專利名稱：用于檢測阿爾茲海默病的光學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題涉及用于非介入性監(jiān)測阿爾茲海默病特異性早期病理事件的方法， 因此其包括用于AD的診斷、治療、預(yù)后以及評價治療應(yīng)答的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
本文的所有文獻(xiàn)均通過弓I用并入本文，其程度視同每篇文獻(xiàn)或?qū)＠暾埦鶈为?dú)明確指出通過引用并入本文。以下的描述包含對理解本發(fā)明有用的信息。這并不是承認(rèn)本文提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與本申請的發(fā)明相關(guān)，也不是承認(rèn)本文任何明確或未明確引用的出版物是現(xiàn)有技術(shù)。
阿爾茲海默病(AD)是一種常見的具有破壞性的年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病。AD 腦病理的特征是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)蛋白水解產(chǎn)物(淀粉樣蛋白β肽(Αβ)，其形成稱為Αβ斑塊的細(xì)胞外聚集物)的典型積聚。認(rèn)為這些斑塊造成對腦中細(xì)胞活動和信息傳遞的干擾，導(dǎo)致神經(jīng)毒性炎癥和神經(jīng)元死亡[2，3]。允許在活體受試者中對病理過程進(jìn)行非介入性檢測的分子成像有可能增強(qiáng)對疾病和藥物有效性的檢測和了解。因此，人們一直致力于開發(fā)能透過活體AD患者和動物模型的顱骨檢測淀粉樣蛋白斑的工具W-9]；然而，淀粉樣蛋白斑的非介入性檢測在臨床上仍有難度，并且在高分辨率下用途有限[10-12]。如最近采用多光子顯微術(shù)通過顱部開口在小鼠腦中進(jìn)行體內(nèi) Αβ斑塊成像所證明的，光學(xué)成像構(gòu)成了體內(nèi)成像的有力、高分辨率且特異的工具[13]。本發(fā)明的主題提出了通過光學(xué)方式對AD患者的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像的人體中的替代性非介入方法，前提是在這些患者的視網(wǎng)膜中出現(xiàn)Αβ斑塊并且其與腦中的斑塊具有相似的特性。
APP在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)(中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的向外生長物)中廣泛表達(dá)，并通過視神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)到軸突的質(zhì)膜和神經(jīng)末梢[14]。斑塊在視網(wǎng)膜的形成是最近開始研究的，特別是在兩種相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和青光眼 [50-53]。仍不清楚A β斑塊出現(xiàn)在AD患者的早期還是晚期。過去的證據(jù)表明A β斑塊在青光眼和AMD患者及其嚙齒類動物模型的視網(wǎng)膜中存在。例如，在青光眼患者中已報道了 RGC層的Αβ沉積[50，51]。在青光眼的實驗?zāi)Ｐ椭?，已將RGC的凋亡與Aβ肽的積累相關(guān)聯(lián)，并且針對其形成的藥物已顯示發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性[52]。在AMD患者中，Αβ沉積可見于玻璃疣(與正在退化的光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞相關(guān))中[53]。
在AD的果蠅轉(zhuǎn)基因模型中，基于突變的人APP和早老素(PS)基因的靶向表達(dá)，在復(fù)眼中發(fā)現(xiàn)了 Αβ的免疫反應(yīng)性，并與視網(wǎng)膜光感受器退化相關(guān)聯(lián)[15]。一個近期的研究證明，在疾病的晚期(晚于10月齡)，在AD轉(zhuǎn)基因鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(NFL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)中存在Αβ沉積。Αβ沉積還與RGC的神經(jīng)變性和小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)[16]。
