專利名稱：生產(chǎn)l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用微生物的L-氨基酸生產(chǎn)方法，特別是L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸等L-氨基酸的生產(chǎn)方法。L-谷氨酸作為調味品、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和 L-色氨酸作為動物飼料用添加劑、健康食品成分或氨基酸輸液等，在產(chǎn)業(yè)上是有用的L-氨基酸。
背景技術：
L-氨基酸是通過使用各種微生物的發(fā)酵方法來進行工業(yè)生產(chǎn)的。例如，L-谷氨酸主要是通過使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)的稱為棒狀桿菌型細菌中的L-谷氨酸生產(chǎn)菌或其突變株的發(fā)酵法來進行生產(chǎn)(參照例如非專利文獻1)。作為通過使用其它微生物的發(fā)酵法進行的 L-谷氨酸生產(chǎn)方法，已知有使用芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉屬(Str印tomyces)、青霉屬 (Penicillium)等的微生物(參照例如專利文獻1)，假單胞菌屬(I^eudomonas)、節(jié)桿菌屬 (ArthrcAacter)、沙雷氏菌屬Gerratia)、假絲酵母屬(Candida)等的微生物(參照例如專利文獻幻，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes) (現(xiàn)稱產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes))等的微生物(參照例如專利文獻3)，大腸桿菌突變株(參照例如專利文獻1)等的方法。此外，還公開了使用屬于克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)或泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬的微生物的L-谷氨酸生產(chǎn)方法(參照例如專利文獻2 4)。為了通過諸如上述的使用微生物的發(fā)酵法生產(chǎn)L-氨基酸等目的物質，可以采用使用野生型微生物(野生株)的方法、使用從野生株衍生的營養(yǎng)缺陷型株的方法、使用從野生株作為各種藥物抗性突變株衍生的代謝調節(jié)突變株的方法、使用具有營養(yǎng)缺陷型株和代謝調節(jié)突變株這兩者的性質的菌株的方法等。而且，近年來在目的物質的發(fā)酵生產(chǎn)中采用了重組DNA技術。例如，通過增強L-氨基酸生物合成體系酶編碼基因的表達(專利文獻5、專利文獻6)、或增強L-氨基酸生物合成體系的碳源流入(專利文獻7)來提高微生物的L-氨基酸生產(chǎn)力。葡萄糖脫氫酶大體上可分為NAD (P)依賴型和PQQ (吡咯并喹啉醌)依賴型。進一步，已知PQQ依賴型(EC1. 1. 5. 2)又包括可溶型和膜結合型，且后者在腸桿菌科細菌中存在于周質空間(外膜、內膜間的空隙)，且在腸桿菌科細菌中廣泛存在。以下，將這種存在于周質空間的以PQQ為輔酶的葡萄糖脫氫酶也記作“GCD”。已知大腸桿菌等一部分細菌不具有G⑶輔酶PQQ的合成能力，只有通過添加PQQ 才會表現(xiàn)GCD活性(非專利文獻幻。另一方面，泛菌屬細菌等細菌具有PQQ合成能力，其具有G⑶全酶。作為涉及GCD的技術，已知有利用GCD編碼基因被缺損的木葡糖桿菌 (Gluconobacter xylnus)從葡萄糖生產(chǎn)纖維素的方法(J. Biosci. Bioeng. 99 (4), 415-422, 2005)。此外，還已知利用葡萄糖脫氫酶活性降低的埃希氏菌屬細菌、或固有缺失葡萄糖脫氫酶活性的埃希氏菌屬細菌生產(chǎn)[5S，6S]-5，6-二羥基-1，3-環(huán)己二烯-1-羧酸的方法(專利文獻8)。然而，尚不清楚細菌GCD活性的降低對L-氨基酸生產(chǎn)能力的影響?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1 特開平5-244970號公報專利文獻2 美國專利第3，563，857號說明書專利文獻3 特公昭32-9393號公報專利文獻4 特開2000-189175號公報專利文獻5 美國專利第5168056號說明書專利文獻6 美國專利第5776736號說明書專利文獻7 美國專利第5906925號說明書專利文獻8 國際公開第W02006/133898號小冊子非專利文獻非專利文獻1 明石邦彥等著，7 ^ 7酸発酵，學會出版中心，195 215頁，1986
年非專利文獻2 =FEMS Microbiol. Lett.，24，329-333，1984

發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的課題是提供提供能夠高效生產(chǎn)L-氨基酸的屬于腸桿菌科的微生物，以及使用該微生物高效生產(chǎn)L-氨基酸的方法。解決問題的方法本發(fā)明人等為解決上述問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)通過對固有地具備GCD 活性的腸桿菌科細菌進行修飾以降低GCD活性，能夠提高L-氨基酸生產(chǎn)能力，從而完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下。(1) 一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸桿菌科且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細菌，從而在培養(yǎng)物中生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)物收集L-氨基酸；其中，所述細菌是固有地具備以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶的活性、但經(jīng)過修飾而降低了該酶的活性的細菌。(2)前述方法，其中，通過滅活編碼所述酶的gcd基因而降低了 G⑶活性。(3)前述方法，其中，所述gcd基因是編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列的DNA或其變體。(4)前述方法，其中，所述L-氨基酸選自L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸以及L-半胱氨酸。(5)前述方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸或L-半胱氨酸。(6)前述方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸，且所述細菌中選自檸檬酸合酶、甲基檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脫氫酶中的1種或2種以上的酶的活性得到了增強。(7)所述方法，其中，所述L-氨基酸是L-半胱氨酸，且所述細菌中選自3-磷酸甘油酸脫氫酶、絲氨酸乙酰轉移酶、硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)中的至少1種或2種以上的活性，和/或yeaS基因的表達得到了增強。(8)前述方法，其中，所述細菌是屬于選自泛菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、摩根氏菌屬和耶爾森菌屬中的屬的細菌。發(fā)明的效果通過使用本發(fā)明的微生物，能夠高效地發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、 L-精氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、或L-半胱氨酸等L-氨基酸。


[圖1]顯示輔助質粒RSF-Red-TER的結構的圖。[圖2]顯示輔助質粒RSF-Red-TER的構建的圖。[圖3]顯示啟動子Pnlp的序列的圖。發(fā)明的
具體實施例方式以下，對本發(fā)明進行具體說明。<1>本發(fā)明中使用的屬于腸桿菌科的細菌本發(fā)明中使用的細菌是固有地具備GCD活性、且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細菌，且該細菌經(jīng)過了修飾而降低了 GCD活性。本發(fā)明的細菌可以通過對固有地具備GCD活性、且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細菌修飾而降低GCD活性來獲得。此外，本發(fā)明的細菌還可以通過對固有地具備G⑶活性、但經(jīng)過了修飾而降低了 G⑶活性的屬于腸桿菌科的細菌賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力、或者增強所述細菌的L-氨基酸生產(chǎn)能力來獲得。對于L-氨基酸的種類沒有特殊限制，可以列舉出L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-瓜氨酸等堿性氨基酸，L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、 L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-蘇氨酸、L-絲氨酸等羥基單氨基羧酸形式的氨基酸，L-脯氨酸等環(huán)式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等酸性氨基酸，特別優(yōu)選L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸。本發(fā)明的微生物可以具有2種以上氨基酸的生產(chǎn)能力。此外，在本發(fā)明中，L-氨基酸包括游離體的L-氨基酸和/或其鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、鉀鹽。在本發(fā)明中，具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細菌，是指具有當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，產(chǎn)生并向培養(yǎng)基中分泌L-氨基酸的能力的細菌。此外，優(yōu)選的是能夠使培養(yǎng)基中蓄積優(yōu)選為 0. 5g/L以上、更優(yōu)選為1. Og/L以上的量的目的L-氨基酸的細菌。以下，將用于進行修飾以降低GCD活性的、作為本發(fā)明的細菌的親本株使用的細
5菌以及賦予或增強L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法示例如下。<2_1>本發(fā)明的細菌本發(fā)明的細菌是屬于腸桿菌科的細菌。腸桿菌科中包括屬于埃希氏菌(Escherichia)、腸桿菌(Enterobacter)、歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、泛菌(Pantoea)、光狀桿菌(Photorhabdus)、 普羅威登斯菌(Providencia)、拉烏爾菌(Raoultella)、沙門氏菌(Salmonia)、沙雷氏菌 (Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、摩根氏菌(Morganella)、耶爾森菌(Yersinia)等屬的細菌。特別是優(yōu)選根據(jù) NCBI (National Center for Biotechnology Information)的數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgi · id = 91347)中使用的分類法被分類為腸桿菌科的細菌。所謂屬于埃希氏菌屬的細菌沒有特別的限制，是指該細菌根據(jù)微生物學家所知的分類被歸類為埃希氏菌屬。作為屬于埃希氏菌屬的細菌的例子，包括但不限于大腸桿菌 (E. coli) 。屬于埃希氏菌屬的細菌例如包括Neidhardt等的著作(Neidhardt，F(xiàn). C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella :Cellular and Molecular Biology/SecondEdition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press，Washington, D. C.)中記述的種系的微生物。具體而言，可以列舉源自原型野生株K12株的大腸桿菌 W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌 MG1655(ATCC47076)等。這些菌株可以從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址P.O. Box 1549Manassas，VA 20108，United States of America)通過分售獲得。即，對各菌株給予了對應的登錄號，可以利用該登錄號通過分售獲得。各菌株的相應登錄號見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄。作為腸桿菌屬細菌，可以列舉成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。具體而言，可以使用歐洲專利申請公開952221號說明書中示例的菌株。而且，一些成團腸桿菌最近基于16SrRNA堿基序列分析等被重新分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。 在本發(fā)明中，只要是分類為腸桿菌科的，可以是屬于腸桿菌屬或泛菌屬中任何一個屬的細菌。作為腸桿菌屬的代表株，可以列舉出成團腸桿菌ATCC12287株。作為泛菌屬細菌的代表性細菌，可以列舉出Pantoea ananatis,斯氏泛菌 (Pantoea stewartii)、成團泛菌、檸檬泛菌(Pantoea citrea)。具體而言，可以列舉出下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請公開0952221 號說明書)Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請公開0952221 號說明書)Pantoea ananatis AJ13601 株(FERM BP-7207)(歐洲專利申請公開0952221 號說明書)這些菌株在分離出來時被鑒定為成團腸桿菌，并作為成團腸桿菌保藏。但是，如上所述，現(xiàn)在通過16S rRNA的堿基序列解析等被重新分類為Pantoea ananatis。
