專利名稱：生產(chǎn)己二?；?7-adca的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)N-己二酰化的β-內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株，它們的構(gòu)建方 法，以及鑒定與過表達(dá)涉及將來自發(fā)酵培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合 物的基因和酶的方法。
背景技術(shù)：
半合成的β -內(nèi)酰胺抗生素(SSA’ S)從β -內(nèi)酰胺中間產(chǎn)物開始以工業(yè)規(guī)模生 產(chǎn)，例如6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)、7-氨基-去乙酰氧基-頭孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基頭 孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯/鹽(7-ACCA)、7_氨基_3_[ (Z/ E)-l_丙烯-1-基]-3-頭孢烯-4-羧酸酯/鹽(7-PACA)、7-氨基去乙酰基頭孢烷酸 (7-ADAC)、7_氨基-3-氨甲?；跫谆?3-頭孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。第一代7-ADCA制品衍生自PenG，其中5_元青霉烯環(huán)到6_元頭孢烯環(huán)的擴(kuò)環(huán) 和隨后苯乙?；?7-ADCA苯乙酸側(cè)鏈的切割均使用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。下一代7-ADCA制品 仍然從PenG獲得，但是在化學(xué)擴(kuò)環(huán)之后，使用合適的(青霉素)?；该复偾谐揭阴?基-7-ADCA的苯乙酸側(cè)鏈。已開發(fā)出其它方法，其中使用合適的擴(kuò)環(huán)酶體外進(jìn)行PenG到苯 乙酰基-7-ADCA的擴(kuò)環(huán)，但是這些方法僅具有很低的工業(yè)重要性。最近期和最精致的7-ADCA生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)下述Penicillium chrysogenum, 所述Penicillium chrysogenum用編碼合適擴(kuò)環(huán)酶的基因轉(zhuǎn)化并表達(dá)所述基因。該經(jīng)改 造的Penicillium chrysogenum菌株在存在己二酸作為側(cè)鏈前體時(shí)在發(fā)酵管中生長時(shí)， 生產(chǎn)并分泌己二?；?7-ADCA-見W093/05158。在該生產(chǎn)過程中，從發(fā)酵液中回收己二酰 基-7-ADCA，對其進(jìn)行合適的酰基酶處理，從而切除己二酸側(cè)鏈，之后進(jìn)一步純化、結(jié)晶和 干燥由此獲得的7-ADCA。其它側(cè)鏈前體已公開于W095/0414W2-(羧乙基硫代)乙酸和 3_(羧甲基硫代)_丙酸)、W095/04149Q-(羧乙基硫代)丙酸)、W096/38580 (苯乙酸)和 W098/048034和W098/048035 (多種二羧酸)中。擴(kuò)環(huán)酶負(fù)責(zé)多種N-?；嗝雇樗?元 環(huán)的擴(kuò)環(huán)，從而得到相應(yīng)的N-?；ヒ阴Ｑ趸^孢烷酸。然而，除了被用作側(cè)鏈前體以外，己二酸鹽可以被降解并在初級代謝中被用作碳 源。這由 Robin et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 57，357-362))在使用蔗糖 作為主要碳源的分批培養(yǎng)物中證實(shí)。耗盡(源自蔗糖的)葡萄糖和果糖后，開始形成己二 酰基-6-APA和己二?；?7-ADCA，并且在這一階段中，僅至多2%的己二酸被并入β -內(nèi) 酰胺化合物中，而剩余部分被用作碳源。作者提出，由于己二酸和脂肪酸之間的相似性， 己二酸降解很可能通過β-氧化而發(fā)生。在較晚的研究中，Thykaer et al. (Metabolic Engineering(2002) ,4,151-158)以生產(chǎn)己二酰基-7-ADCA 的Penicillium chrysogenum菌 株的代謝網(wǎng)絡(luò)分析為基礎(chǔ)得出下述結(jié)論己二酸鹽降解通過氧化酶發(fā)生在微體(乙醛 酸循環(huán)體)中，而不是胞質(zhì)溶膠或線粒體中。通常(絲狀)真菌和酵母中，特別是Penicillium chrysogenum中，在細(xì)胞內(nèi)定位、 涉及的酶以及氧化通路在微生物總體代謝中的作用方面，氧化通路的本質(zhì)仍然是 不清楚的。為了減少己二酸降解，Thykaer et al. (2002)已提出缺失負(fù)責(zé)己二酸鹽降解的酶，然而沒有將任何此類酶指定為合適的候選者。因?yàn)榕c葡萄糖或甘油相比，己二酸鹽是昂貴的，所以己二酸鹽的降解是不想要的。 取而代之，從工業(yè)生產(chǎn)工藝的觀點(diǎn)來看，人們非常希望己二酸鹽向N-己二?；摩?-內(nèi)酰 胺化合物的并入產(chǎn)率(incorporation yield)接近100%。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，在能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株中過 表達(dá)編碼己二?；?CoA形成酶的基因?qū)е峦蛔凅w微生物菌株具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng)基 的己二酸進(jìn)入N-己二酰化的β -內(nèi)酰胺化合物的并入。發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供了用于鑒定能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的微 生物菌株的一個(gè)或多個(gè)基因的方法，所述基因編碼涉及在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)微 生物菌株將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶。將 來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物可包括以下步驟1.將己二酸從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)至微生物細(xì)胞內(nèi)部。2.通過酶，例如CoA連接酶(EC 6. 2. 1. xx)或CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC2. 8. 3. xx)，將細(xì)胞 內(nèi)己二酸轉(zhuǎn)化成己二?；?CoA。3.通過酶酰基輔酶A 異青霉素N?；D(zhuǎn)移酶(EC 2. 3. 1. 164)，將來自己二酰 基-CoA的己二酰基片段轉(zhuǎn)移至異青霉素N，得到己二?；?6-APA。4.任選地，可以借助于擴(kuò)環(huán)酶(EC 1. 14. 20. 1)將己二?；鵢6_APA轉(zhuǎn)化成己二酰 基-7-ADCA。用于鑒定微生物菌株的編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；?β-內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶的一個(gè)或多個(gè)基因的方法可包括以下步驟a.選擇涉及將酸活化成各自酰基-CoA化合物的一個(gè)或多個(gè)已知基因的核苷酸序 列和/或任選地由所述基因編碼的一個(gè)或多個(gè)已知酶的氨基酸序列；b.使用從步驟(a)中選擇的序列作為BLAST搜索中的探針，用于在能夠生產(chǎn)N-己 二酰化的內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株的可獲得的核苷酸或氨基酸序列中鑒定同源序 列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二酰化的 內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶的基因可以選自由以下組成的組編碼能夠催化細(xì)胞內(nèi)
己二酸轉(zhuǎn)化成己二?；?CoA的酶(例如CoA-連接酶和CoA-轉(zhuǎn)移酶)的基因。CoA-連接酶(EC 6. 2. 1. xx)優(yōu)選地具有合成二羧酸(如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊 二酸、羧基-甲基-硫代-丙酸、硫代-二-丙酸、反式-β -氫粘康酸和/或己二酸)的 CoA-衍生物的能力。高度優(yōu)選的CoA-連接酶(EC 6. 2. 1. xx)具有合成己二?；?CoA的能 力。CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)優(yōu)選地具有合成二羧酸(如草酸、丙二酸、琥珀酸、 戊二酸和/或己二酸)的能力。高度優(yōu)選的CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC2.8.3.XX)具有合成己二酰 基-CoA的能力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選擇的序列(探針)是已知的基因核苷酸序列，或已 知的酶氨基酸序列(任選地由所述基因編碼)，并且可選自(但不限于)由以下基因組成的 組
探針A.來自 Saccharomyces cerevisiae 的乙酰-輔酶 A 合成酶(EC6. 2. 1. 1) (Entrez 登記號 AAB35143)。探針B.來自 Penicillium chrysogenum 的苯乙酸-CoA 連接酶(EC6. 2. 1. 30) (Entrez 登記號 CAA04820)。探針C.來自Saccharomyces cerevisiae的極長鏈脂肪?；?CoA合酶 (EC6. 2. 1. 3) (Entrez 登記號 CAA84983)探針D.來自 Aspergillus oryzae 的?；?CoA 合成酶(Entrez 登記號 Q2UHE5)探針E.來自Homo sapiens的琥珀酰基-CoA :3_酮酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶A亞基(EC 2. 8. 3. 5) (Entrez 登記號 BAB40810)探針F.來自 Escherichia coli 的甲酰-輔酶-A 轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. 2) (Entrez 登記號P69902)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法利用來自&iccharomyces cerevisiae的乙酰 基-輔酶A合成酶(EC 6. 2. 1. 1) (Entrez登記號AAB35143)的氨基酸序列作為探針(探針 A)和 / 或來自 Penicillium chrysogenum 的苯乙酸-CoA 連接酶(EC 6. 2. 1. 30) (Entrez 登 記號CAA04820)的氨基酸序列作為探針(探針B)。