專利名稱：確定細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性的制作方法
確定細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于確定細(xì)胞對(duì)核苷類似物藥物的敏感性的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
急性髓性白血病(AML)這一術(shù)語(yǔ)用于定義由于髓前體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的一系列各種癥狀的血液疾病。轉(zhuǎn)化導(dǎo)致血液和骨髓中的未成熟和未分化細(xì)胞的增殖，并抑制正常的造血作用。對(duì)于AML患者的有效治療目前仍是一個(gè)難題，臨床結(jié)果經(jīng)常難以預(yù)料和令人失望。僅有70%的新確診并接受標(biāo)準(zhǔn)治療方案的患者對(duì)于治療有所反應(yīng)。而且，這些患者中還有一大部分不能獲得長(zhǎng)期緩解，并發(fā)展出對(duì)于后續(xù)治療的抗性。核苷類似物(NA)是一類廣泛用于治療某些癌癥和病毒感染的抗代謝藥物。這類化合物在結(jié)構(gòu)上與體內(nèi)的天然核苷相似，并且服從于相同的攝取和代謝機(jī)制，這使得它們被摻入到新合成的DNA中。這種DNA的摻雜導(dǎo)致DNA合成的抑制和鏈終止，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。NA是需要被磷酸化為三磷酸形式才能形成有活性的核苷酸的前藥。某些NA并不直接破壞DNA的復(fù)制。例如抗皰疹藥物阿昔洛韋，它在被細(xì)胞攝取和磷酸化之后通過(guò)抑制DNA 聚合酶而破壞DNA的復(fù)制。核苷類似物阿糖胞苷(Ara-C)是一種活性最強(qiáng)的單一抗癌藥劑，已經(jīng)作為治療 AML的主要療法被應(yīng)用了三十年以上。Ara-C在體內(nèi)通過(guò)特異性的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白hENTl被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，并迅速地被dCK磷酸化為其單磷酸形式。Ara-CMP被核苷激酶進(jìn)一步磷酸化為其有活性的三磷酸形式Ara-CTP。Ara-CTP的抗增殖作用和細(xì)胞毒性作用是由于其能夠干擾DNA聚合酶，并摻入至DNA鏈中，導(dǎo)致鏈終止和DNA合成的停止。高劑量Ara-C還可以導(dǎo)致細(xì)胞色素C在細(xì)胞溶質(zhì)中的累積、線粒體膜功能的喪失和活性氧分子(reactive oxygen species)的增加。對(duì)Ara-C的化學(xué)抗性可能來(lái)自于多種影響Ara-CTP形成及其摻入DNA的水平的因素，所述因素包括低藥物攝取、被胞苷脫氨酶轉(zhuǎn)化為Ara-U或者活性代謝物被胞質(zhì)核苷酶脫磷酸化等。對(duì)核苷類似物藥物的抗性的基本機(jī)制為由于NA的不充分的三磷酸化。這一結(jié)果的主要原因是由于磷酸化酶(例如dCK)的水平降低、細(xì)胞攝取的效率不夠高(例如hENTl 的水平降低)、NA降解酶(特別是胞苷脫氨酶cdd)的水平增高、以及三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)總量的增加。脫氧核糖核苷激酶(dNK)水平也被認(rèn)為在藥物抗性中起重要作用。Ara-C對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)沒(méi)有作用，因?yàn)榇竽c桿菌沒(méi)有dCK，并且可通過(guò)脫氧胞苷脫氨酶(cdd)將Ara-C脫氨基而形成Ara-尿嘧啶。Wang et al.，Antimicrob. Agents. Chemother.，1998,42 丨620-2625 描述了 cdd缺陷型 E. coli 突變體(S05218)的構(gòu)建，該突變體通過(guò)表達(dá)人類dCK基因而在Ara-C的存在下表現(xiàn)出相對(duì)減少的生長(zhǎng)。當(dāng)在不存在可被dCK誘導(dǎo)的促進(jìn)物IPTG的條件下檢測(cè)時(shí)，Ara-C對(duì)于生長(zhǎng)的作用完全消失，這表明在細(xì)菌中人類dCK的表達(dá)導(dǎo)致Ara-CTP摻入至細(xì)菌DNA中。在傳統(tǒng)上，Ara-C效力的體外評(píng)估包括檢測(cè)a)細(xì)胞死亡，b) S期活性的降低，或c) 在使白細(xì)胞瘤細(xì)胞接觸Ara-C后使用AML克隆形成測(cè)定。這些方法均為非標(biāo)準(zhǔn)化方法，并且費(fèi)時(shí)而昂貴，并不適用于常規(guī)篩選。因此，在使用包括Ara-C的治療方案對(duì)患者進(jìn)行治療時(shí)并不會(huì)考慮患者對(duì)于藥物的敏感性，患者可能受到令人虛弱的副作用的影響，所述副作用例如骨髓抑制、惡心、腹瀉、嘔吐以及發(fā)展出具有抗藥性的繼發(fā)性癌癥。因此，需要簡(jiǎn)便、快速的預(yù)篩選測(cè)試方法來(lái)確定患者中核苷類似物藥物的效力。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于確定細(xì)胞對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性或敏感性的方法和試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于在體外確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性或敏感性的方法，所述方法包括下述步驟(i)用脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物處理患者樣本或細(xì)胞系或其部分；(ii)裂解來(lái)自步驟(i)中的患者樣本或細(xì)胞系中的細(xì)胞；(iii)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌和脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物混合；(iv)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑混合；(ν)任選地，將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌混合；以及(vi)檢測(cè)步驟(iii)、(iv)和任選地步驟(ν)的每一步的混合物的生物發(fā)光，其中每一混合物的比較的生物發(fā)光水平提供了對(duì)所述藥物的抗性或敏感性的量度。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性或敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了脫磷酸化劑、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和引入脫氧核糖核苷激酶基因的生物發(fā)光性報(bào)告物用于在離體條件下確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)能被脫氧核糖核苷激酶磷酸化的藥物的抗性或敏感性的用途。


