！罢{(diào)控元 件”在本文以最廣的可能意義使用，且包括與目的基因相互作用的其它基因。被設(shè)計(jì)為減少或沉默多核苷酸/多肽表達(dá)的遺傳構(gòu)建體可以包括多核苷酸的反 義拷貝。在這樣的構(gòu)建體中，多核苷酸被置于關(guān)于啟動(dòng)子和終止子的反義方向。通過反轉(zhuǎn)多核苷酸或多核苷酸區(qū)段獲得“反義”多核苷酸，以便產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本與基 因的mRNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)，例如5，GATCTA 3，(編碼鏈) 3，CTAGAT 5，(反義鏈)3，CUAGAU 5，mRNA5，GAUCUCG 3，反義 RNA為基因沉默設(shè)計(jì)的遺傳構(gòu)建體還可以包括反向重復(fù)。“反向重復(fù)”是其中重復(fù)的第二個(gè)一半在互補(bǔ)鏈中的重復(fù)序列，例如5，-GATCTA.........TAGATC-3，3，-CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的轉(zhuǎn)錄本可以進(jìn)行互補(bǔ)堿基配對(duì)從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。通常，在重復(fù)區(qū)之間需 要至少3^bp的間隔以允許發(fā)夾的形成。另一個(gè)沉默方法包括使用靶向與miRNA等同的轉(zhuǎn)錄本的小反義RNA (Llave etal. ,2002, Science 297,2053).明確考慮到使用對(duì)應(yīng)于本發(fā)明多核苷酸的這樣的小反義 RNA。本文使用的術(shù)語遺傳構(gòu)建體還包括小反義RNA和其它用于引起基因沉默的這樣 的多核苷酸。用本文定義的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化還可以通過稱為正義抑制的過程引起基因 沉默(例如 Napoli et al.，1990，Plant Cell 2,279 ；de Carvalho Niebel et al.，1995， Plant Cell，7，347)。在一些情況下，正義抑制可以包括整個(gè)或部分編碼序列的過表達(dá)， 但是還可以包括基因非編碼區(qū)如內(nèi)含子或5'或3’非翻譯區(qū)(UTR)的表達(dá)。嵌合的部分 正義構(gòu)建體可以用于協(xié)同地沉默多個(gè)基因(Abbott et al. ,2002, PlantPhysiol. 128(3)； 844-53 Jones et al.，1998，Planta 204:499-505)。還考慮到使用這樣的正義抑制對(duì)策 沉默與本發(fā)明啟動(dòng)子有效地連接的序列的表達(dá)。為基因沉默設(shè)計(jì)的遺傳構(gòu)建體中的多核苷酸插入物可以對(duì)應(yīng)于編碼序列和/或 非編碼序列，如啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子和/或5’或3’ UTR序列或?qū)?yīng)的基因。其它的基因沉默對(duì)策包括顯性失活(dominant negative)方法和使用核酶構(gòu)建體 (Mclntyre, 1996, Transgenic Res,5,257)。轉(zhuǎn)錄前沉默可以通過突變基因本身或其調(diào)控元件得到。這樣的突變可以包括點(diǎn)突 變、移碼、插入、刪除和置換。植物術(shù)語“植物”預(yù)期包括整個(gè)植物或植物的任何部分、植物的繁殖體和后代。本文使用的術(shù)語‘后代’是指從本發(fā)明的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物獲得的或源自本發(fā)明 的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的任何細(xì)胞、植物或其部分。因此，術(shù)語后代包括但不限于種子，從種 子、植物或其部分獲得的植物，或源自植物組織培養(yǎng)或克隆技術(shù)的植物。術(shù)語‘繁殖體’意思是可以用于有性或無性再生或繁殖的植物的任何部分，包括種 子和插條?！稗D(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”植物是指含有作為遺傳操作或轉(zhuǎn)化結(jié)果的新遺傳物質(zhì)的 植物。新遺傳物質(zhì)可以源自與獲得的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的植物相同物種的植物或源自不同的物 種。轉(zhuǎn)化的植物包括用新遺傳物質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明的植物可以生長(zhǎng)且自交或與不同的植物品系雜交，且獲得的帶有所需表型 特征的雜交體可以得到鑒定?？梢陨L(zhǎng)兩代或兩代以上。從這樣的標(biāo)準(zhǔn)培育方法獲得的植 物也形成本發(fā)明的一個(gè)部分。


