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由粗制核酸樣品直接擴(kuò)增的方法

文檔序號:580937閱讀:339來源:國知局
專利名稱:由粗制核酸樣品直接擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一般地涉及從粗制樣品中直接擴(kuò)增核酸的方法。引言DNA譜型(profiles)的快速并準(zhǔn)確的檢測是法醫(yī)工作樣品分析的一個(gè)關(guān)鍵方面。 粗制樣品,例如血液和口腔拭子,含有能夠抑制在基于PCR的短串聯(lián)重復(fù)(STR)分型中使用的聚合酶活性的物質(zhì)。歷史上,在進(jìn)行下游酶操作例如PCR擴(kuò)增之前,已需要去除抑制劑并純化DNA。很多種DNA分離和純化方法以及試劑盒是可以購得的。但是,它們的使用增加了制備后續(xù)分析樣品的時(shí)間和花費(fèi)。概述該發(fā)明提供了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法,包括提供包含脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將該粗制樣品與5mM至25mM的NaOH孵育;將該粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;以及對該脫氧核糖核酸進(jìn)行PCR,其中所述的直接緩沖液包含至少3% -8%的甘油,0. 2% -0. 9%的非離子表面活性劑和1000-3000 μ g/ml的BSA。合適的非離子表面活性劑包括,但不限于,聚山梨醇酯(Tween)、Tween20、Triton-XlOO等等。本發(fā)明提供了進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法,包括提供包含脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將該粗制樣品與5mM到25mM的NaOH孵育;將該粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;以及在該溶液中進(jìn)行PCR,其中所述的直接緩沖液包含至少 5 個(gè) PCR 引物對,10-50mM 的 Tris-HCl (PH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、 0. 01%-ο. 04% 的疊氮化鈉、3%-8% 的甘油、100-350 μ M 的每一種 dNTP、0. 2%-0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了確定人的身份的方法,包括提供包含來自該人的脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將該粗制樣品與5mM到25mM的NaOH孵育;將該粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;其中所述直接緩沖液包含多個(gè)引物對, 其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;在溶液中進(jìn)行PCR以形成多個(gè)PCR擴(kuò)增子;其中每個(gè)PCR擴(kuò)增子具有可確定的大??;以及通過參考PCR擴(kuò)增子的大小來鑒定該人;其中所述的直接緩沖液還包含10-50mM的Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -004% 的疊氮化鈉、3% -8% 的甘油、100-350 μ M 的每一種 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml 的 BSAjP 0. 101-0. 35U/μ 1 的 DNA 聚合酶。在一些實(shí)施方式中,包括制備核酸用于下游酶操作的方法,所述方法包括提供包含脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將該粗制樣品與5mM到25mM的NaOH孵育;將該粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;以及在該溶液中進(jìn)行下游酶操作,其中所述的直接緩沖液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (PH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、 0. 01% -ο. 04% 的疊氮化鈉、3% -8% 的甘油、100-350μΜ 的每一種 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml的BSA和0· 10-0. 35U/μ 1的DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中,所述下游酶操作是PCR。本發(fā)明還提供了用于基因分析的試劑盒,所述試劑盒包含多個(gè)引物對,其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;和直接緩沖液,其中所述直接緩沖液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、3% -8%的甘油、100-350 μ M的每一種dNTP,0. 