專利名稱：來自可再生資源的異戊二烯的聚合物的制作方法
來自可再生資源的異戊二烯的聚合物本申請要求2008年6月30日提交的美國臨時專利申請系列號61/133，521的權(quán) 益。美國臨時專利申請系列號61/133，521的教導(dǎo)內(nèi)容在此通過引用的方式完整并入。
背景技術(shù)：
異戊二烯甲基-丁-1，3-二烯)是在廣泛類型的應(yīng)用中使用的一種極重要的 有機化合物。例如，異戊二烯用作眾多化學(xué)組合物和聚合物合成中的中間體或原材料。異 戊二烯也是由許多植物和動物(包括人類)天然合成的重要生物材料。異戊二烯在室溫下 是無色液體并且是高度可燃的。異戊二烯的結(jié)構(gòu)式是當(dāng)異戊二烯的立體調(diào)節(jié)聚合在20世紀(jì)60年代早期變得商業(yè)可行時，它變成用于 順-1，4-聚丁二烯合成中的重要單體。通過此類立體調(diào)節(jié)聚合所產(chǎn)生的順-1，4-聚異戊二 烯在結(jié)構(gòu)和特性上與天然橡膠相似。即使它不與天然橡膠完全相同，但是它可以在許多應(yīng) 用中用作天然橡膠的替代物。例如，合成的順-1，4-聚異戊二烯橡膠廣泛地用于制造輪胎 和其他橡膠產(chǎn)品中。這種對合成的順-1，4-聚異戊二烯橡膠的需求消費了大部分在世界市 場中可獲得的異戊二烯。其余異戊二烯用于制造其他合成橡膠、嵌段共聚物和其他化學(xué)產(chǎn) 品中。例如，異戊二烯用于制造丁二烯-異戊二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯共聚物橡膠、苯 乙烯-異戊二烯-丁二烯橡膠、苯乙烯-異戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-異戊二 烯嵌段共聚物。多年來，已經(jīng)研究了用于產(chǎn)生異戊二烯的許多合成途徑。例如，通過異丁烯與甲醛 在催化劑存在下反應(yīng)來合成異戊二烯在美國專利3，146，278、美國專利3，437，711、美國專 利3，621，072、美國專利3，662，016、美國專利3，972，955、美國專利4，000，209、美國專利 4，014，952、美國專利4，067，923和美國專利4，511，751中描述。美國專利3，574，780公開 了用于通過將甲基叔丁醚與空氣的混合物穿過混合氧化物催化劑而制造異戊二烯的另一 種方法。甲基叔丁醚隨后在該催化劑上被裂化成異丁烯和甲醇。產(chǎn)生的甲醇氧化成甲醛， 后者隨后與異丁烯在相同催化劑上反應(yīng)以產(chǎn)生異戊二烯。美國專利5，177，290公開了用于 產(chǎn)生二烯類(包括異戊二烯)的方法，其涉及使叔烷基醚和氧源的反應(yīng)混合物在功能上不 同的兩種催化劑上在足以導(dǎo)致以所述醚的最少回收產(chǎn)生高產(chǎn)率所述二烯類的反應(yīng)條件下 反應(yīng)。工業(yè)應(yīng)用中所用的異戊二烯一般作為熱裂化石油或石腦油的副產(chǎn)物產(chǎn)生或另外 自石油化學(xué)流提取。這是相對昂貴的能量密集方法。隨著世界范圍對基于石油化學(xué)的產(chǎn)品 的需求持續(xù)增長，異戊二烯的成本預(yù)計在長期上升至高得多的水平并且它的可獲得性在任 何情況下是有限的。換而言之，存在以下顧慮來自基于石油化學(xué)源的未來異戊二烯供應(yīng)將 不足以滿足預(yù)計需求并且價格將上升至空前的水平。因此，當(dāng)前存在對從環(huán)境友好的低成 本可再生來源獲得異戊二烯源的需求。發(fā)明簡述
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已經(jīng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)中的某些細(xì)胞可以將細(xì)胞培養(yǎng)基中可獲得的多于約0. 002%的碳轉(zhuǎn) 化成異戊二烯。這些細(xì)胞具有(i)編碼異戊二烯合酶多肽并(ii)與啟動子有效連接的異源 核酸。在一些情況下，這些細(xì)胞在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述碳源例如是，但不限于糖 類、甘油、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動物脂肪、動物油、脂肪酸、脂類、磷脂、甘油酯類、 甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提 取物、來自酵母提取物的組分或前述二者或多者的任意組合。在這種培養(yǎng)基中產(chǎn)生的異戊 二烯隨后可以被回收并聚合成合成橡膠和其他有用的聚合材料。預(yù)計對使用這種類型異戊二烯合成的合成橡膠和其他含異戊二烯的聚合物將存 在明顯需求，其中所述的異戊二烯從可再生的不基于石油化學(xué)的資源產(chǎn)生。實際上，據(jù)信相 對于用衍生自石油化學(xué)工藝的異戊二烯制成的那些聚合物，工業(yè)用戶和消費者將希望購買 衍生自此類環(huán)境友好來源的含有異戊二烯的聚合物。還相信用戶會愿意為采用可再生資源 制成的此類環(huán)境友好產(chǎn)品支付額外價格。然而，重要的是能夠驗證此類含有異戊二烯的聚 合物實際上由不基于石油化學(xué)的資源制成。在衍生自不基于石油化學(xué)的資源方面，含有合 成性異戊二烯的本發(fā)明聚合物提供了可驗證的益處。它們也可以通過分析區(qū)別來自天然來 源的橡膠。本發(fā)明更具體地公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚 合物，其中該聚異戊二烯聚合物具有大于-22%。的δ 1V值。這種類型的聚異戊二烯可以是 聚異戊二烯均聚物。本發(fā)明還披露了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其 中該聚異戊二烯聚合物具有在-30%。至-28.5%。范圍內(nèi)的δ "C值。這種類型的聚異戊二烯 也可以是聚異戊二烯均聚物。本發(fā)明也公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物， 其中該聚異戊二烯聚合物不含有蛋白質(zhì)，并且其中該聚異戊二烯聚合物具有在-34%。 至- %。范圍內(nèi)的δ 1V值。本發(fā)明還披露了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其 中該聚異戊二烯聚合物具有小于99. 9%的順-1，4-微結(jié)構(gòu)含量，其中該聚異戊二烯聚合 物具有小于99. 9%的反-1，4-微結(jié)構(gòu)含量，并且其中該聚異戊二烯聚合物具有在-34%。 至- %。范圍內(nèi)的δ 1V值。本發(fā)明也公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其 中該聚異戊二烯聚合物具有大于2%的3，4-微結(jié)構(gòu)含量，并且其中該聚異戊二烯聚合物具 有在-34%。至- %。范圍內(nèi)的δ "C值。本發(fā)明還披露了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其 中該聚異戊二烯聚合物具有大于2%的1，2-微結(jié)構(gòu)含量，并且其中該聚異戊二烯聚合物具 有在-34%。至- %。范圍內(nèi)的δ "C值。