本發(fā)明的另外方面將從下列僅以舉例方式給出的說明以及參考隨附的圖變得顯而易見，其中圖1顯示一般的縮合單寧途徑；圖2 (A)說明了從成熟的兔足三葉草(T. arvense)葉組織中克隆的代表TaMYBH 全長(zhǎng)cDNA序列的cDNA序列；圖2⑶說明了 TaMYB14的氨基酸翻譯物。圖3顯示了來自相同溫室條件中生長(zhǎng)的三葉草屬物種和栽培品種的不同組織中 TaMYBH的轉(zhuǎn)錄本水平。泳道1，(分子量梯度)；泳道2是白三葉草成熟葉cDNA文庫(kù)(栽 培品種Huia)；泳道3是白三葉草成熟根cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)；泳道4是白三葉草 成熟匍匐枝cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)；泳道5是白三葉草成熟花cDNA文庫(kù)(栽培品種 DCl 11)；泳道6是白三葉草新葉cDNA (栽培品種Huia)；泳道7是白三葉草成熟葉cDNA (高 花青素栽培品種Isabelle)；泳道8是兔足三葉草未成熟葉cDNA(栽培品種AZ^25)；泳道 9是兔足三葉草成熟葉cDNA(栽培品種AZ^25)；泳道10是白三葉草分生組織花cDNA(栽 培品種Huia)；泳道11是白三葉草分生組織葉cDNA(栽培品種Huia)；泳道12是白三葉草 僅分生組織毛狀體cDNA(栽培品種Huia)；泳道13是西部三葉草成熟植物(葉、根和匍匐 枝cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia))；泳道14是三葉草成熟結(jié)節(jié)cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)； 泳道15是TOPO中克隆的兔足三葉草MYB14cDNA克隆，泳道16是TOPO中克隆的兔足三葉 草MYB14基因組克隆，泳道17是西部三葉草基因組DNA ；泳道17是白三葉草基因組DNA ；泳 道17是兔足三葉草基因組DNA ；泳道20，(分子量梯度)。圖4顯示來自相同溫室條件中生長(zhǎng)的三葉草屬物種和栽培品種的不同組織中 BANYULS(A)和LAR(B)的轉(zhuǎn)錄本水平。泳道1，(分子量梯度)；泳道2是白三葉草成熟葉 cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)；泳道3是白三葉草成熟根cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)；泳道 4是白三葉草成熟匍匐枝cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia)；泳道5是白三葉草成熟花cDNA文 庫(kù)(栽培品種DC111)；泳道6是白三葉草新葉cDNA(栽培品種Huia)；泳道7是白三葉草 成熟葉cDNA(高花青素栽培品種Isabelle)；泳道8是兔足三葉草未成熟葉cDNA(栽培品 種AZ^25)；泳道9是兔足三葉草成熟葉cDNA (栽培品種AZ^25)；泳道10是白三葉草分生 組織花cDNA(栽培品種Huia)；泳道11是白三葉草分生組織葉cDNA(栽培品種Huia)；泳 道12是白三葉草僅分生組織毛狀體cDNA(栽培品種Huia)；泳道13是西部三葉草成熟植 物(葉、根和匍匐枝cDNA文庫(kù)(栽培品種Huia))；泳道14是白三葉草成熟結(jié)節(jié)cDNA文庫(kù) (栽培品種Huia)；泳道15是TOPO中克隆的兔足三葉草BAN或LAR克隆，泳道16是TOPO 中克隆的兔足三葉草BAN或LAR基因組克隆，泳道17是西部三葉草基因組DNA ；泳道17是 白三葉草基因組DNA ；泳道17是兔足三葉草基因組DNA ；泳道20，(分子量梯度)。圖5顯示了轉(zhuǎn)化的白三葉草成熟葉組織的DMACA染色結(jié)果。成熟白三葉草葉組織 的DMACA染色(淺/深灰色)鑒定了㈧野生型和⑶用TaMYBH基因轉(zhuǎn)化的植物中的縮 合單寧。圖6顯示了用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體M14ApHZBarP。E1、E2和E3表明了基因組等 位基因TaMYBH-I的3個(gè)外顯子。圖7顯示了三葉草MYB14、最高的BLASTN命中和AtTT2的全長(zhǎng)cDNA序列的比對(duì)， 相似性用淺灰突出顯示。圖8顯示了兔足三葉草TaMYB14、最高的BLASTP命中和AtTT2的翻譯的開放閱讀框的比對(duì)，相似性用淺灰突出顯示，基序用線框框出。圖 9 顯示了 TaMYB14 (表達(dá)的 TaMYBHFiTa 和沉默的 TaMYB14_2S) ,ToMYB 14 等位基 因和TrMYBH等位基因的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列的比對(duì)，區(qū)別處用深灰/白色區(qū)域突出顯示，刪除 /插入?yún)^(qū)用線框突出顯示。圖10顯示了與兔足三葉草TaMYB14等位基因(TaM3、TaM4)比對(duì)的白三葉草 TrMYBH等位基因(TRM*)的全長(zhǎng)基因組DNA序列的比對(duì)，突出顯示了外顯子(淺灰)和內(nèi) 含子(深灰)中的區(qū)別之處。圖11顯示了與兔足三葉草TaMYB14等位基因(TaM3、TaM4)比對(duì)的西部三葉草 ToMYBH等位基因(Tol、To6)的全長(zhǎng)基因組DNA序列的比對(duì)，突出顯示了外顯子(淺灰)和 內(nèi)含子(深灰)中的區(qū)別之處。圖12顯示了兔足三葉草TaMYB14等位基因(Ta*)和類三葉草TafMYBH等位基因 (Taf*)的全長(zhǎng)基因組DNA序列的比對(duì)，外顯子(淺灰)和內(nèi)含子(深灰)顯示出區(qū)別。圖13顯示含有來自MYB14pHANNIBAL的NotI片段的構(gòu)建體pHZbarSMYB的Vector NTI圖，所述構(gòu)建體含有在pdk內(nèi)含子旁側(cè)的正義(SMYB14F)和反義(SMYB14R)方向的來自 兔足三葉草的TaMYBHcDNA區(qū)段。