2 % -0. 9 %的聚山梨醇酯、 1000-3000 μ g/ml的BSA和0. 10-0. 35U/ μ 1的DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中,上述試劑盒任選地包括NaOH或其它強(qiáng)堿化合物,或其它的細(xì)胞裂解劑。其它的實(shí)施方式是反應(yīng)混合物,其包含直接緩沖液和多個(gè)引物對;其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;以及其中所述直接緩沖液包含10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % _0· 04 % 的疊氮化鈉、 3% -8% 的甘油、100-350 μ M 的每一種 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯,1200-3000 μ g/ml 的BSA和0. 10-0. 35U/ μ 1的DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中,上述試劑盒可任選地包括 NaOH或其它強(qiáng)堿化合物,或其它的細(xì)胞裂解劑。


本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解下面描述的附圖只用于說明目的。附圖并不意圖以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。圖1是來自血液樣本的基因組DNA的STR譜的電泳圖譜。圖2A-2D是點(diǎn)樣到FTA紙上的四份血液樣本的不合格的(failed) STR譜的電泳圖譜。圖3A至12B是來自10個(gè)其血液被點(diǎn)樣到FTA紙上的個(gè)體的STR譜的比較電泳圖譜,所述FTA紙的穿孔被置于本文中的本發(fā)明的直接緩沖液中并標(biāo)記為“A”。而標(biāo)記為“B” 的電泳圖譜代表使用!Iomega出售的PowerPlex 16 HS純化系統(tǒng)制備的相同10個(gè)個(gè)體的血液STR譜。示例性實(shí)施方式描述在本申請中,除非特別地另外說明,單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。在本申請中,除非特別地另外說明,詞語“一”(“a”或“an”)的意思是“至少一”。在本申請中,除非另外說明,使用 “或”意味著“和/或”。另外,術(shù)語“包括”(“including”)以及其它形式(例如“ includes” 和“included”)的使用不是限制性的。本文中使用的節(jié)標(biāo)題僅用于組織結(jié)構(gòu)目的,并且不能理解為限制所描述的主題。 出于任何目的,本申請引用的全部文獻(xiàn)、或文獻(xiàn)的部分,包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論文在此通過引用全部明確地并入。如果一篇或多篇并入的文獻(xiàn)定義了與本申請的術(shù)語定義相矛盾的術(shù)語,以本申請為準(zhǔn)。定義本文中使用的術(shù)語“粗制樣品”指的是懷疑含有核酸的生物來源標(biāo)本,其沒有經(jīng)過分離或純化所述核酸的步驟。例如,血液樣品是粗制樣品。任選地,粗制樣品中的細(xì)胞被裂解。此外,點(diǎn)樣在包含裂解試劑的紙上,例如FTA紙(從Whatman商業(yè)獲得)上的血液樣品是粗制樣品。頰上皮細(xì)胞(cheek cells)的口腔試子是粗制樣品的另一個(gè)實(shí)例。粗制樣品包括,但不限于,血液、稀釋血液、紙上的血液、口腔試子以及樣品儲(chǔ)存基質(zhì)(例如FTA紙) 上的口腔試子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到大量的可以用該發(fā)明幫助分析的其它粗制樣品。本文中使用的術(shù)語“直接緩沖液”指的是粗制樣品可以放至其中的緩沖液。直接緩沖液包含進(jìn)行下游酶操作例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物和酶。直接緩沖液允許核酸釋放并在直接緩沖液中直接擴(kuò)增,不需要任何核酸分離或純化。說明性的PCR循環(huán)次數(shù)和溫度可以從Sambrook等的分子克隆,1993年第三版中獲得。雖然本發(fā)明關(guān)注PCR直接緩沖液的使用,但應(yīng)當(dāng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易采用本發(fā)明的直接緩沖液作為前端步驟進(jìn)行其它類型的下游酶操作,例如,使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄,或使用連接酶的寡核苷酸連接測定。本文中使用的“下游”,當(dāng)用于涉及在靶核酸上實(shí)施的方法和操作時(shí),指的是在從生物樣品中釋放核酸的方法(包括但不限于裂解細(xì)胞以將核酸從細(xì)胞中釋放)之后,在靶核酸樣品上實(shí)施的方法和操作。本文中使用的“下游酶操作”指的是在核酸樣品上實(shí)施的方法,包括但不限于使用聚合酶的PCR、使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄、或使用連接酶的寡核苷酸連接測定。