專利名稱：染色體畸變檢測的制作方法
染色體畸變檢測本發(fā)明涉及檢測損傷DNA分子的制劑的改進方法，并涉及可有效地用在該等方法 中的遺傳工程化的細胞。
背景技術(shù)：
DNA損傷可由多種制劑誘發(fā)，諸如紫外光、X射線、自由基、甲基化劑、拓撲異構(gòu)酶 抑制劑、DNA合成抑制劑、活性氧產(chǎn)生器和其它誘變。這些制劑可影響基因組DNA的完整性， 這是由生物中DNA分子的改變、變化、重排或損傷所引起的，包括但不限于基因突變或染色 體重排。這些突變在多細胞生物中可產(chǎn)生致癌，或在有性繁殖生物中會損傷配子從而導(dǎo)致 后代中的先天性缺陷。這些DNA損傷劑可化學(xué)改性包括DNA的核苷酸，也可破壞連接核苷酸的磷酸二酯 鍵或破壞堿基(T-A或C-G)之間的締合。為抵消這些DNA損傷劑的影響，細胞已經(jīng)發(fā)展了 多種機制。比如大腸桿菌中的SOS響應(yīng)是由DNA損傷誘發(fā)的良好表征的細胞響應(yīng)，其中表 達了一系列蛋白質(zhì)，包括修復(fù)損傷的DNA的DNA修復(fù)酶。許多情況下確定什么制劑會引起或加重DNA分子的改變是非常重要的。當(dāng)評估使 人或動物接觸引起DNA損傷的制劑是否安全時，對這些制劑的檢測就尤其重要。比如檢測 這些制劑的方法可用作基因毒性試驗而用于篩選作為候選藥物、食品、食品添加劑或化妝 品的化合物，以評估受關(guān)注化合物是否誘發(fā)DNA損傷?；蛘?，檢測DNA損傷劑的方法可用來監(jiān)測可疑污染點的水源和土壤樣本污染被含 有誘變的污染物污染的情況。用于確定制劑毒性的多種方法諸如染色體異常測試是已知的，但這些方法因多種 原因而不盡人意。比如樣本的孵育需要許多天，而通常希望在較短的時間期限內(nèi)獲得遺傳 毒性數(shù)據(jù)。此外，許多已知的檢測DNA損傷的方法檢驗永久性DNA損傷為端值，其以錯誤修 復(fù)DNA(突變和重組)的形式或者以未修復(fù)的片段DNA的形式而存在。然而大多數(shù)DNA損 傷在可測到該端值之前已被修復(fù)，并且永久性DNA損傷僅在條件太苛刻以致修復(fù)機制已經(jīng) 飽和的情況下才發(fā)生。因此與可辨別的遺傳損傷或其它遺傳端值相比，與DNA損傷修復(fù)過 程相關(guān)的變化在較大程度上發(fā)生在較高比例的細胞中。盡管缺乏一些代謝途徑，但在動物和人中發(fā)現(xiàn)那些相當(dāng)?shù)目商娲耐緩剑鳛閷?遺傳性損傷響應(yīng)的基本DNA修復(fù)機制在酵母和哺乳動物之間是相似的。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中對DNA損傷的響應(yīng)已被很好的 表征。RAM4編碼同源重組修復(fù)途徑(見下文)的結(jié)構(gòu)元件，并響應(yīng)于將酵母暴露于廣譜的 基因毒素而被轉(zhuǎn)錄上調(diào)，其中廣譜的基因毒素包括但不限于UV和X照射和烷基化劑，因此 RAM4是用于監(jiān)測遺傳端值的良好替代品(Cole等人，Molecular and CellularBiology, 7 :1078-1084)。RAM4編碼DNA修復(fù)酶的成員并由多種不同DNA損害或損傷轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)至組 成型水平以上，但是啟動子不對非基因毒性氧化或還原應(yīng)激、熱或滲透沖擊或氨基酸饑餓 作出反應(yīng)。鑒于所述特征，可通過諸如例如Greenscreen試驗中的綠色熒光蛋白(GFP)的 報告蛋白的RAM4誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄而對DNA損傷進行監(jiān)測。
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Greenscreen基因毒性試驗公開在1998年10月8日所公布的W098/44149 (RAD54) 中，并且提供了包括調(diào)節(jié)元件的重組DNA分子，該調(diào)節(jié)元件響應(yīng)于DNA損傷激活基因表達并 可操作地連接至編碼發(fā)光報告蛋白的DNA序列。這種DNA分子可用于轉(zhuǎn)化細胞，而這類細 胞可用在基因毒性試驗中來檢測引起或加重DNA損傷的制劑的存在?？墒辜毎佑|制劑， 并且細胞中發(fā)光報告蛋白表達的增加表明該制劑引起DNA損傷。WO 98/44149中描述的基因毒性試驗檢測DNA修復(fù)活性的誘導(dǎo)。因此WO 98/44149 中描述的方法以更具體的方式用于檢測DNA損傷劑的存在。WO 98/44149進一步描述了許多可用于轉(zhuǎn)化宿主細胞，尤其是酵母細胞的有用的 遺傳構(gòu)建體，從而其可用在基因毒性試驗中。一種這樣的構(gòu)建體是yEGFP-444(示出在WO 98/44149 的圖 12 中)。許多酵母突變株現(xiàn)在以改變的表型存在，其包括更具滲透性的細胞膜和受損的或 降低的輸出泵活性，其通常通過刪除其相應(yīng)基因而提供對異生物質(zhì)的有效解毒。2005年2月10日公布的WO 05/12533描述了 Greenscreen試驗的修改版，其包括 W098/44149中所述的載體的自發(fā)重排，從而產(chǎn)生更亮的報告蛋白。Knight 等人開發(fā)了 Greenscreen 試驗的新方案(Mutagenesis 22 :409-416,2007) 以通過添加大鼠肝臟S9提取物而增強酵母的代謝能力，旨在從更大量的前誘變劑中檢測
基因毒性。遺傳分析和隨后的生物化學(xué)表征已經(jīng)定義了三種主要的DNA輻射損傷修復(fù)途徑， 即核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)，重組修復(fù)途徑和復(fù)制后修復(fù)和誘變途徑(PR 。NER主要識 別引起螺旋畸變的損害，重組修復(fù)途徑負責(zé)雙鏈斷裂的修復(fù)，PRR被定義為在不實際移除復(fù) 制阻斷損害的情況下將DNA損傷誘發(fā)的單鏈缺口轉(zhuǎn)化為大分子量DNA的活性，這通常被稱 為DNA耐受或避免途徑(avoidance pathway)。除了以上所識別的三種DNA輻射修復(fù)途徑 外，負責(zé)損傷堿基修復(fù)的基因?qū)儆趬A基切除修復(fù)途徑(BER)。BER途徑識別并修復(fù)特定的堿 基修飾損害，所述堿基修飾損害主要是由DNA烷化劑和氧化劑所產(chǎn)生的DNA的相對較小的 修飾。BER途徑和NER途徑之間可以存在強的相互作用。通過使某些DNA修復(fù)途徑失活可 進一步提高真核生物基因毒性檢測系統(tǒng)的敏感性(Jia等人kiences 75 :82_88，2003)。所有的BER反應(yīng)都由稱作DNA糖基化酶的特異類的DNA酶的作用而引發(fā)。糖基化 酶識別并以損害特異的方式結(jié)合于損傷位點，并且介導(dǎo)糖主鏈上受損堿基的裂解。MAGl編 碼具體參與烷基化損害修復(fù)的3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶。Magl具有廣泛的底物，其包括 由甲基化劑和乙基化劑以及其它工業(yè)烷基化劑所產(chǎn)生的損害。用出芽酵母中APm和APN2 編碼的脫嘌呤/脫嘧啶(AP)核酸內(nèi)切酶進一步處理由MaglDNA糖基化酶所產(chǎn)生的脫堿基 位點。主要需要精確的預(yù)調(diào)節(jié)篩選和遺傳工程化細胞，這可有助于濾出投入相對可以忽 略時的產(chǎn)品開發(fā)(例如，藥物開發(fā))早期的基因毒素。本發(fā)明檢測BER、NER和重組修復(fù)途徑中修復(fù)機制的誘導(dǎo)。特別有用的是顯示本轉(zhuǎn) 化的細胞和方法可用于化合物的實際藥物庫的高通量的篩選，以檢測在哺乳動物細胞中可 能有基因毒性但是被Ames、Vitotox或其它基于原核的篩選漏掉的化合物。