作為歐文氏菌屬細菌，可以列舉出解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細菌，可以列舉出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。具體地，可以列舉出下述菌株。解淀粉歐文氏菌ATCC15580株胡蘿卜軟腐歐文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(歐洲專利申請公開955368號說明書)植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(歐洲專利申請公開955368號說明書)本發(fā)明的細菌是諸如上述的腸桿菌科細菌，并且，該細菌是固有地具備GCD活性、 且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細菌。所謂固有地具備GCD活性的腸桿菌科細菌，是指野生株或gcd基因非修飾株具有GCD活性的細菌。作為這樣的屬于腸桿菌科的細菌，可以列舉出屬于泛菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、摩根氏菌屬、以及耶爾森菌屬、檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)、變形桿菌屬(Proteus)等屬的細菌。更具體地，可以列舉出Int. J. Syst. Bacteriol. ,39(1),61-67, 1989中描述的細菌。大腸桿菌攜帶gcd基因，能夠產(chǎn)生GCD脫輔酶，但其不具備PQQ產(chǎn)生能力，未添加 PQQ的條件下其不具有G⑶活性。然而已經(jīng)知道，如果使其表達某外源基因，則會生成代替 PQQ的物質，從而表現(xiàn)G⑶活性(W02006/133898)。這樣，像埃希氏菌屬細菌那樣通常不具有GCD活性、但處于表現(xiàn)GCD活性的狀態(tài)的細菌，包含于本發(fā)明所稱的“固有地具備GCD活性的腸桿菌科細菌”中。關于GCD活性，參見后述。以下，就賦予如所述的細菌以L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法、或增強如所述的細菌的 L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法進行示例說明。為了賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細菌等的氨基酸生產(chǎn)菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營養(yǎng)缺陷突變株、L-氨基酸的類似物抗性株或代謝調節(jié)突變株，創(chuàng)建L-氨基酸生物合成系統(tǒng)酶表達得到增強的重組菌株等等(參見《7 S 7酸発酵》，(株)學會出版中心，1986年5月30日首次出版發(fā)行，第77-100頁)。 這里，在L-氨基酸生產(chǎn)菌的選育中，所賦予的營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調節(jié)突變等性質可以是單獨一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達被增強的L-氨基酸生物合成系統(tǒng)酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。此外，營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調節(jié)突變等性質的賦予可以與生物合成系統(tǒng)酶的增強組合來進行。具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌株、類似物抗性菌株或代謝調節(jié)突變菌株可如下獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規(guī)突變處理，即X-射線或紫外線照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等處理；然后從所得的突變菌株中選擇顯示營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性或代謝調節(jié)突變并且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的菌株。此外，可以通過進行基因重組來增強酶活性從而賦予或增強L-氨基酸生產(chǎn)能力。 酶活性的增強，可以列舉出例如通過修飾細菌從而增強編碼參與L-氨基酸的生物合成的基因的表達的方法。用于增強基因的表達的方法可以這樣來實現(xiàn)導入通過將包含這些基因的DNA片段導入適當?shù)馁|粒(例如至少包含負責質粒在微生物內的復制增殖功能的基因的質粒載體)而形成的擴增質粒；或者，通過接合、基因轉移等使這些基因在染色體上多拷貝化；抑或在這些基因的啟動子區(qū)域導入突變(參考國際公開小冊子W095/34672號)。當向上述擴增質?；蛘呷旧w上導入目的基因時，用于表達這些基因的啟動子可以是能夠在屬于腸桿菌科的細菌中發(fā)揮功能的任何啟動子，可以是所使用的基因自身的啟動子，也可以是經(jīng)修飾的啟動子。也可以通過適當?shù)剡x擇在L-氨基酸生產(chǎn)菌中強力發(fā)揮功能的啟動子，或者通過使啟動子的-35、-10區(qū)域與共有序列接近，來進行基因表達量的調節(jié)。如上所述的增強酶基因表達的方法，在W000/18935號小冊子、歐洲專利申請公開 1010755號說明書等中有記載。下面，就賦予細菌以L-氨基酸生產(chǎn)能力的具體方法、以及被賦予了 L-氨基酸生產(chǎn)能力的細菌進行示例。以下的描述主要涉及埃希氏菌屬細菌，但以下方法也適用于本發(fā)明中使用的腸桿菌科細菌。L-蘇氨酸生產(chǎn)菌作為具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的微生物優(yōu)選實例可以列舉出L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種或2種以上的活性得到了增強的細菌。作為L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶，可以列舉出天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、thr操縱子所編碼的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基轉移酶(天冬氨酸轉氨酶)(aspC)。括號里為該基因的簡寫符號(下同)。這些酶中特別優(yōu)選天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉移酶以及蘇氨酸合酶。 也可以將L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)基因導入蘇氨酸分解受到抑制的細菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細菌，例如可以列舉出蘇氨酸脫氫酶活性缺損的TDH6菌株(特開 2001-346578 號)。L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶的酶活性受最終產(chǎn)物L-蘇氨酸的抑制。因此，為了構建L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，優(yōu)選對L-蘇氨酸生產(chǎn)菌合成系統(tǒng)基因進行修飾以使所述酶不受L-蘇氨酸的反饋抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成弱化子(attenuator)結構，蘇氨酸操縱子的表達受到培養(yǎng)液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且表達受到弱化作用的抑制。這種修飾可通過去除弱化區(qū)中的前導序列或弱化子來實現(xiàn)(參照 Lynn, S. P. , Burton, W. S. , Donohue, Τ. J. , Gould, R. Μ. , Gumport, R. I. , and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194 :59-69(1987)；國際公開第 02/26993 號小冊子；國際公開第 2005/049808 號小冊子)。蘇氨酸操縱子的上游存在固有啟動子，但可以用非天然啟動子來取代它(參考 W098/04715號小冊子)，也可以構建蘇氨酸操縱子使得參與蘇氨酸生物合成的基因的表達受到λ噬菌體的阻遏物Oppressor)和啟動子的調控(參考歐洲專利第0593792號說明書)。此外，為了對細菌進行修飾使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制，可以通過選擇對α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株來實現(xiàn)。對于如上所述經(jīng)修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優(yōu)選的是其在宿主內的拷貝數(shù)有所提高、或者是其連接于強啟動子而表達量有所增加。除了通過使用質粒的擴增來提高拷貝數(shù)之外，還可以通過使用轉座子、Mu噬菌體等向基因組中轉移蘇氨酸操縱子來提高拷貝數(shù)。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶之外，還增強與糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)或呼吸鏈相關的基因或調控基因表達的基因，或者糖攝取基因。這些在L-蘇氨酸生產(chǎn)中有效的基因的實例可以列舉出，轉氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號說明書)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PepC)(國際公開95/06114號小冊子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps) (歐洲專利877090號說明書)、棒狀桿菌型細菌或者芽孢桿菌屬細菌的丙酮酸羧化酶基因 (國際公開99/18228號小冊子、歐洲申請公開1092776號說明書)。此外，強化賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達，或對宿主賦予L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，也是合適的。作為給予抗性的基因的實例，可以列舉出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 Q003))、rhtB基因(歐洲專利申請公開第0994190號說明書)、rhtC基因(歐洲專利申請公開第1013765號說明書)、yfiK、yeaS 基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)。此外，關于對宿主賦予L-蘇氨酸抗性的方法，可以參考歐洲專利申請公開第0994190號說明書、國際公開第90/04636號小冊子中所記載的方法。作為L-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，可以列舉 大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國專利第5，175，107號、美國專利第5，705，371 號)、大腸桿菌472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國專利第5，631，157號)、大腸桿菌 NRRL-21593 (美國專利第5，939，307號)、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利第5，474，918 號)、大腸桿菌FERM BP-3519和FERM BP-3520 (美國專利第5，376，538號)、大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner et al.，Genetika (俄語)，14，947-956 (1978))、大腸桿菌 VL643 和 VL2055 (EPl 149911A)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突變(leaky mutation) 0該菌株的rhtA基因也有賦予對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性的突變。 B-3996菌株攜帶pVIC40，pVIC40是通過將含有突變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到由RSF1010來源的載體中而獲得的。這種突變的thrA基因編碼基本上已對蘇氨酸反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于 All-UnionScientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素禾斗學中心)(Nagatinskaya Street 3~A, 117105 Moscow，Russia)，保藏號為 RIA 1867。該菌株也在 1987 年 4 月 7 日于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms) (VKPM) (1 Dorozhny proezd. ,1 Moscow 117545, Russia)進行了國際保藏，保藏號為B-3996。還可以使用大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作為L-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株。B-5318菌株是異亮氨酸原養(yǎng)型的，并且pVIC40質粒中的蘇氨酸操縱子的調控區(qū)域被置換為溫度敏感的λ噬菌體Cl阻遏物和I3R啟動子。VKPM B-5318 菌株在1990年5月3日于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)進行了國際保藏，保藏號為 VKPM B-5318。編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的大腸桿菌thrA基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號 337 至 2799，GenBank 登錄號 NC_000913. 2，gi :49175990)。thrA 基因位于大腸桿菌 K_12 染色體上thrL基因和thrB基因之間。大腸桿菌的編碼高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)闡明 (核苷酸編號沘01至3733，GenBank登錄號NC_000913. 2，gi :49175990)。thrB基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrA基因和thrC基因之間。大腸桿菌的編碼蘇氨酸合酶的thrC