本文中使用的術(shù)語“強(qiáng)堿化合物”包括但不限于NaOH。強(qiáng)堿化合物可在加入直接緩沖液的某些實(shí)施方式之前用于裂解細(xì)胞。本文中使用的“基因組DNA”指的是基因或基因片段的染色體DNA序列,包括非編碼區(qū)和編碼區(qū)的DNA序列。基因組DNA還指從細(xì)胞或染色體直接分離的DNA或這種DNA全部或部分的克隆拷貝。本文中使用的術(shù)語“等位基因”指的是與基因或DNA片段相關(guān)聯(lián)的遺傳變異,即, 占據(jù)同一基因座的DNA序列兩個(gè)或更多替代形式中的一個(gè)。本文中使用的術(shù)語“基因座”指的是染色體或核酸分子上的具體位置?;蜃牡任换蛭挥谕慈旧w的相同位點(diǎn)。本文中使用的術(shù)語“短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座”指的是含有長度3至7個(gè)堿基對的短的、重復(fù)序列元件的人類基因組的任何區(qū)域。本文中使用的術(shù)語“包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座”指的是STR基因座,其中在基因組DNA的特定區(qū)域中,重復(fù)序列元件的數(shù)量(和序列的凈長度)在等位基因之間和個(gè)體之間是不同的。本文中使用的術(shù)語“擴(kuò)增引物”和“引物”指的是寡核苷酸,其能夠與鄰近靶序列的RNA或DNA區(qū)位點(diǎn)特異性地退火,并作為合適條件下DNA合成的起始引物,在所述條件下引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo),例如,在存在核苷酸和如DNA-依賴性DNA聚合酶的聚合誘導(dǎo)劑,以及合適的溫度、PH、金屬濃度和鹽濃度的情況下。通常,PCR反應(yīng)使用一對擴(kuò)增引物, 也稱為“引物對”,包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物,其限定了待擴(kuò)增的 RNA或DNA的區(qū)域。本文中使用的術(shù)語“擴(kuò)增”指的是應(yīng)用例如各種引物延伸反應(yīng)中的任何一種,復(fù)制核酸的一部分的方法。示例性的引物延伸反應(yīng)包括但不限于PCR。除非明確說明,“擴(kuò)增” 指的是單個(gè)復(fù)制,或算術(shù)、對數(shù)或指數(shù)擴(kuò)增。
本文中使用的術(shù)語“擴(kuò)增子”或“PCR擴(kuò)增子”指的是線性地或者指數(shù)地增加多核苷酸序列的各種技術(shù),并可以是擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物。擴(kuò)增子可以是雙鏈或單鏈的,并可以包括通過變性雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物而獲得的分離成分鏈。在某些實(shí)施方式中,一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增子可以用作后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)的模板。示例性的擴(kuò)增技術(shù)包括但不限于PCR或任何其它利用引物延伸步驟的方法。擴(kuò)增的其它非限制性實(shí)例包括,但不限于,連接酶檢測反應(yīng)(LDR)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。擴(kuò)增方法可以包括熱循環(huán)或可以等溫進(jìn)行。在各實(shí)施方式中,術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”包括來自擴(kuò)增反應(yīng)任何數(shù)目循環(huán)的產(chǎn)物。本文中使用的術(shù)語“核酸序列”可以指核酸材料本身,并且不限制于生化定義具體核酸,例如DNA或RNA分子的序列信息(即,選自五個(gè)堿基字母A、C、G、T或U的字母連續(xù))。本文中使用的術(shù)語“多核苷酸”,“核酸”或“寡核苷酸”指的是天然或修飾的單體或鍵的線形聚合物,包括脫氧核糖核酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷、肽核酸等等,其通過核苷間的鍵連接并具有通過單體-單體相互作用的規(guī)律形式,例如Watson-Crick類型的堿基配對,特異結(jié)合靶多核苷酸的能力,并能夠在模板-驅(qū)動(dòng)反應(yīng)中連接于另一寡核苷酸。通常單體是通過磷酸二酯鍵或其類似鍵連接以形成大小為幾個(gè)單體(例如,3-4)到幾百個(gè)單體范圍的寡核苷酸。每當(dāng)如寡核苷酸的多核苷酸由一系列字母來表示時(shí),例如“ATGCCTG”,應(yīng)當(dāng)理解,除非另外指出,核苷酸從左到右是以5’ 一3’的順序,并且“A”表示脫氧腺苷,“C”表示脫氧胞苷,“G”表示脫氧鳥苷,“T”表示脫氧胸苷。按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn),字母A、C、G和T 可以用于指代堿基本身、包含所述堿基的核苷或核苷酸。