通過修復(fù)途徑 的失活并通過由螢光素/螢光素酶反應(yīng)對β-半乳糖苷酶報告蛋白的修復(fù)信號的誘導(dǎo)的放 大，本發(fā)明對誘導(dǎo)修復(fù)的檢測極其靈敏并與Greenscreen試驗一樣以更靈敏和更可預(yù)知的方式濾出致畸變的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了包括調(diào)節(jié)元件的真核細胞，該調(diào)節(jié)元件被設(shè)置為 響應(yīng)于DNA損傷而調(diào)節(jié)報告蛋白的表達，其中所述細胞的特征在于其在DNA修復(fù)途徑中是 有缺陷的。調(diào)節(jié)元件可存在于重組載體中。重組載體序列可整合入基因組。提供了具有改變的表型的細胞，其包含更具滲透性的細胞膜和通過刪除相應(yīng)基因 而提供有效解毒的受損的輸出泵。更具體地講，所述受損的輸出泵可以是Snq2(SEQ ID NO 4 禾口 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 禾口 7)禾口 Yorl (SEQ ID NO :8 禾口 9)。提供了細胞，其中有缺陷的DNA途徑是切除修復(fù)(BER)途徑。DNA修復(fù)途徑中的缺 陷可以由MAG1(SEQ ID N0:10和11)的失活引起，并且調(diào)節(jié)元件可包括酵母RAM4啟動子 (SEQ ID NO :1)。在本發(fā)明的另一方面，提供了細胞，其中除了調(diào)節(jié)元件外重組載體還包括編碼報 告蛋白的DNA序列。所述報告蛋白可以是酶。更具體地，所述報告酶可以是半乳糖苷 酶(SEQ ID NO 2 和 SEQ IDNO 3)。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含圖1的重組載體或其功能衍生物的細胞。所述 細胞可以是諸如釀酒酵母的酵母細胞。更具體地講釀酒酵母細胞是SKAM4細胞，所述SKAM4 細胞-具有受損的輸出泵Snq2、Pdr5和^rl活性；-具有BERDNA修復(fù)途徑中的由MA Gl失活所引起的缺陷，以及-具有重組載體序列，其中RAM4調(diào)節(jié)元件可操作地連接于β-半乳糖苷酶基因。雷敏德股份有限公司(ReMynd NV)于2008年7月16日將上述SKAM4細胞保存于 比利時協(xié)調(diào)微生物保藏中心(Belgian Coordinatedcollections of Microorganisms)并 收到保藏號IHEM 22765。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種制備SKAM4細胞的方法，包括以下步驟-刪除輸出泵，-制備RAD54-β -半乳糖苷酶重組載體，-將RAD54_i3-半乳糖苷酶重組載體整合入酵母基因組，以及-使MAGl 失活。在本發(fā)明的另一方面，提供了檢測引起或加重DNA損傷的制劑的存在的方法，該 方法包括使細胞和制劑接觸并監(jiān)測基因表達，其中報告基因表達的增加表明該制劑引起或 加重DNA損傷。更具體地，提供了檢測引起或加重DNA損傷的制劑的存在的方法，該方法包 括使細胞和制劑接觸并監(jiān)測報告蛋白的活性，其中報告蛋白活性的增加表明該制劑引起或 加重DNA損傷。該方法可包括以下步驟-制備指數(shù)生長期的酵母細胞，-加入待檢測的制劑，-孵育細胞，并-監(jiān)測報告基因的表達或報告蛋白的活性。制劑可以是輻射、自由基、化學(xué)品、生物制品、環(huán)境樣本、候選藥物、食品添加劑或化妝品。在本發(fā)明的另一方面，該方法中的報告蛋白是酶，更具體地，報告蛋白是半乳 糖苷酶。在本發(fā)明的另一方面，通過向細胞培養(yǎng)物中添加包含β -半乳糖苷酶底物的裂解 緩沖液而測定報告蛋白的活性，其中所述底物直接或間接地被轉(zhuǎn)化成發(fā)光產(chǎn)物。在具體 實施例中，半乳糖苷酶底物由可被半乳糖苷酶切割成螢光素和半乳糖的D-螢光 素-O-B-吡喃半乳糖(BetaGlo )組成。螢光素可用在螢火蟲螢光素酶反應(yīng)中以產(chǎn)生光。 裂解緩沖液可包含β-半乳糖苷酶底物和螢火蟲螢光素酶，并且細胞的裂解和報告蛋白活 性的監(jiān)測可在一個步驟中進行。 在本發(fā)明的另一方面，所述方法進一步的特征在于其包括在使所述細胞和所述制 劑接觸之前向細胞培養(yǎng)物添加S9提取物的步驟。這種肝提取物允許模擬檢測制劑的代謝 以及通過肝代謝活性向DNA損傷劑的可能轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的另一方面提供了基于原核的基因毒性篩選與本文所述方法的結(jié)合。本發(fā)明的另一方面涉及將本發(fā)明的細胞用在鑒別引起或加重DNA損傷的制劑的 方法中，或涉及將本發(fā)明的細胞用在鑒別斷裂劑(clastogen)的方法中。在本發(fā)明的最后一個方面提供了包含本發(fā)明的細胞的試劑盒。


圖 1 :212T(I)-pRAD54/@GAL(FS-SK2)質(zhì)粒圖2 使用甲磺酸甲酯的Radarscreen試驗結(jié)果。對于參考化合物的圖(圖2至 圖13)的解釋，參見實施例3f。圖3 使用絲裂霉素C的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖4 使用4-硝基喹啉-氧化物的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色 未使用S9。圖5 使用萘啶酮酸的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖6 使用苯并(a)芘的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖7 使用溴化乙錠的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖8 使用順鉬的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖9 使用2-氨基芴的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖10 使用環(huán)磷酰胺的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖11 使用2-氨基蒽的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖12 使用甲基紫精的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖13 使用利福平的Radarscreen試驗結(jié)果。黑色使用S9，灰色未使用S9。圖14 具有Raderscreen試驗中參考化合物的結(jié)果的表4。對于表4 (圖14)的解 釋，參見實施例3f。
具體實施例方式定義通過“DNA損傷”我們是指細胞中DNA分子的任何變化、改變或重排。
通過“DNA修復(fù)”或“DNA修復(fù)途徑”我們是指為恢復(fù)DNA的完整性而給出的過程 或途徑。這種過程或途徑可用于檢測對細胞中DNA分子的損傷。通過“斷裂劑”我們是指引起染色體斷裂從而使得染色體區(qū)段被刪除、添加或重排 的制劑。通過“致癌物質(zhì)”我們是指與癌癥的促成有關(guān)的任何制劑。通過“重組載體”我們是指帶有選擇標(biāo)記基因的DNA分子，其作為附加體質(zhì)?；蚧?因組中的整合片段可在一個或多個宿主細胞(例如大腸桿菌和酵母)中繁殖，而且其也可 以攜帶可衍生自不同物種并對其繁殖不是必需的另外的DNA片段。通過“調(diào)節(jié)元件”我們是指調(diào)節(jié)可以與其相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄的DNA序列。通過“可操作地連接”我們是指調(diào)節(jié)元件能夠調(diào)節(jié)報告蛋白的轉(zhuǎn)錄。通過“報告基因”我們是指編碼蛋白質(zhì)的基因，其中該蛋白質(zhì)的表達可由調(diào)節(jié)元件 進行調(diào)節(jié)。通過“報告蛋白”我們是指由報告基因所編碼的蛋白質(zhì)，可以借助于適當(dāng)?shù)脑囼灣?序量化其水平。