專利名稱：增強的內(nèi)毒素檢測的制作方法
增強的內(nèi)毒素檢測相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年8月18日提交的美國專利申請12/193，169號的優(yōu)先權(quán)，該申 請內(nèi)容的全文以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
內(nèi)毒素，也被稱為脂多糖(LPQ，是革蘭氏陰性菌細胞膜的組成部分，并且是在革 蘭氏陰性菌敗血癥期間發(fā)生的許多毒性效應(yīng)(即便不是全部)的原因。LPS是由與被稱為 脂質(zhì)A的保守的葡萄糖胺類磷脂共價結(jié)合的可變多糖結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的糖脂的混合物。LPS直 接刺激宿主單核細胞和巨噬細胞分泌許多種炎性細胞因子，這些炎性細胞因子包括腫瘤壞 死因子-I (TNF-I)、白介素-I(IL-I)和白介素-8(IL-8)。由宿主巨噬細胞過度釋放的這些 細胞因子促使在革蘭氏陰性菌敗血癥發(fā)作之后出現(xiàn)器官衰竭和死亡。LPS表現(xiàn)的促炎生物 活性通常存在于脂質(zhì)A部分。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供檢測樣本中的革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法。例如，提供檢測樣本中的 革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，該方法包括在非活性酸性蛋白酶存在下使樣本與一種或多 種脂多糖結(jié)合多肽接觸，以及確定該一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是否與樣本結(jié)合。結(jié)合則 表明樣本中含有革蘭氏陰性菌或脂多糖。本文還提供檢測樣本中的革蘭氏陰性菌或脂多糖 的方法，該方法包括在導(dǎo)致樣本中蛋白質(zhì)降解的條件下使樣本與活性酸性蛋白酶接觸，在 非活性酸性蛋白酶存在下使樣本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸，以及確定該一種或多 種脂多糖結(jié)合多肽是否與樣本結(jié)合。提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，該方法包括在導(dǎo)致樣本中蛋白質(zhì) 降解的條件下使樣本與活性酸性蛋白酶接觸，進一步使樣本與變形細胞溶解物接觸，以及 確定在變形細胞溶解物中是否發(fā)生了凝膠化反應(yīng)。提供用于檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的試劑盒。該試劑盒包含酸性蛋白 酶。該試劑盒還包含一種或多種變形細胞溶解物和/或一種或多種脂多糖結(jié)合多肽。下面的附圖和說明書中闡明了一方面或多方面的細節(jié)。從說明書、附圖和權(quán)利要 求書中將顯而易見其它特征、目的和優(yōu)點。


圖 1A-1D 顯示用 EndoPi^p 蛋白酶組合物(BioDtech，Inc.，Birmingham, AL)處 理肽X。圖IA是PPC抑制試驗圖，顯示在內(nèi)毒素檢測中克服肽X的抑制作用所需的肽稀釋 程度。圖IB顯示在用Endoft^p 蛋白酶組合物處理前和處理后肽X樣本中的lEU/ml PPC 的回收。圖IC顯示肽X樣本中的確定內(nèi)毒素污染物的回收。圖ID是PAGE凝膠圖像，顯示 用Endoft·印 蛋白酶組合物處理的肽X降解。圖2A-2C顯示用Endoft^p 蛋白酶組合物處理Sushi3肽。圖2A是PPC抑制試驗圖，顯示在內(nèi)毒素檢測中克服Sushi3肽的抑制作用所需的肽稀釋程度。圖2B顯示Sushi3 肽樣本中的確定內(nèi)毒素污染物的回收。圖2C是PAGE凝膠圖像，顯示用Endoft^p 蛋白酶 組合物處理的Sushi3肽降解。圖3A-;3B顯示用Endear印 蛋白酶組合物處理血紅蛋白。圖3A顯示牛紅細胞的 血紅蛋白樣本中的內(nèi)源性內(nèi)毒素污染物的回收。圖3B是PAGE凝膠圖像，顯示用EndoPi^p 蛋白酶組合物處理的血紅蛋白降解。凝膠在非還原條件下移動產(chǎn)生三個不同的血紅蛋白 群。標明了每個血紅蛋白群和Endoft^p 蛋白酶的位置。圖4A-4B顯示用Endoft^p 蛋白酶組合物處理BSA。圖4A是顯示BSA樣本中確 定的內(nèi)毒素污染物回收的圖。圖4B是PAGE凝膠圖像，顯示用Endoft·印 蛋白酶組合物處 理的BSA降解。標明了 BSA和Endoft·印 蛋白酶的位置。圖5A-5B顯示用Endoft^p 蛋白酶組合物處理IgG。圖5A是來自血漿的兔IgG樣 本中確定的內(nèi)毒素污染物回收的圖。圖5B是PAGE凝膠圖像，顯示用Endoft·印"^蛋白酶組 合物處理的IgG降解。凝膠在還原條件下移動導(dǎo)致輕鏈與重鏈的分離。消化導(dǎo)致重鏈分裂 為大片段和小Fc片段。標明了重鏈和輕鏈、EndoPr印"^蛋白酶以及消化產(chǎn)物的位置。圖6顯示胃蛋白酶對重組因子C(rFC)活性的影響。顯示的數(shù)據(jù)來自60分鐘的 PyroGene Lonza(WalkerSVille，MD)溫育。數(shù)據(jù)點帶閉合黑圓的黑色實線表示得自水中 LPS的結(jié)果。數(shù)據(jù)點帶空心圓的黑色實線表示得自含0.05%胃蛋白酶的水中LPS的結(jié)果。 數(shù)據(jù)點帶三角形的黑色虛線表示水的值。熒光的增強證明用胃蛋白酶處理提高了 rFC酶的 活性。
具體實施例方式由于內(nèi)毒素含有負電荷、脂質(zhì)和碳水化合物，因此已知許多蛋白質(zhì)與內(nèi)毒素結(jié)合 并影響以試驗正確檢測內(nèi)毒素的能力。具體來說，與內(nèi)毒素結(jié)合的蛋白質(zhì)在標準試驗中可 引起抑制或增強，導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果并影響精度。例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑(如大 豆胰蛋白酶抑制劑、α 2巨球蛋白、抑肽酶、抗纖溶酶、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶和水蛭素) 妨礙內(nèi)毒素的檢測方法。如下面的例子所述，用酸性蛋白酶處理包括血清及血液樣本在內(nèi) 的這種樣本可降解樣本中的蛋白質(zhì)而不影響內(nèi)毒素，因此可提高內(nèi)毒素檢測試驗的精度。 酸性蛋白酶可用于例如LAL、因子C和細胞因子ELISA試驗。