本發(fā)明也公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元和至少一種額外單體組成的 聚合物，其中該聚合物包括衍生自異戊二烯的重復(fù)單元嵌段，并且其中衍生自異戊二烯的 重復(fù)單元嵌段具有大于-22%。的δ 13C值。本發(fā)明還披露了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元和至少一種額外單體組成的 聚合物，其中該聚合物包括衍生自異戊二烯的重復(fù)單元嵌段，并且其中衍生自異戊二烯的重復(fù)單元嵌段具有在_34%。至- %。范圍內(nèi)的δ 1V值。本發(fā)明也公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的液體聚異戊二烯聚合 物，其中該聚異戊二烯聚合物具有在5，000至100，000范圍內(nèi)的重量平均分子量，并且其中 該液體聚異戊二烯聚合物具有在-34%。至-24%。范圍內(nèi)的δ 1V值。本發(fā)明還披露了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的液體聚異戊二烯聚合 物，其中該液體聚異戊二烯聚合物具有在5，000至100，000范圍內(nèi)的重量平均分子量，并且 其中該液體聚異戊二烯聚合物具有在-34%。至-24%。范圍內(nèi)的δ 1V值。本發(fā)明也公開了用于驗證聚異戊二烯均聚物來自可持續(xù)的可再生非石油衍生來 源的方法，其包括(I)確定該聚異戊二烯均聚物的S "C值；(II)如果該聚異戊二烯均聚 物具有在-34%。至_30%。范圍內(nèi)或在-28. 5%。至- %。范圍內(nèi)的δ 13C值，則額外地分析該聚 異戊二烯均聚物以確定(1)其順-微結(jié)構(gòu)含量、(2)其3，4_微結(jié)構(gòu)含量、(3)其1，2_微結(jié) 構(gòu)含量、(4)其重量平均分子量或( 存在或不存在作為天然橡膠指示物的殘余蛋白質(zhì)、皂 類、脂類、樹脂或糖類；并且(III)如果該聚異戊二烯均聚物具有(i)大于_22%。的δ 1V值、 (ii)在-30%。至-28. 5%。范圍內(nèi)的δ 13C值或者(iii)在-34%。至_30%。范圍內(nèi)或在-28. 5%。 至-24%。范圍內(nèi)的3"(值并且它(a)具有小于100%的順-微結(jié)構(gòu)含量、(b)含有3，4_微 結(jié)構(gòu)、(c)含有1，2-微結(jié)構(gòu)、(d)具有小于100，000的重量平均分子量或(e)不含有作為天 然橡膠指示物的殘余蛋白質(zhì)、皂類、脂類、樹脂或糖類，則驗證該聚異戊二烯均聚物來自可 持續(xù)的可再生的非石油衍生來源。本發(fā)明還披露了用于驗證具有衍生自異戊二烯的重復(fù)單元的共聚物含有來自可 持續(xù)性的可再生非石油衍生來源的異戊二烯的方法，所述方法包括(I)確定該共聚物中 至少一個聚異戊二烯嵌段的S "C值；和(II)如果該聚異戊二烯嵌段具有(i)大于-22%。 的31 值或(ii)在_34%。至-28. 5范圍內(nèi)的δ "C值，則驗證該共聚物中的異戊二烯來自 可持續(xù)的可再生非石油衍生來源。附圖簡述

圖1是為大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的葛異戊二烯合酶基因的核苷 酸序列(SEQ ID NO :l)。atg起始密碼子以斜體字表示，終止密碼子以粗體字表示并且添加 的I3StI位點加下劃線標(biāo)出。圖 2 是 pTrcKudzu 的圖。圖3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。RBS加下劃線標(biāo)出，葛異戊二烯 合酶起始密碼子以粗體大寫字母表示并且終止密碼子以粗體大寫斜體字母表示。載體骨架 是pTrcHis2B。圖 4 是 pETNHi sKudzu 的圖。圖 5 是 pETNHi sKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 5) 圖 6 是 pCL-lac-Kudzu 的圖。圖 7 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。圖8A是顯示在沒有載體的大腸桿菌BL21細(xì)胞中產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。圖8B是顯示在具有pCL-lac-Kudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的曲線 圖。圖8C是顯示在具有pTrcKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。
圖8D是顯示在具有pETN-HisKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中異戊二烯產(chǎn)生的曲線 圖。圖9A是顯示大腸桿菌BL21/pTrcKudzu在14升補料分批發(fā)酵中發(fā)酵的時間內(nèi)OD 的曲線圖。圖9B是顯示大腸桿菌BL21/pTrCKudzu在14升補料分批發(fā)酵中發(fā)酵的時間內(nèi)異 戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。圖IOA是顯示檸檬泛菌(Panteoa citrea)中異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。對照細(xì)胞 不含重組葛異戊二烯合酶。灰色菱形代表異戊二烯合成，黑色正方形代表0D_。圖IOB是顯示表達(dá)pCL-lac Kudzu的檸檬泛菌中異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。灰色菱 形代表異戊二烯合成，黑色正方形代表0D_。圖IOC是顯示表達(dá)pTrcKudzu的檸檬泛菌中異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖?；疑庑未?表異戊二烯合成，黑色正方形代表0D_。圖11是顯示表達(dá)重組異戊二烯合酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)中異 戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。BG3594comK是不含質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌株(天然的異戊二烯生 產(chǎn)力)。CF443-BG35McomK是含有pBSKudzu的枯草芽孢桿菌菌株(重組的異戊二烯生產(chǎn) 力)。y軸上的IS表示異戊二烯。圖 12 是 pBS Kudzu#2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 57)。圖13是為耶氏酵母(Yarrowia)中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的葛異戊二烯合酶的核苷酸 序列(SEQ ID NO :8)。圖14是包含為耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的葛異戊二烯合酶基因的pTreX3g 的圖。圖 15 是載體 pSPZl (MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO :11)。