就本發(fā)明的目的而言，使用BLAST算法鑒定同源序列(Altschul, et al.，1990， J. Mol. Biol. 215 :403-410)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是公眾可以通過National Center for Biotechnology Information (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲得的。BLAST 算 法參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認(rèn)詞長(W)ll、 BL0SUM62 評分矩陣(見 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 10915 (1989))、 比對(B) 50、預(yù)期(E) 10、M= 5、N = -4和并比較兩條鏈。除了上述本發(fā)明的方法以外，可以基于在含有己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本菌株時(shí) 基因的轉(zhuǎn)錄水平與在不含己二酸的對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本菌株時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄水平的比例 (本文中定義為“己二酸鹽/對照”比例)，來進(jìn)一步選擇編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并 入N-己二酰化的內(nèi)酰胺化合物的的一種或多種酶的基因。優(yōu)選地，此類基因具有大于 1，優(yōu)選地>2，優(yōu)選地>3，優(yōu)選地>4，優(yōu)選地>5，優(yōu)選地> 10，優(yōu)選地> 15，優(yōu)選地>20， 優(yōu)選地> 30，優(yōu)選地> 40，優(yōu)選地大于> 50，優(yōu)選地> 60，優(yōu)選地> 70，優(yōu)選地> 80，最優(yōu) 選地彡90的“己二酸鹽/對照”比例。作為第二對照，可以測定在含有苯乙酸的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)親本菌株時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄水平與在不含苯乙酸的對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本菌株時(shí)基因的 轉(zhuǎn)錄水平的比例(稱作“ΡΑΑ/對照”比例)?？梢酝ㄟ^用“己二酸鹽/對照”比例除以“ΡΑΑ/對照”比例從而得到“己二酸鹽/ ΡΑΑ”比例，來計(jì)算第三比例。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因具有彡1，優(yōu)選地彡2，優(yōu)選地彡3，優(yōu)選 地> 4，優(yōu)選地> 5，優(yōu)選地> 10，優(yōu)選地> 15，優(yōu)選地> 20，優(yōu)選地> 30，優(yōu)選地> 40，優(yōu) 選地大于> 50，優(yōu)選地> 60，優(yōu)選地> 70，優(yōu)選地> 80，最優(yōu)選地> 90的“己二酸鹽/ΡΑΑ” 比例。優(yōu)選的基因?qū)⒔M合高“己二酸鹽/對照”比例與低“ΡΑΑ/對照”比例。例如，具有50 左右“己二酸鹽/對照”比例和10左右“ΡΑΑ/對照”比例(即己二酸鹽/PAA為5)的基因 比己二酸鹽/對照比例在50左右且PAA/對照比例在50左右(即己二酸鹽/PAA為1)的 基因更加優(yōu)選。本發(fā)明第二方面中提供了編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的多肽的基因。優(yōu)選地，編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二酰 化的β -內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶的基因可選自由以下組成的組編碼能夠催化細(xì)胞 內(nèi)己二酸轉(zhuǎn)化成己二?；?CoA的酶(例如CoA-連接酶和CoA-轉(zhuǎn)移酶)的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼是具有CoA-連接酶(EC 6. 2. 1. xx)活性的酶的多肽的基 因， 可具有選自下組的基因組核苷酸序列，所述組由以下組成Pcl3gl4420(SEQ ID No 1) ；Pc21g22010(SEQ ID No 2) ；Pc22g20270(SEQ ID No 3) ；Pc22g00960(SEQ ID No: 4) ；Pcl2g05520(SEQ ID No 5) ；Pcl3gl2270(SEQ ID No 6) ；Pcl8g05710(SEQ ID No 7)；
Pc20gl3500(SEQIDNo8)；Pcl3g01890(SEQIDNo9) ；Pc20gl0840(SEQIDNo:10)Pcl3g05130(SEQIDNo:11)；Pcl3gl0810(SEQIDNo12) ；Pc22g06680(SEQIDNo:13)Pc22gl4900(SEQIDNo:14)；Pc22gl6410(SEQIDNo15) ；Pc21gl3540(SEQIDNo:16)Pc21g20650(SEQIDNo:17)；Pc21g23730(SEQIDNo18) ；Pc21g21960(SEQIDNo:19)Pc22g24780(SEQIDNo:20)；Pc06g01160(SEQIDNo21) ；Pcl2g09980(SEQIDNo:22)Pcl5g00420(SEQIDNo 23)；Pc21g07810(SEQIDNo 24)和Pc21g09470(SEQ ID No25)
或·可具有選自下組的相應(yīng)的cDNA核苷酸，所述組由以下組成SEQ ID No :32 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 38 ； SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 47 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 56 ；·可編碼選自下組的相應(yīng)氨基酸序列，所述組由以下組成SEQ ID No :63 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 79 ；SEQ ID No 70 ；SEQ ID No 71 SEQ ID No 72 ；SEQ ID No 73 ；SEQ ID No 74 ；SEQ ID No 75 ； SEQ ID No 76 ；SEQ ID No 77 ；SEQ ID No 78 ；SEQ ID No 79 ；SEQ ID No 80 ；SEQ ID No 81 ；SEQ ID No82 ；SEQ ID No83 ；SEQ ID No 84 ；SEQ ID No 85 ；SEQ ID No 86 ；SEQ ID No 87 ；在第二個(gè)實(shí)施方案中，編碼是具有CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)活性的酶的多肽的 基因， 可具有選自下組的基因組核苷酸序列，所述組由以下組成Pc20gl5639(SEQ ID No 26) ；Pcl3g02780(SEQ ID No :27) ；Pc22gl3680(SEQ ID No :28) ；Pc22g03940 (SEQ ID No 29) ；Pc 14g00590(SEQ ID No :30) ；Pcl6g00210(SEQ ID No :31)?！た删哂羞x自下組的相應(yīng)的cDNA核苷酸，所述組由以下組成SEQ ID No :57 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 62 ；·可編碼選自下組的相應(yīng)氨基酸序列，所述組由以下組成SEQ ID No :88 ；SEQ ID No 89 ；SEQ ID No 90 ；SEQ ID No 91 ；SEQ ID No92 ；SEQ ID No 93表1和表2展示了基因組核苷酸序列、cDNA序列和氨基酸序列的SEQ ID No如何 彼此相關(guān)。本發(fā)明的核苷酸序列不限于上文所列的序列，其還包括與所述序列“基本同源”的序列，前提是所述基因分別編碼具有CoA-連接酶(EC6. 2. 1. xx)活性或CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)的酶。氨基酸序列不限于上文所列序列，而是還包括與所述序列“基本同源”的序列，前 提是具有此類氨基酸序列的多肽分別具有CoA-連接酶(EC6. 2. 1. xx)活性或CoA-轉(zhuǎn)移酶 (EC 2. 8. 3. xx)活性。當(dāng)序列1具有與序列2至少75 %，優(yōu)選地至少80 %，優(yōu)選地至少85 %，優(yōu)選地至少 90 %，優(yōu)選地至少95 %，仍然更優(yōu)選地至少96 %，仍然更優(yōu)選地至少97 %，仍然更優(yōu)選地至 少98%和最優(yōu)選地至少99%的同一性程度時(shí)，在本文中定義為一條序列(序列1)與另一 序列(序列幻“基本同源”?！盎就础钡乃龆x適用于核苷酸序列以及氨基酸序列。本發(fā)明提供了編碼CoA-連接酶(EC 6. 2. 1. xx)的以下基因1.具有SEQ ID No. 1中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 32中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 63中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3gl4420，以及與這些序列大于 陽％同源，更優(yōu)選地與這些序列大于60 %，更優(yōu)選地大于70 %，更優(yōu)選地大于80 %，更優(yōu)選 地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。2.具有SEQ ID No. 2中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 33中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 64中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g22010，以及與這些序列大于 45 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于50 %，更優(yōu)選地大于60 %，更優(yōu)選地大于70 %，更優(yōu)選 地大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。3.具有SEQ ID No. 3中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 34中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 65中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22g20270。4.