有許多試驗方法可用于診斷 革蘭氏陰性菌感染。制藥和醫(yī)療行業(yè)中目前采用的試驗方法基于被稱為鱟變形細胞溶解物 (LAL)的物質(zhì)。所述溶解物含在內(nèi)毒素存在時發(fā)生反應(yīng)的蛋白質(zhì)。因子C是絲氨酸蛋白酶酶原。它是由LPS激活以啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)的圓尾鱟變形 細胞溶解物(C. rotundicauda amebocyte lysate,CAL)中的關(guān)鍵酶。因子C的活性是對用 于藥劑產(chǎn)品質(zhì)量控制的內(nèi)毒素進行毫微微克水平的靈敏試驗的基礎(chǔ)。因子C在內(nèi)毒素檢測 中的重要性已導(dǎo)致將重組因子C(rFC)的表達作為用以減少內(nèi)毒素檢測靈敏度的批次變化 和季節(jié)性變化的替代源。諸如非活性胃蛋白酶和非活性HIV蛋白酶的非活性酸性蛋白酶通過充當分子伴 侶并保持因子C的適當構(gòu)象而增強因子C的活性。非活性蛋白酶和非活性HIV蛋白酶充當 分子伴侶的能力已有描述(Hulko等人，Protein Sciencel6 :644-53 (2007))。本文提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的改進方法和試劑盒。例如，本文提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，該方法包括在非活性酸性蛋白酶存在下使樣 本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸，以及確定該一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是否與樣本 結(jié)合。結(jié)合則表明樣本中含有革蘭氏陰性菌或脂多糖。任選地，該方法進一步包括在使樣 本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸之前使酸性蛋白酶失活。任選地，該方法進一步包括 在使樣本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸之前，在導(dǎo)致樣本中蛋白質(zhì)降解的條件下使樣 本與活性酸性蛋白酶接觸。本文提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，該方法包 括在導(dǎo)致樣本中蛋白質(zhì)降解的條件下使樣本與活性酸性蛋白酶接觸，在非活性酸性蛋白酶 存在下使樣本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸，以及確定該一種或多種脂多糖結(jié)合多肽 是否與樣本結(jié)合。結(jié)合則表明樣本中含有革蘭氏陰性菌或脂多糖。任選地，該方法進一步 包括在樣本與活性酸性蛋白酶接觸之后使酸性蛋白酶失活。任選地，消化緩沖液包含活性 酸性蛋白酶。任選地，約7. 0的pH值使酸性蛋白酶失活。本文還提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，該方法包括在導(dǎo)致樣本 中蛋白質(zhì)降解的條件下使樣本與活性酸性蛋白酶接觸，進一步使樣本與變形細胞溶解 物接觸，以及確定變形細胞溶解物中是否發(fā)生凝膠化反應(yīng)。凝膠化反應(yīng)表明樣本含有 革蘭氏陰性菌或脂多糖。任選地，變形細胞溶解物選自鱟魚(Limulus polyphemus)、中 H W (Tachypleus tridentatus) ^01 (Carcinoscorpiusrotundicauda)禾口南方 iM (Tachypleus gigas)的溶解產(chǎn)物。適合用于所提供的方法和試劑盒的脂多糖結(jié)合多肽包括變形細胞溶解物的脂多 糖結(jié)合多肽。變形細胞溶解物任選地選自鱟(Limulus polyphemus)、中國鱟(Tachypleus tridentatus) > 01 (Carcinoscorpius rotundicauda)禾口南方當(Tachypleus gigas) 的溶解產(chǎn)物。任選地，一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是包含因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的 多肽。內(nèi)毒素/因子C的脂質(zhì)A-結(jié)合域位于被rFCES包圍的蛋白質(zhì)的氨基末端部分內(nèi)(即， 按在SEQ ID NO 8中編號的前350個氨基酸)。因子C蛋白質(zhì)及其結(jié)構(gòu)域(包括sushi結(jié) 構(gòu)域)描述在美國專利6，719，973中，該專利的內(nèi)容全文以引用的方式并入本文。美國專 利6，719，973還公開了因子C蛋白質(zhì)的sushi肽以及制備和使用sushi肽的方法。因此， 因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域任選地為sushi結(jié)構(gòu)域或sushi肽。因子C蛋白質(zhì)的脂多 糖結(jié)合域例如為因子C蛋白質(zhì)的氨基酸1-333(例如，SEQ ID NO :8的氨基酸1-333)、SEQ ID NO :8的氨基酸四-330、因子C蛋白質(zhì)的sushi 1結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ ID NO :8的氨基酸 29-201)、因子C蛋白質(zhì)的sushi 2結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ ID NO :8的氨基酸195460)、因子C 蛋白質(zhì)的sushi3結(jié)構(gòu)域(例如，SEQID NO 8的氨基酸洸4_330)、sushi 1肽(SEQ ID NO 1)、sushi2 肽(SEQ ID NO 2)、sushi 3 肽(SEQ ID NO 3)、sushi 1-肽(SEQ ID NO 4)、 sushi3-肽(SEQ ID NO 5)、sushi4 肽(SEQ ID NO 6)或 sushi 5 肽(SEQ ID NO 7)。任選地，使樣本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸的步驟包括使樣本與包含因子 C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的二聚體或四聚體接觸。用在本文中的用語因子C 二聚體指連接 在一起的二個因子C蛋白質(zhì)的分子或其部分。