圖16是為耶氏酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化的合成葛(葛麻姆(Puerariamontana)) 異戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID N0:12)。圖17是合成的雜禾中楊(銀白楊χ歐沙11山楊(Populus alba χ Populustremula)) 異戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :1；3)。ATG起始密碼子以粗體字表示并且終止 密碼子加下劃線標(biāo)出。圖18Α顯示概述載體pYLAl、pYLl和pYL2的構(gòu)建的示意圖。圖18B顯示概述載體pYLA (POPl)的構(gòu)建的示意圖。圖18C顯示概述載體pYLA (KZl)的構(gòu)建的示意圖。圖18D顯示概述載體pYLI (KZl)的構(gòu)建的示意圖。圖18E顯示概述載體pYLI (MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖18F顯示概述載體pYLA (MAP29)的構(gòu)建的示意圖。圖19顯示異戊二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier等人，Progress in Lipid Res. 44 :357-4 ，200 。以下描述包括所述途徑中每種多肽的備選名稱和公開 了測量所述多肽活性的測定法的參考文獻(xiàn)(這些參考文獻(xiàn)的每一篇因而分別通過引用的 方式完整并入，尤其是在測定MVA和DXP途徑中多肽的多肽活性方面)。甲羥戊酸途徑 AACT ；乙酰-CoA 乙酰轉(zhuǎn)移酶，MvaE, EC 2. 3. 1. 9，測定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122, 2002 ；HMGS ；羥甲基戊二酰-CoA 合酶，MvaS, EC 2. 3. 3. 10，測定法:J. Bacteriol.，184 4065-4070，2002 ；HMGR ；3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA 還原酶，MvaE, EC 1. 1. 1. 34，測定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；MVK ；甲羥戊酸激酶，ERG12, EC 2. 7. 1. 36，測定法 Curr Genet 19 :9-14,1991 ；PMK ；磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8, EC 2. 7. 4. 2，測定法:Mol Cell Biol. ,11 =620-631,1991 ；DPMDC ；二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1, EC 4. 1. 1.33，測定法 Biochemistry, 33 13355-13362，1994 ；IDI ；異戊烯二磷酸△-異構(gòu)酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2， 測定法:J. Biol. Chem. 264 19169-19175，1989。DXP 途徑=DXS ；1-脫氧木酮糖 ~5~ 磷酸合 酶，dxs，EC 2. 2. 1. 7，測定法=PNAS, 94 12857-62，1997 ；DXR ； 1-脫氧-D-木酮糖 5-磷酸還 原異構(gòu)酶，dxr，EC 2. 2. 1. 7，測定法:Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002 ；MCT ；4-二磷酸 胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶，IspD，EC 2. 7. 7. 60，測定法PNAS，97 :6451-6456,2000 ； CMK ；4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶，IspE, EC 2. 7. 1. 148，測定法=PNAS, 97 1062-1067，2000 ；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚糖醇 2,4-環(huán)二磷酸合酶，IspF, EC 4. 6. 1. 12，測 定法PNAS，96 :11758-11763,1999 ；HDS; 1-羥基-2-甲基 _2_(E) - 丁烯基 4-二磷酸合 酶，ispG, EC 1. 17. 4. 3，測定法 J. Org. Chem. ,70 :9168-9174,2005 ；HDR ；1-羥基 _2_ 甲 基-2-(E)-丁烯基 4-二磷酸還原酶，IspH，EC 1. 17. 1. 2，測定法JACS，126 12847-12855， 2004。圖20顯示這樣的曲線圖，它們代表GC-MS分析具有(左)或沒有(右)葛異戊二 烯合酶基因的重組解脂耶氏酵母菌株的異戊二烯生產(chǎn)力生產(chǎn)量的結(jié)果。箭頭表權(quán)威性異戊 二烯標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫時間。圖 21 是 pTrcKudzu yJDI DXS Kan 的圖。圖 22 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 20)。圖23A是顯示BL21/pTrCKudzukan中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時間0是 用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二烯 的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總異戊二 烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/0D)。圖2 是顯示BL21/pTrcKudzu yIDI kan中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時 間0是用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異 戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總 異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/0D)。圖23C是顯示BL21/pTrcKudzu DXS kan中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時 間0是用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異 戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總 異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/0D)。圖23D是顯示BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。 