9基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號37；34至5020，GenBank登錄號NC_000913. 2，gi :49175990)。 thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開放閱讀框之間。所述3個基因全部作為一個單獨的蘇氨酸操縱子發(fā)揮功能。為增強蘇氨酸操縱子的表達，優(yōu)選從操縱子中將影響轉錄的弱化子區(qū)域去除(W02005/049808，W02003/097839)。編碼對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，以及thrB和thrC基因可以以一個操縱子的形式從存在于蘇氨酸生產(chǎn)株大腸桿菌 VKPM B-3996菌株中的公知的pVIC40質粒獲得。pVIC40質粒在美國專利5，705, 371中有詳述。rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上的ISmin處，靠近編碼谷氨酰胺轉運系統(tǒng)的成分的glnHPQ操縱子。rhtA基因與ORFl (ybiF基因，核苷酸編號764至1651 ,GenBank登錄號 AAA218541，gi :440181)相同，位于pexB與ompX基因之間。表達由ORFl編碼的蛋白的單元稱為rhtA基因(rht 對高絲氨酸和蘇氨酸抗性)。此外，已經(jīng)證明rhtA23突變是在相對于 ATG起始密碼子的-1 位置用 G —A取代(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology (第 17 界國際生物化學與分子生物學大會暨美國生物化學與分子生物學協(xié)會年會摘要)，SanFrancisco, California，1997 年 8 月 24-29 日，摘要號 457，EP 1013765 A)。大腸桿菌的asd基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號3572511至3571408，GenBank登錄號NC_000913. l,gi :16131307),并且可以根據(jù)該基因的堿基序列制備引物通過PCR來獲得 (參見White，T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。其它微生物的asd基因可以通過類似方式獲得。此外，大腸桿菌的aspC基因已經(jīng)闡明(核苷酸編號983742至984932，GenBank登錄號NC_000913. 1，gi :16128895),并且可以通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因可以通過類似方式獲得。L-賴氨酸生產(chǎn)菌屬于埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的實例可以列舉出對L-賴氨酸類似物具有抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制屬于埃希氏菌屬的細菌的生長，但是這種抑制在當 L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時會被全部或部分解除。L-賴氨酸類似物的實例可以列舉出、但不限于，氧代賴氨酸，賴氨酸氧肟酸(lysine hydr0Xamate)，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸 (AEC)，Y-甲基賴氨酸，α-氯代己內酰胺等。這些對賴氨酸類似物具有抗性的突變株可以通過對屬于埃希氏菌屬的細菌進行常規(guī)的人工誘變處理來得到?？捎糜贚-賴氨酸生產(chǎn)的菌株的具體實例可以列舉出大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543,NRRLB-12185 ；參見美國專利第4，346，170號)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，天冬氨酸激酶已經(jīng)對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏。作為L-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-賴氨酸生產(chǎn)菌的親本株，可以列舉出L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種或者2種以上的活性得到了增強的菌株。相關的酶包括，但不限于二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、 二氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國專利第6，040, 160號)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因、二氨基庚二酸差向異構酶(dapF)、
10四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脫?；?dapE)以及天冬氨酸酶 (aspA) (EP 1253195 A)。在這些酶中，特別優(yōu)選為二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、二氨基庚二酸差向異構酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶以及琥珀酰二氨基庚二酸脫?；?。此外，親本株中下述基因的表達水平可以得到增強與能量效率相關的基因(cyo) (EP 1170376 A)、編碼煙酰胺核苷酸轉氫酶的基因(pntAB)(美國專利第5，830，716號)、 ybjE基因(W02005/073390)、或所述基因的組合。作為L-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-氨基酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，還可以列舉催化通過從L-氨基酸生物合成途徑改道而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應的酶的活性減少或者缺損的菌株。作為催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸之外的化合物的反應的酶的例子，可以列舉出高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國專利第 5，827，698 號)和蘋果酸酶(W02005/010175)。作為優(yōu)選的L-賴氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉大腸桿菌WC196 Δ cadAAldcC/ PCABD2 (W02006/078039)。該菌株是通過在編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和IdcC基因被破壞了的WC196株中導入美國專利第6040160記載的質粒pCABD2而得到的菌株。WC196株是由大腸桿菌K-12來源的W3110株出發(fā)，用突變型IysC基因(美國專利第5，661，012號) 替換W3110株染色體上的野生型IysC基因后賦予AEC抗性而選育得到的菌株(美國專利第5，827，698號)，所述突變型IysC基因編碼第352位的蘇氨酸被替換成異亮氨酸從而對 L-賴氨酸反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶III。WC196株被命名為大腸桿菌AJ13069，已于 1994年12月6日保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(現(xiàn)為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心、〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERMP-14690;并于1995年9月四日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-5252 (美國專利第5，827，698號)。WC196 Δ cadA Δ Idc本身也是優(yōu)選的L-賴氨酸生產(chǎn)菌。PCABD2包含編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的大腸桿菌來源二氫吡啶二羧酸合成酶(DDPQ的突變型dapA基因、編碼具有解除了 L-賴氨酸反饋抑制的突變的大腸桿菌來源天冬氨酸激酶III的突變型IysC基因、編碼大腸桿菌來源二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因、以及編碼乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)來源二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因。L-半胱氨酸生產(chǎn)菌細菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力可以通過增強L-半胱氨酸生物合成途徑的酶的活性，或增強參與該途徑的底物化合物如L-絲氨酸等的生成的酶，例如3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸乙酰轉移酶等的活性來提高。3-磷酸甘油酸脫氫酶受絲氨酸的反饋抑制，通過使細菌攜帶編碼該反饋抑制被減弱或解除的突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA基因，可以增強該酶活性。此外，絲氨酸乙酰轉移酶受L-半胱氨酸的反饋抑制。因此，通過使細菌攜帶編碼該反饋抑制被減弱或解除的絲氨酸乙酰轉移酶的突變型cysE基因，可以增強該酶活性。作為編碼大腸桿菌的SAT的基因，cysE已經(jīng)從野生株以及L-半胱氨酸分泌突變株中被克隆出來，其堿基序列已經(jīng)闡明(Denk, D. and Boeck, Α.，J. General Microbiol.，133， 515-525 (1987))。該堿基序列以及該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 37和38所示。此外，通過增強硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)的活性，也可以提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力。硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)蛋白質群由cysPTWA基因簇編碼(特開2005-137369 號公報，EP1528108號說明書)。此外，細菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力還可以通過提高yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)的表達來提高。yeaS基因的堿基序列以及該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:39和40所示。已知在細菌中，除了 ATG以外，還會使用GTG等各種密碼子作為起女臺密石馬子(http //depts. Washington, edu/agro/genomes/students/stanstart. htm)。在SEQ IDNO :39和40中標出的是與最初的密碼子gtg對應的氨基酸Val，但實際上很可能是Met。具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的埃希氏菌屬細菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，例如，用編碼反饋抑制抗性絲氨酸乙酰轉移酶的不同cysE等位基因轉化的大腸桿菌JM15(美國專利6，218，168，俄羅斯專利申請2003121601)，具有過表達編碼適于向細胞分泌有毒物質的蛋白的基因的大腸桿菌 W3110(美國專利5，972，66；3)，半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因編碼的半胱氨酸調節(jié)子的正向轉錄調控物活性增強的大腸桿菌W3110 (W00127307A1)，等等。細菌的L-半胱氨酸生產(chǎn)能力可以通過進行修飾降低yhaM基因編碼的蛋白質(以下也記作“YhaM”)的活性來加以提高。yhaM基因與ECK3099、b4470、yhaN基因同義，以前也稱作b3109或b3108。作為具有L-半胱氨酸生產(chǎn)能力的泛菌屬細菌，可以列舉出經(jīng)過修飾而降低了半胱氨酸脫巰基酶活性的Pantoea ananatis菌株，以及再進一步一具有編碼L-半胱氨酸反饋抑制減弱的突變型絲氨酸乙酰轉移酶的基因的Pantoea ananatis菌株。作為用于這樣的L-半胱氨酸生產(chǎn)菌的選育的親本株，可以列舉出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17 株以及SC17(0)株。AJ13355株是作為低pH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株從靜岡縣磐田市的土壤中分離出來的菌株，而SC17株是從AJ13355株出發(fā)作為粘液質低生產(chǎn)突變株選擇出來的菌株(美國專利第6，596，517號)。AJ13355株于平成10年2 月19日保藏在通產(chǎn)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(現(xiàn)名產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址郵政編碼305-8566，茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM P-16644，并于平成11年1月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號 FERM BP-6614。SC17(0)株是為了對Pantoea ananatis進行基因破壞，作為對λ Red基因產(chǎn)物具有抗性的菌株而構建的菌株(參照參考例1)。SC17株的內部編號是AJ416，其于平成21年2月4日國際保藏在產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM BP-11091。此外，SC17(0)株于2005年9月21日國際保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika)(地址Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)，保藏號 VKPM B-9246。細菌生產(chǎn)的L-半胱氨酸在培養(yǎng)基中通過二硫鍵部分轉化為L-胱氨酸。此外，