具有SEQ ID No. 4中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 35中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 66中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22g00960，以及與這些序列大于 70 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的 序列。5.具有SEQ ID No. 5中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 36中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 67中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl2g05520，以及與這些序列大于 85 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。6.具有SEQ ID No. 6中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 37中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 68中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3gl2270，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。7.具有SEQ ID No. 7中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 38中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 69中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl8g05710，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。8.具有SEQ ID No. 8中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 39中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 70中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc20gl3500，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。9.具有SEQ ID No. 9中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 40中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 71中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3g01890，以及與這些序列大于 75 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于80 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。
10.具有SEQ ID No. 10中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 41中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 72中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc20gl0840，以及與這些序列大于 陽％同源，更優(yōu)選地與這些序列大于60 %，更優(yōu)選地大于70 %，更優(yōu)選地大于80 %，更優(yōu)選 地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。11.具有SEQ ID No. 11中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 42中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 73中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3g05130，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。12.具有SEQ ID No. 12中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 43中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 74中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3gl0810，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。13.具有SEQ ID No. 13中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 44中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 75中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22g06680。14.具有SEQ ID No. 14中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 45中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 76中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22gl4900。15.具有SEQ ID No. 15中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 46中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 77中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22gl6410，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。16.具有SEQ ID No. 16中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 47中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 78中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21gl3540，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。17.具有SEQ ID No. 17中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 48中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 79中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g20650，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。18.具有SEQ ID No. 18中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 49中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 80中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g23730，以及與這些序列大于 85 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。19.具有SEQ ID No. 19中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 50中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 81中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g21960，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。20.具有SEQ ID No. 20中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 51中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 82中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22g24780，以及與這些序列大于 70%同源，更優(yōu)選地與這些序列大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的 序列。21.具有SEQ ID No. 21中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 52中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 83中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc06g01160，以及與這些序列大于 65 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于70 %，更優(yōu)選地大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選 地大于95%同源的序列。22.具有SEQ ID No. 22中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 53中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 84中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl2g09980，以及與這些序列大于45 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于50 %，更優(yōu)選地大于60 %，更優(yōu)選地大于70 %，更優(yōu)選 地大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。23.具有SEQ ID No. 23中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 54中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 85中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl5g00420，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。