所提供的因子C二聚體包含第一多肽和第二 多肽，其中第一多肽和第二多肽各包含因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域。任選地，第一多肽 和第二多肽是相同的或不同的多肽。任選地，因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域是SUShil肽。 sushi Jft可以是 sushi 1 肽(SEQID NO :1)、sushi2 肽(SEQ ID NO 2)、sushi3 肽(SEQ ID NO 3)、sushi 1-肽(SEQID NO 4)、sushi3_ 肽(SEQ ID NO 5)、sushi4 肽(SEQ ID NO 6)或sushi5肽(SEQ ID NO 7)。任選地，sushi肽是sushi3肽或sushi3_肽。任選地，因子 C 二聚體的多肽由二硫鍵連接。二硫鍵是半胱氨酸殘基之間的鍵。任選地，包含因子C 二聚 體的第一多肽和第二多肽各由SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6或7組成。術(shù)語蛋白質(zhì)、肽、多肽或肽部分廣泛地用在本文中，表示由肽鍵連接的兩個或更多 個氨基酸。應(yīng)當認為，術(shù)語肽和多肽在本文中不是用來表明組成分子的氨基酸的具體尺寸 或數(shù)量，并且肽可以含有多達數(shù)個或更多的氨基酸殘基。所提供的肽由多肽的蛋白水解反 應(yīng)產(chǎn)生，即，經(jīng)由多肽中的肽鍵斷裂產(chǎn)生肽。任選可利用化學(xué)合成法或重組DNA技術(shù)生成合 成多肽來產(chǎn)生所提供的肽。例如，利用標準Fmoc保護基和假脯氨酸，在2-氯三苯甲基樹脂 上進行逐步固相肽合成，由此合成所提供的肽。作為另外的選擇，通過使兩種或更多種較小 的化學(xué)合成肽結(jié)合來合成肽。還公開了編碼上述肽序列、其變體及片段的核酸。這些序列包括與特定的多肽序 列相關(guān)的所有簡并序列，即，具有對一種具體多肽序列進行編碼的序列的所有核酸，以及編 碼所公開的多肽序列的變體及衍生物的所有核酸，包括簡并核酸。因此，盡管在本文中可能 沒有寫出每個具體的核酸序列，但應(yīng)理解的是，每個序列實際上都是通過所公開的蛋白質(zhì) 序列而公開和描述在本文中的。多種表達系統(tǒng)用于產(chǎn)生因子C肽以及片段、亞型和變體。本文所提供的核酸序列是核酸種類的例子而不是旨在限制。還提供了包含編碼肽 序列、其變體或片段的核酸的表達載體，其中核酸可控地連接于表達控制序列。還提供了包 含表達載體的培養(yǎng)細胞。這種表達載體和培養(yǎng)細胞可用于制備所提供的肽。分離的或純化的表示的是基本上不含其它物質(zhì)的組合物(例如，多肽或核酸)，所 述的其它物質(zhì)包括通常在性質(zhì)上與該組合物相關(guān)的物質(zhì)。本發(fā)明的多肽或其片段的獲得方式例如是，從自然來源物中提取，編碼多肽的重 組核酸的表達(例如在細胞中或在無細胞翻譯系統(tǒng)中)，或化學(xué)合成多肽。在所提供的方法及試劑盒中，脂多糖結(jié)合多肽任選用可檢測部分進行標記，或者 還包含報告蛋白或親和標記物。脂多糖結(jié)合多肽被直接標記或間接標記(例如，通過用可 檢測部分標記的二級或三級抗體)。有許多標記可供使用，包括但不限于放射性同位素、熒 光標記物和酶底物標記物。放射性同位素包括例如35S、14C、125I、3H和1311。熒光標記物 包括例如稀土螯合物(銪螯合物)、熒光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、 丹磺酰(dansyl)、麗絲胺(Lissamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)和德克薩斯紅(Texas Red) ο 米用例如 Current Protocols in Immunology, Volumes land 2, Coligen et al., Ed.，ffiley-Interscience, New York, N. Y.，Pubs.，(1991)中所公開的技術(shù)任選地使標記 物與抗原結(jié)合配偶體共軛。當使用酶底物標記物時，優(yōu)選酶催化發(fā)色底物的化學(xué)變化，這種化學(xué)變化可采用 各種技術(shù)測量。例如，酶催化底物的顏色變化，這種顏色變化可用分光光度法測量。作為另 外的選擇，酶改變底物的熒光性或化學(xué)發(fā)光性?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)被電子激發(fā)，然 后發(fā)射可測的光(例如使用化學(xué)發(fā)光計)，或者向熒光受體提供能量。酶標記物的例子包括 熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶)、熒光素、2，3- 二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫 氫酶、脲酶、過氧化物酶(如辣根過氧化物酶，HRP)、堿性磷酸酶、J-半乳糖苷酶、葡萄糖化 酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜 環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。
共軛結(jié)合酶的技術(shù)描述于 0' Sullivan et al. , Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Co njugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods inEnzym. (ed J. Langone&H. Van Vunaki s), Academic press, New York, 73 :147-166 (1981)。酶-底 物結(jié)合的例子包括例如辣根過氧化物酶(HRP)與作為底物的過氧化氫酶結(jié)合、堿性磷酸酶 (AP)與作為發(fā)光底物的磷酸對硝基苯酯結(jié)合以及J-D-半乳糖苷酶(J-D-Gal)與發(fā)色底物 (例如，對硝基苯-J-D-半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形酮-J-D-半乳糖苷酶結(jié)合。任選進行試驗，其中使脂多糖結(jié)合多肽附著于例如柱、薄片或板之類的固相支持 體。固相支持體可以是可移動的固相支持體(例如，微球)。使來自受試者或?qū)φ盏臉颖窘?jīng) 過固相支持體(例如與固相支持體接觸)。然后將標記的脂多糖結(jié)合多肽加到固相支持體 上。附著于靶物質(zhì)上的檢測標記物量與樣本中的靶物質(zhì)量相關(guān)。