12如后述，有時L-半胱氨酸通過和培養(yǎng)基中含有的硫代硫酸反應生成S-磺酸半胱氨酸 (Szczepkowski T.W. ,Nature, vol. 182(1958))。進一步，細菌的細胞內生成的L-半胱氨酸有時還和細胞中存在的酮或醛、例如丙酮酸縮合，以硫代半酮縮醇(hemithioketal)為中間體生成噻唑烷(thiazolidine)衍生物(參考日本專利第四92010)。這些噻唑烷衍生物以及硫代半酮縮醇有時作為平衡混合物存在。因此，在本發(fā)明中，L-半胱氨酸生產(chǎn)能力，不僅限于在培養(yǎng)基中或者菌體內蓄積L-半胱氨酸的能力，還包括在培養(yǎng)基中蓄積除L-半胱氨酸之外，L-胱氨酸或其衍生物，例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物或硫代半酮縮醇或者它們的混合物的能力。L-亮氨酸生產(chǎn)菌L-亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括，但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美國專利第 6，124，121號))或對亮氨酸類似物如β-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5， 5，5-三氟亮氨酸等有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭62-34397號和特開平8-70879號)； 通過W096/06^6中描述的基因工程方法獲得的大腸桿菌菌株；大腸桿菌H-9068(特開平 8-70879 號)，等等。用于本發(fā)明的細菌可以是已通過增加參與L-亮氨酸生物合成的一種以上的基因的表達得到改良的。這樣的基因的實例可優(yōu)選例舉以編碼解除了 L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶的突變IeuA基因(美國專利第6，403，342號)為代表的IeuABCD操縱子中的基因。此外，本發(fā)明的細菌可以是已通過增加一種以上編碼從細菌細胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表達而得以改良的。這樣的基因的實例包括1^2682和1^683基因(ygdH 基因)(EP1239041A2)。L-組氨酸生產(chǎn)菌L-組氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株大腸桿菌24株(VKPM B-5945、RU2003677)、大腸桿菌80株(VKPM B-7270、 RU2119536)、大腸桿菌NRRL B-12116-B12121 (美國專利第4，388，405號)、大腸桿菌 H-9342 (FERM BP-6675)以及H-9343 (FERM BP-6676)(美國專利第 6，344, 347 號)、大腸桿菌 H-9341 (FERMBP-6674) (EP1085087)、大腸桿菌AI80/pFM201 (美國專利第 6，258，5 號)，等寸。L-組氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子還包括編碼L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種以上的基因的表達已得到增強的菌株。相關基因的實例包括ATP磷酸核糖基轉移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP環(huán)化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亞氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸異構酶基因(phosphori bosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA)、酉先胺轉移酶基因(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉移酶基因(hisC)、組氨醇磷酸酶基因(hisB)、組氨醇脫氫酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶被L-組氨酸所抑制，因此還可以通過向ATP磷酸核糖基轉移酶基因(hisG)中引入誘導可賦予對反饋抑制的抗性的突變，來有效地增加產(chǎn)生L-組氨酸的能力(俄羅斯專利2003677和2119536)。具有L-組氨酸生產(chǎn)能力的菌株具體實例包括導入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成CN 102177246 A
說明書
12/35頁 系統(tǒng)酶的DNA的載體的大腸桿菌FERM-P 5038和5048 (特開昭56-005099號)，導入了氨基酸輸送的基因的大腸桿菌菌株(EP1016710A)，賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270，俄羅斯專利2119536號)，等等。L-谷氨酸生產(chǎn)菌L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于大腸桿菌(E. coli) VL334thrC+(EP 1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株。大腸桿菌VL3!34(VKPM B-1641)是 L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中有突變(美國專利 4，278，765)。利用可在野生型大腸桿菌菌株K_12 (VKPM B-7)細胞中增殖的噬菌體Pl，通過常規(guī)轉化方法來轉入thrC基因的野生型等位基因。結果，獲得了 L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的 L-谷氨酸生產(chǎn)菌 VL3!MthrC+(VKPM B-8961)。L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)酶中的1種或2種以上的活性得到增強的菌株。作為所述基因的例子，可以列舉 谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、異檸檬酸脫氫酶 (icdA)、順烏頭酸水合酶(acnA，acnB)、檸檬酸合酶(gltA)、甲基檸檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、丙酮酸脫氫酶(aceEF，IpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(PPsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶 (Pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構酶(tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、 磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸異構酶(pgi)等。所述酶中，優(yōu)選谷氨酸脫氫酶、 檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基檸檬酸合酶。作為經(jīng)過了修飾使得檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達增加的菌株的例子，可以列舉EP1078989A、EP955368A以及 EP952221A中公開的菌株。細菌的L-谷氨酸合成能力可以通過提高參與呼吸鏈的酶、例如氰抗性呼吸終端氧化酶(cioA，cioB)的活性來提高。作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子，還可以列舉下述酶的活性降低或缺損的菌株，所述酶催化從L-谷氨酸生物合成途徑改道而合成L-谷氨酸以外的化合物，或者催化分解或消耗L-谷氨酸的反應。作為這樣的酶的例子，可以列舉異檸檬酸裂合酶(aceA)、α -酮戊二酸脫氫酶(sucA)、磷酸乙酰轉移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羥酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰轉移酶(pfl)、乳酸脫氫酶(Idh)、谷氨酸脫羧酶(gadAB)、γ -谷氨?；D移酶(ggt)、γ -谷氨酸半胱氨酸合成酶(gshA)、γ -谷氨酸腐胺合成酶(ycjK)等。α-酮戊二酸脫氫酶活性缺損、或α-酮戊二酸脫氫酶活性降低的屬于埃希氏菌屬的細菌及其獲取方法在美國專利第5，378，616號和第5，573，945號中有記載。作為具體例子，可以列舉出如下。大腸桿菌 W3IIOsucA Kmr大腸桿菌AJU624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJU6^(FERM BP-3854)大腸桿菌AJ1^49(FERM BP-4881)大腸桿菌13110811(^::1(1111:是通過破壞大腸桿菌13110的α -酮戊二酸脫氫酶基
14因(以下也稱“sucA基因”)而得到的菌株。該菌株的α-酮戊二酸脫氫酶完全缺損。作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌的其它例子，可以列舉屬于埃希氏菌屬、且對天冬氨酸代謝拮抗物質有抗性的菌株。所述菌株可以是缺損α-酮戊二酸脫氫酶的，例如大腸桿菌 AJ13199 (FERM ΒΡ-5807)(美國專利第5，908，768號)，以及還降低了 L-谷氨酸分解能力的 FFRM Ρ-12379(美國專利第 5,393,671 號)；AJ13138 (FERM ΒΡ-5565)(美國專利第 6，110，714 號)等。作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的例子，可以列舉出所述Pantoea ananatis AJ13355 株。此外，作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉α -酮戊二酸脫氫酶 (aKGDH)活性缺損、或者a KGDH活性降低的屬于泛菌屬的細菌。作為這樣的菌株有缺損 AJ13355株的a KGDH-El亞基基因(sucA)而得到的AJ13356 (美國專利第6，331，419號)， 以及從AJ13355株出發(fā)作為粘液質低生產(chǎn)突變菌株選擇出來的SC17株衍生的sucA基因缺損株SC17sucA(美國專利第6，596，517號)。AJ13356于1998年2月19日保藏于工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(現(xiàn)為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心、〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，保藏號FERM P-16645， 并于1999年1月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-6616。AJ13355 以及AJ13356在上述保藏機構是作為成團腸桿菌保藏的，但是在本說明書中，將其描述為 Pantoea ananatis。此外，SC17sucA株的內部編號為AJ417，已于2004年2月26日保藏于產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，保藏號FERM BP-08646。而且，作為Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉SC17sucA/ RSFCPG+pSTVCB 株、AJ13601 株、NP106 株以及 NAl 株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中導入大腸桿菌來源的包含檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PPsA)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質粒RSFCPG以及乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)來源的包含檸檬酸合酶基因(gltA)的質粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是從該SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株出發(fā)作為低pH下顯示出對高濃度L-谷氨酸的抗性的菌株而選擇出的菌株。此外，如實施例所述，NP106株是AJ13601株脫去質粒RSFCPG+pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株于1999年8月18日保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目 1番地1中央第6)，保藏號FERM P-17516，并于2000年7月6日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERM BP-7207。此外，攜帶將所述RSFCPG的gltA基因替換為prpC而得到的RSFPPG (W02008/020654，參照后述實施例)的NP106株也是優(yōu)選的L-谷氨酸生產(chǎn)菌。L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的親本株的實例，可以列舉， 但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻遏物缺損的大腸桿菌 AJ12739(tyrA: :TnlO，tyrR) (VKPMB-8197) (W003/044191)，攜帶編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的突變型pheA34基因的大腸桿菌HW1089 (ATCC 55371)(美國專利第5，354，672號)，大腸桿菌MWEC101_b (KR8903681)、大腸桿菌 NRRLB-1214U NRRL B-12145、NRRL B-12146 以及 NRRL B-12147 (美國專利第 4，407，952 號)等。