24.具有SEQ ID No. 24中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 55中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 86中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g07810，以及與這些序列大于 70%同源，更優(yōu)選地與這些序列大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的 序列。25.具有SEQ ID No. 25中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 56中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 87中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc21g09470，以及與這些序列大于 70%同源，更優(yōu)選地與這些序列大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的 序列。本發(fā)明提供了編碼CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)的以下基因26.具有SEQ ID No. 26中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 57中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 88中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc20gl5630，以及與這些序列大于 60 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于70 %，更優(yōu)選地大于80 %，更優(yōu)選地大于90 %，更優(yōu)選 地大于95%同源的序列。27.具有SEQ ID No. 27中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 58中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 89中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl3g02780，以及與這些序列大于 85 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。28.具有SEQ ID No. 28中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 59中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 90中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22gl3680，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。29.具有SEQ ID No. 29中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 60中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 91中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pc22g03940，以及與這些序列大于 95%同源的序列。30.具有SEQ ID No. 30中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 61中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 92中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl4g00590，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。31.具有SEQ ID No. 31中所示基因組核苷酸序列和SEQ ID No. 62中所示相應(yīng)的 cDNA序列和SEQ ID No. 93中所示相應(yīng)的氨基酸序列的Pcl6g00210，以及與這些序列大于 80 %同源，更優(yōu)選地與這些序列大于90 %，更優(yōu)選地大于95 %同源的序列。就本發(fā)明的目的而言，兩條氨基酸序列之間的同源性是指兩條序列之間相同的 氨基酸的百分比。使用BLAST算法測定同源性，所述BLAST算法在Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990))中描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是公眾可以通過 National Center for Biotechnology Information(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲 得的。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認(rèn) 詞長(W) 1UBL0SUM62 評分矩陣(見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))、比對(B) 50、預(yù)期(E) 10、M = 5、N = _4 和并比較兩條鏈。
基本同源的多肽包括可由于天然等位基因變異或株系內(nèi)變異而存在于來自不同 種群的細(xì)胞中或存在于種群中的多態(tài)現(xiàn)象。除了所述特定的氨基酸和/或DNA序列的來源 真菌以外，基本同源的多肽可還衍生自其它真菌，或者可以由人工設(shè)計(jì)和合成的DNA序列編碼。 就本發(fā)明的目的而言，兩條核苷酸序列之間的同源性是指兩條序列之間相同的堿 基的百分比。與特定的DNA序列相關(guān)并通過遺傳密碼子簡并性獲得的DNA序列也是本發(fā)明 的一部分。同源物也可以包括全長序列的具有生物活性的片段?；就吹亩嚯目蓛H含有特定氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代，或非 必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的氨基酸是在這些序列之一中可以被改變 而不顯著改變生物功能的殘基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie， J.U.et al. , Science 247 :1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在兩種研究氨基酸 序列對改變的耐受的途徑。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。 第二種途徑使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改變，并選擇或篩選以 鑒定維持功能性的序列。如作者所述，這些研究解釋了蛋白質(zhì)驚人地耐受氨基酸取代。作 者還指出在蛋白質(zhì)的某位置上何種改變可能是允許的。例如，大部分被埋藏的氨基酸殘基 需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺溚ǔ：苌儆刑卣魇潜Ｊ氐?。其它這類表型沉默取代被描述于 Bowie et al和其中所引用的參考文獻(xiàn)中。術(shù)語“保守取代”旨在表示下述取代，其中氨基酸殘基被替換為具有相似側(cè)鏈的氨 基酸殘基。這些家族是本領(lǐng)域已知的，并包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸 和組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨 基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性 側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸)、具有β-支鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸 (例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。導(dǎo)致經(jīng)改進(jìn)的催化功能(即己二酸鹽轉(zhuǎn)化成為己二?；?CoA)的本發(fā)明的氨基酸 序列的變體可以通過修飾本發(fā)明的相應(yīng)基因來獲得。此類修飾包括1.易錯(cuò)PCR，以引入隨機(jī)突變，之后篩選獲得的變體(基本如實(shí)施例4中所述)，并 分離具有經(jīng)改進(jìn)的動力學(xué)特性的變體2.對編碼己二?；?CoA形成酶的基因的相關(guān)變體進(jìn)行家族改組，之后篩選獲得 的變體(基本如實(shí)施例4中所述)，并分離具有經(jīng)改進(jìn)的動力學(xué)特性的變體導(dǎo)致提高的mRNA和/或蛋白質(zhì)水平，導(dǎo)致更多酶活性(即己二酸鹽轉(zhuǎn)化成為己二 ?；?CoA)的本發(fā)明的基因的變體可以通過修飾所述基因的多核苷酸序列來獲得。此類修 飾為1.以下述方式改進(jìn)密碼子選擇，所述方式使得密碼子(最優(yōu)地)適應(yīng)親本微生物宿主。2.以下述方式改進(jìn)密碼子對選擇，所述方式使得密碼子(最優(yōu)地)適應(yīng)親本微生 物宿主。3.對編碼己二酰基-CoA形成酶的基因組信息添加穩(wěn)定化序列，得到具有提高的半衰期的mRNA分子。用于分離具有改進(jìn)的催化特性或提高的mRNA或蛋白質(zhì)水平的變體的優(yōu)選方法描 述于W003010183和W00301311中。優(yōu)化親本微生物菌株中密碼子選擇的優(yōu)選方法描述于 PCT/EP2007/05594中。對編碼己二?；?CoA形成酶的基因基因添加穩(wěn)定化元件的優(yōu)選方 法描述于W02005059149中。本發(fā)明在第三方面提供了源自親本微生物菌株的突變體微生物菌株，所述親本微 生物菌株在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物，其 特征是所述突變體微生物菌株與親本微生物菌株相比，具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng)基的己二 酸向N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。并入產(chǎn)率在本文中被定義為相對于消耗的己二酸的總摩爾量，被并入N-己二酰 化的內(nèi)酰胺化合物中的己二酸的摩爾百分比。消耗的己二酸的總量等于添加至發(fā)酵過 程中的己二酸的總摩爾量減去發(fā)酵過程后殘余的己二酸的摩爾量。經(jīng)改進(jìn)的并入產(chǎn)率可以 被表述為突變體微生物菌株與親本微生物菌株相比的相對改進(jìn)。例如，當(dāng)親本微生物菌株 具有上文定義的5 %的并入產(chǎn)率而突變體微生物菌株具有6 %的并入產(chǎn)率時(shí)，突變體的經(jīng) 改進(jìn)的并入產(chǎn)率為20% (6/5*100-100)。