在天然存在的多核苷酸中,核苷間的鍵通常是磷酸二酯鍵,并且亞單位可被稱作“核苷酸”。本文中使用的“序列測定”、“測定核苷酸堿基序列”、“測序”、鑒定和類似術(shù)語包括測定部分或全長序列信息。即,該術(shù)語包括序列比較、指紋分析(fingerprinting)和靶多核苷酸類似水平的信息,以及表達(dá)鑒定和目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的靶多核苷酸每個(gè)核苷的排序。在某些實(shí)施方式中,“序列測定”包括鑒定單個(gè)核苷酸,而在其它的實(shí)施方式中,多于一個(gè)核苷酸被鑒定。核苷、核苷酸和/或堿基的鑒定在本文中被認(rèn)為是等價(jià)的。注意的是,在多核苷酸上進(jìn)行序列測定通常產(chǎn)生關(guān)于完全互補(bǔ)的多核苷酸序列的等價(jià)信息,因此與在完全互補(bǔ)的多核苷酸上直接進(jìn)行序列測定是等價(jià)的。本文中使用的關(guān)于寡核苷酸探針的“多個(gè)”包括成套的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針, 其中可以有單個(gè)“通用”寡核苷酸探針,其通常針對靶多核苷酸的非變異區(qū)具有特異性,和一個(gè)或多個(gè)“野生型”和/或“突變”寡核苷酸探針,其通常針對在序列中包含等位基因或突變變體的靶多核苷酸區(qū)具有特異性。本文中使用的“核酸聚合酶”或“聚合酶”指的是使用存在的多核苷酸作為模板催化多核苷酸合成的任何多肽。本文中使用的“DNA聚合酶”指的是使用存在的多核苷酸作為模板催化DNA合成的核酸聚合酶。發(fā)明詳述通過改變預(yù)期的直接緩沖液各個(gè)組分各自的濃度,包括Tris-HCl、KCl、dNTPs、 BSA, AmpliTaq Gold DNA聚合酶、MgCl2、以及單鏈結(jié)合蛋白(SSB)、甘油和非離子表面活性劑,進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)使用例如腐殖酸作為通常存在于難以分析的生物材料樣品中的抑制劑的代表,并且因此作為容易產(chǎn)生粗制樣品的檢測指標(biāo)(proxy)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明當(dāng)分析樣品以鑒定STR等位基因時(shí),下述制劑在產(chǎn)生高質(zhì)量結(jié)果方面尤為有效。本發(fā)明包括包含3% -8%的甘油、0.2% -0.9 %的非離子表面活性劑和 1200-3000 μ g/ml BSA的直接緩沖液。本發(fā)明包括包含10_50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、3 % -8 % 的甘油、100-350 μ M 的每一種 dNTP、 0. 2% -0. 9% 的非離子表面活性劑、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0· 101-0. 35U/μ 1 的 DNA 聚
合酶的直接緩沖液。在一些實(shí)施方式中,非離子表面活性劑可以是聚山梨醇酯(Tween,Tween20), Triton-XlOO 等等。直接緩沖液中使用的試劑可以從供貨商容易地獲得。例如,DNA聚合酶可以從 Applied Biosystems 商業(yè)獲得。合適的 DNA 聚合酶包括 PolA、PolB, PolC, PolD, PolX 和 PolY DNA聚合酶和I型、II型以及III型DNA聚合酶。通常,PCR中使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,例如Taq、Pfu、Vent DeepVentT\92North 0 DNA聚合酶可以被修飾,從而在隨后例如加熱的處理之前沒有活性;例如,參見美國專利5,773,258 (化學(xué)修飾的DNA聚合酶),美國專利5,338,671抗體結(jié)合的DNA聚合酶。DNA聚合酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。DNA聚合酶包括DNA-依賴的聚合酶,其使用DNA作為模板,或RNA-依賴的聚合酶,例如逆轉(zhuǎn)錄酶,其使用RNA作為模板?;谛蛄型葱?,細(xì)菌DNA聚合酶可以細(xì)分為七個(gè)不同的家族A、B、C、D、X、Y和 RT。DNA依賴的DNA聚合酶落入六個(gè)家族(A、B、C、D、X和Y)之一,大多數(shù)落入三個(gè)家族(A、 B 禾口 C)之一。參見,例如,Ito 等(1991)Nucleic Acids Res. 19 :4045-4057 ;Braithwaite 等(199 Nucleic Acids Res. 21 :787-802 ;Filee 等(2002) J. Mol. Evol. 54 :763-773 ;和 Alba(2001)Genome Biol 2 :3002. 1-3002.4。某些DNA聚合酶可以是單鏈多肽(例如,某些 A家族和B家族的聚合酶)或亞基之一具有聚合酶活性的多亞基酶(例如,某些C家族聚合酶)。Id. A融合蛋白可以包含選自A、B、C、D、X或Y聚合酶家族的DNA聚合酶。A家族聚合酶(“Pol Α”)包括復(fù)制和修復(fù)聚合酶。該家族的復(fù)制成員包括T7DNA 聚合酶和真核線粒體DNA聚合酶Y。