此外，也可以使用攜帶編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERMBP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)以及命名為AJ 12604 的大腸桿菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作為親本株(EP 488424 Bi)。此外，還可使用增加了由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質的活性的屬于埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌(美國專利申請公開2003/0148473號以及2003/0157667、 WO 03/044192)。L-色氨酸生產(chǎn)菌L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于誘導L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子包括、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株大腸桿菌JP4735/pMU3(^8(DSM10122)和JP6015/ PMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，該酶由突變的trpS基因編碼(美國專利 5，756，345)；大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有編碼不受絲氨酸反饋抑制性的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美國專利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大腸桿菌 AGX17(pGX44) (NRRLB-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美國專利 4，371，614)； 磷酸烯醇丙酮酸的生產(chǎn)能力增加的大腸桿菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps (W09708333，美國專利6，319，696)等等。此外，還可以使用增強了由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白的活性的屬于埃希氏菌屬的L-色氨酸生產(chǎn)菌(美國專利申請公開2003/0148473 Al和 2003/0157667 Al)。作為L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子，還可以列舉選自鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 (aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇酸丙 ||酉先莽草酸 3- 舞酸合Sl (aroA, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)、分支酸合酶(aroC)、預苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1種或2種以上酶的活性增強的菌株。預苯酸脫水酶和分支酸變位酶以雙功能酶(CM-PD)的形式被pheA基因編碼。所述酶之中，特別優(yōu)選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、 分支酸合酶、預苯酸脫水酶、分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者都受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此可以向這些酶中引入使反饋抑制解除的突變。具有此類突變的菌株的具體實例包括具有脫敏型鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164、和通過將質粒pGH5(W0 94/08031)導入大腸桿菌SV164而獲得的轉化菌株，所述質粒PGH5包含編碼解除了反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的突變serA基因。L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于誘導L-色氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子還包括導入了包含編碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌株(特開昭57-71397號，特開昭62-244382號，美國專利第4，371，614)。此外，可以通過增加色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達來賦予L-色氨酸生產(chǎn)能力。色氨酸合酶由α和β亞單位組成，這兩種亞單位分別由trpA和trpB基因編碼。另外，可以通過增強異檸檬酸裂合酶-蘋果酸合酶操縱子的表達來改進L-色氨酸生產(chǎn)能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生產(chǎn)菌作為L-脯氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子，可以列舉ilvA基因缺損、且能夠生產(chǎn)L-脯氨酸的大腸桿菌702ilvA(VKPM B-8012) (EP1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。本發(fā)明中使用的細菌可以通過增加一種以上參與L-脯氨酸生物合成的基因的表達來進行改良。作為L-脯氨酸生產(chǎn)菌所優(yōu)選的基因的例子，可以列舉編碼解除了 L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶的ProB基因(德國專利第3127361號)。而且，本發(fā)明中使用的細菌，可以通過增加一種以上編碼從細菌細胞中分泌L-氨基酸的蛋白質的基因的表達來進行改良。作為這樣的基因，可以列舉1^682基因和1^683基因(ygdH基因)(EP1239041 A2)。作為具有L-脯氨酸生產(chǎn)能力的屬于埃希氏菌屬的細菌的例子，可以列舉NRRL B-12403以及NRRL B-1M04 (英國專利第2075056號)、VKPMB-8012 (俄羅斯專利申請 2000124295)、德國專利第3127361號所述的質粒突變體、Bloom F. R等(The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34)所述的質粒突變體等大腸桿菌株。L-精氨酸生產(chǎn)菌L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括、但不限于下述屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國專利申請公開2002/058315A1) 及其帶有突變的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄羅斯專利申請200111觀69)，大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926) (EP1170358A1)，引入了編碼 N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的精氨酸生產(chǎn)株 (EP1170361A1)，等等。L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子還包括編碼L-精氨酸生物合成系統(tǒng)酶的1種以上基因的表達增加的菌株。相關基因的實例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶基因(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鳥氨酸轉氨酶基因(argD)、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、 精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲?；姿岷铣擅富?carAB)。L-纈氨酸生產(chǎn)菌L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子包括但不限于經(jīng)修飾而過表達 iIvGMEDA操縱子的菌株(美國專利5，998，178)。優(yōu)選將衰減作用所必需的ilvGMEDA操縱子的區(qū)域移除以使操縱子的表達不會被產(chǎn)生的L-纈氨酸所削弱。此外，優(yōu)選將操縱子中的 ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株的例子還包括具有氨酰t-RNA合成酶突變的突變株(美國專利5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970，該菌株在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970在1988年6月M日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny Proezd. , 1 Moscow 117545, Russia)，保藏號為 VKPM B-4411。此外，還可以使用生長需要硫辛酸(lipoic acid)的突變株和/或缺乏H+-ATP酶的突變株(W096/06926)作為親本株。L-異亮氨酸生產(chǎn)菌L-異亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子包括，但不限于對6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開平5-304969號)，對異亮氨酸類似物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突變株，以及對DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開平5-130882號)。此外，還可以使用經(jīng)過編碼涉及L-異亮氨酸生物合成的蛋白(如蘇氨酸脫氨酶、乙酰羥酸合酶(acetohydroxate synthase)等)的基因轉化的重組菌株作為親本株(特開平2_458號， FR0;356739，和美國專利第 5，998，178 號)。L-酪氨酸生產(chǎn)菌作為酪氨酸生產(chǎn)菌，可以列舉出具有不受酪氨酸的抑制的脫敏型預苯酸脫水酶基因(tyrA)的埃希氏菌屬細菌(歐洲專利申請公開1616940號公報)。在通過基因重組來選育上述L-氨基酸生產(chǎn)菌時，所使用的基因不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，還可以使用這些基因的變體，即以不損害所編碼的蛋白質的功能為限，該基因的同源物、人工修飾體等具有保守突變的基因。具體地說，還可以是下述基因，所述基因編碼具有在公知的蛋白質的氨基酸序列中包含一個或數(shù)個位置上的一個或數(shù)個氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白質。這里，所謂“一個或數(shù)個”因氨基酸殘基的種類或其在蛋白質的立體結構中的位置而異，但具體地是指優(yōu)選ι 20個、更優(yōu)選1 10個、更優(yōu)選1 5個。作為保守突變，當取代部位為芳族氨基酸時，是指在Wie、Trp、Tyr之間相互取代的突變，當取代部位為疏水性氨基酸時，是指在Leu、lie, Val之間相互取代的突變，當取代部位為極性氨基酸時，是指在GlruAsn之間相互取代的突變，當取代部位為堿性氨基酸時，是指在LyS、Arg、HiS之間相互取代的突變，當取代部位為酸性氨基酸時，是指在Asp、Glu之間相互取代的突變，當取代部位為帶有羥基的氨基酸時，是指在kr、Thr之間進行相互取代的突變。保守突變的代表是保守取代，作為可視作保守取代的取代，具體地可以列舉從Ala到Ser或Thr的取代，從 Arg 到 Gin、His 或 Lys 的取代，從 Asn 到 Glu、Gin、Lys、His 或 Asp 的取代，從 Asp 到 Asn、 Glu或Gln的取代，從Cys到Ser或Ala的取代，從Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，從Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代，從Gly到Pro的取代，從His到Asn,Lys, Gin、Arg 或 Tyr 的取代，從 Ile 到 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Leu 到 lie、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，從 Met 到 lie、Leu、Val 或 Phe 的取代，從Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，從Ser到Thr或Ala的取代，從Thr到Ser 或Ala的取代，從Trp到Phe或Tyr的取代，從Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及從Val 到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于基因所來源的微生物的個體差異、種間差異等情形而天然發(fā)生的突變(mutant或 variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。這樣的基因例如可以這樣獲得采用定點突變法對公知基因的堿基序列進行修飾，使得被編碼的蛋白質的特定部位處的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或增加。而且，具有如上所述的保守突變的基因還可以是編碼下述蛋白質的基因就編碼的氨基酸序列全長而言，其與野生型蛋白質具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選97%以上的同源性，且具有與野生型蛋白質等同的功能。而且，在本說明書中， 有些情況下“同源性”(homology) ”是指“同一性”(identity)。此外，可以將基因序列中各自的密碼子替換為易于在基因所導入的宿主中使用的密碼子。