例如，把脂多糖結(jié)合多肽 固定在微量滴定板的底部。然后在允許脂多糖結(jié)合多肽與革蘭氏陰性菌、內(nèi)毒素或脂多糖 (如果樣本中有的話)結(jié)合的條件下把待測樣本加到微量滴定板上。把用例如生物素標記 的第二脂多糖結(jié)合多肽加到微量滴定板上。用與堿性磷酸酶連接的抗生物素蛋白檢測標記 的多肽。與堿性磷酸酶連接的抗生物素蛋白通過從磷酸對硝基苯酯(PNA)底物中釋放對硝 基苯酚而產(chǎn)生可在405nm測定的黃光來檢測結(jié)合并標記的多肽。采用FACS分選對例如熒光標記的微球進行檢測和定量。例如，使脂多糖結(jié)合多肽 連接于微球。然后使微球與待測樣本接觸。把用例如熒光標記物標記的第二脂多糖結(jié)合多 肽加到已經(jīng)與測試樣本接觸的微球上。然后根據(jù)一種或多種熒光標記物，使用FACS分選儀 對結(jié)合、標記的微球進行檢測和定量。任選地，微球可以是磁性微球或熒光微球。例如，使 脂多糖結(jié)合多肽連接于諸如微球的可移動的固相支持體，其可被加到諸如全血或血液制劑 (如血清)的生物樣本中，并通過離心除去。任選地，使脂多糖結(jié)合多肽連接于諸如鐵微球 的磁性微球，并通過磁場除去。作為另一例子，使脂多糖結(jié)合多肽固定在固定的固相支持體(例如柱、濾紙或膜) 上。如此，把脂多糖結(jié)合多肽固定在例如血液透析膜或過濾系統(tǒng)上，用以從全血或血液制劑 中除去細菌和/或內(nèi)毒素。因此，用在本文中的支持體是指任何支持基質(zhì)，如本領(lǐng)域中已知 用來固定脂多糖結(jié)合多肽的固相支持體。合適的支持體包括但不限于包含或涂有纖維素、 丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多羥基甲基丙烯酸酯(polyhydroxymethacrylates)、聚苯乙烯、葡 聚糖、瓊脂糖、多糖、親水乙烯基聚合物、聚合衍生物的玻璃、瓊脂糖、塑料、二氧化硅、聚丙 烯酰胺、水凝膠、凝膠體、膜、濾紙、網(wǎng)、微球或顆粒，以及任何多孔或無孔基質(zhì)。任選地，脂多糖結(jié)合多肽還包含報告蛋白和親和標記物。合適的報告蛋白包括例 如綠色熒光蛋白(GFP)、堿性磷酸酶、過氧化物酶和熒光素酶。親和標記物包括但不限于多 組氨酸、抗生物素蛋白、鏈霉親和素和生物素。樣本任選為生物樣本。用在本文中的測試生物樣本是來自諸如哺乳動物或人的 受試者的樣本，包括但不限于包括體液在內(nèi)的任何生物流體。體液的例子包括但不限于全 血、血清、尿液、唾液、組織滲透物、胸腔積液、肺灌洗液等。生物流體包括細胞培養(yǎng)基或培養(yǎng) 細胞的上清液。例如，樣本可以是血液樣本或血清樣本。任選地，樣本是液體樣本，如在研 究或臨床實驗室或醫(yī)院中使用的水或其它藥劑。任選地，樣本是環(huán)境樣本，包括但不限于流 體、廢棄物、水或雨樣。任選地，環(huán)境樣本得自于例如醫(yī)院中用于所提供方法的分析中的表 面。例如，樣本可得自在醫(yī)院、診所或?qū)嶒炇以O(shè)備中用來分析革蘭氏陰性菌存在的裝置。任選地，分析前在溶液中稀釋樣本。任選地，待測樣本包含需要降解的多肽。因此，舉例來說， 樣本包含抑制標準內(nèi)毒素分析的多肽，例如絲氨酸蛋白酶抑制劑。用在本文的酸、酸性的、天冬氨酸的或天冬氨酸蛋白酶是指在低pH值下具有活性 的蛋白酶。例如，蛋白酶在約0.0至約6.0的PH值下具有活性，或者在0.0-6.0(含)之 間的任何PH值下具有活性。這種蛋白酶在約6.0至約14.0的pH值下不具活性。用在本 文中的非活性酸性蛋白酶指不具有蛋白水解活性的蛋白酶(即，不能分裂諸如多肽或蛋白 質(zhì)的氨基酸序列的蛋白酶)。用在本文中的活性酸性蛋白酶指具有蛋白水解活性的蛋白 酶(即，能夠分裂氨基酸序列的蛋白酶)。作為例子，6. 5或更高的pH值可以使活性酸性 蛋白酶失活(即，蛋白酶存在于PH值為6. 5或更高的溶液中)?？赏ㄟ^向溶液中添加化學(xué) 物質(zhì)來改變?nèi)芤旱腜H值。例如，可使用鹽酸降低pH值，使用氫氧化鈉升高pH值?？墒褂?磷酸使PH值保持在約6. 5。任選地，使用胃蛋白酶抑制劑使胃蛋白酶失活。胃蛋白酶抑制 劑包括但不限于乙脒、N-乙?；?D-苯丙氨?；?L-雙碘酪氨酸、N-乙?；?L-苯丙氨酰 基-D-苯丙氨酸、對氨基苯甲脒、苯甲脒、丁胺(butyamine)、重氮甲酮、乙胺、胃酶抑素和苯 乙脈(phenylactamidine)。酸或酸性蛋白酶(如肽鏈內(nèi)切酶)是已知的，它們分為三大類，即胃蛋白酶(Al)、 反錄胃蛋白酶(retrop印sin，A2)和來自擬反錄病毒(pararetroviruses)的酶(A3)。已知 Al和A2類成員彼此相關(guān)，而A3類成員顯示出與Al和A2有一些關(guān)聯(lián)性。微生物酸蛋白酶 對肽鍵兩側(cè)的芳族或大的氨基酸殘基表現(xiàn)出特異性，這與胃蛋白酶相似，但是它們的作用 沒有胃蛋白酶那樣精確。酸蛋白酶包括微生物、真菌、病毒、動物和植物酸性蛋白酶。微生 物天冬氨酸蛋白酶大致可分為兩組，(i)由曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、 根霉(lihizopus)和脈孢菌(Neurospora)產(chǎn)生的類似胃蛋白酶的酶，和(ii)由內(nèi)座殼 屬(Endothia)和毛霉屬(Mucor spp)產(chǎn)生的類似腎素的酶(Rao等，Microbiology and MolecularBiology 62(3) :597-635(1998) ；Richter 等，Biochem J. 335 :481-90(1998))。 酸性蛋白酶的例子包括但不限于胃蛋白酶(包括胃蛋白酶A、B和C)；腎素；凝乳酶；半 胱氨酸蛋白酶；組織蛋白酶，如組織蛋白酶D和組織蛋白酶E ；人尿酸蛋白酶；和類似HIV 蛋白酶的病毒蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于源自脈孢菌屬(Neurospora oryzae), W(Mucor pusillus) > ^MM (Mucormiehei) > H (Aspergillus niger) 根霉(Rhizopus chinensis)或內(nèi)座殼屬(Endothia parasitica)的真菌蛋白酶。微生 物蛋白酶包括但不限于酵母蛋白酶A、曲菌胃蛋白酶原(aspergillop印sinogen)、根霉 胃蛋白酶(rhizopusp印sin)、青霉胃蛋白酶(penicillop印sin)和內(nèi)座殼屬胃蛋白酶 (endothiapepsin)0實例1-6表明酸性蛋白酶可用于增強含有通常妨礙內(nèi)毒素檢測的分子的樣本中 的內(nèi)毒素檢測。