通過〃 212T (I) -pRAD54/ β GAL(FS-SK2)質(zhì)?！ㄎ覀兪侵副菊f明書的圖1中示出 的重組載體，其可以整合入酵母基因組。通過〃 SKAM4"我們是指通過遺傳修飾W303-1A菌株而構(gòu)建的酵母菌株(Thomas B.J.等人，Cell 56 :619-630,1989)，方式是刪除編碼外排泵的基因和DNA修復(fù)基因，轉(zhuǎn)化 并隨后與含有可操作地連接至β -半乳糖苷酶基因的RAM4啟動子的線性重組載體整合； 并且該酵母菌株保藏于比利時協(xié)調(diào)微生物保藏中心，保藏號是IHEM 22765。通過“S9提取物”我們是指含有細胞色素Ρ450酶的肝微粒體組分。本發(fā)明的實施方式本發(fā)明的方法提供一種新型的成本效益好的基因毒性篩選，其可用于提供預(yù)調(diào)節(jié) 篩選試驗，該預(yù)調(diào)節(jié)篩選試驗在制藥工業(yè)和其它大量化合物需要檢測的應(yīng)用中使用。該基 因毒性篩選提供高通量和低化合物消耗并且對廣譜的誘變劑，尤其是斷裂劑極其敏感。本發(fā)明的染色體畸變檢測適用于評估制劑是否可引起DNA損傷。當(dāng)評估人和DNA 損傷劑接觸是否安全時，其對于檢測引起DNA損傷的制劑特別有用。比如，該方法可用作試 驗以篩選已知的制劑，諸如輻射、自由基、化學(xué)品、生物制品、候選藥物、食品添加劑或化妝 品是否誘發(fā)DNA損傷。作為另外一種選擇，本發(fā)明的該方法可用來監(jiān)測水源或污染土壤被 含有DNA損傷劑的污染物污染的情況。本發(fā)明的篩選方法同樣可用于評估制劑是否會加重DNA損傷。例如，某些制劑會 通過抑制DNA修復(fù)(比如通過阻止修復(fù)蛋白的表達或功能)引起DNA損傷的積聚而不直接 造成DNA損傷。這些制劑通常被稱為共誘變劑(co-mutagen)。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了包括調(diào)節(jié)元件的真核細胞，該調(diào)節(jié)元件被設(shè)置 為調(diào)節(jié)報告蛋白響應(yīng)于DNA損傷的表達，其中所述細胞的特征在于其在DNA修復(fù)途徑中是 有缺陷的。在具體的實施方式中，細胞包括重組載體，其中調(diào)節(jié)元件可操作地連接于報告基 因。用在本發(fā)明的一個方面的細胞中的載體骨架可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何 合適的載體骨架，其可用于攜帶報告蛋白和調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的重組載體例如可以是質(zhì)粒、
8粘粒或病毒載體。當(dāng)復(fù)制DNA分子時這種重組載體非常有用。此外，重組載體也對用DNA 轉(zhuǎn)化細胞非常有用。骨架可包括低拷貝數(shù)的質(zhì)粒、高拷貝數(shù)的質(zhì)?；蛘陷d體。骨架可優(yōu)選地選自 熟知的載體 YCplac22、Y印lacll2、YIplac204、Ylplac211、Ulplacl28、pRS303、pRS304、 pRS305、pJW212T(BBA1762(2006)312-318)或 pRS306(R. Daniel Gietz and Akio Sugino, New yeast-escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitromutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Laboratory of Molecular Genetics. National institute of environmentalhealth sciences, research triangle park, NC, 277709. Gene (1988) 527-534)。如下文的實例所提供，在具體的實施方式中，骨架 由質(zhì)粒PJW212T構(gòu)成。在制藥工業(yè)中，在實驗室中對新型化合物進行基因毒性篩選時重組載體特別有 用。應(yīng)當(dāng)理解，由于立法涉及到經(jīng)遺傳修飾的生物的使用，因此尤其優(yōu)選載體僅用在封閉的 環(huán)境中，而不將其釋放到環(huán)境中?？蓪χ亟M載體進行設(shè)計從而使得其可以在細胞核中自主復(fù)制。在這種情況下，誘 導(dǎo)DNA復(fù)制的元件在重組載體中是必需的。因此，對于酵母來說，優(yōu)選地，載體可包括復(fù)制 起點。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說合適的復(fù)制起點是已知的。例如，來自酵母的合適元件是 來自酵母染色體DNA的酵母2mm質(zhì)粒DNA復(fù)制起點或ARS (自主復(fù)制序列)。這種復(fù)制載體 可在轉(zhuǎn)化體細胞中產(chǎn)生DNA分子的多個拷貝，并因此在需要過表達報告蛋白時是有用的。 YCplac和YEplac載體依靠與著絲粒序列結(jié)合的ARS或2u質(zhì)粒DNA復(fù)制起點，并且限制為 在每個細胞中有一個拷貝。轉(zhuǎn)化體細胞將是依據(jù)本發(fā)明的細胞。作為自主復(fù)制載體的替代，可對重組載體進行設(shè)計以便使載體和DNA分子整合入 宿主細胞的染色體。與復(fù)制的質(zhì)粒相比，這種整合的優(yōu)點是穩(wěn)定性高。在這種情況下，優(yōu)選 靶向整合(例如，通過同源重組)的DNA序列是理想的。例如，并入釀酒酵母染色體IV的 HO基因片段的重組載體有利于釀酒酵母或由其衍生的細胞系的靶向整合。也可以將整合載 體的多個拷貝整合入宿主細胞的基因組。這將實現(xiàn)更高的表達并甚至進一步增加報告蛋白 的信號輸出。重組載體可以包括至少一個可選擇標(biāo)記以允許選擇經(jīng)載體轉(zhuǎn)染的細胞，且優(yōu)選地 允許選擇具有重組載體的細胞，該重組載體并入第一方面的DNA分子。合適的可選擇標(biāo)記 的例子包括對諸如卡那霉素、氨芐青霉素等的抗生素賦予抵抗力的基因。作為另外一種選 擇或另外，可選擇標(biāo)記可包括營養(yǎng)缺陷標(biāo)記，即恢復(fù)原養(yǎng)型的那些，例如，酵母URA3、HIS3、 TRPl或LEU2基因，特別是URA3。編碼報告蛋白的DNA序列可編碼任何可被量化的蛋白質(zhì)。然而，優(yōu)選的是DNA序 列編碼酶。優(yōu)選的編碼酶的DNA序列是半乳糖苷酶的基因。用在本文中的半乳糖 苷酶包括釀酒酵母酶，該釀酒酵母酶由具有由SEQ ID NO :2所表示的核酸序列的基因編碼， 但其旨在包括等位基因變體及其含有保守或非保守變化的生物活性片段，以及任何基本相 同的核酸分子，即其與編碼釀酒酵母β -半乳糖苷酶(SEQID NO 2)的核酸分子70%、75%、 80%,85%,87%,89%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。上述基因編碼具有由SEQ ID NO :3所表示的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶，但 其旨在包括等位基因變體及其含有保守或非保守變化的生物活性片段，以及基本上相同的人工合成蛋白質(zhì)，即其與 SEQ IDNO 370%,75%,80%,85%,87%,89%,90%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。通過向細胞培養(yǎng)物中添加半乳糖苷酶底物而測量報告蛋白的報告活性。具體 的底物是D-螢光素-O-B-吡喃半乳糖苷，任選地進一步包括螢光素酶，由于其不是細胞通 透性的，所以螢光素酶必須加入到裂解緩沖液中。這種底物被半乳糖苷酶切割為螢光 素和半乳糖。然后螢光素用在螢火蟲螢光素酶反應(yīng)中以產(chǎn)生光。由于測量簡單并且酶報告蛋白與螢光素酶反應(yīng)的結(jié)合使得DNA損傷信號被放大， 因此半乳糖苷酶可用作報告蛋白。當(dāng)DAN損傷發(fā)生時，優(yōu)選地，重組DNA分子的調(diào)節(jié)元件激活報告蛋白的表達。