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具有保守突變的基因可以通過突變劑處理等常規(guī)突變處理中使用的方法來獲得。此外，基因還可以是下述DNA，所述DNA與公知基因序列的互補序列或可由所述互補序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有與公知基因產(chǎn)物等同的功能的蛋白質。這里，“嚴格條件”，是指所謂特異性雜交體形成但非特異性雜交體不形成的條件。舉例說明在具有高同源性的DNA之間、例如具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、 特別優(yōu)選97%以上的同源性的DNA之間發(fā)生雜交，而同源性低于上述的DNA之間則不發(fā)生雜交的條件；或者在與常規(guī)Southern雜交的洗滌條件即60°C、1 X SSC、0. 1% SDS，優(yōu)選 0. 1XSSC、0. 1% SDS，更優(yōu)選68°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS相當?shù)柠}濃度、溫度下，洗滌1次更優(yōu)選2 3次的條件。作為探針，也可以使用基因的互補序列的一部分。這種探針可以通過PCR制備，其中PCR以基于公知的基因序列制備的寡核苷酸為引物，以包含這些堿基序列的DNA片段為模板來進行。例如，當使用300bp左右長度的DNA片段作為探針時，雜交的洗滌條件可以是例如 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0上述的關于基因的變體的描述，同樣適用于下述的gcd基因。<2_2>GCD活性的降低接下來，針對使屬于腸桿菌科的細菌的GCD活性降低的修飾進行說明。G⑶活性是指催化下述反應的活性。β -D-葡萄糖+氧化型PQQ -D-δ-葡糖酸內酯+還原型PQQG⑶活性例如可以通過采用600nm的吸光度測定檢測基于以下反應生成的還原型 DCPIP，來測定(特開 2007-129965)。D-葡萄糖+氧化型PMS — D-葡糖酸，5_內酯+還原型PMS還原型PMS+氧化型DCPIP —氧化型PMS+還原型DCPIPPMS:吩嗪甲基硫酸酯(phenazine methosulfate)DCPIP :2,6- 二氯酚靛酚(2,6-dichlorophenol-indophenol)“經(jīng)過修飾而降低了⑶C活性”是指與非修飾株、例如野生型的屬于腸桿菌科的菌株相比，平均每個細菌細胞的GCD活性變低。例如，相當于平均每個細胞的GCD分子數(shù)降低或平均每個分子的GCD活性降低等情況。平均每個細胞的GCD活性的比較，可以通過例如，比較相同條件下培養(yǎng)的細菌的細胞抽提液中所含的GCD活性來進行。而且，活性的“降低”也包括活性完全消失的情況。用于比較的對照的野生型泛菌屬細菌包括例如Pantoea ananatis AJl3355 株(FERM BP-6614)等。G⑶活性的降低可以通過使編碼G⑶的基因(gcd)失活來實現(xiàn)。使gcd基因“失活”，是指通過基因重組對該基因進行修飾或者向該基因導入突變，使得該基因編碼的GCD 的活性降低或消失。作為gcd基因，可以列舉出具有SEQ ID NO 1所示的堿基序列的Pantoea ananatis的gcd基因。該gcd基因編碼的GCD的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。gcd基因可以通過基于這些序列合成合成寡核苷酸，并以Pantoea ananatis的染色體為模板進行 PCR反應來克隆。此外，在通過同源重組缺損gcd基因的情況下，也可以使用與染色體上的 gcd基因具有一定程度以上的同源性、例如80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上的同源性的基因。此外，還可以使用與染色體上的gcd基因在嚴格條件下雜交的基因。作為嚴格條件，可以列舉出例如在與60°C、1XSSC、0. SDS優(yōu)選0. 1XSSC、0. SDS相當?shù)柠}濃度下，進行1次更優(yōu)選2 3次洗滌的條件。使gcd基因失活具體地可以通過例如，使染色體上的gcd基因的編碼區(qū)域的一部分或全部缺失，或者在編碼區(qū)域中插入其它序列來實現(xiàn)。這些方法也稱作基因破壞。此外，通過對gcd基因的啟動子或shine-dalgarnc^SD)序列等表達調節(jié)序列進行修飾而降低gcd基因的表達，也可以使gcd基因失活。表達的降低包括轉錄的降低和翻譯的降低。此外，通過對表達調節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)域進行修飾，也能夠降低基因的表達。而且，還可以將包含染色體上的目標基因前后的序列在內的目標基因整體缺失。 此外，gcd基因的滅活還可以這樣實現(xiàn)向染色體上的gcd基因的編碼區(qū)域導入氨基酸取代(錯義突變)、或者導入終止密碼子(無義突變)、或者導入添加或缺失一 二個堿基的移碼突變(Journal of Biological Chemistry 272 :8611-8617 (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 955511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839(1991))。各基因的修飾優(yōu)選通過基因重組來進行。作為基于基因重組的方法，具體可以列舉出利用同源重組，使染色體上目標基因的表達調節(jié)序列、例如啟動子區(qū)域或編碼區(qū)域或非編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，或者在所述區(qū)域中插入其它序列。表達調節(jié)序列的修飾優(yōu)選是1個堿基以上，更優(yōu)選是2個堿基以上，特別優(yōu)選是3 個堿基以上。此外，在缺失編碼區(qū)域時，只要各基因產(chǎn)生的蛋白質的功能降低或缺失即可， 缺失的區(qū)域可以是N末端區(qū)域、內部區(qū)域、C末端區(qū)域中的任何區(qū)域，也可以是整個編碼區(qū)域。通常，缺失的區(qū)域長能夠切實地使目標基因失活。此外，缺失區(qū)域的上游和下游的讀碼框優(yōu)選是不一致的。在編碼區(qū)域中插入其他序列時，插入的位置可以為目標基因的任何區(qū)域，但插入的序列長能夠切實地使目標基因失活。插入部位的前后序列優(yōu)選讀碼框不一致。對于其他序列沒有特殊限制，只要是能夠降低或缺損目標基因編碼的蛋白質的功能即可，可以列舉例如攜帶抗生素抗性基因或對L-氨基酸生產(chǎn)有用的基因的轉座子等。為了如上所述地修飾染色體上的目標基因，可以通過下述方法實現(xiàn)例如，制作缺失目標基因的部分序列從而不產(chǎn)生發(fā)揮正常功能的蛋白質的經(jīng)修飾的缺失型基因，用含有該基因的DNA轉化細菌，使缺失型基因和染色體上的目標基因之間發(fā)生同源重組，將染色體上的目標基因替換為缺失型基因。由缺失型目標基因編碼的蛋白質即使產(chǎn)生，也具有與野生型蛋白質不同的立體結構，其功能降低或消失。如上所述的基于利用同源重組的基因替換的基因破壞已經(jīng)確立，包括下述 Tj ^^^] "Red 馬區(qū)云力■ ☆ (Red-driven integration)，，白勺 Tj 法(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S Α. 97 :6640-6645 (2000))、Red 驅動整合法與 λ 噬菌體來源的切出系統(tǒng)(Cho，Ε. H.，Gumport, R. I.，Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184 5200-5203(2002))相結合的方法(參照W02005/010175號)等使用線性DNA的方法，或者使用含有溫度敏感復制起點的質粒、可接合轉移的質粒的方法，利用在宿主內不具有復制起點的自殺載體的方法，等等(美國專利第6303383號說明書或特開平05-007491號公報)。目標基因轉錄量的降低可以通過將從目標基因轉錄的mRNA的量與野生株或非修飾株進行比較來確認。評價mRNA量的方法包括例如Northern雜交、RT-PCR等(Molecularcloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。轉錄量的降低只要是與野生株或非修飾株相比降低即可，可以是任何形式的降低，理想的是例如，與野生株、非修飾株相比，降低至至少75%以下、50%以下、25%以下或10%以下，特別優(yōu)選完全不表達。目標基因所編碼的蛋白質的量降低可以通過使用與該蛋白質結合的抗體進行 western 印跡來石角認(Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA) ,2001))。蛋白質量的降低只要是與野生株或非修飾株相比降低即可， 可以是任何形式的降低，理想的是例如，與野生株、非修飾株相比，減少至至少75%以下、 50%以下、25%以下或10%以下，特別優(yōu)選完全不產(chǎn)生蛋白質(活性完全消失)。除了上述基因操作方法以外，為了降低GCD的活性，還可以列舉出例如下述方法 對于泛菌屬細菌等腸桿菌科細菌，利用紫外線照射，或者利用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等等常規(guī)的突變處理中使用的突變劑進行處理，然后選擇GCD的活性降低的菌株。G⑶的活性的降低還可以通過降低PQQ的合成能力來進行。PQQ的合成能力可以通過例如，缺失PQQ生物合成所必需的操縱子pqqAB⑶EF的一部分或全部來降低 (J. S. Velterop, P.W.Postma, J. Bacteriology 177 (17) :5088-5098 (1995))。在大腸桿菌、棒狀桿菌型細菌等不具有GCD活性的微生物中，葡萄糖是利用稱作葡萄糖PTS(糖磷酸轉移酶系統(tǒng))或葡萄糖通透酶的轉運蛋白來攝取的。PTS是與PEP(磷酸烯醇丙酮酸)轉化為Pyr(丙酮酸)的反應相偶聯(lián)以葡萄糖6-磷酸的形式攝入細胞內的。 葡萄糖6-磷酸轉變?yōu)楣?-磷酸，通過所稱的糖酵解系統(tǒng)(EMP =Embden-Meyerhof途徑) 代謝，而生成丙酮酸。另一方面，在具有GCD活性的微生物中，葡萄糖在周質空間中暫時轉變?yōu)槠咸撬岷?，在葡糖酸通透酶的作用下被攝入，通過磷酸化反應而生成6-磷酸葡糖酸。6-磷酸葡糖酸通過戊糖磷酸循環(huán)或Entner-Doudoroff(ED)途徑代謝，生成甘油醛3-磷酸、丙酮酸等。已知醋酸菌等具有GCD的微生物具備特有的糖代謝特性，即將一部分葡萄糖在周質中暫時轉變?yōu)槠咸撬岷蠹右詳z入。細胞內的EMP途徑、ED途徑、戊糖磷酸循環(huán)的容量因微生物而異，因此預想若缺損GCD而改變糖代謝，其下游的代謝模式會發(fā)生變化。對于Pantoea ananatis而言，認為在通常的培養(yǎng)溫度例如34°C下，并非全部的葡萄糖都通過GCD途徑同化，而是存在相當量通過PTS途徑同化的葡萄糖。另一方面，若在高溫例如38°C下進行培養(yǎng)，則可以預想到因為G⑶的最適溫度高，G⑶活性提高，由此G⑶途徑的糖消費增加。Pantoea ananatis中不存在ED途徑，因而6_磷酸葡糖酸由6_磷酸葡糖酸脫氫酶脫氫化，通過戊糖磷酸循環(huán)代謝。在被6-磷酸葡糖酸脫氫酶脫氫時，一分子的 6-磷酸葡糖酸釋放一分子的二氧化碳，因此，可以預想若GCD路徑的糖消費增加，則氨基酸生成量降低。此外還可以推斷，當高溫培養(yǎng)中GCD途徑的糖消費增加時，戊糖磷酸循環(huán)的容量出現(xiàn)不足，溢出的代謝物流向副產(chǎn)物方向，結果是L-氨基酸收率降低?？梢哉J為，在本發(fā)明中，通過降低GCD活性，特別是在高溫培養(yǎng)時，消除了二氧化碳的釋放和向戊糖磷酸循環(huán)的溢出，從而L-氨基酸生產(chǎn)力提高。此外，可以推斷，是在導入了 ED途徑的Pantoea ananatis (特開2003-274988)中，若GCD路徑的糖消費增加，也會因基于6-磷酸葡糖酸脫氫酶的6-磷酸葡糖酸脫氫反應中二氧化碳的釋放、以及ED途徑、戊糖磷酸循環(huán)的容量不足，而導致L-氨基酸收率降低。因此，可以認為，在導入了 ED途徑的Pantoea ananatis中，通過降低G⑶活性，也能夠提高 L-氨基酸生產(chǎn)力。本發(fā)明中使用的細菌可以是降低了 GCD活性、且強化了糖的攝入活性的細菌。 為了提高糖的攝入活性，例如可以提高葡萄糖PTS或葡萄糖通透酶的活性。此外，還已知半乳糖通透酶(Flores et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2007 ;13 :105-116)、木糖通透酶(EP1807445A1)、阿拉伯糖通透酶等易化擴散載體超家族(Major Facilitator superfamiIy(MFS))(Griffith,J. K. et al,Curr. Opin. Cell Biol. 4(4) ；684-95 (1992))成員的轉運蛋白也具有攝入葡萄糖等的活性。因此，在GCD活性降低的細菌中，通過強化這些轉運蛋白的活性，也能夠提高葡萄糖等糖的攝入，從而提高L-氨基酸生產(chǎn)力。<2>本發(fā)明的L-氨基酸的生產(chǎn)方法可以通過用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在該培養(yǎng)基中生成并蓄積L-氨基酸，并且從該培養(yǎng)基收集L-氨基酸，來生產(chǎn)L-氨基酸。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以使用含有碳源、氮源、無機鹽類以及視需要的氨基酸、維生素等有機微量營養(yǎng)元素的常規(guī)培養(yǎng)基?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基或者天然培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中使用的碳源和氮源可以是任意種類的，只要所培養(yǎng)的菌株能夠利用即可。碳源可以使用糖類，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，此外也可以單獨使用或者與其它碳源組合使用有機酸，如乙酸和檸檬酸，以及醇，如乙醇。作為氮源，可以使用氨、銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨或乙酸銨，或者使用硝酸鹽。作為有機微量營養(yǎng)物，可以使用氨基酸、維生素、脂肪酸和核酸，以及包含這些營養(yǎng)物的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，并且在使用生長要求氨基酸等的營養(yǎng)缺陷型突變菌株時，優(yōu)選補充所需要的營養(yǎng)物。特別地，當使用調整為能夠使L-谷氨酸析出的條件的液體培養(yǎng)基時，在培養(yǎng)基中添加泛酸，能夠更有效地晶析(W02004/111258號小冊子)。無機鹽類可以使用磷酸鹽、鎂