時間O是用IPTGG00 μ mol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是OD6tltl并且y2軸是 異戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表 總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/0D)。圖23E是顯示BL21/pCL PtrcKudzu中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時間0 是用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異戊二 烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23F是顯示BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時 間0是用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異 戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總 異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23G是顯示BL21/pCL PtrcKudzu DXS中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。時 間0是用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異 戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓圈代表總 異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖23H是顯示BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。箭 頭表示用IPTGGOOymol)誘導(dǎo)的時間。χ軸是誘導(dǎo)后的時間；y軸是0D_并且y2軸是異 戊二烯的總生產(chǎn)力(yg/L頂空或比生產(chǎn)力(yg/L頂空/0D)。黑色菱形代表0D_，黑色三 角代表異戊二烯生產(chǎn)力(yg/L)并且白色正方形代表異戊二烯的比生產(chǎn)力(yg/L/OD)。圖 24 是 pTrcKKDylkIS kan 的圖。圖 25 是 pTrcKKDylkIS kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)。圖 26 是 pCL PtrcUpperPathway 的圖。圖 27 是 pCL PtrcUpperPathway 的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)。圖28顯示了含有用于在nprE基因座處整合入枯草芽孢桿菌染色體中的下游MVA 途徑和酵母idi的表達(dá)盒的圖。nprE上游/下游表示用于整合的來自nprE基因座的各11Λ 序列。aprE啟動子(堿性絲氨酸蛋白酶啟動子)表示aprE基因的啟動子(_35、_10、+1轉(zhuǎn) 錄起始位點，RBQ。MVKl表示酵母甲羥戊酸激酶基因。RBS-PMK表示帶有該起始位點上游 的芽孢桿菌RBS的酵母磷酸甲羥戊酸激酶基因。RBS-MPD表示帶有該起始位點上游的芽孢 桿菌RBS的酵母二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。RBS-IDI表示帶有該起始位點上游的芽孢桿 菌RBS的酵母idi基因。終止子表示來自解淀粉芽孢桿菌(B.amyliquefaciens)的堿性絲 氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄終止子。SpecR表示壯觀霉素抗性標(biāo)記?！坝糜跀U增的nprE上游重復(fù)序列” 表示用于擴增的上游區(qū)的直接重復(fù)序列。圖四是含有用于在nprE基因座處整合入枯草芽孢桿菌染色體中的下游MVA途徑 和酵母idi的表達(dá)盒的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)。圖30是p9796-楊的圖。圖31是p9796-楊的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)。圖 32 是 pTrcPoplar 的圖。圖 33 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)。圖 34 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的圖。圖 35 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)。圖 36 是 pTrcKudzuDXS Kan 的圖。圖 37 是 PjTrcKudzuDXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 51)。圖 38 是 pCL PtrcKudzu 的圖。圖 39 是 pCL PtrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 52)。圖 40 是 pCL PtrcKudzu A3 的圖。
圖 41 是 pCL PtrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 53)。圖 42 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的圖。圖 43 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO 54)。圖 44 是 pCL PtrcKudzu DXS 的圖。圖 45 是 pCL PtrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 55)。圖46顯示了代表來自生物量原料的異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。分圖A顯示來自玉 米秸稈的異戊二烯生產(chǎn)力，分圖B顯示來自甘蔗渣的異戊二烯生產(chǎn)力，分圖C顯示來自軟木 漿的異戊二烯生產(chǎn)力，分圖D顯示來自葡萄糖的異戊二烯生產(chǎn)力，并且分圖E顯示來自沒有 額外原料的細(xì)胞的異戊二烯生產(chǎn)力。灰色正方形代表培養(yǎng)物在接種后所示時間處的OD6tltl量 值并且黑色三角形代表在接種后所示時間處的異戊二烯生產(chǎn)力。圖47A顯示了代表在不添加葡萄糖的培養(yǎng)物中BL21(ADE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的異戊二烯生產(chǎn)的曲線圖。正方形代表0D_，并且三角形代表產(chǎn)生的異戊二烯 (μ g/ml)ο圖 47B 顯示了代表 Bl^l(ADES)PjTrcKudzu yIDI DXS (kan)的從 1 %葡萄糖原料 轉(zhuǎn)化糖產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。