這種 調(diào)節(jié)元件理想地包括啟動子序列，該啟動子將RNA聚合酶調(diào)動到開放讀碼框的起始密碼子 的DNA附近，并開始轉(zhuǎn)錄編碼報告蛋白的DNA。調(diào)節(jié)元件也可以包括其它諸如用于核糖體結(jié) 合的翻譯初始序列的功能DNA序列，或結(jié)合促進DNA損傷后的基因表達的轉(zhuǎn)錄因子的DNA 序列。調(diào)節(jié)元件甚至可以編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)作用以從調(diào)節(jié)的基因中驅(qū)逐轉(zhuǎn)錄抑制劑并 從而增強該基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的調(diào)節(jié)元件是與DNA修復(fù)蛋白的表達的調(diào)節(jié)天然相關(guān)的DNA序列。比如，來 自酵母基因的調(diào)節(jié)元件可用于制備存在于本發(fā)明的細胞中的重組DNA分子，上述酵母基因 是諸如但不限于 RAD2、RAD6、RAD7、RAD18、RAD23、RAD51、RAD52、RAD54、CDC7、CDC8、CDC9、 MAGI、PHRU DINT、DDR48和UB14。因此，用在本發(fā)明方法中的調(diào)節(jié)元件可包括來自酵母的 基因，諸如 RAD6、RAD7、RAD18、RAD23、RAD51、RAD52、RAD54、CDC7、CDC8、CDC9、MAGl、PHRl、 DINT、DDR48 或 1JB14。優(yōu)選的調(diào)節(jié)元件包括啟動子和RAM4修復(fù)基因的5'調(diào)節(jié)序列。這種調(diào)節(jié)元件可 來自酵母并優(yōu)選地來自釀酒酵母。在本文中使用RAM4基因，尤其包括具有由SEQ ID NO 1所表示的核酸序列的釀酒酵母RAM4啟動子，但其旨在包括等位基因變體及其含有保守 或非保守變化的生物活性片段，以及任何基本相同的核酸分子，即其與編碼釀酒酵母RAM4 啟動子(SEQ ID NO :1)的核酸分子 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、 94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。因此，大多數(shù)優(yōu)選的重組DNA分子包括如本文所定義的RAM4調(diào)節(jié)元件，其可操作 地連接于編碼酶的DNA序列。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，優(yōu)選的重組載體包括可操 作地連接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4基因。優(yōu)選的載體可包括可操作地連接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4調(diào)節(jié)元件和適于 整合入靶細胞的基因組的核苷酸序列。促進靶向整合入基因組并且可并入重組載體的其它DNA序列包括來自釀酒酵母 核糖體DNA陣列的序列。這類rDNA序列促進向釀酒酵母的染色體XII或向衍生自釀酒酵 母的細胞系的靶向整合。因此優(yōu)選的載體可包括可操作地連接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4調(diào)節(jié)元件和 適于整合入靶細胞基因組的核苷酸序列，其中該核苷酸序列可以是rDNA序列。優(yōu)選的重組載體是圖1所示的212T (I)-pRAD54/β GAL(FS-SD)質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的一方面，重組載體并入細胞。這類宿主細胞可以是真核的。優(yōu)選的 宿主細胞為諸如釀酒酵母的酵母細胞。優(yōu)選酵母是因為它們像細菌一樣可易于處理但它們是真核的，因此具有相對于細菌而言與人類更加緊密相關(guān)的DNA修復(fù)系統(tǒng)。通過遺傳修飾W303-1A菌株而構(gòu)建優(yōu)選的酵母菌株(Thomas B. J等人，Cell 56 619-630，1989)，方式是破壞外排泵和DNA修復(fù)基因、轉(zhuǎn)化以及隨后與線性化的重組載體整 合，該線性化的重組載體包含可操作地連接于報告基因的調(diào)節(jié)元件。提供了具有改變的表型的細胞，其包括更具滲透性的細胞膜和通常通過刪除相應(yīng) 基因而提供有效解毒的受損的輸出泵。更具體地講，所述受損的外排泵選自Snq2 (SEQ ID NO 4 和 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 和 7)和 Yorl (SEQ ID NO :8 和 9)。因此，在本發(fā)明的一方 面，具有改變的表型的細胞，即，酵母細胞的特征在于具有至少一個，特別是二個或三個選 自 Snq2 (SEQ ID NO :4 和 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 和 7)和 Yorl (SEQ ID NO :8 和 9)的受損 的輸出泵。如本文所用，編碼上述外排泵，即Snq2 (SEQ ID NO :4)、Pdr5 (SEQ ID NO :6)和 YorKSEQ ID NO :8)的核酸序列旨在包括等位基因變體及其含有保守或非保守變化的生物 活性片段，以及任何基本上相同的核酸分子，即其與上述編碼輸出泵的多核苷酸的任一個 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。同樣，上述外排泵蛋白質(zhì)，即 Snq2 (SEQ ID NO :5)、Pdr5 (SEQID NO 7)和 Yorl (SEQ ID NO 9)旨在包括等位基因變體及其含有保守或非保守變化的生物活性片段，以及基本 相同的人工合成蛋白質(zhì)，即其與上述輸出泵蛋白質(zhì)的任一個70^^75^^80^^85%,87%、 89%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。根據(jù)本發(fā)明，具有改變的表型的細胞的受損DNA修復(fù)途徑可以是NER、BER或重組 修復(fù)途徑中的任一個，并且通常通過所述DNA修復(fù)途徑中一個或多個基因的失活而實現(xiàn)。BER途徑中失活的基因可以是MAG1、APN1或APN2基因。NER途徑中失活的基因可 以是RAD2基因。重組修復(fù)途徑中失活的基因可以是RAD50或RAD52基因。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的具有改變的表型的細胞中的受損DNA修復(fù) 途徑包括BER途徑或NER途徑，更特別是BER途徑。BER途徑中優(yōu)選的失活基因是MAGl基 因。NER途徑中優(yōu)選的基因是RAD2基因。如本文所用MAGl基因，尤其包括具有由SEQ IDNO 10所表示的核酸序列的釀酒酵母MAGl基因，但其旨在包括等位基因變體及其含有保守或 非保守變化的生物活性片段，以及任何基本上相同的核酸分子，即其與編碼釀酒酵母RAM4 啟動子(SEQ IDNO 10)的核酸分子 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。同樣，MA Gl蛋白質(zhì)(SEQ ID NO=Il)旨在包括等位基因變體及其含有保守或非 保守變化的生物活性片段，以及基本相同的人工合成蛋白質(zhì)，即其與具有SEQ ID N0:11的 釀酒酵母 MA Gl 蛋白質(zhì) 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或 99%相同。更優(yōu)選的酵母菌株是修飾的W303-1A菌株-具有刪除的外排泵；-具有至少一個失活DNA修復(fù)途徑；-包括含有可操作地連接于報告基因的RAM4調(diào)節(jié)元件的線性化重組載體。本發(fā)明優(yōu)選的酵母細胞具有BER途徑的失活。