^Tt.、 丐 ^Tt.、^^ ^Tt.、,孟 ^Tt. -^l O培養(yǎng)優(yōu)選控制在發(fā)酵溫度20 45°C、pH 3-9的條件下進行通氣培養(yǎng)。當培養(yǎng)中pH 下降時，可以例如添加碳酸鈣，或用氨氣等堿來中和。在這樣的條件下，優(yōu)選通過進行10 120小時左右的培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中蓄積目的氨基酸。在本發(fā)明中，通過在適于細菌生長的溫度下進行培養(yǎng)，能夠高效地生產(chǎn)L-氨基酸，特別是在高溫進行培養(yǎng)時，效果顯著。例如，對于Pantoea ananatis等泛菌屬細菌而言， 通常34°C左右是生長優(yōu)選的溫度，GCD活性降低的細菌與非修飾株相比在該培養(yǎng)溫度下的 L-氨基酸生產(chǎn)能力更高，而在例如36°C或38°C，L-氨基酸生產(chǎn)能力進一步提高。此外，可以使用調整為能夠析出L-谷氨酸的條件的液體培養(yǎng)基，在使L-谷氨酸在培養(yǎng)基中析出的同時進行培養(yǎng)。作為L-谷氨酸析出的條件，可以列舉出例如pH 5. O 4. O、優(yōu)選pH 4. 5 4. O、更優(yōu)選pH 4. 3 4. O、特別優(yōu)選pH 4. O。此外，當使L-谷氨酸在培養(yǎng)基中析出時，預先添加L-谷氨酸、L-賴氨酸晶體作為晶種，能夠更有效地進行晶析(歐洲專利1233069號、歐洲專利申請公開1624069號)。作為從培養(yǎng)結束后的培養(yǎng)液中收集L-氨基酸的方法，可以采用公知的回收方法來進行。例如，可以采用從培養(yǎng)液中除去菌體后進行濃縮晶析的方法，或者通過離子交換色譜等來收集。當在能夠使L-谷氨酸析出的條件下進行培養(yǎng)時，析出到培養(yǎng)液中的L-谷氨酸可以采用離心分離或過濾等來收集。這種情況下，可以在使溶解在培養(yǎng)基中的L-谷氨酸晶析后，一并進行分離。而且，在生產(chǎn)堿性氨基酸時，可以采用通過下述方法進行發(fā)酵、并回收目的堿性氨基酸的方法來進行生產(chǎn)將培養(yǎng)中的PH調控為6. 5 9. 0、將培養(yǎng)結束時的培養(yǎng)基的pH調控為7. 2 9. 0，將發(fā)酵中發(fā)酵罐內壓力調控為正，或者向培養(yǎng)基中供給二氧化碳氣或含二氧化碳氣的混合氣體，使得存在培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子至少為2g/L以上的培養(yǎng)期，將所述碳酸氫根離子和/或碳酸根離子作為以堿性氨基酸為主的陽離子的抗衡離子(參照特開2002-065287號、美國專利申請公開第2002025564號)。本發(fā)明中收集的L-氨基酸除了含有作為目標的L-氨基酸之外，還可以含有微生物菌體、培養(yǎng)基成分、水分以及微生物的代謝副產(chǎn)物等。收集的L-氨基酸的純度為50% 以上，優(yōu)選為 85% 以上，特別優(yōu)選為 95% 以上(US5，431，933，JP1214636B, US4，956，471， US4, 777，051，US4946654, US5, 840358，US6, 238，714，US2005/0025878)。當采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)L-半胱氨酸時，得到的L-半胱氨酸可以用來生產(chǎn)L-半胱氨酸的衍生物。L-半胱氨酸的衍生物包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸 (carbocysteine)、磺酸半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。此外，當L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培養(yǎng)基中積累時，從培養(yǎng)基中采集噻唑烷衍生物，使得噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之間的反應平衡向L-半胱氨酸一側移動，從而可以生產(chǎn)L-半胱氨酸。此外，當S-磺酸半胱氨酸在培養(yǎng)基中積累時，例如可以使用二硫蘇糖醇等還原劑通過進行還原轉化得到L-半胱氨酸。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明?！矃⒖祭?〕λRed基因產(chǎn)物抗性的I^antoea ananatis菌株的構建為了在Pantoea ananatis中進行基因缺損，構建了用于高效率地進行稱作“Red 驅動整合”或“Red 介導整合”的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645 (2000))的受體菌。首先，構建了表達λ的gam、bet和exo諸基因(以下稱“ λ Red基因”)的新輔助質粒RSF-Red-TER (圖1)。詳細描述見參考例2。該質?？梢杂糜诰哂胁煌虮尘暗膹V域宿主。理由是1)其具有在許多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌甚至植物中都能夠穩(wěn)定保持的RSF1010廣宿主域質粒的復制子 (Scholz,等，1989 ；Buchanan-ffolIaston 等，1987)，2) λ Red 基因、gam、bet 和 exo 基因受到能夠被許多細菌的RNA聚合酶識別的PlacUV5啟動子的調節(jié)(例如Brunsctiwig，Ε.和 Darzins, Α.，Gene，111，1，35-41 (1992) ；Dehio, Μ.等，Gene,215，2，223-229 (1998))，3) 自調節(jié)因子Pla。UV5_lacI、以及大腸桿菌rrnB操縱子的P非依賴性轉錄終止子(TrrnB) 降低 λ Red 基因的本底表達水平(Skorokhodova, A. Yu 等，Biotekhnologiya (俄語)，5， 3-21(2004)) ο而且，RSF-Red-TER質粒包含果聚糖蔗糖酶(Ievansucrase)基因(sacB)，利用該基因，可以在含蔗糖的培養(yǎng)基中從細胞回收質粒。
在大腸桿菌中，PCR反應生成的DNA片段與由RSF-Red-TER質粒提供的短側翼區(qū)域一起發(fā)生整合的頻率與使用PKD46輔助質粒(Datsenko，K. Α.，Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,6640-6645, (2000))時一樣高。然而，λ Red 基因的表達對 Pantoea ananatis顯示毒性。用RSF-Red-TER輔助質粒轉化的細胞在含IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，ImM)和適當抗生素(氯霉素25 μ g/ml或卡那霉素40 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基上顯示非常低的生長速度，λ Red介導的重組(λ Red-mediated recombination)的效率即使能夠觀察到，也是非常低的(10_8)。選擇了對λ Red基因的全部3個基因的表達均具有抗性的Pantoea ananatis突變菌株。為此,通過電穿孔將RSF-Red-TER質粒導入Pantoea ananatis SC17株(美國專利第6，596，517號)。培養(yǎng)18小時后，得到了約IO6個轉化株，有10個克隆的菌落尺寸大， 其余的菌落都非常小。培養(yǎng)18小時后，大菌落為約2mm，小菌落為約0.2mm。將培養(yǎng)延長至 M小時，小菌落不再繼續(xù)生長，而大菌落繼續(xù)生長。將對λ Red基因的全部3個基因(gam、 bet和exo)的表達均具有抗性的大菌落Pantoea ananatis突變菌株中的一個用于進一步分析。從1個大菌落克隆和數(shù)個小菌落克隆中分離出RSF-Red-TER質粒DNA，用其再次轉化大腸桿菌MG1655，考察了質粒合成Red基因的活性產(chǎn)物的能力。由所得轉化體中 Red依賴性整合的對照實驗可知，只有從大菌落克隆分離的質粒可引起Red依賴性整合所必需的XRed基因的表達。為了考察所選的大菌落克隆中是否發(fā)生Red介導的整合， 使用PCR反應生成的下述線性DNA片段進行了電穿孔，所述DNA片段設計為包含KmK標記和與hisD基因同源的40bp側翼區(qū)域，并且整合到Pantoea ananatis的hisD基因的 SmaI識別位點。將2個小菌落的克隆用作對照。Pantoea ananatis的hisD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO :3。PCR中使用SEQ ID NO :4和5的寡核苷酸作為引物，使用 pMWl 18-(λ BttL-Kmr-AattR)質粒作為模板。使用對λ Red基因不具有抗性的2個小菌落的克隆作為對照。pMW118-U attL-Knf-λ attR)質粒的構建在參考例3中詳細描述。RSF-Red-TER質粒能夠通過該質粒上的IacI基因誘導Red基因的表達。對兩種誘導條件進行了考察。在第1組中，電穿孔1小時前添加IPTG(ImM)；在第2組中，在用于制備可電穿孔細胞的培養(yǎng)開始時添加IPTG。攜帶來自大菌落克隆的RSF-Red-TER的細胞的后代的生長速度并未顯著地低于不帶有該質粒的菌株。添加IPTG僅使這些培養(yǎng)物的生長速度有些許降低。另一方面，小菌落克隆的后代在未添加IPTG的條件下生長非常緩慢，而加以誘導后生長基本上停止。對大菌落克隆的后代的細胞進行電穿孔后，有許多10^克隆(短誘導時間為18個克隆，延長誘導時間后為約100個克隆)生長?？疾斓娜?00個克隆均具有His_表現(xiàn)型，通過PCR對20個克隆進行了確認，結果確認了這些細胞的染色體結構與預想的相同。另一方面，對小菌落克隆的后代的細胞進行電穿孔仍未能得到整合的菌株。使所得大菌落克隆在含7%蔗糖的平板上生長以使質粒脫落，用RSF-Red-TER再次進行轉化。將不攜帶質粒的菌株命名為SC17(0)。上述再次轉化后生長出的全部克隆均與親本菌株克隆SC17(0) —樣具有較大的菌落尺寸。在用RSF-Red-TER質粒再次轉化的SC17(0)株中進行了 Red介導的整合實驗。 對于所得的3個獨立轉化株，使用與前述實驗所用的相同的DNA片段進行了考察。采用了短誘導時間(電穿孔1小時前)。在各實驗中，生長出超過10個的KmK克隆。測試的全部克隆均具有His—表現(xiàn)型。這樣，選擇出突變菌株，將其命名為對XRed基因的表達具有抗性的SC17 (0)。該菌株可以作為用于對Pantoea ananatis染色體的Red依賴性整合的合適受體菌?！矃⒖祭?〕輔助質粒RSF-Red-TER的構建輔助質粒RSF-Red-TER的構建方案如圖2所示。作為構建的最初步驟，設計了 RSFsacBPlacMCS載體。為此，分別使用SEQ ID NO 6、7、8、9的寡核苷酸通過PCR擴增了包含pACYC184質粒的cat基因和枯草芽孢桿菌的sacB 基因的結構部分的DNA片段。這些寡核苷酸的5'末端分別包含對進一步克隆而言必需且便利的Bgl II、Sac I JbaI、和BamHI限制酶位點。將所得1. 5kb的sacB片段克隆到此前獲得的ρ麗119-Pla。lacI載體的)(baI-BamHI位點。該載體是依照與ρ麗118_Pla。lacI載體的相關描述(Skorokhodova, A. Yu 等，Biotekhnologiya (俄語)，5，3-21 Q004))相同的方法構建的。只是該載體包含來自PMW219而不是pMW218質粒的多接頭位點。接下來，將上述的1. Okb的cat片段用BglII和McI處理，并克隆到在先步驟中所得的 RSF-PlaeIacIsacB 質粒的 BamHHacI 位點。所得質粒 pMW_Pla。lacIsacBcat 包含PlacUV5-lacI-sacB-cat片段。為了將該片段亞克隆到RSF1010載體，將 pMW-Pla。laCISaCBCat用BglII消化，并用DNA聚合酶I克列諾片段處理使末端平滑化，然后用Mel切割。從瓊脂糖凝膠中洗提出pMWPla。lacIsacBcat質粒的3. 8kb的BglII-^tcI 片段，將其與用I3StI和McI處理的RSF1010載體連接。用連接混合液轉化大腸桿菌TG1， 將其在含氯霉素(50mg/L)的L培養(yǎng)基(純水IL中包含細菌用胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g> NaCl 5g、瓊脂15g而成的培養(yǎng)基，ρΗ7. 0)上鋪板。對從生長出的克隆中分離的質粒進行限制酶分析，得到了 RSFsacB質粒。為了構建RSFsacBPla。MCS載體，以SEQ ID NO 10以及 11的寡核苷酸為引物，以ρ麗119-Pla。lacI質粒為模板，通過PCR擴增了包含Plaeuv5啟動子的DNA片段。將所得的146bp片段用Mel和NotI消化，將其與RSFsacB質粒的&icI-NotI 大片段連接。然后，以SEQ ID NO 12和13的寡核苷酸為引物，以pKD46質粒(Datsenko， K. Α.，Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,6640-6645, (2000))為模板，通過 PCR 擴增了包含AReda β γ基因和轉錄終止子tL3的2. 31Λ的DNA片段。將所得片段克隆到 RSFsacBPlacMCS載體的PvuI-NotI位點。這樣，設計了 RSFRed質粒。為了排除Red基因的通讀轉錄，將大腸桿菌rrnB操縱子的P -依賴性轉錄終止子插入到cat基因與Placuv5啟動子之間。為此，以SEQ ID NO 14和11的寡核苷酸為引物， 以大腸桿菌BW3350的染色體為模板，通過PCR擴增了包含Plaeuv5啟動子與TrrnB終止子的 DNA片段。將所得的這些片段用KpnI處理，并進行連接。然后，以SEQ ID N0:11和15的寡核苷酸為引物，通過使用寡核苷酸的PCR擴增了包含Plaew5和TrrnB這兩者的0. 5kb片段。將所得DNA片段用EcoRI消化，并用DNA聚合酶I克列諾片段處理使末端平滑化，然后用BamHI切割，將其與RSFsacBPlacMCS載體的Ecll36II-BamHI大片段連接。將所得質粒命名為 RSF-Red-TER0〔參考例 3〕pMWl 18- ( λ attL-Kmr- λ attR)質粒的構建ρ麗118-UattL-Knf-λ attR)質粒通過用pUC4K質粒的卡那霉素抗性基因取代 pMW118-attL-Tc-attR(W02005/010175)質粒中的四環(huán)素抗性標記基因來構建。為此，將 pMWllS-attL-I^c-attR質粒的EcoRI-HindI11 大片段與pUC4K質粒的HindiII-PstI (676bp)和EcoRI-HindIII (585bp)這2個片段連接。作為基礎的pMW118-attL-Tc_attR是通過連接以下4個片段而得到的。1)使用引物 Pl (SEQ ID NO 16)和 P2 (SEQ ID NO 17)從大腸桿菌 W3350 (包含 λ 原噬菌體)染色體的相當于attL的區(qū)域通過PCR擴增得到的具有attL(SEQ ID NO 18)的 BglII-EcoRI片段(114bp)。這些引物包含BglII和EcoRI的附加識別位點。