盡管有這些令人鼓舞的進(jìn)展，在本領(lǐng)域仍需要用于診斷、預(yù)后和治療AD的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的主題通過發(fā)現(xiàn)在死后AD患者的眼視網(wǎng)膜中存在A β斑塊而滿足了此需求。 使用表達(dá)突變形式的人APP和PSl基因的小鼠(API^SWe/PSldE9，本文中稱AD-Tg小鼠)，本發(fā)明的主題還提供了這樣的證據(jù)，即發(fā)現(xiàn)Αβ斑塊在視網(wǎng)膜中的早期形成先于它們在腦中的顯現(xiàn)。此外，本發(fā)明的主題鑒定了基于免疫的療法，其使用裝載于樹突細(xì)胞上的髓磷脂衍生肽弱激動劑[17，18]，對減少小鼠腦中和AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中的Αβ斑塊有效。最后，本發(fā)明的主題證明，對活動物全身注射姜黃(curcumin) ( 二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)) (結(jié)合并標(biāo)記A β斑塊的天然化合物[19，20])可實現(xiàn)對視網(wǎng)膜中A β斑塊的非介入性高分辨率和特異性成像。本發(fā)明的主題第一次允許在AD哺乳動物視網(wǎng)膜中檢測Αβ斑塊數(shù)量和位置，并重復(fù)計數(shù)和實時監(jiān)測。


在參考附圖中說明了示例性實施方案。本文公開的實施方案和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性而非限制性的。
圖1展示了通過姜黃使其可視化的AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜Αβ沉積。圖 Ia-If顯示了離體用抗人Αβ抗體和姜黃染色的9月齡AD-Tg(圖la-le)和非Tg(圖If) 小鼠的冷凍切片圖像，表明通過這兩種檢測方法染色的Αβ斑塊的共定位。圖Id和Ie顯示了每個通道顯示的斑塊染色模式的更高放大倍數(shù)圖像。圖If顯示了在非Tg(野生型)小鼠中不存在抗人Αβ斑塊和姜黃的雙陽性。用DAPI (藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核。比例尺=100μπι。 圖Ig-Ij是用抗Αβ抗體和姜黃離體染色的10月齡AD-Tg (η = 27)和非Tg(n = 18)小鼠視網(wǎng)膜整體(whole mount)的代表性圖像。在幾個不同的視網(wǎng)膜層中證實了 Aβ斑塊(紅色和綠色通道重疊的黃點(diǎn))的形成圖Ig顯示了 IPL-內(nèi)網(wǎng)層，圖Ih顯示了 INL-內(nèi)核層/ OPL-外網(wǎng)層，圖Ii顯示了 ONL-外核層。圖IJ顯示在非Tg(野生型)小鼠中基本不存在 Αβ斑塊(圖Ig和lj，下排)。獨(dú)立通道的更高放大倍數(shù)圖像證實了兩種處理的斑塊染色模式。比例尺=5μπι。圖Ik-In顯示了體內(nèi)用姜黃染色，而后用抗人Αβ抗體和DAPI離體染色的整眼縱向冷凍切片。在圖Ik-Im中，在10月齡AD-Tg小鼠的大部分視網(wǎng)膜層和脈絡(luò)膜中檢測到Αβ斑塊。在圖In中，在非Tg(野生型)小鼠中的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中檢測不到 A β斑塊。比例尺=20 μ m。
圖2顯示了人阿爾茲海默病患者視網(wǎng)膜的Aβ斑塊。圖加和2b是以下處理后的 87歲的AD患者的人整體視網(wǎng)膜的代表性圖像，其用蘇丹黑β染色以消除非特異性的自發(fā)熒光信號，隨后離體用姜黃染色(白色箭頭指示姜黃標(biāo)記的斑塊)。比例尺=IOym0用 DAPI (藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核。圖2c和2d顯示了以下處理后的65歲AD患者的人整體視網(wǎng)膜的更高放大倍數(shù)圖像，其用蘇丹黑B染色(黑點(diǎn)是蘇丹染色)，隨后用姜黃染色(白色箭頭指示姜黃標(biāo)記的斑塊)。比例尺=5 μ m。圖2e-2g提供了 65至90歲的一系列人AD患者視網(wǎng)膜中姜黃陽性斑塊的另外實例。圖2h-2j是65和87歲人AD患者人整體視網(wǎng)膜的代表性圖像，其在幾個視網(wǎng)膜深度(以包括RGC和IPL)用人抗A β抗體染色隨后用蘇丹黑B 處理。圖2i表示視網(wǎng)膜斑塊的更高放大倍數(shù)圖像。Αβ斑塊形態(tài)與在小鼠視網(wǎng)膜和腦中所發(fā)現(xiàn)的類似。比例尺=5μπι。圖2k-aii顯示了用姜黃對同一人視網(wǎng)膜的后續(xù)染色，其表明斑塊被人Αβ抗體和姜黃選擇性共標(biāo)記(下排圖像是單獨(dú)通道)。圖2η顯示了用人Αβ 抗體和姜黃對死后的非AD人整體視網(wǎng)膜進(jìn)行雙染色，未顯示有A β斑塊的跡象(下排圖像是單獨(dú)通道)。比例尺=5 μ m。