參照附圖對(duì)本發(fā)明作了描述，其中 圖1為顯示生物發(fā)光性細(xì)菌生物傳感器對(duì)Ara-C的反應(yīng)的示意圖；圖(A)對(duì)應(yīng)的是通過(guò)0D600檢測(cè)的生長(zhǎng)水平，圖(B)對(duì)應(yīng)的是以相對(duì)光單位(RLU)檢測(cè)的相同培養(yǎng)物中的發(fā)光水平； 圖2為顯示生物發(fā)光性生物傳感器對(duì)低濃度Ara-C的反應(yīng)的示意圖； 圖3為顯示生物傳感器對(duì)Ara-CTP的反應(yīng)的示意圖。圖(A)對(duì)應(yīng)的是細(xì)菌生物傳感器對(duì)以不同濃度添加的Ara-CTP的反應(yīng)。圖(B)對(duì)應(yīng)的是細(xì)菌生物傳感器對(duì)于在測(cè)定開(kāi)始時(shí)加入BAP、隨后又加入不同濃度的Ara-CTP的反應(yīng)； 圖4為使用生物發(fā)光性細(xì)菌生物傳感器進(jìn)行細(xì)胞裂解測(cè)定的示意圖，顯示了對(duì) Ara-C的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)； 圖5為顯示四種治療應(yīng)答曲線的示意圖； 圖6顯示了 Ara-C敏感性KGl_a細(xì)胞對(duì)25 μ M的Ara-C和對(duì)對(duì)照的反應(yīng)；以及 圖7的兩幅圖顯示了 25 μ M的Ara-C對(duì)于來(lái)自Ara-C反應(yīng)性AML患者的外周血樣 (圖(C))和來(lái)自Ara-C抗性AML患者的外周血樣(圖(D))的效果。
發(fā)明的詳細(xì)描述 本發(fā)明提供了用于快速確定患者細(xì)胞樣本或細(xì)胞系對(duì)于抗癌藥物和抗病毒藥物的抗性或敏感性的方法。所述方法使用了對(duì)核苷類似物(NA)藥物敏感的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌，所述核苷類似物(NA)藥物依賴于脫氧核糖核苷激酶(dNK)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)磷酸化。
本發(fā)明涉及細(xì)胞裂解測(cè)定，所述測(cè)定使用生物發(fā)光性細(xì)菌作為藥物活性的報(bào)告物，并對(duì)篩選對(duì)dNK磷酸化依賴性NA藥物具有敏感性的病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞的用途具有顯著的潛在價(jià)值。所述測(cè)定適于用作藥物治療開(kāi)始之前對(duì)臨床樣本的預(yù)篩選和用作減量療法效力的指示。此外，所述測(cè)定可以重復(fù)地用于癌癥復(fù)發(fā)的患者，以確定腫瘤是否經(jīng)過(guò)無(wú)性進(jìn)化，以及是否能夠使用所述藥物獲得第二次的完全康復(fù)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，將生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌與經(jīng)過(guò)藥物處理的細(xì)胞裂解物混合，并檢測(cè)由細(xì)菌發(fā)出的生物發(fā)光，從而確定細(xì)胞對(duì)所述藥物的敏感性。脫氧胞苷脫氨酶 (cdd)-缺陷型細(xì)菌對(duì)核苷類似物藥物具有敏感性，并且當(dāng)它們存在時(shí)表現(xiàn)出生物發(fā)光的增加。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物發(fā)光”指的是在存在分子氧(O2)和能量(NADH)的條件下， 通過(guò)熒光素酶的催化，在活生物體內(nèi)由于有機(jī)化合物(熒光素)的氧化而產(chǎn)生可見(jiàn)光。發(fā)光的能力依賴于生物體的還原能力，因此只有有代謝活性的細(xì)菌才能產(chǎn)生光。
生物發(fā)光表型可以是內(nèi)源性的，或者也可以通過(guò)例如引入并在組成型啟動(dòng)子控制下表達(dá)分離自發(fā)冷光桿菌(Photorhabdus luminescens)的IuxCDABE操縱子，而使大多數(shù)細(xì)菌具有生物發(fā)光表型。生物發(fā)光性細(xì)菌不需要外源性底物，并能夠發(fā)光而作為細(xì)菌實(shí)時(shí)生理狀態(tài)的直接指示。
低于0. 05 μ m的NA藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度，可以通過(guò)生物發(fā)光性細(xì)菌光輸出的顯著增高而被檢測(cè)出來(lái)，這一技術(shù)適用于在8小時(shí)或更短的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)臨床NA劑量范圍的反應(yīng)進(jìn)行定量。
本發(fā)明的細(xì)菌可為對(duì)NA藥物敏感并表達(dá)能賦予生物發(fā)光表型的內(nèi)源性或外源性基因的任何細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌不能使胞嘧啶脫氨生成尿嘧啶，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌不表達(dá)脫氧胞苷脫氨酶(cdd)。所述細(xì)菌優(yōu)選地為E. coli，更優(yōu)選地為E. coli MG 1655。MG 1655是野生型E. coli K-12衍生菌株。野生型MG 1655表達(dá)脫氧胞苷脫氨酶。因此，本發(fā)明的最優(yōu)選的細(xì)菌為脫氧胞苷脫氨酶(cdd)-缺陷型的E. coli MG 1655菌株。這種菌株保藏于NCTC，保藏號(hào)為No. 13427。