通常妨礙內(nèi)毒素檢測的分子包括多種不同類型的肽，如短的陽離子肽(即 肽X)、酶(即sushi3肽)、金屬蛋白(即血紅蛋白)、循環(huán)蛋白(即白蛋白)和免疫球蛋白 (即IgG)。實例包括全部蛋白質(zhì)和小肽。另外也對內(nèi)源性和外源性內(nèi)毒素的檢測進行了說 明。在所有給出的實例中，用Endc^rep 蛋白酶組合物的處理提高了內(nèi)毒素檢測的精度。提供了用于檢測革蘭氏陰性菌或脂多糖的試劑盒。該試劑盒包含酸性蛋白酶。該 試劑盒還包含一種或多種變形細胞溶解物和/或一種或多種脂多糖結(jié)合多肽。任選地， 脂多糖結(jié)合多肽是變形細胞溶解物的脂多糖結(jié)合多肽。任選地，變形細胞溶解物選自鱟(Limulus polyphemus) ^43 (Tachypleus tridentatus) ^01 (Carcinoscorpius rotundicauda)和南方鱟(Tachypleus gigas)的溶解產(chǎn)物。如上所述，酸性蛋白酶可以 是任何酸性蛋白酶。例如，酸性蛋白酶選自胃蛋白酶、腎素、凝乳酶、半胱氨酸蛋白酶、組 織蛋白酶D、組織蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脈孢菌屬(Neurospora oryzae) 蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉屬(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲酶 (Aspergillusniger)(Rhizopus chinensis)胃 Bi、51 (Endothia
parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶Α、曲菌胃蛋白酶原(aspergillop印sinogen)、根霉 胃蛋白酶(rhizopusp印sin)、青霉胃蛋白酶(penicillop印sin)和內(nèi)座殼屬胃蛋白酶 (endothiapepsin)。同樣如上所述，一種或多種脂多糖結(jié)合多肽例如是包含因子C蛋白質(zhì) 的脂多糖結(jié)合域的多肽。試劑盒任選地包含固相支持體，如柱、板、薄片或可移動的固相支 持體?？梢苿拥墓滔嘀С煮w例如是磁性或熒光微球。任選地，試劑盒還包含一種或多種緩 沖液，如消化緩沖液。任選地，一種或多種變形細胞溶解物和酸性蛋白酶在相同或分開的容 器中。任選地，一種或多種脂多糖結(jié)合多肽和酸性蛋白酶在相同或分開的容器中。任選地， 酸性蛋白酶是非活性的。任選地，試劑盒包含活性酸性蛋白酶和非活性酸性蛋白酶，其中活 性酸性蛋白酶與非活性酸性蛋白酶相同或不同。因此，舉例來說，如果蛋白酶是不同的，則 活性蛋白酶是胃蛋白酶，非活性蛋白酶是凝乳酶。公開了材料、組合物和組分，所述材料、組合物和組分可用于所公開的方法及組合 物，可與所公開的方法及組合物聯(lián)用，可用于所公開的方法及組合物中的制備，或者是所公 開的方法及組合物的產(chǎn)物。本文中公開了這些及其它材料，應(yīng)該理解的是，這些材料的組 合、子集、相互作用物、群組等也是公開的，雖然可能并沒有明確地具體公開提到這些化合 物的每個不同的個體和集體組合及置換，但本文中具體地設(shè)想和描述了每一種。例如，如 果公開并討論了一種方法，并可以對在該方法或該方法的步驟中所使用的材料進行若干變 動，則可具體地設(shè)想該方法及可能的變動的每種組合及置換，除特明確指出相反的情況以 外。同樣設(shè)想并公開了上述的任何子集或組合。因此，如果在方法中有許多可以實施的附加 步驟，應(yīng)該理解的是，這些附加步驟的每一步都可以與所公開方法的任何具體的方法步驟 或方法步驟的組合一同實施，并且可具體地設(shè)想每一這種組合或組合的子集，并且應(yīng)該認 為這都是公開的。因此已經(jīng)描述了許多方面。然而應(yīng)該理解的是，可以做出各種修改。此 外，當描述一種特征或一個步驟時，該特征或步驟可以與本文中的任何其它特征或步驟組 合，盡管沒有明確指出這種組合。因此，即使本文中沒有明確公開，但也提供了所公開的試 劑、步驟和特征的所有組合。本文中的范圍可以表示為從大約一個具體值和/或到大約另一個具體值。當表示 為這樣的范圍時，其包括從一個具體值和/或到另一個具體值。同樣，當使用先行詞約將數(shù) 值表示為近似值時，應(yīng)理解為公開了具體的值。整個本申請中引用了許多出版物。在此將這些出版物的公開內(nèi)容全文以引用的方 式并入本申請。給出以下實例對本領(lǐng)域技術(shù)人員提供有關(guān)實施和評價本文權(quán)利要求的化合物、組 合物、制品、裝置和/或方法的完整公開和描述，這些純粹是示例性的，不旨在限制本文所 提供的方法和材料的范圍。實例
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一般方法材料根據(jù)制造商的說明，利用Lonza(Walkersville，MD)的PyroGene 試驗進行內(nèi)毒 素檢測和定量，使用或不使用lEU/ml陽性對照產(chǎn)物(PPC)驗證試驗的可靠性。試驗的檢測 范圍是0.001至10EU/ml。血紅蛋白(牛紅細胞)購自Calbiochem(La Jolla, CA)，，其含 有的內(nèi)源性內(nèi)毒素的水平為300EU/mg。兔IgG (血漿的)也來自Calbiochem，含大約2EU/ mg。牛血清白蛋白(BSA)購自 Sigma (St. Louis，] 0)，含< lEU/mg。Sushi3 肽由 American Peptide (Sunnyvale,CA)化學(xué)合成，不含可測的內(nèi)毒素。由專利來源提供肽乂，含< lEU/mg。 無內(nèi)毒素的水得自BioDtech，Inc. (Birmingham, AL)。當樣本內(nèi)毒素含量低時，添加內(nèi)源 性內(nèi)毒素到所指的水平。內(nèi)毒素以大腸桿菌055 :B5脂多糖的形式購自List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA)。EndoPrep 方案Endoft·印""試劑盒由 BDTI 消化緩沖液 QOmM醋酸鈉，pH值 4. 5) (BioDtech, Inc.， Birmingham, AL)和Endoft^p 蛋白酶組合物(BDTI 消化緩沖液中的5%胃蛋白酶原液) 構(gòu)成。按以下方案進行所有實驗。用BDTI 消化緩沖液把蛋白質(zhì)樣本稀釋到合適的工作水 平。將此溶液270 μ 1等份試樣與30 μ L的BDTI 蛋白酶溶液混合并渦旋10秒。每組實驗 中包括含30 μ L的BDTI 消化緩沖液而不是BDTI 蛋白酶溶液的樣本，用以確定沒有消化 的基準內(nèi)毒素。混合后用石蠟?zāi)どw住管，在37°C水浴中溫育指定的時間。