圖3顯示了在癥狀發(fā)生前早期階段中小鼠視網(wǎng)膜Αβ斑塊的形成以及在疾病發(fā)展時的累積。在將姜黃經(jīng)靜脈注射入尾靜脈后，在AD-Tg小鼠的視網(wǎng)膜和腦中可見Αβ斑塊。圖3a-3n是多種年齡的AD-Tgfc= 18)和非Tg(野生型；η = 10)小鼠整體視網(wǎng)膜的代表性ζ軸投影圖像。圖3a-3d顯示了 2. 5月齡的AD-Tg小鼠，圖3a顯示了視網(wǎng)膜中斑塊的存在，圖北顯示了在相同位置用特異性抗人抗體離體染色對Αβ斑塊的確認(rèn)(黃色顯示的姜黃和Αβ抗體的共定位)。比例尺=10μπι。圖3c-3d顯示在腦的海馬和皮層中未檢測到斑塊。比例尺=100μπι。圖:3e-3h顯示了 5月齡AD-Tg小鼠，圖!Be顯示視網(wǎng)膜中斑塊的存在，圖3f為特異性Αβ抗體離體染色后的圖像。比例尺=10 μ m。圖3g和池顯示檢測腦中的斑塊。比例尺=50 μ m。圖3i-3k顯示了 9月齡的AD-Tg小鼠，圖3i顯示了視網(wǎng)膜中的多個斑塊，圖3j和3k顯示了腦中的斑塊，比例尺(i) = IOym,比例尺(j，k) = 50 μ m。 圖31-3n顯示了 17月齡的AD-Tg小鼠，圖31顯示視網(wǎng)膜中的大量斑塊，圖:3m和3η顯示腦中的斑塊。比例尺⑴=10μπι(πι，η) = IOOym0圖3o_3q顯示了 9月齡的非Tg(野生型) 小鼠，圖3ο顯示視網(wǎng)膜中無斑塊，圖3p和3q顯示腦中無斑塊。比例尺(ο) = 10ym(p,q) =100 μ m0 圖4顯示了在基于樹突細(xì)胞的疫苗接種后AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的減少。 圖4a-4g是10月齡小鼠整體視網(wǎng)膜的代表性ζ軸投影圖像，圖顯示了 PBS處理的 AD-Tg對照小鼠，圖4d-4f顯示經(jīng)疫苗接種的AD-Tg小鼠，圖4g顯示了用姜黃和抗人A β抗體離體染色的非Tg(野生型)小鼠。圖4b和4c，以及圖顯示了視網(wǎng)膜的姜黃和抗Αβ抗體標(biāo)記的獨(dú)立通道圖像。比例尺=10μπι。圖4h是視神經(jīng)盤周圍12個區(qū)域的視圖(表示為長方形1-12)，其代表了整體視網(wǎng)膜中斑塊定量分析所覆蓋的區(qū)域(n = 4小鼠 /組；2個視網(wǎng)膜/小鼠)比例尺=200 μ m。圖4i顯示了在用基于免疫的疫苗接種處理過的AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中觀察到的斑塊數(shù)與用PBS處理的對照相比降低(Student' s t檢驗；P = 0. 0028)。圖4j顯示了在經(jīng)疫苗接種的AD-Tg小鼠的視網(wǎng)膜中觀察到的平均斑塊面積與其對照相比降低(Student' s t檢驗；P = 0. 0002)。圖4k顯示了斑塊覆蓋總面積的顯著降低也在基于免疫的疫苗接種后同一小鼠腦海馬和皮層檢測到(Student' s t檢驗；P = 0.0085)。每圖中的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖5顯示了 AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中姜黃標(biāo)記斑塊的體內(nèi)成像。圖5a_5c為靜脈注射姜黃或施用PBS后，未灌注AD-Tg和非Tg(野生型)小鼠(10月齡)整體視網(wǎng)膜的體內(nèi)代表性ζ軸投射圖像(紅色箭頭表示血管)。圖如顯示在靜脈注射姜黃后，在AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中可見A β斑塊(白色箭頭指示)(n = 6)。圖恥顯示在靜脈注射PBS后在AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中不能檢測到斑塊(n =幻。圖5c顯示在靜脈注射姜黃后的非Tg(野生型)小鼠的視網(wǎng)膜中檢測不到斑塊(n = 5)。圖5d是采用三通道以及縱向切片/冠狀虛擬切片 (sagittal/coronal virtual section)的代表性共聚焦ζ軸投射圖像，其展示了 AD-Tg小鼠整體視網(wǎng)膜的實質(zhì)和血管中被抗人Αβ抗體染色的Αβ斑塊(用白色箭頭指示血管內(nèi)的斑塊)在。圖展示了用基于AOFT光譜成像系統(tǒng)的熒光顯微鏡拍攝的圖像，并用分割和分類軟件分析和可視化。在圖5e中，用姜黃體內(nèi)染色并以單通道成像(激發(fā)562/40nm ； 發(fā)射624/40nm)的整體視網(wǎng)膜中可見A β斑塊(白色)和血管(箭頭指示)。圖5f顯示了同一整體視網(wǎng)膜和區(qū)域中被姜黃標(biāo)記的Αβ斑塊的特異性光學(xué)標(biāo)簽(optical signature, OS)的光譜分類圖像。Αβ斑塊以偽彩顯示(白色箭頭指示)，所有非斑塊組織為綠色偽彩。 比例尺=IOym0圖5g-5j是單次姜黃注射后的圖像，其中通過光發(fā)射而后用光譜控制源 (波長M6/15nm)在活A(yù)D-Tg小鼠視網(wǎng)膜(η = 4)中可見斑塊(白色箭頭指示)。圖5i和5j是更高放大倍數(shù)圖像，其中斑塊多數(shù)在靠近視神經(jīng)盤的區(qū)域中被檢測到，而且平均斑塊大小與在整體視網(wǎng)膜(離體)中觀察到的相似。圖證顯示在靜脈注射姜黃的非Tg(野生型)小鼠(n = 4)中未檢測到斑塊。比例尺(g，k) = 100 μ m，(h-j) =IOym. 23。
圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案對Αβ斑塊進(jìn)行診斷、預(yù)后和分析的光譜成像系統(tǒng)的流程圖。
圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案對A β斑塊進(jìn)行診斷、預(yù)后和/或分析的光譜成像系統(tǒng)的流程圖。
圖8顯示了被發(fā)現(xiàn)來源于內(nèi)源性小鼠APP基因的小視網(wǎng)膜斑塊(大部分直徑 < Iym)的高分辨率圖像。圖像來自10月齡的非Tg(野生型)小鼠視網(wǎng)膜。
圖9顯示了活A(yù)D-Tg和非Tg (野生型)小鼠視網(wǎng)膜的圖像，其顯示在AD-Tg視網(wǎng)膜中有姜黃染色斑塊，在非Tg(野生型)視網(wǎng)膜中無姜黃染色斑塊。
發(fā)明詳述 本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文，視同已完整公開。除非另外指明，發(fā)展本文所用的科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解相同。 Singleton Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ^lHlK, J. Wiley & Sons (New York, NY 2001) ；March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 第五版，J. Wiley & Sons (New York, NY 2001)；以及 Sambrook 和 Russel， Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本申請所用術(shù)語的通用指南。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，與本文所述相似或等同的許多方法和材料可用于本發(fā)明的實施中。事實上，本發(fā)明不以任何方式受限于所述的方法和材料。
本文所用的“施用”是指用于向患者遞送藥物組合物的任何途經(jīng)。遞送途徑可包括非介入性口服(通過口)，外用(皮膚)、經(jīng)粘膜(鼻、頰/舌下、陰道、眼部和直腸)和吸入途徑，以及腸胃外途徑和其他本領(lǐng)域已知方法。腸胃外是指通常與注射相關(guān)的施用途徑，包括眶內(nèi)、輸液、動脈內(nèi)、頸動脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、 鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管。通過腸胃外途徑，組合物可為輸液或注射用溶液或懸液的形式，或為凍干粉末的形式。
本文所用的“阿爾茲海默病”是指鑒定為退行性或認(rèn)知障礙疾病的任何形式的癡呆。該疾病可為穩(wěn)態(tài)的，由特殊的全腦損傷引起，或進(jìn)展性的，由身體損傷或疾病導(dǎo)致的長時期認(rèn)知功能下降引起(下降程度超過正常衰老所預(yù)計的)。
本文所用的“年齡相關(guān)性黃斑變性”是指老年人的醫(yī)學(xué)病癥，其由視網(wǎng)膜損傷導(dǎo)致的視野中央視力喪失(黃斑)導(dǎo)致。
本文所用的“白內(nèi)障”是指在眼部晶狀體或其外膜上發(fā)生的混濁，程度從輕微到完全不透明并阻擋光線穿過不等。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生初期，晶狀體的能力會增強(qiáng)，導(dǎo)致近視，并且晶狀體的逐漸變黃和混濁化會降低對藍(lán)色的感知。白內(nèi)障通常緩慢發(fā)展，引發(fā)視力下降，如果不治療則可能引發(fā)失明。
本文所用的“熒光標(biāo)記物”是指含有熒光團(tuán)的任何和所有混合物，用于將該化合物附著至另一個分子(如蛋白質(zhì)或核酸)。這通常通過與靶分子所包含的官能團(tuán)選擇性結(jié)合的熒光團(tuán)活性衍生物來實現(xiàn)。
本文所用“青光眼”是指一類疾病，其影響視神經(jīng)并包括以特征性方式喪失視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。青光眼被歸類為視神經(jīng)病的一種類型。
本文所用“哺乳動物”是指哺乳動物綱(Mammalia)的任何成員，包括但不限于人和非人靈長類如猩猩，以及其他猿和猴物種；農(nóng)業(yè)飼養(yǎng)哺乳動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬； 家養(yǎng)哺乳動物如狗和貓；實驗動物包括嚙齒類，如小鼠、大鼠、豚鼠等。該術(shù)語不表示具體的年齡或性別。因此成體或新生個體以及胎兒(不管雄性或雌性)都包含在本術(shù)語的范圍內(nèi)。
本文所用“治療有效量”是指能夠在接受治療的哺乳動物中達(dá)到有益結(jié)果的量。治療有效量可根據(jù)個體確定，并可基于(至少部分基于)哺乳動物的生理特性、所用遞送系統(tǒng)或治療技術(shù)的類型以及相對于受治疾病、異常或病癥的發(fā)展而言的施用時間等考慮因素。