圖14顯示了用于檢測(cè)來自從推定轉(zhuǎn)化的白三葉草中分離的基因組DNA的 M14ApHZBAR存在的PCR反應(yīng)。泳道；Al、Bl為分子量梯度；A2-18和B2-B15為轉(zhuǎn)化的三葉 草，B16為非轉(zhuǎn)化的白三葉草，B17為質(zhì)粒對(duì)照，B18為水對(duì)照。引物是擴(kuò)增1244bp片段的 35S(啟動(dòng)子)和PMYBR(到基因的3’末端)。圖15顯示了野生型㈧和用TaMYB14構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因(B至D)白三葉草葉 的DMACA篩選結(jié)果。圖16顯示了表達(dá)TaMybHA基因的DMACA染色的轉(zhuǎn)基因小葉的香毛簇(E-G)、表皮 細(xì)胞(H)和葉肉細(xì)胞(I-K)的油鏡照片。圖17顯示了葡萄種子提取物單體-葡萄種子提取物中單體的SRM色譜顯示在下 面。跡線(1^ ^^是四1.3111/^的5冊(cè)的產(chǎn)物離子123、139和165m/z的總和(兒茶精(C) 和表兒茶精(EC))。跡線B是307. 3m/z的SRM的產(chǎn)物離子139和151m/z的總和(沒食子 兒茶精(GC)和表沒食子兒茶精(EGC))。圖18顯示了葡萄種子提取物二聚體和三聚體。葡萄種子提取物中二聚體和三聚 體的SRM色譜顯示在下面。跡線A是579. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子291、409和427m/z的總和 (PC PC 二聚體)。跡線B是595. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、307、427和443m/z的總和 (PC PD 二聚體)。跡線C是867. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子291、577和579m/z的總和(3PC 三聚體)。提供了 PC PC 二聚體、PC PD 二聚體和兩個(gè)3PC三聚體的MS2譜作為鑒定中 心代謝產(chǎn)物的證據(jù)。圖19顯示了對(duì)照(白三葉草_ve)和表達(dá)MYB14的轉(zhuǎn)基因(白三葉草+ve)植物 的單體的SRM色譜顯示在下面。跡線4是四1.3111/2 SRM的產(chǎn)物離子123、139和165m/z的 總和(PC ；兒茶精和表兒茶精)。跡線B是307. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子139和151m/z的總 和(PD ；沒食子兒茶精和表沒食子兒茶精)。固定色譜比例從而顯示修飾的植物中單體的出 現(xiàn)。在對(duì)照植物中沒有檢測(cè)到單體。從修飾的植物中提供表兒茶精(EC)和表沒食子兒茶 精(EGC)的MS2譜，作為鑒定這些代謝產(chǎn)物的證據(jù)。
圖20顯示了對(duì)照(白三葉草_ve)和表達(dá)MYB14的轉(zhuǎn)基因(白三葉草+ve)植物 的二聚體的SRM色譜顯示在下面。跡線A是579. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子291、409和427m/ ζ的總和(PC PC 二聚體)。跡線B是595. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、307、427和443m/ ζ的總和(PC PD 二聚體)。跡線C是611. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子307和443m/z的總和 (PD PD 二聚體))。固定色譜比例從而顯示修飾的植物中二聚體的出現(xiàn)。在對(duì)照植物中 沒有檢測(cè)到二聚體。從修飾的植物中提供3個(gè)PD PD 二聚體(1- 和一個(gè)PC PD混合 的二聚體的MS2譜，作為鑒定這些代謝產(chǎn)物的證據(jù)。圖21顯示了對(duì)照(白三葉草-ve)和表達(dá)MYB14的轉(zhuǎn)基因(白三葉草+ye)植物 的三聚體的SRM色譜顯示在下面。跡線A是867. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、577和579m/ ζ的總和(3PC三聚體)。跡線B是883. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、307、427、443、577、579、 593、595和757m/z的總和(PC PD 二聚體)。跡線C是899. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、 307、443、593、595、611、731、757 和 773m/z 的總和(IPC 2PD 三聚體)。跡線 D 是 915. 3m/ ζ SRM的產(chǎn)物離子307、443、609、611、747、773和789m/z的總和(3PD三聚體)。固定色譜 比例從而顯示修飾的植物中三聚體的出現(xiàn)。在對(duì)照植物中沒有檢測(cè)到三聚體。從修飾的植 物中提供3PD三聚體和IPC 2PD混合的三聚體的MS2譜，作為鑒定這些代謝產(chǎn)物的證據(jù)。圖22顯示了用于檢測(cè)來自從推定轉(zhuǎn)化的煙草小植物中分離的基因組DNA的 M14ApHZBAR存在的PCR反應(yīng)。