處理后在無內(nèi)毒 素的水中以1 100稀釋樣本，然后進行PyroGene 測試?？紤]源于添加BDTI 蛋白酶溶 液的10%樣本稀釋，并計算到給出的結(jié)果中。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)用每個樣本處理進行PAGE分析以監(jiān)測內(nèi)毒素檢測與蛋白質(zhì)降解的相關(guān)性。對 于PAGE分析，把20 μ L未稀釋的消化樣本添加至含45 μ L無內(nèi)毒素的水、10 μ L5mM DTT和 25 μ LCB S Scientific ClearPAGE (Del Mar, CA)4x樣本緩沖液(對于非還原性電泳，以 另外的水取代DTT)的混合物中。該樣本在70°C水浴中加熱10分鐘，將17 μ L樣本載入浸 在 CBS Scientific ClearPAGE IxTris-Tricine-SDS 電泳緩沖液(還原或非還原)的 CBS Scientific ClearPAGE10-20% TEO-CI SDS凝膠中，在200伏特下電泳45分鐘，電流梯度 為從60mA至30mA。按制造商的說明書，所有的凝膠均用Sigma ProteoSilver (St. Louis, MO)銀染試劑盒染銀。PPC抑制試驗用陽離子肽進行PCC抑制試驗以確定對PPC回收的抑制程度。在無內(nèi)毒素水中配 制系列的肽10倍稀釋液。把270 μ L每種稀釋液的等份試樣加入含有30 μ L10EU/ml LPS的 無內(nèi)毒素玻璃管中至最終的內(nèi)毒素濃度為lEU/ml。在Lonza PyroGene (Walkersville， MD)試驗中對每個樣本50 μ L進行測試。沒有肽的樣本作為對照和參考。PyroGent 凝膠凝結(jié)試驗為驗證Endoft·印 蛋白酶組合物對凝膠凝結(jié)試驗的適用性，用LonzaPyroGent 系統(tǒng)(Walkersville，MD)測試消化的樣本。對于試驗，在無內(nèi)毒素的玻璃小瓶中混合 100 μ L樣本與100 μ L PyroGent 試驗溶解產(chǎn)物并渦旋10秒。然后樣本在37°C水浴中
無攪拌溫育60分鐘。溫育后，目視檢查樣本的凝塊形成。連同樣本一起對一系列0.03至0. 12EU/ml的標準物和空白進行三重測試，用以驗證試驗的可靠性。實例1:肽X肽X(專利的)是顯示在治療裝置中極其有效的短陽離子肽混合物。這種產(chǎn)品的分 子量為2. 0至6. 5kDa，平均大小為3. 5kDa。在LAL和rFC試驗中，肽X完全抑制內(nèi)毒素檢 測，甚至阻止確定的內(nèi)毒素加樣的回收。初步實驗確定抑制作用是由肽與內(nèi)毒素的緊密結(jié) 合造成的。這種結(jié)合不能被鹽、洗滌劑、超濾或加熱取代。這種抑制機理也造成大量的稀釋 變得不充分。為了顯示肽X的內(nèi)毒素抑制程度，把lEU/ml內(nèi)毒素攙入肽在水中的稀釋液，并 用PyroGene 試驗測試加樣回收率(圖1A)。以濃度0. lmg/ml開始，前幾個10倍稀釋液 仍顯示出100%或接近100%的抑制。檢測到超過50%的內(nèi)毒素需要稀釋到0. lyg/ml。要 實現(xiàn)完全的內(nèi)毒素回收，必須將肽稀釋到濃度為lOng/ml，這代表對治療劑量的2，000, 000 倍稀釋。這種類型的稀釋阻止內(nèi)源性內(nèi)毒素的檢測。用Endoft^p 樣本制備試劑盒處理肽X以消除這種抑制活性。在BDTI 消化緩 沖液中配制0. lmg/ml肽X樣本，并在用或不用Endoft·印 蛋白酶組合物處理的情況下測 試PPC回收率。與上述結(jié)果一致，未處理樣本的PPC被100%抑制(圖1B)。用Endoft^p 蛋白酶組合物處理且不進行37 °C水浴中的溫育將PPC回收率提高到超過63%。適當?shù)臏?育進一步將回收率提高到超過75%。這種PPC回收水平超過了 FDA所要求的50%的水平， 后者被認為是可接受的試驗報告。為進一步對此進行測試，測定Endc^rep 蛋白酶組合物 允許檢測污染內(nèi)毒素的能力。在含大約250EU/mg內(nèi)毒素的BDTI 消化緩沖液中配制新的 0. lmg/ml肽X樣本。與PPC結(jié)果相似，用Endoft·印 蛋白酶組合物進行處理，在處理過程 中，檢測量從0EU/ml提高到多于150EU/ml (圖IC和表1)。這表示檢測到起始加入內(nèi)毒素 的計算值的60%以上。PAGE分析顯示內(nèi)毒素檢測量的增加與肽X的降解相對應(yīng)(圖1D)。 添加Endoft^p 蛋白酶組合物而不進行溫育將肽的量減少大約25-30%。適當?shù)臏赜M一 步減少原生肽的量，30分鐘處理后減少到低于10%，120分鐘處理后減少到幾乎可以忽略 的量。表1. 60 分鐘PyroGene (Lonza ；ffalkersville, MD)溫育的熒光數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，包括的步驟有(a)在非活性酸性蛋白酶存在下使所述樣本與一種或多種脂多糖結(jié)合多肽接觸；以及(b)確定所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是否與所述樣本結(jié)合，結(jié)合則表明所述樣本 中含革蘭氏陰性菌或脂多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸性蛋白酶選自真菌酸性蛋白酶、微生物酸 性蛋白酶和動物酸性蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸性蛋白酶選自腎素、凝乳酶、半胱氨 酸蛋白酶(plasm印sin)、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、 脈孢菌屬(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉 屬(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲酶(Aspergillus niger)蛋白酶、華根霉(Rhizopus chinensis)蛋白酶、栗疫菌(Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶Α、曲菌胃蛋 白酶原(aspergillop^sinogen)、根霉胃蛋白酶(rhizopusp印sin)、青霉胃蛋白酶 (penicillopepsin)禾口內(nèi)座殼屬胃蛋白酶(endothiapepsin)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括在步驟(a)之前使所述酸性蛋白酶失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括在步驟(a)之前，在導(dǎo)致所述樣本中蛋白質(zhì) 降解的條件下使所述樣本與活性酸性蛋白酶接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中消化緩沖液包含所述活性酸性蛋白酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，進一步包括在步驟(a)之前且在使所述樣本與活性酸 性蛋白酶接觸之后，使所述酸性蛋白酶失活。