正方形代表0D_，并且三角形代表產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ ml) ο圖 47C 顯示了代表BL21(ADE3)pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1 %轉(zhuǎn)化糖原料產(chǎn)生 異戊二烯的曲線圖。正方形代表0D_，并且三角形代表產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖 47D 顯示了代表 BL21 ( λ DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1% AFEX 玉米秸稈 產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖。正方形代表0D_，并且三角形代表產(chǎn)生的異戊二烯(yg/ml)。圖48顯示了展示酵母提取物影響異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖。分圖A顯示在以不同量 的酵母提取物補料的發(fā)酵罐內(nèi)部光密度的時程。分圖B顯示異在以不同量的酵母提取物補 料的發(fā)酵罐內(nèi)部戊二烯滴度的時程。該滴度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。 分圖C顯示酵母提取物對補料分批培養(yǎng)中所培育大腸桿菌中的異戊二烯生產(chǎn)的影響。圖49顯示了曲線圖，其展示用大腸桿菌細(xì)胞從500L生物反應(yīng)器的異戊二烯生產(chǎn) 力生產(chǎn)量，所述的大腸桿菌細(xì)胞含有pTrcKudzu+ylDI+DXS質(zhì)粒。分圖A顯示在葡萄糖和酵 母提取物補料的500升生物反應(yīng)器內(nèi)部光密度的時程。分圖B顯示在葡萄糖和酵母提取物 補料的500升生物反應(yīng)器內(nèi)部異戊二烯滴度的時程。該滴度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的 異戊二烯的量。分圖C顯示從葡萄糖和酵母提取物補料的500升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的總異 戊二烯的時程。圖 50 是 pJMupperpathway2 的圖。圖 51 是 pJMupperpathway2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 56)。圖 52 是 pBS Kudzu#2 的圖。圖53A是曲線圖，其顯示在14升補料分批發(fā)酵中表達(dá)重組葛異戊二烯合酶的 芽孢桿菌的發(fā)酵時間期間的生長。黑色菱形代表沒有重組異戊二烯合酶的對照菌株 (BG3594comK)(天然的異戊二烯生產(chǎn)力)和灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢桿菌(重 組的異戊二烯生產(chǎn)力)。圖5 是曲線圖，其顯示在14升補料分批發(fā)酵中表達(dá)重組葛異戊二烯合酶的芽孢 桿菌的發(fā)酵時間期間的異戊二烯生產(chǎn)力。黑色菱形代表沒有重組異戊二烯合酶的對照菌株(BG3594comK)(天然的異戊二烯生產(chǎn)力)和灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢桿菌(重 組的異戊二烯生產(chǎn)力)。圖 54 是質(zhì)粒 pETMP. alba HGS 的圖。圖 55A 和 55B 是質(zhì)粒 pET24P. alba HGS 的核苷酸序列(SEQ IDNO 87)。圖56是示意圖，其顯示用于核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230的限制性位點和 BspHI與Ncol位點之間的相容性粘性末端。圖57是質(zhì)粒EWL230的圖。圖58A和58B是質(zhì)粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO 88)。圖59是示意圖，其顯示用于核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230的限制性位點和 NsiI與I^stI位點之間的相容性粘性末端。圖 60 是 EWLM4 的圖。圖61A和61B是質(zhì)粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO 89)。圖 62 是質(zhì)粒 MCM484-487 的圖。圖 63A-63C 是質(zhì)粒 MCM484 的核苷酸序列(SEQ ID NO 90)。圖 64A-64C 是質(zhì)粒 MCM485 的核苷酸序列(SEQ ID NO 91)。圖 65A-65C 是質(zhì)粒 MCM486 的核苷酸序列(SEQ ID NO 92)。圖 66A-66C 是質(zhì)粒 MCM487 的核苷酸序列(SEQ ID NO 93)。圖67A-67D是大腸桿菌菌株(EWL256)的異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖，其中所述的大腸 桿菌菌株表達(dá)來自MVA途徑的基因并且在補料分批培養(yǎng)中以15升規(guī)模在沒有酵母提取物 補料的情況下培育。圖67A顯示光密度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。圖 67B顯示異戊二烯滴度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。該滴度定義為每升發(fā) 酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖67C顯示從葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的總 異戊二烯的時程。圖67D顯示葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的總二氧化碳釋放速率 (TCER)或代謝活性曲線。圖68A-68E是大腸桿菌菌株(EWL256)的異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖，其中所述的大腸 桿菌菌株表達(dá)來自MVA途徑的基因并且在補料分批培養(yǎng)中以15升規(guī)模在酵母提取物補料 的情況下培育。圖68A顯示光密度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。圖68B 顯示異戊二烯滴度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。該滴度定義為每升發(fā)酵 培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖68C顯示從葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的總異 戊二烯的時程。圖68D顯示葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的容積生產(chǎn)力。在酵母提 取物補料的情況下，平均值1. lg/L/小時維持40小時時間03-63小時)。圖68E顯示葡萄 糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的二氧化碳釋放速率(CER)或代謝活性曲線。