最優(yōu)選的酵母細胞是SKAM4細胞，其中-輸出泵Snq2、Pdr5和Yorl的活性受損；-在BERDNA修復(fù)途徑中具有由MAGl失活引起的缺陷；以及-包括重組載體，其中RAM4調(diào)節(jié)元件可操作地連接于β-半乳糖苷酶基因。根據(jù)本發(fā)明的一方面，使轉(zhuǎn)化細胞的DNA修復(fù)途徑中的一個失活。失活的DNA修 復(fù)途徑可以是NER、BER或重組修復(fù)途徑。本發(fā)明優(yōu)選的酵母細胞具有BER途徑的失活。BER途徑中失活的基因可以是MAGl、APm或ΑΡΝ2基因。NER途徑中失活的基因可 以是RAD2基因。重組修復(fù)途徑中失活的基因可以是RAD50或RAD52基因。BER途徑中優(yōu)選的失活基因是MAGl基因。NER途徑中優(yōu)選的基因是RAD2基因。可對上述外排泵或上述DNA修復(fù)途徑中的失活基因進行突變或刪除或降低其相 應(yīng)的mRNA水平。失活的蛋白質(zhì)可以是非功能性的或不表達的。通過表達下調(diào)造成的失活可以包括但不限于例如，反義RNA分子、核酶和小干擾 RNA(RNAi)分子。本發(fā)明的反義核酸分子是在細胞條件下特異性雜交(例如結(jié)合)至編碼DNA修 復(fù)蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA的那些，方式是例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑 制DNA修復(fù)蛋白的表達。該結(jié)合可以通過常規(guī)的堿基對互補，或例如在與DNA雙鏈結(jié)合的 情況下，通過雙螺旋的大溝中的特定相互作用來實現(xiàn)。設(shè)計反義分子的方法對本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說是熟知的。構(gòu)建在反義治療中有用的寡聚物的一般方法已經(jīng)進行了評論，例如， 由 Van der Krol 等人，(1988) Biotechniques 6 :958_976、Mein 等人，(1988) Cancer Res 48 :2659-2668 以及 Narayanan，R.禾口 Aktar， S. (1996) =Antisense therapy. Curr. Opin. Oncol. 8 (6) :509-15.作為非限制性實例，反義寡核苷酸可靶向與下列區(qū)域雜交mRNA帽 區(qū)、翻譯起始位點、翻譯終止位點、轉(zhuǎn)錄起始位點、轉(zhuǎn)錄終止位點、多腺苷化信號、3'非翻譯 區(qū)、5'非翻譯區(qū)、5'編碼區(qū)、中間編碼區(qū)和3'編碼區(qū)。反義構(gòu)建體例如可作為表達質(zhì)粒被遞送，當(dāng)在細胞中轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生與編碼修復(fù)基因 產(chǎn)物的細胞mRNA的至少唯一部分互補的RNA。或者，反義構(gòu)建體可表現(xiàn)為體外產(chǎn)生的寡核 苷酸探針的形式，當(dāng)被引入表達修復(fù)基因的細胞時，該寡核苷酸探針通過與mRNA和/或編 碼修復(fù)基因的基因組序列雜交而產(chǎn)生對相應(yīng)基因的選擇性抑制。這種寡核苷酸探針優(yōu)選 為修飾的寡核苷酸，其對諸如核酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶的內(nèi)源性核酸酶有抵抗力，因 此在體內(nèi)穩(wěn)定。就反義DNA而言，衍生自編碼修復(fù)基因的核苷酸序列的翻譯起始位點(例 如，-10和+10之間的區(qū)域)的寡脫氧核苷酸是優(yōu)選的。反義分子可以被遞送到體內(nèi)表達修復(fù)基因的細胞內(nèi)。已經(jīng)開發(fā)了許多將反義DNA 或RNA遞送至細胞內(nèi)的方法，并且這些方法在本領(lǐng)域是熟知的。由于反義分子的細胞內(nèi)濃 度要達到足以抑制內(nèi)源性mRNA的翻譯通常是困難的，因此優(yōu)選的方法是利用重組DNA構(gòu)建 體，其中反義寡核苷酸被置于強啟動子的控制之下。用這樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染受試者的靶細胞 優(yōu)選會導(dǎo)致單鏈RNA的轉(zhuǎn)錄，該單鏈RNA會以足夠的量與編碼受關(guān)注基因產(chǎn)物的內(nèi)源性轉(zhuǎn) 錄物雜交以阻止各個mRNA的翻譯。例如，可在體內(nèi)引入載體以便使其被細胞攝入并指導(dǎo)反 義RNA的轉(zhuǎn)錄。只要其可以被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生所需的反義RNA，這樣的載體可保持為附加體或可 變成染色體整合的?？赏ㄟ^本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建這種載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的其它載體，其用于在哺乳動物細胞中復(fù)制和表達。編碼反義RNA的序列的表達可通過本領(lǐng)域已知的在哺乳動物中作用并優(yōu)選在人 類細胞中起作用的任何啟動子進行。這種啟動子可以是可誘導(dǎo)的或組成型的。這種啟 動子可以包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290 304-310)、包含在勞氏肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto等人，1980， Cell 22 :787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner 等人，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :1441-1445)以及金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，1982，Nature 296 :39-42)。核酶也可以下調(diào)修復(fù)基因產(chǎn)物的表達。核酶分子被設(shè)計用來催化地裂解受關(guān)注基 因的轉(zhuǎn)錄物，阻止其翻譯為多肽。(參見例如，Sarver等人，(1990) Science 247 :1222-1225 和美國專利No. 5，093，246)。一般而言，核酶催化RNA中磷酸二酯鍵的位點特異性的切割或 接合。盡管在位點特異性識別序列處切割mRNA的多種形式的核酶可用來破壞修復(fù)基因的 mRNA,但優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀和發(fā)夾狀核酶是RNA分子，其通過與互補性RNA靶序 列堿基配對以及在特定位點進行切割反應(yīng)而起作用。對于錘頭狀核酶來說，該核酶在UX 二 核苷酸之后切割，其中X可以是除鳥苷之外的任何核糖核苷酸，盡管當(dāng)X是胞嘧啶時切割速 率最高。催化效率進一步受到尿苷之前的核苷酸的影響。在實際中，NUX三聯(lián)密碼(通常 為⑶C、⑶C或UUC)在靶mRNA中是必需的。這類靶mRNA用于設(shè)計大約12或13個核苷酸 的反義RNA，這些核苷酸包圍該位點但跳過不與核酶形成常規(guī)堿基對的C。合成錘頭狀核酶可被工程化改造為選擇性地結(jié)合和切割互補的mRNA分子，然后 釋放片段，以蛋白酶的功效重復(fù)該過程。與例如不是催化的但可是化學(xué)計量的，與靶序列形 成1 1復(fù)合物的反義寡核苷酸相比，這可顯示出顯著的優(yōu)勢。本發(fā)明的錘頭狀酶可被設(shè)計 為6-4-5莖-環(huán)-莖的結(jié)構(gòu)或適用于該目的之任何其它的結(jié)構(gòu)。一般而言，由于化學(xué)切割 步驟是迅速的而釋放步驟是限速的，因此如果核酶的雜交“臂”(螺旋I和III)相對較短， 比如約5或6個核苷酸，則速度和特異性提高。