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中約7.O的pH值使所述酸性蛋白酶失活。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是變形細胞溶 解物的脂多糖結(jié)合多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述變形細胞溶解物選自 當(Limulus polyphemus)、中 國當(Tachypleus tridentatus)、圓 尾當 (Carcinoscorpiusrotundicauda)禾口南方當(Tachypleus gigas)的溶角軍產(chǎn)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是包含因子C蛋 白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中包含因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的多肽選自 因子 C 蛋白質(zhì)的氨基酸 1-333、sushi-Ι 肽、sushi-1 Δ 肽、sushi-3 肽、sushi-3 Δ 肽、sushi 4肽和sushi 5肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽還包含報告蛋 白和親和標記物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述報告蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、堿性磷 酸酶、過氧化物酶和熒光素酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述親和標記物是多組氨酸、抗生物素蛋白、鏈 霉親和素或生物素。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽以可檢測的方 式被標記。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述可檢測的標記物是熒光標記物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使所述樣本與所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽 接觸包括使所述樣本與包含因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的二聚體或四聚體接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述二聚體或四聚體包含sushi肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述sushi肽選自sushi1肽、sushi2肽、sushi 3 肽、sushi 1-肽、sushi 4 肽、sushi 5 肽禾口 sushi 3-肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽連接于固相支 持體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述固相支持體是柱或板。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述固相支持體是可移動的固相支持體。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述可移動的固相支持體是磁性微球。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述可移動的固相支持體是熒光微球。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣本是生物樣本。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述生物樣本選自血漿、血液、血清、尿液和唾液。
29.一種檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法，包括的步驟有(a)在導(dǎo)致所述樣本中蛋白質(zhì)降解的條件下使所述樣本與活性酸性蛋白酶接觸；(b)進一步使所述樣本與變形細胞溶解物接觸；以及(c)確定所述變形細胞溶解物中是否發(fā)生了凝膠化反應(yīng)，凝膠化反應(yīng)表明所述樣本中 含革蘭氏陰性菌或脂多糖。
30.根據(jù)權(quán)利要去四所述的方法，其中所述變形細胞溶解物選自 當(Limulus polyphemus)、中 國當(Tachypleus tridentatus)、圓 尾當 (Carcinoscorpiusrotundicauda)禾口南方當(Tachypleus gigas)的溶角軍產(chǎn)物。
31.一種檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的試劑盒，包含變形細胞溶解物和酸性蛋 白酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述變形細胞溶解物選自 當(Limulus polyphemus)、中 國當(Tachypleus tridentatus)、圓 尾當 (Carcinoscorpiusrotundicauda)禾口南方當(Tachypleus gigas)的溶角軍產(chǎn)物。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述酸性蛋白酶選自腎素、凝乳酶、半胱氨 酸蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脈孢菌屬(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉屬(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲 Sl (Aspergillus niger)(Rhizopus chinensis) SSBI^Sl^S' (Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶Α、曲菌胃蛋白酶原(aspergillop印sinogen)、根霉 胃蛋白酶(rhizopusp印sin)、青霉胃蛋白酶(penicillop印sin)和內(nèi)座殼屬胃蛋白酶 (endothiapepsin)0