修復(fù)聚合酶中有大腸桿菌(E.coli)DNA Pol I,水生棲熱菌(Thermus aquaticus)Pol I (Taq DNA聚合酶)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)Pol I。切除修復(fù)和后隨鏈合成過程中產(chǎn)生的R崎片段的加工是由修復(fù)聚合酶執(zhí)行的。由于大多數(shù)熱穩(wěn)定的Pol A酶不具有3’到5’核酸外切酶活性,所以它們不能校對新合成的核酸鏈,從而具有高錯(cuò)配率。B家族聚合酶(“Pol B”)基本上是復(fù)制聚合酶,包括主要的真核DNA聚合酶α、 δ、ε,也包括DNA聚合酶ζ。Pol B聚合酶也包括由一些細(xì)菌和噬菌體編碼的DNA聚合酶, 其中最具特點(diǎn)的來自iTLPhi^和1 69噬菌體。Pol B酶參與前導(dǎo)鏈和后隨鏈兩者的合成, 并由于其在復(fù)制過程中的卓越的準(zhǔn)確性而引人關(guān)注,因?yàn)槌巳狈π钚缘腄NA聚合酶 α和ζ,許多Pol B酶具有強(qiáng)3’ -5’核酸外切酶活性。BSA可以從各種來源商業(yè)獲得,例如,來自Roche,貨號107114Μ001。FTA紙從 Whatman商業(yè)獲得。在一些實(shí)施方式中,使用帶有血斑的FTA紙。例如,來自Whatman的血斑卡(貨號WB 100014)。在一些實(shí)施方式中,包含血液或口腔細(xì)胞的FTA紙被裁剪去除含有生物材料的小區(qū),例如,直徑0. 5mm至1. 2mm,或直徑1. 0-1. 5mm,或直徑1. 5-2. Omm的圓孔。 在一些實(shí)施方式中,紙被直接放入含有直接緩沖液的PCR混合液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
在一些實(shí)施方式中,在FTA紙放入直接緩沖液之前不要求清洗FTA紙。在一些實(shí)施方式中,當(dāng)最初細(xì)胞未被裂解時(shí),例如,當(dāng)使用非FTA紙時(shí),在與直接緩沖液混合并進(jìn)行PCR反應(yīng)之前,將5-25mM的NaOH溶液與非FTA紙孵育。在其它的實(shí)施方式中,細(xì)胞可以通過暴露于非NaOH的試劑而被裂解。在一些實(shí)施方式中,直接緩沖液還包含多對PCR引物對。例如,在一些實(shí)施方式中,直接緩沖液包括5對引物對。在一些實(shí)施方式中,直接緩沖液包括10對引物對。在一些實(shí)施方式中,直接緩沖液包括多于10對引物對。在一些實(shí)施方式中,直接緩沖液不包含 PCR引物對,而是在分開的時(shí)間加入PCR引物對。本方法的一些實(shí)施方式消除了進(jìn)行PCR之前對樣品純化步驟的需要。同樣的方法可以應(yīng)用于FTA卡上的血液和口腔細(xì)胞樣品。另外,顯著地減少了生理樣品的處理,因此這可以防止樣品間可能的交叉污染以及消除人為錯(cuò)誤的可能性。在一些實(shí)施方式中,從FTA 卡到STR譜所需要的時(shí)間可以減少至少11/2小時(shí)。該方法與目前法醫(yī)市場上能夠獲得的自動(dòng)化儀器是兼容的。從FTA純化DNA的相關(guān)花費(fèi)可以消除。相對于傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法,得到完整STR譜的成功率是相當(dāng)?shù)?。如圖1所示,用Applied Biosystems Identifiler HID v. 1試劑盒直接使用的基因組DNA樣品提供了完整的STR譜。然而,當(dāng)從點(diǎn)樣在FTA圓孔(1.2mm孔)上的血液提取血液基因組DNA,而不清洗圓孔去除干擾后續(xù)樣品檢測的物質(zhì),例如,通過直接PCR的STR圖譜分析時(shí),STR譜是部分的或者無法檢測的,參見圖2A-2D。所要求保護(hù)的發(fā)明和另一商業(yè)獲得的產(chǎn)品之間的進(jìn)一步比較數(shù)據(jù)表明,在任何情況下,所要求保護(hù)的發(fā)明的直接緩沖液通過使用1.2mm大小的打孔器在點(diǎn)樣在FTA紙上的 10份血源樣本中進(jìn)行直接PCR,為10份均提供了完整的STR譜(具體地,圖3-12,標(biāo)記“A” 的電泳圖譜)。使用另一個(gè)STR試劑盒,完整的STR譜只見于10份檢測樣本中的4份(圖 3B、4B、7B和8B),部分STR譜見于10份檢測樣本中的5份(圖5B-7B和9B-10B),并且有一個(gè)樣本未見STR譜(圖6B)。
實(shí)施例在第一個(gè)實(shí)施例中,將血液施用于FTA紙(Whatman)并且空氣干燥。制備FTA 紙的0. 5mm圓孔并放入含有PCR引物的直接緩沖液,所述PCR引物來自商業(yè)獲得的 Identifiler <g) Human Identity 試劑盒(Applied Biosystems)。接著進(jìn)行 PCR0在第二個(gè)實(shí)施例中,使用TE緩沖液(IOmM Tris-Cl和0. ImM EDTA, pH 8. 0)制備 100倍血液稀釋液。1 μ 1稀釋血液用于在直接緩沖液中啟動(dòng)PCR。在第三個(gè)實(shí)施例中,收集口腔拭子樣品并置于500 μ 1 TE緩沖液中。產(chǎn)生的懸浮液在97°C加熱5分鐘。10 μ 1產(chǎn)生的懸浮液用于在直接緩沖液中啟動(dòng)PCR。