本文所用“治療”是指治療性處理和預(yù)防性手段兩者，其中目的是預(yù)防或減緩(減少)目的病理病癥、疾病或異常，即使治療最終無法成功。需要治療的包括已經(jīng)患病的以及易于患病的或者需要預(yù)防疾病的。
β淀粉樣蛋白沉積是AD神經(jīng)病理的核心，并且是阿爾茲海默病的關(guān)鍵標(biāo)志。然而，在活體阿爾茲海默病患者和動物中監(jiān)測A β斑塊受到目前MRI和PET的分辨率和特異性的限制，并且只有在腦組織尸檢后通過監(jiān)測斑塊和纏結(jié)的數(shù)量和分布才能確定地診斷為阿爾茨海默病或其他特征為Aβ斑塊形成的疾病或病癥。因此，開發(fā)斑塊的體內(nèi)鑒定法對診斷以及評估應(yīng)答于治療的疾病發(fā)展很關(guān)鍵。
本發(fā)明的主題證明了哺乳動物視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的形成，并教導(dǎo)了對視網(wǎng)膜Αβ 斑塊進(jìn)行鑒定、量化和成像的方法。本發(fā)明的主題可用于患阿爾茲海默病、癡呆以及其他特征為Αβ斑塊形成的臨床病癥和疾病的患者。而且，本發(fā)明的主題發(fā)現(xiàn)，AD患者中視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的形成是在它們在腦中顯現(xiàn)之前。因此，本發(fā)明的主題公開了在哺乳動物中早期診斷AD的方法，其包括以下步驟，向患者施用用于染色視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的熒光標(biāo)記物， 并用光學(xué)成像系統(tǒng)對患者的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像，以鑒定被染色的Αβ肽。
本發(fā)明主題的另一個實施方案教導(dǎo)了通過測量治療前后患者視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的增多或降低來對哺乳動物AD進(jìn)行預(yù)后的方法。所述預(yù)后方法包括以下步驟，向患者施用用于染色視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的熒光標(biāo)記物，并用光學(xué)成像系統(tǒng)對患者視網(wǎng)膜進(jìn)行成像以鑒定被染色的A β肽，隨后對患者施用AD治療并經(jīng)過使AD治療發(fā)揮作用的時間。在AD治療后再次對患者施用用于染色視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的熒光標(biāo)記物，并用光學(xué)成像系統(tǒng)對患者視網(wǎng)膜進(jìn)行成像來鑒定染色Aβ肽的增多或減少。
在另一實施方案中，本發(fā)明的主題公開了治療哺乳動物患者的AD的方法，其包括向所述患者施用治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑，以降低Αβ斑塊的形成或消除其存在。
本發(fā)明的主題還可用于提高具有視網(wǎng)膜Αβ斑塊的哺乳動物患者的視力的方法， 包括以下步驟，向該患者施用治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑。提高視力的方法可用于AD、癡呆或其他特征為Αβ斑塊形成的臨床病癥和疾病(如年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)和青光眼)的患者。
在另一些實施方案中，本發(fā)明的主題描述了，Αβ斑塊在哺乳動物的視網(wǎng)膜存在，并可用于對多種特征為視網(wǎng)膜Αβ斑塊的其他臨床病癥和疾病進(jìn)行分析、預(yù)后和診斷。代表性的臨床病癥和疾病可包括AMD和青光眼。
在本發(fā)明主題中確定的其他發(fā)現(xiàn)包括用于對非人哺乳動物和人患者的視網(wǎng)膜進(jìn)行體內(nèi)Αβ斑塊可視化的光學(xué)成像系統(tǒng)。所述光學(xué)成像系統(tǒng)整合采用了熒光顯微鏡、汞和氙弧光燈、CCD照相機(jī)、基于AOTF(聲光可調(diào)濾光器)的光譜圖像采集裝置以及成像后分析軟件。光學(xué)成像系統(tǒng)整合以上工具以提供被染色Αβ斑塊的視網(wǎng)膜圖像，提供從原始圖像提取的光譜標(biāo)記的可視偽彩標(biāo)志，其表示A β斑塊對象的大小和位置。
在可另一實施方案中，光學(xué)成像系統(tǒng)整合使用了立體顯微鏡，其被調(diào)節(jié)成以更高分辨率使熒光和散射信號可視化。立體顯微鏡可裝備Polychrome V波長可變光源。在另一些實施方案中，光學(xué)成像系統(tǒng)可整合MicroFire彩色數(shù)字照相機(jī)和一個或更多個放大鏡頭以提高放大倍數(shù)和圖像細(xì)節(jié)。通過采用成像軟件進(jìn)行后分析圖像分段和分類，以獲得和優(yōu)化圖像采集。