圖69A-69D顯示通過MVA(途徑)來自不同碳源的異戊二烯的生產(chǎn)力。圖69A顯 示了以葡萄糖、生物量水解物、甘油或乙酸鹽作為唯一碳源，含有MVA途徑和異戊二烯合酶 的大腸桿菌EWL256的生長。添加不同的碳源至培養(yǎng)基中的濃度。包括不添加碳源的 陰性對照。將生長測量為600nm處的光密度。圖69B顯示了以葡萄糖、生物量水解物、甘油 或乙酸鹽作為唯一碳源被培育時，來自含有MVA途徑和異戊二烯合酶的大腸桿菌EWL256的 異戊二烯的比生產(chǎn)力。添加不同的碳源至培養(yǎng)基中的濃度。包括不添加碳源的陰性對 照。在接種190分鐘、255分鐘和317分鐘后取得樣品并且使用GC-MS測量由細(xì)菌產(chǎn)生的異戊二烯。圖69C顯示以葡萄糖或木糖作為唯一碳源的大腸桿菌EWL256的生長。添加不同 的碳源至培養(yǎng)基中的濃度。包括不添加碳源的陰性對照。將生長測量為600nm處的光 密度。圖69D顯示了以葡萄糖或木糖作為唯一碳源培育時，來自大腸桿菌EWL256的異戊二 烯的比生產(chǎn)力。添加所述碳源至培養(yǎng)基中的濃度。包括不添加碳源的陰性對照。在接 種260分鐘、322分鐘和383分鐘后取得樣品并且使用GC-MS測量由細(xì)菌產(chǎn)生的異戊二烯。圖70A和70B顯示由大腸桿菌菌株分別從葡萄糖和來自脂肪酸產(chǎn)生異戊二烯。對 于圖70A，挑取來自用pMCM118(攜帶下游甲羥戊酸途徑的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化WW4的11個菌落以驗 證該下游途徑的存在。來自所述菌落的細(xì)胞在含有0. 酵母提取物和2%葡萄糖的TM3 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在誘導(dǎo)4小時后，對等分試樣的誘導(dǎo)的培養(yǎng)物測定異戊二烯產(chǎn)生。全部菌 落顯示產(chǎn)生異戊二烯。誘導(dǎo)劑IPTG具有強烈生長抑制作用，如從該誘導(dǎo)劑由50 μ M到達(dá) 900 μ M濃度時細(xì)胞密度降低3至4. 6倍顯而易見(數(shù)據(jù)未顯示)。曲線圖表明更高的誘導(dǎo) 作用產(chǎn)生更高的異戊二烯比滴度。對于圖70Β，生產(chǎn)培養(yǎng)物以稀釋度1至10從洗滌的過夜 培養(yǎng)物接種。將該培養(yǎng)物培育幾小時并用50 μ MIPTG誘導(dǎo)。左側(cè)柱圖顯示誘導(dǎo)4小時后， 隨后進行1小時異戊二烯積累測定法的異戊二烯分析結(jié)果。中間柱圖顯示在相同的誘導(dǎo)時 間下，但通過12小時異戊二烯積累測定法所分析的相同培養(yǎng)物的1小時歸一化值。右側(cè)柱 圖顯示被誘導(dǎo)13小時的培養(yǎng)物的1小時異戊二烯積累測定法的值。圖71是用于克隆來自葛的異戊二烯合酶的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體 pUWL201PW(6400bp)的圖。Tsr，硫鏈絲菌素抗性基因。圖片取自Takaiwa等人，Mol. Gen. Genet. 264 :477_485，2000。圖72顯示白色鏈霉菌(Streptomyces albus)野生型菌株(“wt")和攜帶質(zhì)粒 PUWL201PW(陰性對照)或pUWL201_iso(編碼來自葛的異戊二烯合酶)的菌株的異戊二烯 形成。圖73A是馬氏甲烷八疊球菌(Mmazei)古菌下游途徑操縱子的圖。圖7 和73C是馬氏甲烷八疊球菌古菌下游途徑操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO 113)。圖74A是來自馬氏甲燒八疊球菌古菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的圖。圖74B和74C是來自馬氏甲燒八疊球菌古菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的 核苷酸序列(SEQ ID NO :114)。圖75A-7OT顯示與RM11608-2相比，EWL256的生長和異戊二烯產(chǎn)生的比生產(chǎn)力。 生長(OD55tl)由白色菱形代表；異戊二烯的比生產(chǎn)力由實心條形代表。χ軸是用200μΜ(圖 75Α和75Β)或400 μ M(圖75C和75D) IPTG誘導(dǎo)后的時間(小時)。Y-I軸是異戊二烯的生 產(chǎn)力(μ g/L/OD/小時)并且Y-2是任意單位的在波長550處的光密度。OD55tl的這些值必 須乘以6. 66以獲得培養(yǎng)物的實際0D。圖 76 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的圖。圖 77A 和 77B 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的核苷酸序列(SEQ IDNO :122)。圖78A-78F是大腸桿菌菌株的異戊二烯產(chǎn)生的曲線圖，其中所述的大腸桿菌菌株 表達(dá)馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶和pgl(RHM1116081)并且在 補料分批培養(yǎng)中以15升規(guī)模培育。圖78A顯示光密度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi) 部的時程。圖78B顯示異戊二烯滴度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。該滴度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。用于計算異戊二烯的方法59小時內(nèi)產(chǎn)生 的累積性異戊二烯，在59小時的g/發(fā)酵罐容積，L [ = ]g/L培養(yǎng)液。圖78C也顯示異戊 二烯滴度在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的時程。用于計算異戊二烯的方法/ (瞬 時的異戊二烯產(chǎn)生速率，g/L/小時)dt從t = 0至59小時[=]g/L培養(yǎng)液。圖78D顯示 從葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的總異戊二烯的時程。圖78E顯示葡萄糖補料的 15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的容積生產(chǎn)力。圖78F顯示葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部的二 氧化碳釋放速率(CER)或代謝活性曲線。圖79A 是質(zhì)粒 pJ201 :19813 的圖。圖 79B 和 79C 是質(zhì)粒 pJ201 :19813 的核苷酸序列(SEQ ID NO :123)。圖80顯示在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部光密度的時程。圖81顯示在葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器內(nèi)部異戊二烯滴度的時程。