依據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的示例性試劑盒本發(fā)明也提供了設(shè)計(jì)為加速實(shí)施某些方法的試劑盒。在一些實(shí)施方式中,試劑盒通過裝配實(shí)施所述方法中使用的兩種或更多種組分而用于加速目標(biāo)方法的實(shí)施。在一些實(shí)施方式中,試劑盒可以包括預(yù)先測量的單位量的組分,以最小化終端用戶測量的需要。在一些實(shí)施方式中,試劑盒可以包括進(jìn)行該發(fā)明的一種或多種方法的說明書。在某些實(shí)施方式中,試劑盒的組分被優(yōu)化,以與另一試劑盒組合操作。盡管本發(fā)明已依據(jù)這些示例性實(shí)施方式和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解,在不進(jìn)行過多的實(shí)驗(yàn)的情況下,這些實(shí)施方式的多種變化和修改是可能的。 所有這些變化和修改都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此,在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了試劑盒,其包含多個(gè)引物對,其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;和直接緩沖液,其中所述直接緩沖液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KCl、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01% -0. 04% 的疊氮化鈉、3% -8%的甘油、100-350μΜ的每一種dNTP、0. 2% _0. 9 %的非離子表面活性劑、 1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 Ampli Taq Gold DNA 聚合酶。這樣的試劑盒可以用于例如鑒定生物諸如人的身份,其是通過利用例如毛細(xì)管電泳分析的微衛(wèi)星多態(tài)性的集合來實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)行這種人類身份鑒定的說明性步驟可見于例如從Applied Biosystems商業(yè)獲得的Identifiler HID試劑盒中,以及美國專利 6,221,598,6, 479,235,5, 843,660和7,008,771。在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明提供的試劑盒、方法和反應(yīng)混合物可以采用方法用于降解樣品的多重PCR,例如見于Dimsoski和Woo的 W0050M515。在一些實(shí)施方式中,試劑盒中的直接緩沖液包含0. 2-0. 9 %的聚山梨醇酯、 3% -8% 的甘油、1200-3000 μ g/ml 的 BSA。在一些實(shí)施方式中,試劑盒中的直接緩沖還包含10_50mM的Tris-HCl (pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、3 % -8 % 的甘油、 100-350 μ M 的每一種 dNTP、0. 2 % -0. 9 % 的聚山梨醇酯、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶。在一些實(shí)施方式中,試劑盒中的直接緩沖液進(jìn)一步包含5mM-25mM的NaOH。在一些實(shí)施方式中,NaOH在與直接緩沖液分開的小瓶中提供。本申請中引用的所有文獻(xiàn)和類似資料,包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍、 論文和因特網(wǎng)網(wǎng)頁,無論這些文獻(xiàn)和類似資料的形式如何,均通過引用以其整體明確納入本文用于任何目的。2007年3月23日提交的美國申請?zhí)?0/896,668,2007年5月17號提交的美國申請?zhí)?1/750,316和2008年3月M日提交的美國申請?zhí)?2/054,174通過引用以其整體所有內(nèi)容納入本文。盡管本發(fā)明是與各種實(shí)施方式組合進(jìn)行描述的,但并不意味著本發(fā)明受限于這些實(shí)施方式。相反地,本發(fā)明包含了各種替代、修改和等同方式,如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的。
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法,其包括提供包含脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將所述粗制樣品與NaOH孵育;將所述粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;以及在所述含有核酸的溶液中進(jìn)行PCR,其中所述直接緩沖液包含至少0. 2% -0. 9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和1000-3000 μ g/ml的BSA0