在另一些實施方案中，光學(xué)成像系統(tǒng)可整合入診斷、預(yù)后和治療哺乳動物Αβ斑塊的方法中。此外，可用自適應(yīng)光學(xué)儀器(adaptive optics)來增強(qiáng)光學(xué)成像系統(tǒng)，所述自適應(yīng)光學(xué)儀器通過降低快速變化的光學(xué)失真的影響來提高光學(xué)成像系統(tǒng)的性能。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的主題可用于藥物開發(fā)和測試。因為非介入性、快速重復(fù)性成像方法能夠連續(xù)比較多種藥物和多種藥物劑量，因此本發(fā)明的主題能在藥物開發(fā)和測試中得到有利的應(yīng)用。
之前的報道鑒定了腦的A β病理情況，其基于對在AD患者的晶狀體中A β累積的發(fā)現(xiàn)[31]。本研究為Αβ斑塊在AD患者視網(wǎng)膜的存在提供了證據(jù)，所述Αβ斑塊能通過姜黃特異性地可視化。在所有檢查的AD患者視網(wǎng)膜中都發(fā)現(xiàn)了 A β斑塊，而它們在非AD對照中未被檢測到。在年輕和年老的AD小鼠中，都觀察到視網(wǎng)膜和腦Αβ斑塊病理之間的良好相關(guān)性，斑塊在疾病發(fā)展過程中以年齡依賴性方式累積，并且作為對同一治療模式的應(yīng)答， 視網(wǎng)膜和腦都顯示出Αβ斑塊的降低。總之，與腦有很多相似性的視網(wǎng)膜組織可潛在地被用于診斷和監(jiān)測AD。
在本研究中，AD患者視網(wǎng)膜中的Αβ斑塊大部分在RGC層中被檢測到。在AD小鼠的眼中，所見到的斑塊大部分在視網(wǎng)膜層和脈絡(luò)膜中。從NFL到ONL斑塊是顯著的，而且Αβ斑塊的聚集更經(jīng)常在視網(wǎng)膜的內(nèi)層被發(fā)現(xiàn)，表明有可能通過活個體的眼進(jìn)行斑塊成像。AD小鼠的視網(wǎng)膜發(fā)生年齡依賴性Αβ斑塊增加，Αβ斑塊在數(shù)量和大小方面都增加，與在腦中觀察到的年齡依賴斑塊累積相似。我們的結(jié)果證明視網(wǎng)膜斑塊病理與近期的研究一致，所述研究揭示在成年和年老的AD-Tg小鼠中視網(wǎng)膜Αβ沉積與視網(wǎng)膜炎癥和退化相關(guān) [16]。在本發(fā)明的主題中，我們不只提供支持視網(wǎng)膜和腦斑塊病理之聯(lián)系的證據(jù)，還表明在年輕的AD-Tg小鼠中，在視網(wǎng)膜中檢測到Αβ斑塊要比在腦中檢測到更早。我們還能證明， 在接種髓磷脂衍生肽之后AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜的A β斑塊顯著減少；已發(fā)現(xiàn)該處理及相關(guān)處理有效降低腦的Αβ斑塊負(fù)荷[17，對，25]。這些發(fā)現(xiàn)提供了可用于評估對斑塊減少療法之應(yīng)答的視網(wǎng)膜斑塊鑒定，以及視網(wǎng)膜斑塊可應(yīng)答于有效減少腦中Aβ斑塊的相同治療。
重要的是，在人眼GCL所見斑塊的尺寸達(dá)到大于5 μ m，這一事實使得通過視網(wǎng)膜對阿爾茲海默患者進(jìn)行成像成為可行方法，并且進(jìn)行一些修改后甚至可使用目前可獲得的人眼成像工具，如自適應(yīng)光學(xué)檢眼鏡[32]。在活體小鼠中，已發(fā)現(xiàn)可購得的瞳孔放大視網(wǎng)膜照相機(jī)能有效紀(jì)錄眼底照相，使得能夠評價視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的縱向變化[33]。調(diào)整成觀察藍(lán)綠熒光蛋白的藍(lán)光共焦掃描激光檢眼鏡(bCSLO)也提供了在活體小鼠視網(wǎng)膜中觀察 RGC的非介入性方法[34]。這里，為證明觀點(diǎn)，我們采用裝備有Polychrome V光譜光源和雙凸透鏡的立體顯微鏡(Leica S6E)在活體小鼠中成功檢測了姜黃標(biāo)記的斑塊。而外，采用AOTF系統(tǒng)，我們在消除強(qiáng)背景自發(fā)熒光信號(來自紅血細(xì)胞)的同時通過姜黃成功檢測了視網(wǎng)膜A β斑塊。
在本研究中，當(dāng)以7. 5mg/kg的單劑量全身施用或口服施用姜黃時，其能有效地檢測視網(wǎng)膜Αβ斑塊。已證明姜黃有穿過血腦和血-視網(wǎng)膜屏障的能力，這是有效的斑塊成像劑的必要條件。就安全性而言，在癌癥患者中使用姜黃的I期和II期試驗已經(jīng)證明了當(dāng)長時間給藥時，即使是在高劑量下(12g/天)，其對人的毒性也很低[35]。從小鼠轉(zhuǎn)換到人用于視網(wǎng)膜斑塊成像的靜脈內(nèi)或口服給予的姜黃劑量(低于Ig)預(yù)計在所報道的安全水平內(nèi)。此外，最近的研究報道了顯著增強(qiáng)姜黃在人中的穩(wěn)定性和生物利用度的多種方法[36]。