泳道；Al是分子量梯度；A2-10是轉(zhuǎn)化的煙草，A13U4是煙 草對(duì)照，A15是質(zhì)粒對(duì)照。弓丨物是擴(kuò)增1244bp片段的35S(啟動(dòng)子)和PMYBR(到基因的3’ 末端)O圖23顯示了用M14ApHZBAR構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因(Α至G)煙草 (Nicotianatabacum)葉的 DMACA 篩選結(jié)果。圖M顯示了對(duì)照(野生型)和表達(dá)MYB14的修飾的(轉(zhuǎn)基因)植物的SRM色譜顯 示在下面。跡線々是四1. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子123、139和165m/z的總和(PC ；兒茶精和表 兒茶精)。跡線B是307. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子139和151m/z的總和(PD 沒食子兒茶精和 表沒食子兒茶精)。跡線C是579. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、409和427m/z的總和(PC PC 二聚體)。跡線D是867. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子四1、577和579m/z的總和(PC PC PC 三聚體(timer))。固定色譜比例從而顯示修飾的植物中單體、二聚體和三聚體的出現(xiàn)。注 意，沒有檢測(cè)到混合的PC PD或100% PD 二聚體或三聚體。圖25顯示了表兒茶精(EC)、沒食子兒茶精(GC)、表沒食子兒茶精(EGC)的MS2譜， 從表達(dá)MYB14的修飾的(轉(zhuǎn)基因)植物中提供PC PC 二聚體1和2以及PC PC PC 三聚體，作為鑒定這些代謝產(chǎn)物的證據(jù)。圖沈顯示了用于檢測(cè)M14pHANNIBAL在基因組DNA(從推定轉(zhuǎn)化的兔足三葉草中 分離)中存在的PCR反應(yīng)。泳道；Al是pHANNIBAL 陰性對(duì)照載體，A2是含有35S和基因組基 因構(gòu)建體的M14ApHZBAR-擴(kuò)增1244bp片段的對(duì)照；A3是含有hpRNA構(gòu)建體的M14pHANNIBAL 陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，A4是含有0CS終止子上游的反義方向的MYB片段的pHANNIBAL (陰性對(duì)照)， A5是pHZBARSMYB陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，A6是分子量梯度，A7-18是轉(zhuǎn)化的兔足三葉草，A19是基 因組DNA野生型兔足三葉草，A20是水對(duì)照。B =Bl是分子量梯度，B2-B11是轉(zhuǎn)化的兔足三葉草，B12是M14pHANNIBAL陽(yáng)性質(zhì)粒 對(duì)照。引物是擴(kuò)增393bp片段的35S(啟動(dòng)子)和PHMYBR(到基因的3’末端)。
圖27顯示了野生型兔足三葉草愈傷組織(A)和在組織培養(yǎng)基上再生的小植物(B 至D)的DMACA篩選結(jié)果。在愈傷組織中和在組織培養(yǎng)基上再生的轉(zhuǎn)基因(E至L)兔足三 葉草小植物的DMACA篩選中沒有DMACA染色出現(xiàn)。與野生型植物相比，染色極大地減少了。圖28顯示了兔足三葉草對(duì)照和敲除植物的四個(gè)單體SRM色譜。跡線A是對(duì)照植 物291. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子123、139和165m/z的總和(PC ；兒茶精和表兒茶精)。B是敲 除植物291. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子123、139和165m/z的總和(PC ；兒茶精和表兒茶精)。C 是對(duì)照植物307. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子139和151m/z的總和(PD ；沒食子兒茶精和表沒食 子兒茶精)。D是敲除植物307. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子139和151m/z的總和(PD ；沒食子兒 茶精和表沒食子兒茶精)。從對(duì)照植物中提供MS2譜，作為兒茶精和沒食子兒茶精在對(duì)照植 物中的證據(jù)。固定跡線A、B、C和D的色譜比例從而顯示兒茶精和沒食子兒茶精在敲除植物 中的消失。圖四顯示了對(duì)照和敲除的兔足三葉草植物的二聚體SRM色譜。跡線A是579. 3m/ ζ SRM的產(chǎn)物離子291和427m/z的總和(PC PC 二聚體)。跡線B是595. 3m/z SRM的產(chǎn) 物離子307、427和443m/z的總和(PC PD 二聚體)。跡線C是611.3m/z SRM的產(chǎn)物離子 307和443m/z的總和(PD PD 二聚體)。固定色譜的比例從而顯示二聚體在敲除植物中 的消失。從對(duì)照植物中提供MS2譜，作為所有三種類型的二聚體在對(duì)照中的證據(jù)。圖30顯示了用于檢測(cè)來自從推定轉(zhuǎn)化的紫花苜蓿中分離的基因組DNA的 PTaMybHA存在的PCR分析。泳道L ；分子量梯度；1_3是非轉(zhuǎn)化的，4_10是轉(zhuǎn)化的，11是野 生型，12是水對(duì)照，13是質(zhì)粒對(duì)照。