2)從大腸桿菌W3350(包含λ原噬菌體)染色體的相當于attR的區(qū)域使用引物 P3 (SEQ ID NO 19)禾口 P2 (SEQ ID NO 20)通過 PCR 擴增得到的具有 attR (SEQ ID NO 21) 的PstI-HindIII片段(182bp)。這些引物包含PstI和HindIII的附加識別位點。3)pMW118-ter_rrnB 的 BglII-HindIII 大片段(3916bp)。質粒 pMW118_ter_rrnB 是通過連接以下3個DNA片段而得到的。-pMW118的具有Aatll-EcoRI片段的大片段Q359bp)。該片段是通過用EcoRI消化ρ麗118、并用DNA聚合酶I克列諾片段進行處理、再用AatII進行消化而得到的。·具有氨芐青霉素抗性(Αρκ)的基因bla的pUC19的AatII-BglII小片段 (1194bp)。該片段是使用引物P5和P6 (SEQ ID NO :22和23)對pUC19質粒的相應區(qū)域進行PCR擴增而得到的。這些引物中包含I3StIdatII和BglII的附加識別位點?！まD錄終止子ter_rrnB的BglII-PstI小片段(36;3bp)。該片段是通過使用引物 P7和P8(SEQ ID N0J4和2 對大腸桿菌MG1655染色體的相應區(qū)域進行PCR擴增而得到的。這些引物包含I3StIjglII和I3StI的附加識別位點。4)具有四環(huán)素抗性基因和ter_thrL轉錄終止子的pML-Tc_ter_thrL的 EcoRI-PstI 小片段(1388bp) (SEQ ID NO :26)。pML-Tc_ter_thrL 質粒是通過如下的 2 個步驟獲得的。 將 pML-MCS 質粒(Mashko，S. V.等，Biotekhnologiya (俄語)，2001，no. 5，3-20) 用XbaI和BamHI消化，然后將大片段(3342bp)與包含ter_thrL終止子的XbaI-BamHI片段 (68bp)連接。該包含ter_thrL終止子的片段是使用引物P9和P10(SEQ ID NO :27和觀) 對大腸桿菌MG1655染色體的相應區(qū)域進行PCR而得到的。這樣，得到了 pML_ter_thrL質粒。這些引物包含PstI、^CbaI和BamHI的附加識別位點?！ML_ter_thrL質粒用KpnI和)(baI消化，然后用DNA聚合酶I克列諾片段處理，再與具有四環(huán)素抗性基因的PBR322的EcoRI-Van91I小片段(1317bp)連接，從而得到了 pML-Tc-ter_thrL質粒。而且，將pBR322用EcoRI和Van91I消化，然后再用DNA聚合酶 I克列諾片段進行了處理。〔參考例4〕谷氨酸生產(chǎn)質粒RSFPPG的構建構建了 L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)基因，prpC基因(國際公布2006/051660 號小冊子)、ppc基因、gdh基因(歐洲申請公布099擬82號說明書)被擴增的質粒 RSFPPG(W02008/020654)。設計了引物1(SEQ ID NO :29)和引物2(SEQ ID NO :30)，用于擴增RSFCPG(歐洲申請公開1233068號說明書)的gltA基因的ORF以外的部分。使用該引物，以RSFCPG為模板進行PCR，獲得了約14.91Λ的片段。另一方面，對于prpC，使用引物3 (SEQ ID NO 31)和引物4 (SEQ ID NO 32)，以大腸桿菌W3110株的染色體DNA為模板進行PCR，獲得了約1. 2kb 的片段。將兩PCR產(chǎn)物分別用BglII和KpnI處理并進行連接，然后轉化大腸桿菌JM109株。收集出現(xiàn)的所有菌落，以混合物的形式提取質粒。用該質?；旌衔镛D化檸檬酸合酶(CS)缺損株大腸桿菌ME8330株，將其涂布于含50mg/L尿嘧啶、5mg/L硫胺素-HCl的M9極限培養(yǎng)基(1L純水中含葡萄糖5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0. 5g、氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g而成的培養(yǎng)基)。收集出現(xiàn)的所有菌落，以混合物的形式提取質粒，用該質?；旌衔镛D化P. Ananatis L-谷氨酸生產(chǎn)菌NP106株。對于出現(xiàn)的克隆，在中性條件下進行試管培養(yǎng)，將顯示與G106S株等同的L-谷氨酸收率的菌株作為NA1。此外，從該菌株抽提質粒，將其作為prpC、gdh、ppc強化用質粒RSFPPG。在作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌的Pantoea ananatis NP106株中導入所述質粒RSFPPG，構建了 L-谷氨酸生產(chǎn)菌NP106/RSFPPG (該菌株稱作“NA1 株，，)。NP106株是如下述地獲得的。將前文例示的Pantoea ananatis AJ13601株在 LBGM9培養(yǎng)基中于34°C振蕩培養(yǎng)一夜，稀釋到每個平板為100 200個菌落，將其涂布在含四環(huán)素12. 5mg/L的LBGM9平板上，所述LBGM9培養(yǎng)基是在L培養(yǎng)基(細菌用胰蛋白胨IOg/ L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、pH7. 0)中添加極限培養(yǎng)基成分(葡萄糖5g/L、硫酸鎂2mM、 磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0. 5g/L、氯化銨lg/L、磷酸氫二鈉6g/L)而得到的液體培養(yǎng)基。對于出現(xiàn)的菌落，將其轉印到含四環(huán)素12. 5mg/L和氯霉素25mg/L的LBGM9平板上，選擇氯霉素敏感性的菌株，從而獲得了 PSTVCB脫落的菌株，將其命名為G106S。而且，將G106S株在 LBGM9液體培養(yǎng)基中于34°C振蕩培養(yǎng)一夜，稀釋到每個平板為100 200個菌落，將其涂布在不含藥物的LBGM9平板上。對于出現(xiàn)的菌落，將其轉印在含四環(huán)素12. 5mg/L的LBGM9平板和不含藥物的LBGM9平板上，選擇四環(huán)素敏感性菌株，從而獲得了 RSFCPG脫落的菌株，將其命名為NP106。這樣獲得的NP106株不再具有AJ13601株所攜帶的RSFCPG和pSTVCB這 2個質粒。G106S株是像上述那樣地在AJ13601株中僅脫落pSTVCB而得到的菌株?！矊嵤├?〕基于gcd基因缺損株的L-谷氨酸生產(chǎn)(1) gcd基因缺損株的構建采用常規(guī)方法合成了 SEQ ID NO 33和34所示的2個合成DNA引物。SEQ ID NO 33所示的引物具有Pantoea ananatis的gcd基因上游的同源序列與 XattL-Knf-AattR的5，端的同源序列相接而成的結構。SEQ ID NO :34的引物具有Pantoea ananatis的gcd基因下游的互補序列與λ attL-Kmr- λ attR的3，端的互補序列相接而成的結構。通過使用這些引物，以ρ麗IlS-UattL-Knf-XattR)為模板進行PCR，擴增了約 1.51Λρ的片段，其中在XattL-Knf-λ attR序列的5，端連接gcd基因上游的同源序列，在 λ attL-Knf- λ attR序列的3，端連接gcd基因下游的同源序列。純化上述PCR片段，將其用于針對Pantoea ananatis染色體的λ依賴性整合。將輔助質粒RSF-Red-TER用作λ噬菌體Red基因的載體。為了得到Pantoea ananatis的電轉化感受態(tài)細胞，用RSF-Red-TER質粒對SC17 (0)株進行轉化，然后在含50 μ g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基上于34°C培養(yǎng)一夜。接下來，將培養(yǎng)液用含50 μ g/ml氯霉素的新鮮LB培養(yǎng)基稀釋100倍，34°C通氣下進行生長使得0D_為0. 3。然后，添加ImM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600為0. 7。將IOmL培養(yǎng)液中的菌體用等量的冷的10%甘油洗滌3次，懸浮在80 μ 1的冷 10%甘油中。將上述PCR產(chǎn)物溶解在10 μ 1去離子水中，將PCR片段100-200ng添加到細胞懸浮液中。操作使用細菌電穿孔裝置(“BioRad”美國、商品號165-2089，版本2-89)進行。使用的脈沖的參數(shù)為電場強度18kV/cm，脈沖時間5毫秒。電穿孔后，立即在細胞懸浮液中添加補充有葡萄糖(0.5%)的LB培養(yǎng)基lml。然后，使細胞在34°C通氣下生長2小時，用含40 μ g/ml的卡那霉素的L培養(yǎng)基(純水IL中包含細菌用胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、瓊脂15g的培養(yǎng)基，pH7. 0)進行選擇，獲得了約20個菌落作為轉化體。使用SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36所示的2個合成DNA 引物，通過PCR確認了 gcd基因區(qū)域中插入了卡那霉素抗性基因的片段，將能夠確認片段插入的菌株命名為SC17(0) Agcd0從該菌株抽提基因組DNA，通過電穿孔轉化了 NAl株。將導入了 SC17(0):: Agcd的基因組DNA的NAl株用添加了 40mg/L卡那霉素、 12. 5mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和瓊脂15g/L的LBGM9培養(yǎng)基平板進行選擇，獲得了約20個的菌落作為轉化體。這些菌株的gcd基因區(qū)域中均插入了 XattL-Knf-XattR的片段，選出其中的1個克隆，將其命名為NAl: Aged。O) gcd基因缺損株的L-谷氨酸生產(chǎn)能力評價為了研究gcd基因的缺損對L-谷氨酸生產(chǎn)的影響，使用NAl Δ gcd株和NAl株， 進行了 L-谷氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)分為形成菌體的種子培養(yǎng)和生成L-谷氨酸的主培養(yǎng)這兩個階段進行。種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下。
〔種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成〕
蔗糖50g/LMgSO4 ·7Η200.4g/LGD113(消泡劑)O.lmL/L(NH4)2SO44.0g/LKH2PO42.0g/L酵母提取物4.0g/LFeSO4 ·7Η20O.Olg/LMnSO4 ·5Η20O.Olg/L檸檬酸0.02g/LL-賴氨酸鹽酸鹽0.4g/LDL-曱硫氨酸0.4g/Lε-二氨基庚二酸0.4g/L泛酸鈣18mg/L
四環(huán)素鹽酸鹽12.5mg/L120°C、蒸氣滅菌20分鐘。將NAl Δ gcd株和NAl株用添加了 12. 5mg/L四環(huán)素和瓊脂15g/L的LBGM9培養(yǎng)
28基平板進行前培養(yǎng)，將相當于1張平板的量接種到裝有上述組成的培養(yǎng)基300mL的IL容量的微型罐中，34°C、pH6. 0進行約12小時攪拌培養(yǎng)，并進行控制使得通氣為1/lvvm、氧濃度為3%以上。添加氨氣進行調整使得培養(yǎng)中的pH為6.0。以培養(yǎng)基中的糖的耗盡為指標， 結束種子培養(yǎng)。主培養(yǎng)培養(yǎng)基組成如下。
權利要求
1.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸桿菌科且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細菌，從而在培養(yǎng)物中生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)物收集L-氨基酸；其中，所述細菌是固有地具備以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶的活性，但經(jīng)過修飾而降低了該葡萄糖脫氫酶的活性的細菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，通過使編碼所述葡萄糖脫氫酶(GCD)的gcd基因失活而降低了該葡萄糖脫氫酶的活性。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述gcd基因是編碼SEQIDNO :2的氨基酸序列的DNA或其變體。
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，所述L-氨基酸是選自L-谷氨酸、 L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸中的一種或二種以上的L-氨基酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸或L-半胱氨酸。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-谷氨酸，且所述細菌中選自檸檬酸合酶、甲基檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脫氫酶中的1種或2種以上的酶的活性得到了增強。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸是L-半胱氨酸，且所述細菌中選自3-磷酸甘油酸脫氫酶、絲氨酸乙酰轉移酶和硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統(tǒng)中的至少1種或2種以上的活性和/或yeaS基因的表達得到了增強。
8.權利要求1 7中任一項所述的方法，其中，所述細菌是屬于選自泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬 (Serratia)、摩根氏菌屬(Morganella)和耶爾森菌屬(Yersinia)中的屬的細菌。
全文摘要
用培養(yǎng)基培養(yǎng)屬于腸桿菌科、且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細菌，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)物收集L-氨基酸；其中，所述細菌是固有地具備以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶的活性、但經(jīng)過修飾而降低了該酶的活性的細菌。
文檔編號C12N9/04GK102177246SQ20098013494
公開日2011年9月7日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權日2008年9月8日
發(fā)明者原吉彥, 宅見和浩, 瀧川里繪, 野中源 申請人:味之素株式會社