AD患者視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的鑒定為開發(fā)允許進(jìn)行體內(nèi)檢測的高分辨率和靈敏度的成像方法提供了新機(jī)會。這些結(jié)果可能與在AD患者中發(fā)現(xiàn)的早期視覺功能異常相一致[37，38]，并與在AD患者中報道的視網(wǎng)膜異常的證據(jù)(如GCL細(xì)胞喪失以及NFL萎縮) [39-44]相一致。盡管Αβ斑塊在AD的早期還是晚期在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)仍不清楚，但是目前在不同年齡的這些患者的視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)Αβ斑塊，以及這些斑塊在AD-Tg小鼠疾病的非常早的癥狀發(fā)生前階段可檢測到的事實，都加強(qiáng)了通過眼中姜黃標(biāo)記的斑塊能用于AD早期診斷的可能性。重要的是，根據(jù)它們在視網(wǎng)膜中的獨(dú)特大小和分布，在AD患者中觀察到的斑塊可最終被用于區(qū)別性診斷在年齡相關(guān)性黃斑變性中檢測到的斑塊的位置局限在玻璃疣中的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，并且看起來大小較小W5-47]。就AD患者中所見的視網(wǎng)膜異常而言，斑塊減少治療(如目前的DC疫苗接種)也可有助于緩解一些視力功能缺陷，甚至引起視力的改善。
隨著世界人口的老齡化和AD的日益盛行，AD的早期檢測對于評估風(fēng)險、評估新療法以及在AD發(fā)生后通過早期干預(yù)進(jìn)行治療而言變得更加重要。認(rèn)為AD病理(包括淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)元纖維纏結(jié))在癥狀顯現(xiàn)和發(fā)生任何實質(zhì)性神經(jīng)變性的多年以前就已經(jīng)出現(xiàn)。尤其需要發(fā)現(xiàn)AD特異性的早期檢測標(biāo)記物(如視網(wǎng)膜中的A β斑塊)，其可在仍能正常認(rèn)知的個體中預(yù)測腦病理和認(rèn)知降低的發(fā)生。本發(fā)明人在小鼠AD模型中的發(fā)現(xiàn)支持了使用姜黃標(biāo)記的視網(wǎng)膜斑塊體內(nèi)成像作為AD病理早期指征和對治療介入之應(yīng)答的非介入性工具。
此外，本發(fā)明的主題引入了降低和/或消除視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的疫苗接種療法，所述Αβ斑塊通常與AD患者眼和視力的退化相關(guān)。使用髓磷脂衍生肽或髓磷脂衍生肽的弱激動劑有效誘導(dǎo)了神經(jīng)保護(hù)，并降低了視網(wǎng)膜中的斑塊形成。
總之，我們在人視網(wǎng)膜中鑒定了 Αβ斑塊，并且描述了通過已證明在人體中安全的全身施用化合物，通過對視網(wǎng)膜A β斑塊進(jìn)行成像而與在腦中相比更早并更容易地檢測并監(jiān)測阿爾茲海默斑塊病理的新方法。這可在仍正常并良好認(rèn)知的個體中在發(fā)現(xiàn)顯著的功能缺陷前預(yù)測腦病理和認(rèn)知降低的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)顯示，視網(wǎng)膜的光學(xué)成像可用作監(jiān)測AD 發(fā)展以及對治療介入之應(yīng)答的非介入性方法W8]。
實施例 提供以下實施例以更好地說明本發(fā)明，其不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。對于所提及的特定材料，其程度僅為說明目的而非旨在限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開發(fā)出等同的手段或反應(yīng)物，而無需創(chuàng)造性勞動，并且不背離本發(fā)明的范圍。
實施例1 結(jié)果 可使用姜黃將AD小鼠視網(wǎng)膜的Αβ沉積可視化 使用攜帶人API^swe和PSldE9轉(zhuǎn)基因的AD-Tg小鼠來評價開發(fā)用于檢測眼中A β 斑塊的非介入性工具的可能性。我們首先證實，姜黃對AD-Tg小鼠海馬中由人A β特異抗體檢測到的相同斑塊具有親和力(圖Ia ；獨(dú)立通道圖Ib和Ic)。在更高的放大倍數(shù)下，圖像顯示采用每種程序獲得的特異性染色模式(圖Id和Ie)。人Αβ斑塊在非Tg同胎野生型(wt)小鼠的腦中檢測不到(圖If)。然后，我們測試了 AD-Tg小鼠眼中的Αβ斑塊是否也能結(jié)合姜黃。高分辨率下的檢測顯示，姜黃和抗人A β抗體兩者均標(biāo)記出AD-Tg小鼠視網(wǎng)膜中Αβ斑塊的存在(圖lg-li，視網(wǎng)膜整體；圖lk-lm，橫截面)，但在非Tg(野生型)小鼠中沒有標(biāo)記(圖Ij和In)。代表性圖像顯示了視網(wǎng)膜整體中多個深度(在80 μ m深度的焦平面連續(xù)采集)(以包括內(nèi)網(wǎng)層(IPL ；圖Ig)；內(nèi)核層(INL)/外網(wǎng)層(0PL ；圖Ih)和外核層(0NL ；圖Ii))中Αβ斑塊的位置。