本發(fā)明的方法在體外進(jìn)行，即在患者體外進(jìn)行。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“患者細(xì)胞樣本”指的是分離自患者的細(xì)胞。所述細(xì)胞樣本的細(xì)胞應(yīng)典型地為癌性細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞，例如急性髓性白血病細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“患者”指的是哺乳動(dòng)物，包括非靈長(zhǎng)類(例如牛、豬、馬、貓、大鼠和小鼠)和靈長(zhǎng)類(例如猿猴和人)動(dòng)物，更優(yōu)選地為人。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述樣本材料為骨髓或獲自外周血的白細(xì)胞，可通過(guò)例如常規(guī)的放血技術(shù)獲得。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”指的是永生化的離體細(xì)胞培養(yǎng)物。所述細(xì)胞系中的細(xì)胞應(yīng)典型地為癌性細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞，例如急性髓性白血病細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“未處理的對(duì)照細(xì)胞”指的是未經(jīng)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物處理的患者細(xì)胞樣本或細(xì)胞系中的細(xì)胞。
本發(fā)明的方法和試劑盒可用于確定對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物即應(yīng)用脫氧核糖核苷激酶(dNK)途徑的NA藥物的抗性或敏感性。表1提供了抗病毒藥物和抗癌藥物實(shí)例的非窮舉列表，它們的作用機(jī)機(jī)理均依賴于通過(guò)dNK進(jìn)行的磷酸化。
表 1
權(quán)利要求
1.在體外確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性或敏感性的方法，其中所述方法包括下述步驟(i)用脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物處理患者樣本或細(xì)胞系或其部分； ( )裂解來(lái)自步驟(i)的患者樣本或細(xì)胞系中的細(xì)胞；(iii)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告物細(xì)菌和脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物混合；(iv)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑混合；(ν)任選地，將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌混合；以及(vi)檢測(cè)步驟(iii)、(iv)和任選地步驟(ν)的每一步所得的混合物的生物發(fā)光，其中每一所述混合物的比較的生物發(fā)光水平提供了對(duì)所述藥物的抗性或敏感性的量度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括下述步驟a)對(duì)來(lái)自所述患者樣本或細(xì)胞系的未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行裂解；b)將部分來(lái)自步驟(a)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌和脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物混合；c)將部分來(lái)自步驟(a)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑混合；d)任選地，將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌混合；以及e)檢測(cè)步驟(b)、(c)和任選地步驟(d)的每一步的混合物的生物發(fā)光，并從權(quán)利要求 1的步驟(iii)、(iv)和任選地步驟(ν)的每一步中所檢測(cè)的相應(yīng)生物發(fā)光中分別減去步驟(b)、(C)和任選地步驟(d)的每一步的混合物的生物發(fā)光，其中針對(duì)每一測(cè)定的生物發(fā)光的所得值的比較提供了對(duì)所述藥物的抗性或敏感性的量度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(v)，并且其中通過(guò)下列通用公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本的抗性或敏感性進(jìn)行分類若生物發(fā)光LIP > LI且LIP > L且LI L，則所述細(xì)胞攝取并代謝所述藥物； 若生物發(fā)光LIP > L且LI > L且LIP Li，則所述藥物被攝取但并未被代謝； 若生物發(fā)光LIP > LI > L，則所述藥物被攝取和部分地被代謝；以及若生物發(fā)光LIP ^ LI ^ L，則所述藥物未被攝取，其中L =裂解物，LI =裂解物和轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物，LIP =裂解物和轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和磷酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(ν)，并且其中使用下列公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本的敏感性進(jìn)行分類% Int = [T(n/m)] XlOO其中％ ^^二相互作用^，了二處理(藥物)，以及 η = LIP 且 m = LI ；或 η = LIP 且 nd m = L ；或 η = LI 且 m = L ； 其中若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ ht 彡 10%，且當(dāng) η = LI 且 m = L 時(shí)％ Int < 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ Int 彡 10%，且當(dāng) 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者時(shí)％ Int > 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取但并未代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ ht 彡 10%，且當(dāng) η = LI 且 m = L 時(shí)％ Int > 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并部分代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；以及若當(dāng)η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L三者時(shí)％ Int彡10%, 則所述患者樣本或細(xì)胞系未攝取所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(ν)，并且其中使用下述公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本的抗性或敏感性進(jìn)行分類% Int = [T (n/m)-C(n/m)]X100 其中% Int =相互作用0A ；T =處理(藥物)；C =對(duì)照(無(wú)藥物)，以及 η = LIP 且 m = LI ；或 η = LIP 且 m = L ；或 η = LI 且 m = L, 其中若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ ht 彡 10%，且當(dāng) η = LI 且 m = L 時(shí)％ Int < 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ Int 彡 10%，且當(dāng) 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者時(shí)％ Int > 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取但并未代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ ht 彡 10%，且當(dāng) η = LI 且 m = L 時(shí)％ Int > 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并部分代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；以及若當(dāng)η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L 三者時(shí)％ Int ( 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系未攝取所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中若當(dāng)η = LIP且m = LI時(shí)％ Int彡5%，且當(dāng)η = LI且m = 1^時(shí)％ Int ( 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng) η = LIP 且 m = LI 時(shí)％ Int 彡 10%，且當(dāng) 11 = 1^1且111 = 1^和11 = 1^1卩且111 = 1^ 二者時(shí)％ Int > 5 %，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取但并未代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng)η = LIP且m = LI時(shí)％ Int彡5%，且當(dāng)η = LI且m = L時(shí)％ Int > 5%，則所述患者樣本或細(xì)胞系攝取并部分代謝所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物；若當(dāng)η = LIP且m = LI和η = LI且m = L以及η = LIP且m = L三者時(shí)％ Int彡10%, 則患者樣本或細(xì)胞系未攝取所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中不進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(v)，并且其中使用下述公式對(duì)細(xì)胞系或患者樣本的抗性進(jìn)行分類若生物發(fā)光LIP ^ Li，則所述患者樣本或細(xì)胞系對(duì)所述藥物完全有抗性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中不進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(ν)，并且其中使用下述公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本對(duì)所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性進(jìn)行分類% Int = [T(n/m)] XlOO 其中η = LIP且m = Li，并且其中若％ Int < 10%，則所述者樣本或細(xì)胞系對(duì)所述藥物基本有抗性。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中不進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(ν)，并且其中使用下述公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本的抗性進(jìn)行分類若生物發(fā)光[T(n)-C(n)] ^ [Τ (m)-C (m)]，則所述患者樣本或細(xì)胞系對(duì)所述藥物有抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中不進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(ν)，并且其中使用下述公式對(duì)所述細(xì)胞系或患者樣本對(duì)所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性進(jìn)行分類% Int = [T(n/m)-C(n/m)]X100 其中η = LIP且m = Li，并且其中若％ Int ( 10%，則所述患者樣本或細(xì)胞系對(duì)所述藥物基本有抗性。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌為E.coli MG 1655的脫氧胞苷脫氨酶(cdd)-缺陷型菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌表達(dá)luxCDABE操縱子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌的保藏編號(hào)為 No. NCTC 13427ο