引物是35S和PMYBR(到基因的3’末端)。圖31顯示了用于檢測(cè)來自從推定轉(zhuǎn)化的蕓苔小植物中分離的基因組DNA的 M14ApHZBAR存在的PCR分析。泳道8是蕓苔對(duì)照；泳道18是分子量梯度；泳道1_7和9_17 是轉(zhuǎn)化的蕓苔。引物是擴(kuò)增1244bp片段的35S(啟動(dòng)子)和PMYBR(到基因的3’末端)。圖 32 顯示了野生型蕓苔(甘藍(lán)(Brassica oleracea)) (A)和用 M14ApHZBARP 構(gòu) 建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因(B至D)葉的DMACA篩選結(jié)果。圖33顯示了兩種對(duì)照和表達(dá)MYB14的轉(zhuǎn)基因蕓苔中四1. 3m/z SRM的產(chǎn)物離子 123、139和165m/z的SRM色譜(兒茶精(C)和表兒茶精(EC))。提供了在綠色對(duì)照和轉(zhuǎn)基 因+ve樣品中檢測(cè)到的表兒茶精的MS2譜，作為鑒定這些代謝產(chǎn)物的證據(jù)。在紅色對(duì)照樣 品中沒有檢測(cè)到表兒茶精。圖34顯示了由申請(qǐng)人鑒定的所有三葉草MYB14蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。圖35顯示了圖34中比對(duì)的序列間的百分比同一性。序列表的簡(jiǎn)單描述
權(quán)利要求
1.一種編碼如本文定義的MYB14多肽的分離的核酸分子或其功能片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽含有具有與SEQIDNO 14 和46至M中任一個(gè)至少70%同一性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽含有具有與SEQIDNO 14 至少70%同一性的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽含有SEQID N0:14和46 至討中任一個(gè)的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中MYB14多肽含有SEQID N0:15和SEQ ID NO 17的序列，但是沒有SEQ ID NO 16的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽含有SEQID NO 14的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽調(diào)控植物中黃 酮類的產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的多核苷酸，其中黃酮類是縮合單寧。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽調(diào)控植物中黃 酮類生物合成途徑中的至少一個(gè)基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽調(diào)控植物中縮 合單寧生物合成途徑中的至少一個(gè)基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽或其功能片 段含有具有與SEQ ID NO: 17至少70%同一性的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的分離的多核苷酸，其中MYB14多肽或其功能片 段含有SEQ ID NO 17的氨基酸序列。
13.一種分離的具有選自下列核苷酸序列的核苷酸序列的核酸分子a)SEQ ID NO :1至13和55至64中的至少一個(gè)或其組合；b)a)中序列的互補(bǔ)物；c)a)或b)中序列的功能片段或變體；d)a)、b)或c)中序列的同源物或直系同源物；e)從a)、b)、c)或d)中序列獲得的RNA序列的反義序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的核酸分子，其中變體具有與特定序列至少70%的同一性。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自a)SEQID NO :1、2 或 55 ；b)a)中序列的互補(bǔ)物；c)a)或b)中序列的功能片段或變體；d)a)、b)或c)中序列的同源物或直系同源物；e)從a)、b)、c)或d)中序列獲得的RNA序列的反義序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中變體具有與特定序列至少70%的同一性。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中含有SEQID NO :1的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中含有SEQID NO :2的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中含有SEQID N0:55的序列。