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種試驗，可以 經(jīng)驗地確定具體結(jié)構(gòu)設(shè)計的適用性。通過本領(lǐng)域已知的任何用于合成這類分子的方法可制備本發(fā)明的反義RNA和核 酶分子。這些包括用于化學(xué)合成本領(lǐng)域熟知的寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技術(shù)， 如固相磷酰胺化學(xué)合成。作為另外一種選擇，可通過在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子 的DNA序列產(chǎn)生RNA分子。這類DNA序列可被并入多種包含合適的RNA聚合酶啟動子的載 體?；蛘撸梢允褂媒M成型地或誘導(dǎo)性地合成反義RNA(取決于所用的啟動子)的反義cDNA 構(gòu)建體。在刪除或敲除中，靶基因表達是檢測不到的或可忽略的。修復(fù)基因的敲除指修復(fù) 基因的功能表達顯著減少以使得修復(fù)蛋白表達是檢測不到的或以降低的水平存在。這可 以通過多種機制來實現(xiàn)，這些機制包括對編碼序列引入破壞，如插入一個或多個終止密碼 子、插入DNA片段等、刪除或部分刪除編碼序列、用終止密碼子取代編碼序列等。在一些情 況下，最終從基因組中刪除外源轉(zhuǎn)基因序列，留下自然序列的凈變化?？墒褂貌煌姆椒?來進行“敲除”?？梢哉T導(dǎo)全部或部分自然基因的染色體刪除，包括非編碼區(qū)，特別是啟動 子區(qū)、3'調(diào)節(jié)序列、增強子的刪除，或激活修復(fù)基因表達的基因的刪除。也可以通過引入 阻斷自然基因表達的反義構(gòu)建體來進行功能敲除(例如，參見Li和Cohen(1996)Cell 85:319-329)?！扒贸边€包括條件敲除，例如通過使細胞與促進靶基因改變的物質(zhì)接觸而使靶 基因發(fā)生改變、在靶基因位點(例如Cre-Iox系統(tǒng)中的Cre)引入促進重組的酶或本領(lǐng)域已 知的其它方法。用于同源重組的DNA構(gòu)建體將包括帶有所需遺傳修飾的修復(fù)基因的至少一部分， 并將包括與靶基因座同源的區(qū)域。通過同源重組而產(chǎn)生具有靶基因修飾的細胞的方法 在本領(lǐng)域是已知的。對于轉(zhuǎn)染真核細胞的各種技術(shù)，參見Keown等人(1990)Methods in Enzymologyl85:527_537。本發(fā)明的另一酵母細胞可具有不止一種的失活修復(fù)基因。提供了具有改變的表型的細胞，其包括更具滲透性的細胞膜和通過刪除相應(yīng)基因 而提供有效解毒的受損的輸出泵。更具體地講，所述受損的輸出泵可以是Snq2、Pdr5和 ^rl。根據(jù)本發(fā)明的方面，所述轉(zhuǎn)化的細胞可具有改變的表型，其包括更具滲透性的細 胞膜和/或細胞壁以及提供有效解毒的受損的輸出泵。如本文上面所描述，可以通過反義 RNA分子、核酶、經(jīng)由同源重組的刪除或通過抑制劑而獲得這種改變的表型。與細胞壁的完 整性有關(guān)的基因是例如ERG6。在優(yōu)選的實施方式中，受損的輸出泵為Snq2、Pdr5和Yorl。盡管不排除不穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化(瞬態(tài))細胞的使用，但是用于表達由DNA分子編碼的 蛋白質(zhì)的宿主細胞最好是被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的另一個方面，提供了制備SKAM4細胞的方法，該方法包括以下步驟-刪除輸出泵；-制備RAD54-β -半乳糖苷酶重組載體；-將RAD54-β -半乳糖苷酶重組載體整合入酵母基因組；以及-使MAGl 失活。根據(jù)本發(fā)明的方面的遺傳工程化細胞可通過實施例中描述的步驟來制備。根據(jù)本 發(fā)明的一個方面的細胞最好是諸如酵母的單細胞生物(比如上述菌株中的一種)。本發(fā)明的方法可包括使細胞(諸如SKAM4酵母細胞)與制劑接觸并監(jiān)測基因表 達，其中報告基因表達的增加表明該制劑引起或加重DNA損傷。本發(fā)明的方法可包括使諸 如SKAM4酵母細胞的細胞和制劑接觸并監(jiān)測報告蛋白的活性，其中報告蛋白活性的增加表 明該制劑引起或加重DNA損傷。根據(jù)本發(fā)明的方法，這種遺傳工程化細胞可用于評估制劑是否誘發(fā)或加重DNA損 傷。響應(yīng)于DAN損傷誘導(dǎo)半乳糖苷酶的表達。底物由半乳糖苷酶進行切割。依據(jù) 所用的底物和可能的另外的反應(yīng)，可通過適當(dāng)?shù)姆绞?例如但不限于色度計、熒光計或光 度計)測量最終的反應(yīng)產(chǎn)物以作為所引起的DNA損傷的指標(biāo)。斷裂之后，可在限定數(shù)目的完整細胞的懸浮液中或從細胞所釋放的限定量的材料 來評估對DNA損傷的反應(yīng)。本發(fā)明的一方面的方法對檢測在低濃度下誘發(fā)DNA損傷的制劑 特別有用。該方法可用于篩選諸如輻射、自由基、化學(xué)品、生物制品、環(huán)境樣本、候選藥物、食 品添加劑或化妝品的制劑以評估活生物體(尤其是人)與這種制劑接觸是否安全。本發(fā)明的方法可用來檢測來自可疑污染點的水源或土壤樣本是否被DAN損傷劑 或加重DNA損傷的制劑所污染。比如，這類方法可用來監(jiān)測工業(yè)廢水中污染物的存在，該污 染物可導(dǎo)致與污染接觸的人或其它生物中DNA損傷的加重。
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本發(fā)明的方法可包括以下步驟-制備指數(shù)生長期的酵母細胞；-加入待檢測的制劑；-孵育細胞；以及-監(jiān)測報告基因的表達或報告蛋白的活性。本發(fā)明方法中的報告蛋白可以是酶，最優(yōu)選的酶是半乳糖苷酶。通過向細胞培養(yǎng)物中添加含有β -半乳糖苷酶底物的裂解緩沖液而測定報告蛋 白的活性，其中底物被直接或間接地轉(zhuǎn)化為可測的產(chǎn)物，諸如但不限于有色產(chǎn)物、化學(xué)發(fā)光 產(chǎn)物或熒光產(chǎn)物。β -半乳糖苷酶可將β -半乳糖苷酶底物切割成例如螢光素和半乳糖，其中螢光 素然后被用在螢火蟲螢光素酶反應(yīng)中以產(chǎn)生光。在本發(fā)明的方法中，裂解緩沖液可含有β-半乳糖苷酶底物和螢火蟲螢光素酶， 并且細胞的裂解和報告蛋白活性的監(jiān)測可以在一個步驟中進行。當(dāng)開始實驗時，指數(shù)生長中的酵母細胞優(yōu)選地具有1至3之間的密度?？梢允褂?不同類型的多孔板，優(yōu)選使用96孔板。制劑可以不同的濃度加入。多孔板的孵育可在1小 時至12小時之間完成，優(yōu)選為6小時。孵育溫度應(yīng)該在20°C和37°C之間，優(yōu)選在30°C?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)牟煌呀饩彌_液，優(yōu)選Beta-Glo 細胞裂解緩沖液。 Beta-Glo 細胞裂解緩沖液含有β -半乳糖苷酶底物和用于螢光素酶反應(yīng)所有必需的 因子?？上蛄呀饩彌_液中加入不同的β -半乳糖苷酶底物，諸如但不限于 -Galacton 、Galacton-start 或Galacton-plus -螢光素二-β-D-吡喃型半乳糖、試鹵靈β-D-吡喃型半乳糖、甲基傘形酮 酰- β -D-吡喃型半乳糖、4-甲基傘形酮酰- β -D-吡喃型半乳糖、螢光素二(β -D-吡喃型 半乳糖)-鄰-硝基苯-β -D-吡喃型半乳糖、氯酚紅(chlorofenol red)-β-D-吡喃型半 乳糖或D-螢光素-ο- β -吡喃型半乳糖。優(yōu)選地，底物是D-螢光素-ο- β -吡喃型半乳糖。在孵育的開始和結(jié)束，通過在595nm下用分光光度法測定濁度而確定細胞的數(shù) 量。加入例如底物之后，用發(fā)光儀測量產(chǎn)生的光。針對細胞密度校正發(fā)光信號。用樣本發(fā) 光值除以參考發(fā)光值來計算標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光值。在本發(fā)明的方法中制劑可被代謝。可通過在酵母報告菌株中表達各個哺乳動物酶 而完成被測制劑的代謝。作為另外一種選擇，存在于后線粒體(post mitochandriaDsg提 取物并包括微粒體的哺乳動物肝臟酶可加入本發(fā)明的方法中。因此可用附加的步驟進行如上描述的方法，其中在待測制劑加入之前將S9提取 物加入到細胞中。S9提取物是含有細胞色素P450酶的肝微粒體組分。所以本發(fā)明的方法的進一步特征在于其包括在使所述細胞和所述制劑接觸之前 向細胞培養(yǎng)物中添加S9提取物的步驟。諸如例如Vitotox 的基于原核的基因毒性篩選對誘變化合物的檢測非常靈敏。 本發(fā)明在檢測致畸變和致癌化合物方面非常靈敏。當(dāng)基于原核的基因毒性篩選與本發(fā)明結(jié) 合時，將以非常靈敏的方式檢測全部范圍的DNA損傷劑。