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變體菌株具有至少5 %，更優(yōu)選地至少7. 5%，更優(yōu)選地至少 10 %，更優(yōu)選地至少15 %，更優(yōu)選地至少20 %，更優(yōu)選地至少30 %，更優(yōu)選地至少40 %，更 優(yōu)選地至少50 %，更優(yōu)選地至少60 %，更優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選地至少80 %，更優(yōu)選地至 少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，更優(yōu)選地至少97 %，更優(yōu)選地至少98 %，更優(yōu)選地至少99 %， 更優(yōu)選地至少100%的經(jīng)改進(jìn)的并入產(chǎn)率。能夠獲得的最大的經(jīng)改進(jìn)的并入產(chǎn)率取決于親本微生物菌株的實(shí)際并入產(chǎn)率。當(dāng) 親本微生物菌株具有5%的并入產(chǎn)率且理論最大并入產(chǎn)率為100%時(shí)，則突變體微生物菌 株可具有1900% (100/5*100-100)的最大經(jīng)改進(jìn)的并入產(chǎn)率。類似地，當(dāng)親本微生物菌株 已經(jīng)具有50%的并入產(chǎn)率并且理論最大并入產(chǎn)率為100%時(shí)，則突變體微生物菌株可具有 100% (100/50*100-100)的最大經(jīng)改進(jìn)的并入產(chǎn)率。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前文概括的、通過前文所述的本發(fā)明方法鑒定的、編碼 一個(gè)或多個(gè)涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的一種或多 種酶(優(yōu)選地CoA-連接酶和/或CoA-轉(zhuǎn)移酶)的本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)基因，與其中所述 基因未被過表達(dá)的親本微生物菌株相比，在本發(fā)明的突變體微生物菌株中被過表達(dá)?；虻倪^表達(dá)在本文中被定義為下述基因表達(dá)，所述表達(dá)會導(dǎo)致突變體微生物菌 株中所述基因編碼的酶的活性至少是親本微生物中酶活性的1. 5倍；優(yōu)選地，所述酶的活 性是親本微生物中酶活性的至少2倍，更優(yōu)選地至少3倍，更優(yōu)選地至少4倍，更優(yōu)選地至 少5倍，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少10倍和最優(yōu)選地至少20倍。由微生物菌株生產(chǎn)的β -內(nèi)酰胺化合物可以是任何N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺，其 中所述β -內(nèi)酰胺片段是青霉烯或頭孢烯。優(yōu)選的N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物是之 前所列中間產(chǎn)物的己二?；苌?-氨基青霉烷酸(6-APA)、7_氨基-去乙酰氧基-頭 孢烷酸(7-ADCA)、7_氨基頭孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯/鹽 (7-ACCA)、7-氨基-3- [ (Z/E) 丙烯 基]_3_ 頭孢烯-4-羧酸酯 / 鹽(7-PACA)、7-氨基 去乙酰基頭孢烷酸(7-ADAC)、7_氨基-3-氨甲?；跫谆?3-頭孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)及其它。最優(yōu)選的是N-己二?；念^孢菌素，最優(yōu)選的是己二?；?7-ADCA。能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株可以選自由真菌、細(xì)菌 或酵母組成的組。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物菌株是真菌，優(yōu)選地是絲狀真菌。一種優(yōu)選的 絲狀真菌可選自由 Aspergillus、Acremonium、Trichoderma 禾P Penicillium 組成的組。 更優(yōu)選地，本發(fā)明的突變體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu)選地為Penicillium chrysogenum。一禾中優(yōu)選的細(xì)菌可以選自由 Streptomyces、Nocardia 或 Flavobacterium 組 成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明 的突變體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu)選地是Penicillium chrysogenum,所 述微生物菌株已用編碼擴(kuò)環(huán)酶的基因、優(yōu)選地用Sti^ptomyces clavuligerus cefE基 因轉(zhuǎn)化過，所述編碼擴(kuò)環(huán)酶的基因使得菌株在存在前體己二酸時(shí)培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)己二酰 基-7-ADCA。在另一實(shí)施方案中，能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明的突變 體微生物菌株屬于Penici 11 ium物種，最優(yōu)選地是Penici 11 ium chrysogenum,并且除了擴(kuò) 環(huán)酶基因(優(yōu)選Mi^ptomyces clavuligerus cefE基因)以外，還經(jīng)羥化酶基因(優(yōu)選 Streptomyces clavuligerus cefF基因)轉(zhuǎn)化過，所述羥化酶基因的表達(dá)產(chǎn)物將己二酰 基-7-ADCA的3-甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為3-羥甲基，得到己二?；?7-氨基去乙?；^孢烷酸(己 二酰基-7-ADAC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明的突變 體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu)選地是Penicillium chrysogenum,并且經(jīng)擴(kuò)環(huán) 酶/羥化酶基因(優(yōu)選Acremonium chrysogenum cefEF基因)轉(zhuǎn)化過，所述基因的表達(dá)產(chǎn) 物將己二?；?7-ADCA的3-甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化成3-羥甲基，得到己二酰基-7-氨基去乙?；?頭孢烷酸(己二?；?7-ADAC)。在另一實(shí)施方案中，能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明的突變體 微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu)選地是Penicillium chrysogenum,并且除了編碼 擴(kuò)環(huán)酶的基因(優(yōu)選Mi^ptomyces clavuligerus cef基因)和羥化酶基因以外，還經(jīng)乙 酰基轉(zhuǎn)移酶基因(優(yōu)選Mi^ptomyces clavuligerus cefG基因)轉(zhuǎn)化過，所述乙?；D(zhuǎn)移 酶基因的表達(dá)產(chǎn)物(即?；D(zhuǎn)移酶)將3-羥甲基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為3-乙酰氧甲基側(cè)鏈，得到己 二?；?7-ACA。在又一個(gè)實(shí)施方案中，能夠生產(chǎn)N-己二酰化的β -內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明的突變 體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu)選地是Penicillium chrysogenum,并且用編碼 擴(kuò)環(huán)酶的基因(優(yōu)選Mi^ptomyces clavuligerus cefE基因)、編碼羧化酶的基因(優(yōu)選 Streptomyces clavuligerus cefF基因)和O-氨甲?；D(zhuǎn)移酶的基因(優(yōu)選Sti^ptomyces clavuligerus cmcH基因)轉(zhuǎn)化過，從而得到己二?；?7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-頭 孢烯-4-羧酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu) 選地為Penicillium chrysogenum，任選地用編碼擴(kuò)環(huán)酶、羥化酶、擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶、乙?；?轉(zhuǎn)移酶和/或O-氨甲?；D(zhuǎn)移酶的一個(gè)或多個(gè)上述基因轉(zhuǎn)化過，另外在編碼涉及己二酸消 耗的酶的一個(gè)或多個(gè)基因中具有缺失。此類修飾的優(yōu)選的例子是(但不限于)氧化編碼酶。涉及的各種酶可以分別是CoA連接酶(EC 6. 2. 1. XX)，?；?CoA脫氫酶(EC1. 3. 99. XX)，?；?CoA氧化酶(EC 1.3. 3. XX)，烯?；?CoA水合酶(EC4. 2. 1. 17)，3-羥基?；?CoA 脫氫酶(EC 1. 1. 1. 35)或乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶(EC 2. 3. 1. 16)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變體微生物菌株屬于Penicillium物種，最優(yōu) 選地為Penicillium chrysogenum，任選地用編碼擴(kuò)環(huán)酶、羥化酶、擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶、乙?；?轉(zhuǎn)移酶、O-氨甲?；D(zhuǎn)移酶的一個(gè)或多個(gè)上述基因轉(zhuǎn)化過，和/或在編碼涉及己二酸消耗 的酶的基因中含有缺失，另外還用編碼能夠提高培養(yǎng)基中N-己二酰化的β -內(nèi)酰胺分泌的 酶的基因轉(zhuǎn)化過。此類基因的優(yōu)選的例子是(但不限于)=Acremonium chrysogenum cefT 基因或其同源物或Acremonium chrysogenum cefM基因或其同源物。本發(fā)明的突變體微生物菌株的一種高度優(yōu)選的實(shí)施方案具有以下特征1)其屬于 Penicillium 物種，最優(yōu)選地為 Penicillium chrysogenum，和，2)任選地用編碼以下的基因轉(zhuǎn)化a.擴(kuò)環(huán)酶，優(yōu)選地為 Sti^ptomyces clavuligerus cefE 基因；b.