該滴度定 義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖82顯示從葡萄糖補料的15升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的總異戊二烯的時程。圖83是曲線圖，其顯示在葡萄糖和酵母提取物補料的500升生物反應(yīng)器內(nèi)部光密 度的時程。圖84是曲線圖，其顯示在葡萄糖和酵母提取物補料的500升生物反應(yīng)器內(nèi)部異戊 二烯滴度的時程。該滴度定義為每升發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)生的異戊二烯的量。圖85是曲線圖，其顯示從葡萄糖和酵母提取物補料的500升生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的 總異戊二烯的時程。發(fā)明詳述用于在產(chǎn)生異戊二烯的細(xì)胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生異戊二烯的技術(shù)在2007年12月13 日提交的美國臨時專利申請系列號61/013，574中和2007年12月13日提交的美國臨時專 利申請系列號61/013，386及在美國專利申請系列號12/335，071中描述。為了教導(dǎo)通過這 種方法產(chǎn)生和回收異戊二烯的技術(shù)，美國臨時專利申請系列號61/013，574、美國臨時專利 申請系列號61/013，386和美國專利申請系列號12/335，071的教導(dǎo)內(nèi)容在此通過引用的方 式并入。在任何情況下，美國臨時專利申請系列號61/013，574、美國臨時專利申請系列號 61/013，386和美國專利申請系列號12/335，071教導(dǎo)了用于在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生增加量的異 戊二烯的組合物和方法。特別地，這些組合物和方法提高異戊二烯產(chǎn)生的速率并增加所產(chǎn) 生異戊二烯的總量。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了生成4. 8X 104nmole/gw。m/小時的異戊二烯的細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)(表1)。這些系統(tǒng)的效率由的細(xì)胞從培養(yǎng)基消費的碳轉(zhuǎn)變成異戊二烯(％碳產(chǎn)率) 的約23. 6摩爾％產(chǎn)率(10. 7重量％產(chǎn)率)展示。如實施例和表2中所示，每升培養(yǎng)液生成 大約60. 5g異戊二烯。異戊二烯以峰比速率1.88X IO5納摩爾/OD/小時(1.88X 105納摩 爾/gWCm/小時)產(chǎn)生。根據(jù)需要，使用其他條件，如本文中所述的那些條件，可以獲得甚至 更大的量的異戊二烯。在一些實施方案中，可再生碳源用于異戊二烯的產(chǎn)生。本發(fā)明的組 合物和方法是受歡迎的，因為它們允許每細(xì)胞的高異戊二烯產(chǎn)率、高碳產(chǎn)率、高異戊二烯純 度、高生產(chǎn)力、低能量消耗、低的生產(chǎn)成本及投資和最少的副反應(yīng)。這種用于異戊二烯生產(chǎn) 的高效大規(guī)模生物合成方法為基于異戊二烯的合成橡膠提供了異戊二烯來源并且為使用 天然橡膠提供了受歡迎的低成本備選。如下文進一步討論，可以通過將編碼異戊二烯合酶多肽(例如，植物異戊二烯合酶多肽)的異源核酸導(dǎo)入細(xì)胞而大大增加由所述細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的量。異戊二烯合 酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化成異戊二烯。如實施例中所示，異源性葛麻 姆(葛(kudzu))或銀白楊(楊(Poplar))異戊二烯合酶多肽在多種宿主細(xì)胞如大腸桿 菌(EschericHIa coli)、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)禾口里氏木霄(Yarrowia lipolytica)中表達(dá)。還如實施例中所示， 異源性馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina mazei) (Μ. mazei)甲羥戊酸激酶(MVK)在宿主 細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)以增加異戊二烯產(chǎn)生。全部這些細(xì)胞比沒有異源異戊二烯合酶多肽 的相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生更多的異戊二烯。如表1和表2中所示，使用本文中所述的方法，產(chǎn)生了大 量的異戊二烯。例如，具有異源異戊二烯合酶核酸的枯草芽孢桿菌細(xì)胞在14升發(fā)酵罐中比 相應(yīng)的沒有該異源核酸的對照枯草芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生大約10倍更多的異戊二烯(表2)。 發(fā)酵罐中大腸桿菌產(chǎn)生每升培養(yǎng)液60. 5g異戊二烯(mg/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培 養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積)和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生30mg/L異戊二烯表明可以產(chǎn)生顯著量的 異戊二烯(表幻。根據(jù)需要，可以在甚至更大的規(guī)模上產(chǎn)生異戊二烯或者本文中所述的其 他條件可以用來進一步增加異戊二烯的量。表1和表2中列出的載體和實驗條件在下文和 實施例部分中進一步詳細(xì)描述。表1 使用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物和方法，來自搖瓶的異戊二 烯的示例性產(chǎn)率。用于測量異戊二烯生產(chǎn)力的測定法在實施例I，第II部分中描述。對于 該測定法，在一個或多個時間點從搖瓶取得樣品并將其培養(yǎng)30分鐘。隨后測量該樣品中產(chǎn) 生的異戊二烯的量。異戊二烯產(chǎn)生的頂空濃度和比速率在表1中列出并在本文中進一步描 述。
權(quán)利要求
1.由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯 聚合物具有大于_22%。或在_30%。至-28. 5%。范圍內(nèi)的δ 13C值。
2.如權(quán)利要求1中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有 在-21%。至-12%。范圍內(nèi)的δ "C值。
3.如權(quán)利要求1中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有 在-29. 5%。至-28. 5%。范圍內(nèi)的δ "C值。
4.如權(quán)利要求1中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有 在-30%。至_29%。范圍內(nèi)的δ "C值。
5.如權(quán)利要求1中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物是均聚物。