20.一種能夠與權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述的核酸分子或其互補(bǔ)物結(jié)合的探針。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的探針，其能夠在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與特定的序列結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的探針，其能夠與編碼如SEQID N0:17中列出的3’序 列基序的核酸結(jié)合。
23.一種能夠與根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)所述的核酸分子或其互補(bǔ)物結(jié)合的引物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的引物，其能夠在PCR條件下與特定的序列結(jié)合。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或M所述的引物，其能夠與編碼如SEQID N0:17中列出的3’序 列基序的核酸結(jié)合。
26.—種如本文定義的分離的MYB14多肽或其功能片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的MYB14多肽，其含有SEQID N0:15和SEQ IDNO 17的序 列，但是沒有SEQ ID NO 16的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的分離的多肽，具有選自下列氨基酸序列的氨基酸序列a)SEQ ID NO :14和46至M中的任一個(gè)；或b)列在a)中的序列的功能片段或變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的分離的多肽，其中變體含有具有與SEQID N0:14和46至 54中任一個(gè)至少70%同一性的序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的分離的多肽，其中變體含有具有與SEQID N0:14至少70% 同一性的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的分離的多肽，其中MYB14多肽含有SEQID NO 14和46至 54中任一個(gè)的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的分離的多肽，其中MYB14多肽含有SEQID NO 14的序列。
33.一種由權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的核酸分子編碼的分離的多肽。
34.一種含有編碼權(quán)利要求沈至33中任一項(xiàng)的多肽的序列的分離的核酸分子。
35.一種包括基本上如權(quán)利要求1至19或34中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列的構(gòu)建體。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的構(gòu)建體，其包括-至少一個(gè)啟動(dòng)子；和-核酸分子；其中啟動(dòng)子與核酸分子有效地連接從而控制核酸分子的表達(dá)。
37.一種從野生型改變而來從而包括基本上如權(quán)利要求1至19或34中任一項(xiàng)所述的 核酸分子的宿主細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞，其中核酸是權(quán)利要求33或34所述的遺傳構(gòu)建 體的部分。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
40.一種用基本上如權(quán)利要求1至19或34中任一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞 或植物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物的植物細(xì)胞，其中核酸是權(quán)利要求35或36所述的遺 傳構(gòu)建體的部分。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的植物的種子。
43.一種包括是或獲自權(quán)利要求40或41所述的植物或其部分的成分的組合物。
44.一種基本上如權(quán)利要求1至19或34中任一項(xiàng)所述的核酸分子用于改變植物或植 物細(xì)胞的用途。
45.一種使用基本上如權(quán)利要求1至19或34中任一項(xiàng)所述的核酸分子來改變植物或 植物細(xì)胞從而產(chǎn)生改變的植物或植物細(xì)胞的方法。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途或根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中改變了植物或植 物細(xì)胞中黃酮類的產(chǎn)生或黃酮類產(chǎn)生中的中間體的產(chǎn)生。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途或方法，其中黃酮類包括至少一種縮合單寧或其單體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途或方法，其中縮合單寧選自兒茶精、表兒茶精、表沒食 子兒茶精或沒食子兒茶精。