羥化酶，優(yōu)選地為 Sti^ptomyces clavuligerus cefF 基因；c.擴(kuò)環(huán)酶 / 羥化酶,優(yōu)選地為 Acremonium chrysogenum cefEF 基因；d.乙?；D(zhuǎn)移酶基因，優(yōu)選地為Sti^ptomyces clavuligerus cefG基因，和/或e. O-氨甲?；D(zhuǎn)移酶，優(yōu)選地為 Sti^ptomyces clavuligerus cmcH 基因；f. N-己二酰基β -內(nèi)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，優(yōu)選地為Acremonium chrysogenum cefT基 因，包括能夠(通過上文列出的方法)從這些例子獲得的經(jīng)優(yōu)化的變體。3.任選地，編碼己二酸鹽降解酶或己二酸鹽消耗酶的基因也以下述方式被修飾， 所述方式使得與親本微生物菌株相比降解或消耗被降低。本發(fā)明第四方面提供了構(gòu)建本發(fā)明的突變體微生物菌株的方法。使用核酸構(gòu)建體 例如表達(dá)構(gòu)建體獲得本發(fā)明基因在本發(fā)明突變體微生物菌株中的功能性過表達(dá)，所述核酸 構(gòu)建體含有一個(gè)或多個(gè)所選擇的基因，各自與一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作地連接，所述控 制序列指導(dǎo)編碼的多肽在合適的表達(dá)宿主中表達(dá)。核酸構(gòu)建體可以在一個(gè)DNA片段上，或 優(yōu)選地在獨(dú)立的片段上。表達(dá)應(yīng)被理解為包括多肽生產(chǎn)中涉及的任何步驟，并可包括轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有編碼序列在特定宿主生物中表 達(dá)所需的所有控制序列時(shí)，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語“表達(dá)載體”或“盒”同義。術(shù)語“控 制序列”在本文中被定義為包括對多肽的表達(dá)來說必需的或有利的所有組件。每種控制序 列對編碼多肽的核酸而言可以是內(nèi)源的(native)或外源的(foreign)。這類控制序列可 包括，但不限于啟動子、前導(dǎo)序列、最適翻譯起始序列(如Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266 19867-19870中所述)、分泌信號序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止子。控制序 列至少包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。術(shù)語“可操作地連接”在本文中被定義為下 述構(gòu)型，其中控制序列被適當(dāng)?shù)刂糜谂cDNA序列的編碼序列相關(guān)的位置，使得控制序列能 指導(dǎo)多肽的生產(chǎn)?？刂菩蛄锌砂ê修D(zhuǎn)錄控制序列的適當(dāng)?shù)膯幼有蛄小幼涌梢允窃诩?xì)胞中 顯示轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，它們可得自編碼 細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。啟動子對細(xì)胞或多肽而言可以是同源的或異源的。
絲狀真菌細(xì)胞優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶gpdA啟動子；蛋白酶啟動子如ρ印Α、ρ印B、ρ印C ；葡糖淀粉酶glaA啟動子；淀粉酶 amyA.amyB啟動子；過氧化氫酶catR或catA啟動子；葡萄糖氧化酶goxC啟動子；β -半乳 糖苷酶IacA啟動子；α-葡糖苷酶aglA啟動子；翻譯延伸因子tefA啟動子；木聚糖酶啟 動子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD ；纖維素酶啟動子如eglA、eglB、cbhA ；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子啟動子如 areA、creA、xlnR、pacC、prtT等或任何其它，并且可在諸如NCBI的網(wǎng)站上找到(http:// www, ncbi. nlm. nih. rov/entrez/)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動子可源于被高度表達(dá)的基因(在本文中定義為 mRNA濃度至少為總細(xì)胞mRNA的0. 5% (w/w))。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動子可源于 被中度表達(dá)的基因(在本文中定義為mRNA濃度至少為總細(xì)胞mNRA的0.01%至0.5% (w/ w))0在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動子可源于被低表達(dá)的基因(在本文中定義為mRNA濃 度低于總細(xì)胞mRNA的0. 01 % (w/w))。在一個(gè)進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用微陣列數(shù)據(jù)選擇基因，并進(jìn)而選擇這些 基因的啟動子，所述啟動子具有確定的轉(zhuǎn)錄水平和調(diào)節(jié)。藉此，可以使基因表達(dá)盒最適地適 應(yīng)其應(yīng)當(dāng)發(fā)揮功能的條件。其中要通過該方法選擇的合適啟動子是具有非常高的如上文解 釋的“己二酸鹽/對照”比例的基因的啟動子。另外，由W02007071399分離和/或公開的 強(qiáng)和/或組成型啟動子可以被考慮作為合適的啟動子?；蛘?，可將隨機(jī)的DNA片段克隆在本發(fā)明的多核苷酸之前。使用W02007118836公 開的乙酰胺平板實(shí)驗(yàn)，可以容易地篩選活性啟動子，因?yàn)檫@些啟動子應(yīng)當(dāng)促進(jìn)在乙酰胺作 為唯一氮源上的生長。這些DNA片段可衍生自許多來源，即不同的物種，由PCR擴(kuò)增得來， 合成得來等等?？刂菩蛄羞€可以包括合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是被絲狀真菌細(xì)胞識別為終止轉(zhuǎn) 錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3’末端可操作地連接。在細(xì)胞中有功能的 任何終止子都可用于本發(fā)明中。對絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的終止子得自編碼Aspergillus oryzae TAKA 淀粉酶，Aspergillus niger 葡糖淀粉酶，Aspergillus nidulans 氨基苯甲酸 合酶，Aspergillus niger α -葡糖苷酶，trpC基因禾口 Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋 白酶的基因?？刂菩蛄幸部梢园ê线m的前導(dǎo)序列，mRNA的非翻譯區(qū)，其對于絲狀真菌細(xì)胞 的翻譯而言是重要的。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5’ -端可操作地連接。在細(xì)胞 中有功能的任何前導(dǎo)序列都可以用于本發(fā)明中，對絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的前導(dǎo)序列得 自編碼Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶和Aspergillus nidulans丙糖磷酸異構(gòu)酶和 Aspergillus niger glaA的基因。其它優(yōu)選的起始序列由W02006077258分離和/或公開?？刂菩蛄幸部梢园ǘ嗑巯佘账峄蛄校鲂蛄信c核酸序列的3’ -端可操作地 連接，并且在被轉(zhuǎn)錄后被絲狀真菌細(xì)胞識別為對經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷酸化殘基的 信號。在細(xì)胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明中。對絲狀真菌細(xì)胞而言 優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列得自編碼Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶，Aspergillus niger 葡糖淀粉酶，Aspergillus nidulans氨基苯甲酸合酶，F(xiàn)usarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋 白酶和Aspergillus niger α-葡糖苷酶的基因。核酸構(gòu)建體可以是表達(dá)載體。表達(dá)載體可以是任何載體(例如質(zhì)?；虿《?，其可便利地進(jìn)行重組DNA步驟并可導(dǎo)致編碼多肽的核酸序列的表達(dá)。載體的選擇應(yīng)典型地取決 于載體與要引入載體的細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于 染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、小染色體或人工染色體。用于絲狀真菌的自主維 持的克隆載體可包含AMAl-序列(參閱例如Aleksenko and Clutterbuck (1997)，F(xiàn)ungal Genet. Biol. 21 :373-397)?；蛘?，載體可以是下述載體，當(dāng)其被引入細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)基因組中，并與其被整合在 其中的染色體一起復(fù)制。整合型克隆載體可以隨機(jī)或在預(yù)先確定的靶基因座上整合進(jìn)宿主 細(xì)胞的染色體中。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，整合型克隆載體包括與宿主細(xì)胞基 因組中預(yù)先確定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于將克隆載體的整合靶向該 預(yù)先確定的基因座上。為了促進(jìn)定向整合，克隆載體優(yōu)選地在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞前被線性化。優(yōu) 選地進(jìn)行線性化使得克隆載體的至少一端(但是優(yōu)選任一端)側(cè)翼是與靶基因座同源的序 列。靶基因座側(cè)翼的同源序列的長度優(yōu)選地至少0. 11Λ，進(jìn)一步優(yōu)選地至少0. 21Λ，還更優(yōu) 選地至少0. 51Λ，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少11Λ，最優(yōu)選地至少21Λ。優(yōu)選地，如W0050956M和/ 或TO2007115886所述，針對改進(jìn)的靶向DNA整合頻率修飾親本微生物菌株。