因此本發(fā)明另一方面是基于原核的基因毒性篩選和本發(fā)明方法的結(jié)合。本發(fā)明還包括在鑒定引起或加重DNA損傷的制劑的方法中使用本發(fā)明的細胞，而 且更具體地，包括在鑒定斷裂劑的方法中使用細胞?？蓪⒈疚拿枋龅闹苿┖图毎b進試劑盒。因此，在第一容器中可存在一種或多 種制劑，而且試劑盒可任選地在第二容器中包括一種或多種制劑。試劑盒可包括描述本發(fā) 明方法的說明書。制劑、細胞、容器和/或說明書可存在于包裝內(nèi)。試劑盒的內(nèi)容物可包含但不限于冷凍的細胞、生長培養(yǎng)基、緩沖液、多孔板、S9提 取物+輔因子、酶底物、參考化合物等。實驗部分實施例1 :S9提取物的制備從成年雄性Wi star大鼠制備S9提取物。對大鼠腹膜內(nèi)注射Aroclor 1254 (500mg/ kg體重)在玉米油中的溶液(20% w/v)。五天后，大鼠被斷頸處死。將肝在攪拌機中切碎并 用波特勻漿器(potterhomogenizer)在3倍體積的磷酸鹽緩沖液中均漿。將勻漿物在9000g 下離心15分鐘。將上清液(S9組分)轉(zhuǎn)移到保存在液氮中的無菌安瓿(sterile ampule) 中。實施例2 :SKAM4菌株的構(gòu)津酵母菌株SKAM4具有整合在URA3基因座的β -半乳糖苷酶基因(其在RAM4啟 動子的轉(zhuǎn)錄控制下)。另外，編碼外排泵(Snq2、Pdr5*^rl)的基因和編碼涉及DNA修復(fù) 的蛋白質(zhì)的基因(Magl)被刪除。實施例加=SPY菌株的構(gòu)建菌株 W303-1A (參見B. J. Thomas, R. Rothstein, Elevatedrecombination rates in transcriptional active DNA, Cell 56 (1989) 619-630)用于通過同源重組刪除 SNQ2。使用引物SNQ2F和SNQ2R以及使用酵母snq2: KanMX刪除菌株(Euroscarf Acc. NO.Y03951)的基因組DNA作為模板生成PCR片段。該片段轉(zhuǎn)化進入W303-1A細胞，并在合 適的含有抗生素G418的固體生長培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。這樣得到了菌株W3_dS。接下來，用引物PDR5F1和PDR5R以及適當(dāng)?shù)臄y帶HIS3基因的質(zhì)粒(釀酒酵母) 作為模板生成PCR片段。該片段轉(zhuǎn)化進入菌株W3_dS，并在合適的缺乏組氨酸的固體生長培 養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。這樣得到了菌株W3_dSP。接下來，用引物Y0RF1和Y0R1R以及合適的攜帶TRPl基因的質(zhì)粒(釀酒酵母)作 為模板來生成PCR片段。該片段轉(zhuǎn)化進入菌株W3_dSP，并在合適的缺乏色氨酸的固體生長 培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。這樣得到了菌株W3_dSPY。實施例2b 質(zhì)粒 212T(I)-pRAD54/0 GAL(FS-SK2)的構(gòu)建用XbaI切割質(zhì)粒pJW212T(BBA 1762 (2006) 312-318)，并且將載體骨架連接到稱 為pXY212T(I)的環(huán)形質(zhì)粒。隨后，將含有β-半乳糖苷酶基因的DNA片段克隆(用限制酶 BamHI 和 MuI)進入 ρΧΥ212Τ (I)，得到質(zhì)粒 212Τ (I)-LacZ。用引物RAM4P_R 以及酵母(釀酒酵母)基因組DNA作為模板通過PCR生成含有RAM4啟動子的DNA片段， 并將該片段克隆(使用限制酶BamHI和NgoMVI)進入質(zhì)粒212T (I)-LacZ。這樣得到了質(zhì)粒 212T (I) -pRAD54/ β GAL (FS-SK2)，其包含RAM4啟動子和β -半乳糖苷酶基因的功能性融合。
實施例2c 質(zhì)粒 212T (I) -pRAD54/ β GAL (FS-SK2)整合入 W3_dSPY用SbfI切割質(zhì)粒2121(1)- 肌054/0 641^爾5-51(2)，并隨后轉(zhuǎn)化到菌株13_(15卩￥。 在合適的缺乏尿嘧啶的固體生長培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。這樣得到了菌株SK2A3。實施例2d 菌株SK2A3中Magl的刪除然后，用引物MAG1/Leu2-Fl和MAG1/Leu2-Rl以及適當(dāng)?shù)臄y帶LEU2基因的質(zhì)粒 (釀酒酵母)作為模板生成PCR片段。該片段轉(zhuǎn)化進入SK2A3細胞，并且在合適的缺乏亮氨 酸的固體生長培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化株。這樣得到了菌株SKAM4?；蛐蚐KAM4 MATa leu2_3/112 ura3_l trpl-92 his3_ll，15 ade2-lcanl_100s nq2::kanMX4pdr5::HIS3yorl::TRP1 ura3::URA3/pRAD54-β GAL magi::LEU2。在實施例2a、2b和2d中所用的引物序列SNQ2F5' -CCGCCCATTTCCGTTTAAATCCG-3‘SNQ2R5' -TTTTCCTGTGTCCAATTTTTTTATTTTC-3'YORFl5' -AAAAGATTAATATTACTGTTTTTATATTCAAAAAGAGTAAAGCCGTTGCTATATACGAATCAGATTTTATGTTTAGATCTTTTATGCTT-3‘YORlR5' -GTACCATCGGCAACATATAAATAAATAAAAGAGAAAAATCATGCAACAAATAATATAAATGAGGGCCAAGAGGGAGGGCAT-3‘PDR5F15' -AAGAAATTAAAGACCCTTTTAAGTTTTCGTATCCGCTCGTTCGAAAGACTTTAGACAAAAGAGTGCACCATAATTCCGTTTTAAGA-3‘PDR5R5' -ATGTTTATTAAAAAAGTCCATCTTGGTAAGTTTCTTTTCTTAACCAAATTCAAAATTCTATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTT-3‘RAD54P_F5' -TGGTACCGGGCCGGCTGCGCTACGGTTCCTGCCGCTC-3'RAD54P_R5' -GTACCCGGGGATCCATGCATCAGTTATAAGGAAATATATATGGTACC-3‘MAG1/Leu2-Fl5 ‘ -TAAGTTATCTATGAATCAATGAGAATTGGCCACTGCCCTCTGATATGACGATGGAAGTGGGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC-3‘MAG1/Leu2-Rl5 ‘ -CCCTACGAGAAGCTGTAAATATGAATTTCTTTAGTAGGCATCACACACAACAATAGGGTGGGTCCGGTTAAACGGATCTCGCATTGATGAGGCAAC實施例3 具有發(fā)光和S9代謝活化的Radarscreen試驗實施例3a:原理