49.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途或根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中改變了植物或植 物細(xì)胞中黃酮類生物合成途徑中至少一種酶的表達(dá)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的用途或方法，其中改變了植物或植物細(xì)胞中縮合單寧生物 合成途徑中至少一種酶的表達(dá)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途或方法，其中所述酶是LAR和/或ANR。
52.根據(jù)權(quán)利要求46至51中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中改變的產(chǎn)生或表達(dá)是增加 的產(chǎn)生或表達(dá)。
53.根據(jù)權(quán)利要求44至52中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中植物是飼料作物植物或者 植物細(xì)胞是飼料作物植物細(xì)胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求44至53中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中植物是豆科植物或者植物 細(xì)胞是豆科植物細(xì)胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中改變的產(chǎn)生或表達(dá)基本上 是在所有的植物組織中。
56.根據(jù)權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中改變的產(chǎn)生或表達(dá)是在植 物的葉組織中。
57.根據(jù)權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中改變的產(chǎn)生或表達(dá)是在植 物的營(yíng)養(yǎng)部分中。
58.根據(jù)權(quán)利要求44至M中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中改變的產(chǎn)生或表達(dá)是在植 物的表皮組織中。
59.根據(jù)權(quán)利要求44至55中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中黃酮類或縮合單寧改變的 產(chǎn)生是在基本上沒有黃酮類或縮合單寧的植物的組織中。
60.根據(jù)權(quán)利要求44至59中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中通過用核酸或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 植物而改變植物。
61.根據(jù)權(quán)利要求44至60中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中通過操作植物的基因組改 變植物從而在植物或其部分中表達(dá)相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物或其植物中產(chǎn)生的核酸而言 增加水平的或減少水平的核酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求44至61中任一項(xiàng)所述的用途或方法，其中利用本發(fā)明改變的黃酮類和/或縮合單寧的水平足以提供治療的或農(nóng)業(yè)的益處。
63.一種根據(jù)權(quán)利要求45至62中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求40、41和63中任一項(xiàng)所述的植物的部分、種子、果實(shí)、收獲的材 料、繁殖體或后代。
65.根據(jù)權(quán)利要求34所述的植物的部分、種子、果實(shí)、收獲的材料、繁殖體或后代，其經(jīng) 遺傳修飾從而含有權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的至少一種核酸分子或權(quán)利要求35或36 所述的構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明提供了由申請(qǐng)人指定為MYB14的新的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因(核酸序列、蛋白質(zhì)序列和其變體和片段)，其可以用于操作植物中黃酮類特別是縮合單寧的產(chǎn)生。本發(fā)明提供了編碼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)具有與SEQ IDNO14和46至54的MYB14多肽序列的任一個(gè)的至少70％的同一性。本發(fā)明還提供了經(jīng)遺傳修飾從而含有多核苷酸的構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生具有改變的黃酮類特別是縮合單寧產(chǎn)生的植物的方法，通過使用本發(fā)明的MYB14核酸分子。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102124111SQ200980129156
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者K·R·漢考克, M·格雷格 申請(qǐng)人:格拉斯蘭茲技術(shù)有限公司