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)粒，或者可以是兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含 有要被引入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA。 DNA構(gòu)建體可在附加型載體上使用。然而在本發(fā)明中，構(gòu)建體優(yōu)選地被整合進(jìn)宿主 菌株的基因組中。本發(fā)明在第五方面提供了本發(fā)明的基因用于構(gòu)建在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的本發(fā)明的突變體微生物的用途，其中所述突 變體微生物菌株與親本微生物菌株相比，具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng)基的己二酸向N-己二 ?；膬?nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變體微生物菌株可含有多于一個(gè)本發(fā)明的基因，所述基因 均被過表達(dá)，并且其組合導(dǎo)致與親本微生物菌株相比經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng)基的己二酸向 N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變體微生物菌株含有編碼能夠催化細(xì)胞內(nèi)己二 酸轉(zhuǎn)化成己二?；?CoA的酶(如前文所述的CoA-連接酶和CoA-轉(zhuǎn)移酶)的一個(gè)或多個(gè) 本發(fā)明的基因，以及被功能性失活的編碼涉及一個(gè)或多個(gè)己二酸降解通路的酶的基因。一 個(gè)單一微生物菌株中功能性失活的涉及己二酸降解的基因與涉及己二酸并入N-己二?；?的內(nèi)酰胺化合物的基因的過表達(dá)的組合導(dǎo)致與親本微生物菌株相比進(jìn)一步改進(jìn)的由 來自培養(yǎng)基的己二酸向N-己二?；膬?nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率?！肮δ苄允Щ畹摹痹?本文中被定義為基因的失活，這導(dǎo)致所編碼的酶的殘余活性優(yōu)選地少于50%、更優(yōu)選地少 于40 %、更優(yōu)選地少于30 %、更優(yōu)選地少于20 %、更優(yōu)選地少于10 %、更優(yōu)選地少于5 %、更 優(yōu)選地少于2%?！盎虻氖Щ睢痹诒疚闹斜欢x為修飾基因，從而獲得如上文定義的功能 性失活的基因。用于修飾基因從而獲得功能性失活的基因的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可 包括通過導(dǎo)致(過早)終止或讀碼框位移的堿基對突變使基因失活；突變編碼一個(gè)或多 個(gè)關(guān)鍵氨基酸(例如水解酶的催化三聯(lián)體)的一個(gè)或多個(gè)堿基；引起酶氨基酸序列中突變 的基因突變，這導(dǎo)致酶的半衰期降低；以下述方式修飾mRNA分子，所述方式使得mRNA半衰期降低；插入破壞開放讀碼框的第二序列(即選擇標(biāo)記物基因)；基因的部分或完全去除；基 因啟動子的去除/突變；使用反義DNA或可比較的RNA抑制方法降低細(xì)胞中mRNA的有效量。 最優(yōu)選地，通過缺失使基因功能性失活，導(dǎo)致編碼的多肽和由此造成的酶活性完全不存在。本發(fā)明第六方面提供了通過培養(yǎng)本發(fā)明的突變體微生物菌株生產(chǎn)N-己二?；?β -內(nèi)酰胺化合物的方法，其中用于生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的方法與使用親 本微生物菌株生產(chǎn)N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的方法相比，具有經(jīng)改進(jìn)的由來自培養(yǎng) 基的己二酸進(jìn)入N-己二酰化的β -內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。

圖1展示了涉及缺失Penicillium chrysogenum基因Pc22g20270的步驟。圖例·實(shí)心箭頭，Pc22g20270啟動子；·空心箭頭，Pc22g202700RF ； 陰影框，trpC終止子； 虛線框，ccdA基因； 實(shí)心框，Iox位點(diǎn); 交叉，重組事件； 向下的箭頭，過程中的先后步驟REKR和KRAM，重疊無功能amdS選擇標(biāo)記物片段； REKRAM,功能性amdS選擇標(biāo)記物基因。數(shù)字指示寡核苷酸的SEQ ID NO?！皹?biāo)簽”指示可用于突變體鑒定的特異性核苷酸 序列的存在。圖2展示了涉及驗(yàn)證Penicillium chrysogenum基因Pc22g20270實(shí)際缺失的步 驟。圖例實(shí)心箭頭，Pc22g20270啟動子；空心箭頭，Pc22g202700RF ；陰影框，trpC終止子； 實(shí)心框，Iox位點(diǎn)；REKRAM，功能性amdS選擇標(biāo)記物基因。數(shù)字指出所示三個(gè)PCR反應(yīng)的寡 核苷酸的SEQ ID NO (見表4)。一般材料和方法BLAST 算法被用于鑒定同源序列(Altschul，et al. ,1990, J. Mol. Biol. 215 403-410) ο 公眾可通過 National Center for Biotechnology Information (http: //www, ncbi. nlm. nih. rov/)獲得進(jìn)行BLAST分析的軟件。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定算法的靈 敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認(rèn)詞長(W)11、BL0SUM62評分矩陣(見HenikofT & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))、比對(B) 50、預(yù)期(E) 10,M = 5, N = -4和并比較兩條鏈。如別處所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook,J. et al. (1989)，Molecular cloning -.a laboratory manual, 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。根據(jù)制造商的流程使用校正讀碼聚合酶 Turbo-Pfu-Polymerase (Stratagene,荷蘭)或 Phusion (Finnzymes)進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增，但 是構(gòu)建好的菌株和質(zhì)粒的驗(yàn)證通過使用Taq聚合酶實(shí)現(xiàn)。限制性酶來自^witrogen 或 New England Biolabs0 對常規(guī)克隆而言，使用 Escherichia coli 菌株 I^oplO 和 DHlOB(Invitrogen)。構(gòu)建好的質(zhì)粒的驗(yàn)證通過限制性分析和隨后的測序進(jìn)行。
實(shí)施例實(shí)施例1
鑒定編碼推定的己二?；?CoA-合成酶的Penicillium chrysogenum基因1. CoA 連接酶(EC 6. 2. 1. xx)使用探針Α、探針B、探針C和探針D (見上下文)搜索Penicillium chrysogenum 菌株WisC0nsin54-1255的基因組，隨后的注解揭示了編碼推定的CoA-連接酶活性(EC 6. 2. 1. xx)的25個(gè)基因；見表1。2. CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)使用探針E和探針F(見上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株 Wiscons54-1255的基因組，揭示了編碼推定的CoA-轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)的6個(gè)基因；見表2。實(shí)施例2編碼推定的CoA連接酶(EC 6. 2. l.xx)和/或CoA轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)的 Penicillium chrysogenum基因的微陣列分析為了鑒定31個(gè)經(jīng)鑒定的推定的己二?；?CoA合成酶尤其是CoA連接酶(EC 6.2.1)和/或CoA轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)中哪些是用于過表達(dá)從而提高N-乙?；?β -內(nèi)酰胺化合物的合適候選者，進(jìn)行微陣列研究。使用Affymetrix Custom GeneChip程序 (Affymetrix, Inc. ， Santa Clara, CA) =GeneChip, DSM_PENa520255F, P. chrysogenum 基因組序列制備專有的DNA微陣列。將含有或不含有編碼擴(kuò)環(huán)酶的Sti^ptomyces clavuligerus cefE基因的 P. chrysogenum菌株接種于含有25ml β -內(nèi)酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基(如US20020039758中所述) 的IOOml搖瓶中，所述培養(yǎng)基含有10g/l己二酸鹽，3g/l苯乙酸(PAA)或不含前體(對照)。 將培養(yǎng)物在25°C下孵育，每分鐘旋轉(zhuǎn)280次。90小時(shí)后對總發(fā)酵液取樣并迅速冷卻。洗滌 細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀物冷凍于液氮中。隨后通過用研缽和研杵研磨冷凍的沉淀物來破碎細(xì) 胞，并使用iTrizol分離RNA。在Bioanalyzer(Agilent)上常規(guī)檢查總RNA的品質(zhì)和數(shù)量。 使用20微克總RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)cDNA合成和標(biāo)記反應(yīng)(根據(jù)Affymetrix說明書)。根據(jù)供應(yīng) 商的說明書(Affymetrix，Santa Clara, USA)進(jìn)行 GeneChips 的雜交。使用 Affymetrix GeneChip OperatingSoftware (GCOS, Affymetrix, Santa Clara, USA)掃描和分析經(jīng)雜交 的陣列。所有實(shí)驗(yàn)一式三份完成，并采取三次測量的平均作為轉(zhuǎn)錄本的相對水平。通過測定含己二酸鹽的培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄本水平和含PAA或?qū)φ张囵B(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄 本水平之間的比例，來鑒定由己二酸鹽特異性誘導(dǎo)的基因。使用含PAA的培養(yǎng)基，通過注意 對照培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄本水平和含PAA的培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄本水平之間的比例，來鑒定特異性 應(yīng)答。結(jié)果展示于表1和表2中。表1編碼具有推定的CoA連接酶活性(EC 6.2.1.XX)的酶的Penicillium chrysogenum基因的轉(zhuǎn)錄本水平