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所述直接緩沖液還包含10-50mM的Tris-HCl(pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01%-0. 04% 的疊氮化鈉、100-350 μ M 的每一種 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
4.一種鑒定人的身份的方法,其包括提供包含來自所述人的脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將所述粗制樣品與NaOH孵育;將所述粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液,其中所述直接緩沖液包含多個(gè)引物對,其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;在所述含有核酸的溶液中進(jìn)行PCR以形成多個(gè)PCR擴(kuò)增子,其中每個(gè)PCR擴(kuò)增子具有可確定的大小;以及通過參考所述PCR擴(kuò)增子的大小來鑒定所述人,其中所述直接緩沖液還包含 0. 2% -0.9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和1000-3000 μ g/ml的BSA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中所述直接緩沖液還包含10-50mMTris-HCl (pH8. 3)、 30-80mM KCl、1. 4-2. 4mM MgCl2、0. 01% -0. 04% 的疊氮化鈉、100-350 μ M 的每一種 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
7.一種制備核酸的方法,其包括提供包含脫氧核糖核酸的粗制樣品;任選地將所述粗制樣品與NaOH孵育;將所述粗制樣品與直接緩沖液混合以形成含有核酸的溶液;在所述溶液中進(jìn)行下游酶操作,其中所述直接緩沖液包含0.2% -0.9%的聚山梨醇酯、3% -8% 的甘油和 1000-3000 μ g/ml 的 BSA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中所述下游酶操作是PCR。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中所述直接緩沖液還包含10-50mM的Tris-HCl(pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01%-0. 04% 的疊氮化鈉、100-350 μ M 的每一種 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中所述直接緩沖液還包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、 100-350 μ M 的每一種 dNTP、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
12.—種試劑盒,其包含多個(gè)引物對,其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;以及直接緩沖液,其中所述直接緩沖液包含0. 2% -0. 9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和 1000-3000 μ g/ml 的 BSA。
13.權(quán)利要求12的試劑盒,其中所述直接緩沖液進(jìn)一步包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、 100-350 μ M 的每一種 dNTP、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
14.權(quán)利要求13的試劑盒,其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
15.一種反應(yīng)混合物,其包含直接緩沖液和多個(gè)引物對,其中每個(gè)引物對位于包含短串聯(lián)重復(fù)(STR)的基因座的側(cè)翼;以及其中所述直接緩沖液包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的疊氮化鈉、 3%-8% 的甘油、100-350 μ M 的每一種 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯 20、1200-3000 μ g/ ml 的 BSA 和 0. 101-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸的改進(jìn)的方法,試劑盒和反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施例中提供了允許從極低樣品純化的粗制樣品中直接擴(kuò)增核酸的新的直接緩沖液制劑。
文檔編號C12Q1/68GK102177250SQ200980134038
公開日2011年9月7日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者C·張, D·Y·王, L·K·亨尼西 申請人:生命科技公司
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