6.由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯 聚合物具有在-34%。至-24%。范圍內(nèi)的δ 1V值，并且其中該聚異戊二烯(i)不含蛋白質(zhì)， 或( )具有小于99. 9%的順-1，4-微結(jié)構(gòu)含量和小于99. 9%的反-1，4-微結(jié)構(gòu)含量，或 (iii)具有大于2%的3，4_微結(jié)構(gòu)含量，或(iv)具有大于2%的1，2-微結(jié)構(gòu)含量，或(ν) 具有在5，000至100，000范圍內(nèi)的重量平均分子量。
7.如權(quán)利要求6中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有 在-33%。至_25%。范圍內(nèi)的δ "C值。
8.如權(quán)利要求7中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有大于 5%的1，2-微結(jié)構(gòu)含量。
9.如權(quán)利要求8中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述聚異戊二烯聚合物具有小于 2.0的多分散性。
10.如權(quán)利要求6中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述液體聚異戊二烯聚合物具有 在30，000至50，000范圍內(nèi)的重量平均分子量。
11.由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元和至少一種額外單體組成的聚合物，其中所述 聚合物包括衍生自異戊二烯的重復(fù)單元嵌段，并且其中衍生自異戊二烯的重復(fù)單元嵌段具 有大于-22%?；蛟赺；34%。至- %。范圍內(nèi)的δ 13C值。
12.如權(quán)利要求11中所述的聚合物，其中所述聚合物是共聚物，其選自由(i)異戊二烯 與1，3_ 丁二烯的共聚物，(ii)異戊二烯與苯乙烯的共聚物，(iii)異戊二烯、1，3_ 丁二烯 與苯乙烯的共聚物和(iv)異戊二烯與α -甲基苯乙烯的共聚物組成的組。
13.如權(quán)利要求12中所述的聚異戊二烯聚合物，其中所述液體聚異戊二烯聚合物具有 小于1.8的多分散性。
14.由衍生自異戊二烯的重復(fù)單元組成的聚合物，其中所述異戊二烯通過(a)在用于 產(chǎn)生異戊二烯的合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的細(xì)胞，(b) 產(chǎn)生異戊二烯和(c)從培養(yǎng)物回收異戊二烯來產(chǎn)生。
15.如權(quán)利要求14中所述的聚合物，其中通過聚合步驟(c)中回收的異戊二烯合成所 述聚合物。
16.如權(quán)利要求1中所述的聚合物，其中該聚合物由衍生自異戊二烯的重復(fù)單元組成， 其中所述異戊二烯通過(a)在用于產(chǎn)生異戊二烯的合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含編碼異戊二 烯合酶多肽的異源核酸的細(xì)胞，(b)產(chǎn)生異戊二烯和(c)從培養(yǎng)物回收異戊二烯來產(chǎn)生。
17.如權(quán)利要求6中所述的聚合物，其中該聚合物由衍生自異戊二烯的重復(fù)單元組成，其中所述異戊二烯通過(a)在用于產(chǎn)生異戊二烯的合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含編碼異戊二 烯合酶多肽的異源核酸的細(xì)胞，(b)產(chǎn)生異戊二烯和(c)從培養(yǎng)物回收異戊二烯來產(chǎn)生。
18.用于驗證聚異戊二烯均聚物來自可持續(xù)的可再生非石油衍生來源的方法，其包 括(I)確定該聚異戊二烯均聚物的S 1V值；(II)如果該聚異戊二烯均聚物具有在_34%。 至-30%。范圍內(nèi)或在-28. 5%。至-24%。范圍內(nèi)的δ 13C值，則額外地分析該聚異戊二烯均聚物 以確定(1)其順-微結(jié)構(gòu)含量、(2)其3，4-微結(jié)構(gòu)含量、(3)其1，2-微結(jié)構(gòu)含量、(4)其重 量平均分子量或( 存在或不存在作為天然橡膠指示物的殘余蛋白質(zhì)、皂類、脂類、樹脂或 糖類；并且(III)如果該聚異戊二烯均聚物具有(i)大于_22%。的δ 1V值、(ii)在-30%。 至-28. 5%。范圍內(nèi)的δ 13C值或者(iii)在-34%。至_30%。范圍內(nèi)或在-28. 5%。至_24%。范圍 內(nèi)的31 值并且如果它a)具有小于100%的順-微結(jié)構(gòu)含量、(b)含有3，4_微結(jié)構(gòu)、(c) 含有1，2_微結(jié)構(gòu)、(d)具有小于100,000的重量平均分子量或(e)不含有作為天然橡膠指 示物的殘余蛋白質(zhì)、皂類、脂類、樹脂或糖類，則驗證該聚異戊二烯均聚物來自可持續(xù)的可 再生的非石油衍生來源。
19.如權(quán)利要求18中所述的方法，其中通過表明該聚異戊二烯均聚物具有在_34%。 至-30%。范圍內(nèi)的δ "C值和通過表明該聚異戊二烯均聚物不含有作為天然橡膠指示物的 殘余蛋白質(zhì)、皂類、脂類、樹脂或糖類作出驗證。
20.用于驗證具有衍生自異戊二烯的重復(fù)單元的共聚物含有來自可持續(xù)性的可再生非 石油衍生來源的異戊二烯的方法，所述方法包括(I)確定該共聚物中至少一個聚異戊二 烯嵌段的S 1V值；和(II)如果該聚異戊二烯嵌段具有(i)大于-22%。的δ "C值或(ii) 在-34%。至-28. 5范圍內(nèi)的δ "C值，則驗證該共聚物中的異戊二烯來自可持續(xù)的可再生非 石油衍生來源。
全文摘要
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)中的某些細(xì)胞可以將細(xì)胞培養(yǎng)基中可獲得的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯。這些細(xì)胞具有與啟動子有效連接并編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在這種培養(yǎng)基中產(chǎn)生的異戊二烯隨后可以被回收并聚合成合成橡膠和其他有用的高分子材料。在衍生自不基于石油化學(xué)的資源方面，含有合成性異戊二烯的本發(fā)明聚合物提供了可驗證的益處。它們也可以通過分析區(qū)別來自天然源的橡膠。本發(fā)明更具體地公開了由衍生自異戊二烯單體的重復(fù)單元組成的聚異戊二烯聚合物，其中該聚異戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。這種類型的聚異戊二烯可以是αs-1A-聚異戊二烯均聚物橡膠。
文檔編號C12P5/02GK102131935SQ200980133059
公開日2011年7月20日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者A·S·普哈拉, A·米亞斯尼科夫, C·佩雷斯, F·J·費赫爾, F·瓦耳, G·K·肖塔尼, G·M·懷特德, J·C·麥考利夫, K·J·桑福德, M·塞爾溫, 杜卡 R·拉 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司