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫氧核糖核苷激酶為胸苷激酶1、 胸苷激酶2、脫氧胞苷激酶或脫氧鳥(niǎo)苷激酶。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫氧核糖核苷激酶為脫氧胞苷激酶。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫氧核糖核苷激酶誘導(dǎo)劑為 IPTG0
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫磷酸化劑為堿性磷酸酶。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫磷酸化劑為細(xì)菌堿性磷酸酶、牛小腸堿性磷酸酶、蝦堿性磷酸酶或牛小腸粘膜堿性磷酸酶。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物為抗癌藥物或抗病毒藥物。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥物為Ara-C或氟達(dá)拉濱。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞系或患者樣本的細(xì)胞為癌性細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為急性髓性白血病細(xì)胞。
23.用于確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的抗性或敏感性的試劑盒，所述試劑盒包含引入編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌為E.coli MG 1655 的脫氧胞苷脫氨酶(cdd)-缺陷型菌株。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求M所述的試劑盒，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌表達(dá) IuxCDABE操縱子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌的保藏編號(hào)為No.NCTC 13427。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至沈中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述脫氧核糖核苷激酶為脫氧胞苷激酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述脫磷酸化劑為細(xì)菌堿性磷酸酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至觀中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述脫氧核糖核苷激酶誘導(dǎo)劑為 IPTG。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至27中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物為抗癌藥物或抗病毒藥物。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至觀中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物為Ara-C或氟達(dá)拉濱。
32.脫磷酸化劑、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物以及引入脫氧核糖核苷激酶基因的生物發(fā)光性報(bào)告物用于在離體條件下確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)藥物的抗性或敏感性的用途， 其中所述藥物能通過(guò)脫氧核糖核苷激酶而被磷酸化。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在體外確定細(xì)胞系或患者樣本對(duì)脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物的敏感性的方法，其中所述方法包括下述步驟(i)用脫氧核糖核苷激酶依賴性藥物處理患者樣本或細(xì)胞系或其部分；(ii)裂解來(lái)自步驟(i)中的患者樣本或細(xì)胞系中的細(xì)胞；(iii)任選地，將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與含有編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌混合；(iv)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與含有編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌和脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物混合；(v)將部分來(lái)自步驟(ii)的細(xì)胞裂解物與含有編碼脫氧核糖核苷激酶的基因的生物發(fā)光性報(bào)告細(xì)菌、脫氧核糖核苷激酶轉(zhuǎn)錄促進(jìn)物和脫磷酸化劑混合；以及(vi)檢測(cè)步驟(iii)至(v)每一步所得的混合物的生物發(fā)光，其中每一混合物的比較的生物發(fā)光水平提供了對(duì)于所述藥物的抗性或敏感性的量度。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102186985SQ200980130139
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者維維安·克萊爾·索爾茲伯里, 哈比博·馬哈芒德·歐羅什, 瑪格麗特·安·史密斯, 保羅·約翰·伊諾瑟恩茲, 馬克·威廉·魯杜克, 阿什利·黛安·馬丁 申請(qǐng)人:蘭道克斯實(shí)驗(yàn)有限公司, 英國(guó)西英格蘭大學(xué)