35.一種檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的試劑盒，包含一種或多種脂多糖結(jié)合多 肽和酸性蛋白酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是變形細胞溶解物的脂多糖結(jié)合多肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述變形細胞溶解物選自 當(Limulus polyphemus)、中 國當(Tachypleus tridentatus)、圓 尾當 (Carcinoscorpiusrotundicauda)禾口南方當(Tachypleus gigas)的溶角軍產(chǎn)物。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述酸性蛋白酶選自腎素、凝乳酶、半胱氨 酸蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、人尿酸蛋白酶、HIV蛋白酶、脈孢菌屬(Neurospora oryzae)蛋白酶、微小毛霉(Mucor pusillus)蛋白酶、毛霉屬(Mucor miehei)蛋白酶、黑曲 Sl (Aspergillus niger)(Rhizopus chinensis) SSBI^Sl^S' (Endothia parasitica)蛋白酶、酵母蛋白酶Α、曲菌胃蛋白酶原(aspergillop印sinogen)、根霉 胃蛋白酶(rhizopusp印sin)、青霉胃蛋白酶(penicillop印sin)和內(nèi)座殼屬胃蛋白酶 (endothiapepsin)0
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽是包含因子 C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的多肽。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中包含因子C蛋白質(zhì)的脂多糖結(jié)合域的多肽選 自 sushi-Ι 肽、sushi-Ι Δ 肽、sushi-3 肽、sushi-3 Δ、sushi 4 肽禾口 sushi5 肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽還包含報告 蛋白和親和標記物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的試劑盒，其中所述報告蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、堿性 磷酸酶、過氧化物酶和熒光素酶。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的試劑盒，其中所述親和標記物是多組氨酸或生物素。
45.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述脂多糖結(jié)合多肽以可檢測的方式被標記。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的試劑盒，其中所述可檢測的標記物是熒光標記物。
47.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述脂多糖結(jié)合多肽是包含因子C蛋白質(zhì)的 脂多糖結(jié)合域的二聚體或四聚體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的試劑盒，其中所述二聚體或四聚體包含sushi肽。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中所述sushi肽選自sushi1肽、sushi2肽、 sushi 3 肽、sushi 1-肽、sushi 4 肽、sushi 5 肽禾口 sushi 3-肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽連接于固相 支持體。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中所述固相支持體是柱或板。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中所述固相支持體是可移動的固相支持體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的試劑盒，其中所述可移動的固相支持體是磁性微球。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的試劑盒，其中所述可移動的固相支持體是熒光微球。
55.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，還包含一種或多種緩沖液。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的試劑盒，其中所述緩沖液是消化緩沖液。
57.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽和所述酸性 蛋白酶在分開的容器中。
58.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述一種或多種脂多糖結(jié)合多肽和所述酸性 蛋白酶在相同的容器中。
59.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述酸性蛋白酶是非活性酸性蛋白酶。
60.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，還包含非活性酸性蛋白酶。
全文摘要
本文提供檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的方法。還提供用于檢測樣本中革蘭氏陰性菌或脂多糖的試劑盒。
文檔編號C12R1/01GK102124124SQ200980132249
公開日2011年7月13日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日
發(fā)明者M·G·佩佩, M·K·尚皮翁 申請人:拜奧泰克公司