權(quán)利要求
1.用于鑒定微生物菌株的一個(gè)或多個(gè)下述基因的方法，所述基因編碼涉及將來自培養(yǎng) 基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶，所述方法可包括以下步 驟a.選擇涉及將酸活化成各自?；?CoA化合物的一個(gè)或多個(gè)已知基因的核苷酸序列和 /或任選地由所述基因編碼的一個(gè)或多個(gè)已知酶的氨基酸序列；b.使用從步驟(a)中選擇的序列作為BLAST搜索中的探針，用于在能夠生產(chǎn)N-己二酰 化的內(nèi)酰胺化合物的微生物菌株的可獲得的核苷酸或氨基酸序列中鑒定同源序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?內(nèi) 酰胺化合物的一種或多種酶的所述基因選自下組，所述組由編碼能夠催化細(xì)胞內(nèi)己二酸轉(zhuǎn) 化成己二?；?CoA的酶如CoA-連接酶和CoA-轉(zhuǎn)移酶的基因組成。
3.在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二酰化的β-內(nèi)酰胺化合物的突變 體微生物菌株，其特征是所述菌株與非突變體親本菌株相比，具有改進(jìn)的將來自培養(yǎng)基的 己二酸向N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的并入產(chǎn)率。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其特征是所述經(jīng)改進(jìn)的己二酸鹽并入產(chǎn)率為至少5%。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的突變體菌株，其中所述突變體菌株的編碼涉及將來自培養(yǎng) 基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶并且用根據(jù)權(quán)利要求1 或2的方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)基因，與其中所述基因未被過表達(dá)的親本微生物菌株相比， 在所述突變體菌株中被過表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的菌株，其中涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?內(nèi) 酰胺化合物的所述酶是己二?；?CoA形成酶，優(yōu)選地是酸性CoA連接酶(EC 6. 2. 1. xx)和 /或酸性-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的菌株，其中所述編碼酸性CoA連接酶(EC6.2.l.XX)的基因選自 由以下組成的組Pcl3gl4420(SEQ ID No 1) ；Pc21g22010 (SEQ ID No 2) ；Pc22g20270 (SEQ ID No 3) ；Pc22g00960(SEQ ID No :4) ；Pcl2g05520(SEQ ID No :5) ；Pcl3gl2270(SEQ ID No 6) ；Pcl8g05710(SEQ ID No :7) ；Pc20gl3500(SEQ ID No :8) ；Pcl3g01890(SEQ ID No: 9) ；Pc20gl0840(SEQ ID No :10) ；Pcl3g05130(SEQ ID No :11) ；Pcl3gl0810(SEQ ID No: 12) ；Pc22g06680(SEQ ID No :13) ；Pc22gl4900(SEQ ID No :14) ；Pc22gl6410(SEQ ID No: 15) ；Pc21gl3540(SEQ ID No :16) ；Pc21g20650(SEQ ID No :17) ；Pc21g23730(SEQ ID No: 18) ；Pc21g21960(SEQ ID No :19) ；Pc22g24780(SEQ ID No :20) ；Pc06g01160(SEQ ID No: 21) ；Pcl2g09980(SEQ ID No :22) ；Pcl5g00420(SEQ ID No :23) ；Pc21g07810(SEQ ID No: 24)和Pc21g09470(SEQ ID No 25)和與所述序列基本同源的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的菌株，其中所述編碼酸性-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC2.8. 3. xx)的基 因選自由以下組成的組Pc20gl5639(SEQ ID No :26) ；Pcl3g02780 (SEQ ID No :27)； Pc22gl3680(SEQ ID No :28) ；Pc22g03940(SEQ ID No :29) ；Pcl4g00590(SEQ ID No :30)； Pcl6g00210(SEQ ID No :31)和與所述序列基本同源的序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述N-己二?；膬?nèi)酰胺化合物 選自由己二?；?6-ΑΡΑ，己二?；?7-ADCA，己二?；?7-ACA，己二?；?7-ACCA，己二酰 基-7-PACA，己二?；?7-ADAC，己二?；? -ACCCA組成的組。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述菌株是真菌、細(xì)菌或酵母。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述真菌屬于Penicillium物種。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其中所述真菌是Penicilliumchrysogenum, 優(yōu)選地其經(jīng)編碼擴(kuò)環(huán)酶或擴(kuò)環(huán)酶/水解酶的基因轉(zhuǎn)化過并且表達(dá)編碼擴(kuò)環(huán)酶或擴(kuò)環(huán)酶/水 解酶的基因。
13.用于構(gòu)建權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所定義的突變體菌株的方法，所述方法包括過表 達(dá)編碼涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；摩?-內(nèi)酰胺化合物的一種或多種酶 的一個(gè)或多個(gè)基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中涉及將來自培養(yǎng)基的己二酸并入N-己二?；?β -內(nèi)酰胺化合物的所述酶是己二酰基-CoA形成酶，優(yōu)選地是酸性CoA連接酶(EC 6. 2. 1) 和/或酸性-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3)。
15.一種基因，其編碼酸性CoA連接酶(EC 6. 2.1. XX)并且選自由Pcl3gl4420 (SEQ ID No 1) ；Pc21g22010(SEQ ID No 2) ；Pc22g20270(SEQ ID No 3) ；Pc22g00960(SEQ ID No 4) ；Pc 12g05520(SEQ ID No 5) ；Pcl3gl2270(SEQ ID No 6) ；Pcl8g05710(SEQ ID No 7) ；Pc20gl3500(SEQ ID No 8) ；Pcl3g01890(SEQ ID No 9) ；Pc20gl0840(SEQ ID No :10)； Pcl3g05130(SEQ ID No :11) ；Pcl3gl0810(SEQ ID No :12) ；Pc22g06680(SEQ ID No :13)； Pc22gl4900(SEQ ID No :14) ；Pc22gl6410(SEQ ID No :15) ；Pc21gl3540(SEQ ID No :16)； Pc21g20650(SEQ ID No :17) ；Pc21g23730(SEQ ID No :18) ；Pc21g21960(SEQ ID No :19)； Pc22g24780(SEQ ID No :20) ；Pc06g01160(SEQ ID No :21) ；Pcl2g09980(SEQ ID No :22)； Pcl5g00420(SEQ ID No :23) ；Pc21g07810(SEQ ID No :24)和 Pc21g09470(SEQ ID No 25) 和與所述序列基本同源的序列構(gòu)成的組，或者編碼酸性-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. xx)且選自 Pc20gl5639(SEQ ID No :26) ；Pcl3g02780(SEQ ID No :27) ；Pc22gl3680(SEQ ID No :28)； Pc22g03940(SEQ ID No :29) ；Pcl4g00590(SEQ ID No :30) ；Pcl6g00210(SEQ ID No :31)禾口 與所述序列基本同源的序列構(gòu)成的組。
16.編碼酸性-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC2. 8. 3. xx)并且選自下組的基因，所述組由以下組成 Pc20gl5639(SEQ ID No :26) ；Pcl3g02780(SEQ ID No :27) ；Pc22gl3680(SEQ ID No :28)； Pc22g03940(SEQ ID No :29) ；Pcl4g00590(SEQ ID No :30) ；Pcl6g00210(SEQ ID No :31)禾口 與所述序列基本同源的序列。
17.由根據(jù)權(quán)利要求14或15中定義的基因編碼的多肽。
18.用于生產(chǎn)N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物的方法，所述方法包括在包含己二酸的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)定義的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變體微生物菌株，其源自在包含己二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠生產(chǎn)N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物的親本微生物菌株的，其特征是所述突變體微生物菌株具有經(jīng)改進(jìn)的將來自培養(yǎng)基的己二酸向N-己二?；摩?內(nèi)酰胺化合物的并入。
文檔編號C12N9/10GK102131921SQ200980130996
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者德 勃戈 馬爾科·亞歷山大·范, 魯洛夫·阿利·蘭斯·伯韋比格 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司