酵母菌株SKAM4攜帶RAD54-LacZ報告構(gòu)建體，該報告構(gòu)建體對影響其基因組DNA 完整性的制劑敏感。供給在生長培養(yǎng)基中的化合物可以通過確定它們對報告基因表達的影 響而評估其基因毒性。通過向酵母培養(yǎng)物中加入含有β-半乳糖苷酶底物的Beta-Glo 細胞裂解緩沖液而測定報告活性。β-半乳糖苷酶將底物切割成螢光素和半乳糖。螢光素 然后用在螢光素酶反應(yīng)中以產(chǎn)生光。通過加入后線粒體上清液S9來實現(xiàn)化合物的代謝活 化。實施例北設(shè)備和產(chǎn)物設(shè)備酶標(biāo)儀:Multiskan Ascent 型號 354(ThermoLabsystems)微孑L板搖床Titramax 101 (Heidolph Instruments)微量滴定板蓋聚苯乙烯、無菌(Greiner =#656161)96孔微孔板聚苯乙烯細胞培養(yǎng)物μ透明白色(Greiner =#655098)酶標(biāo)儀發(fā)光infinite M20(yTecan產(chǎn)物BAP (苯并[A]芘)適當(dāng)時每孔加入2 μ 1 BAP (500 μ g/ml)
Beta-Glo 檢測系統(tǒng)目錄編號E4740 (promega) IOOml裂解緩沖液在-20°C下以IOml的份保存后線粒體S9 提取物 Trinova Biochem (Moltox of Notox) (#11-101. 8) 8ml 提取物 在-80°C下以400 μ 1的份保存葡萄糖-6-磷酸Sigma (#G6526)-IgNADP Sigma(#N5755_250MG)KP04Sigma(#P3786_100G)MgCl2 六水合物 VWR (#1. 05833. 0250)酵母生長培養(yǎng)基=SC-URA (液體/固體)將下列組分溶于蒸餾水-0. 77g/l CSM-URA(MP biomedicals#4511_222)-用于生物化學(xué)的5g/l 的硫酸銨(Fw 132, 14) (Merck #1. 01211. 1000)-1. 7g/l酵母氮源W/0硫酸銨&氨基酸(Remel =#459932 ；由Oxoid發(fā)行)-0. 05g/l 腺嘌呤(6-氨基嘌呤，F(xiàn)w :135. 1) (MP biomedicals#4060_012)在120°C下高壓蒸汽滅菌的溶液20分鐘。加入2%D(+)_葡萄糖-一水合物(50ml/ 1來自40%的蒸餾水高壓蒸汽滅菌的溶液)(Merck #1. 08342. 2500，F(xiàn)w :196. 17)。作為另 外一種選擇，立即加入D (+)-葡萄糖-一水合物并且采用過濾方法對溶液消毒。將培養(yǎng)基 在室溫下存儲。在固體培養(yǎng)基的情況下，消毒前在溶液中加入2%瓊脂(Oxoid :#LP0011)，并用4M NaOH 將 pH 調(diào)至Ij 6. 5。實施例3c 方法從-80°C用SKAM4細胞貯液配制平板培養(yǎng)物。該平板可儲存+/_2個月。在100ml錐形瓶(erlenmeyer)中的50ml培養(yǎng)基中接種來自平板培養(yǎng)物的少量細 胞，并在30°C，200rpm下過夜生長，從而制得菌株SKAM4的液體貯液培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物可以
18在4°C下儲存并可在至少1到2周用于隨后的實驗。第一天把5、10、20、40、80μ 1貯液培養(yǎng)物接種到50ml培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm下過夜 生長。目的是在第二天得到具有約1至3的OD595的至少一種培養(yǎng)物。第二天制備使用和未使用S9的S9-混合物。以下給出一個微量滴定板所需的毫升數(shù)
權(quán)利要求
1.一種真核細胞，其特征在于-存在重組載體，其中RAM4調(diào)節(jié)元件可操作地連接于報告蛋白； -有缺陷的堿基切除修復(fù)(BER)途徑；以及 -受損或降低的輸出泵活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核細胞，其中所述重組載體被整合入基因組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的真核細胞，其中所述輸出泵是Snq2、Pdr5和 ^rl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的真核細胞，其中所述報告蛋白是β-半乳糖苷酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的真核細胞，其中所述重組載體是圖1的載體或 其功能衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的真核細胞，其中所述真核細胞是酵母細胞，特別 地，所述酵母細胞是SKAM4細胞，所述SKAM4細胞-具有重組載體序列，其中所述RAM4調(diào)節(jié)元件可操作地連接于報告蛋白； -在BER DNA修復(fù)途徑中具有由MAGl的失活所引起的缺陷；以及 -具有受損的輸出泵Snq2、Pdr5和^rl活性。
7.一種用于制備權(quán)利要求1至6中所定義的細胞的方法，其包括以下步驟 -制備RAD54-報告基因重組載體；-將所述RAD54-報告基因重組載體整合入基因組中； -使所述BER途徑失活； -刪除所述輸出泵。
8.一種包括使根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的細胞與制劑接觸并監(jiān)測所述報告蛋白的 活性的方法，其中報告基因表達和/或報告蛋白活性的增加表明所述制劑引起或加重DNA 損傷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步驟 -制備指數(shù)生長期的酵母細胞；-加入待測制劑； -孵育所述細胞；以及-監(jiān)測所述報告基因的表達或所述報告蛋白的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中通過向細胞培養(yǎng)物中加入含有半乳糖苷酶 底物的裂解緩沖液而測定所述報告蛋白的活性，其中所述底物直接或間接地轉(zhuǎn)化為發(fā)光產(chǎn) 物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶底物被β-半乳糖苷酶切 割成螢光素和半乳糖，并且其中所述螢光素然后用在螢火蟲螢光素酶反應(yīng)中以產(chǎn)生光。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述裂解緩沖液包含半乳糖苷酶底物和螢 火蟲螢光素酶，并且所述細胞的裂解和所述報告蛋白活性的監(jiān)測在一個步驟中進行。
13.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項所述的方法，進一步的特征在于其包括在使所述細 胞與所述制劑接觸之前向細胞培養(yǎng)物中添加S9提取物的步驟。
14.基于原核的基因毒性篩選與根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項所述的方法的結(jié)合。
15. 一種包含權(quán)利要求1至6中任一項所定義的細胞的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測引起或加重DNA損傷的制劑的改進方法，并涉及可有效地用在該等方法中的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的細胞。
文檔編號C12N5/00GK102124099SQ200980131715
公開日2011年7月13日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者A·勞維斯, G·J·格里費恩, H·R·杜哈梅爾, N·梵達梅 申請人:雷敏德股份有限公司