對橫截面的分析進(jìn)一步證實了 Αβ斑塊在深視網(wǎng)膜層和脈絡(luò)膜的沉積；在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)和IPL到OPL層明顯占優(yōu)勢(圖lk-lm)。而在非Tg(野生型)同胎小鼠中沒有人Αβ斑塊(圖Ij和In)，偶爾檢測到小的姜黃陽性斑塊。為了確定這些野生型小鼠中姜黃染色所檢測到的小且稀疏的斑塊的性質(zhì)，我們采用姜黃和小鼠Αβ特異性抗體對10月齡野生型小鼠的整體視網(wǎng)膜進(jìn)行了雙染色實驗。的確，發(fā)現(xiàn)在野生型視網(wǎng)膜中由姜黃檢測到的小斑塊也被抗小鼠Αβ抗體共標(biāo)記，從而證實它們的身份是內(nèi)源形成的小鼠Αβ沉積(圖8a-8d)。
實施例2 結(jié)果 Αβ斑塊在AD患者的視網(wǎng)膜中形成并可由姜黃可視化 其后我們檢測了確診為AD的患者(n = 9 ；年齡范圍48至94歲；根據(jù)他們的神經(jīng)病理報告分類為不同的疾病嚴(yán)重度)眼部尸檢中以及年齡匹配的正常對照的眼部尸檢中 (η = 4 ;66至92歲；參見表1的人眼捐獻(xiàn)記錄)Αβ斑塊的存在情況。通過蘇丹黑B染色來消除固定人眼的自發(fā)熒光和非特異信號(圖2)，其在激發(fā)范圍360-710nm下觀察到，并與脂褐素/脂質(zhì)沉積和/或長期福爾馬林固定有關(guān)[21，22]。對于姜黃染色，我們首先將人整體視網(wǎng)膜浸沒在蘇丹黑B中(圖加和2c ；未觀察到斑塊)，而后暴露在姜黃中(圖2b和 2d ；代表性圖像顯示相同組織位置處的斑塊)。在所檢測的所有AD患者的眼中都在對應(yīng)于 GCL、IPL和INL視網(wǎng)膜層的多個焦距深度通過姜黃檢測到了斑塊，大小為1至IOym(通常約5μπι)(圖加和2力，并且與報告的腦中的斑塊病理明顯相關(guān)。我們也采用針對人Αβ的抗體分析了人視網(wǎng)膜。我們在AD患者中鑒定了 Αβ斑塊并且發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)與在小鼠視網(wǎng)膜和腦中所發(fā)現(xiàn)的類似[圖池和2i代表容易檢測到斑塊的最里層視網(wǎng)膜層(即GCL)； 圖2i是更高放大倍數(shù)的視網(wǎng)膜A β斑塊結(jié)構(gòu)；圖2j代表更深的連續(xù)焦平面(即IPL)]。當(dāng)只使用二抗時不能檢測到斑塊(數(shù)據(jù)未顯示)。在Αβ免疫標(biāo)記后將人視網(wǎng)膜暴露在姜黃中，確定了它們的共定位(圖2k-2m)。在非AD人眼中，未檢測到Aβ斑塊(圖2η)。
表 1
權(quán)利要求
1.診斷哺乳動物中阿爾茲海默病的方法，其包括向所述哺乳動物施用用于染色Aβ肽的熒光標(biāo)記物； 用光學(xué)成像系統(tǒng)對該哺乳動物的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像； 檢查所述圖像中被染色的Αβ肽；和如果存在被染色的Αβ肽，則診斷該哺乳動物為患阿爾茲海默病。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述光學(xué)成像在體內(nèi)進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自姜黃、姜黃衍生物、硫磺素S及衍生物、 硫磺素T及衍生物、剛果紅及衍生物、甲氧基-Χ04、匹茲堡化合物B (PiB)、DDNP、重氮黃G， 及其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)選自光譜儀、熒光顯微鏡、立體顯微鏡、 水銀燈、可變波長光源、氙燈、CCD門控照相機(jī)、彩色數(shù)字照相機(jī)、基于聲光可調(diào)濾光器的光譜圖像采集系統(tǒng)、自適應(yīng)光學(xué)儀器、成像軟件，及其組合。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為姜黃，并且施用的姜黃量小于12.0克并大于7. 5mg。
6.對哺乳動物的阿爾茲海默病進(jìn)行預(yù)后的方法，其包括 向?qū)ο笫┯糜糜谌旧獳β肽的熒光標(biāo)記物；用光學(xué)成像系統(tǒng)對該對象的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像； 檢查所述圖像中被染色的Αβ肽；與之前診斷相比，對該對象的視網(wǎng)膜中被染色的Αβ肽的增加/減少進(jìn)行定量；和根據(jù)在所述對象視網(wǎng)膜中染色的Aβ肽的水平進(jìn)行預(yù)后。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述光學(xué)成像在體內(nèi)進(jìn)行。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自姜黃、姜黃衍生物、硫磺素S及衍生物、 硫磺素T及衍生物、剛果紅及衍生物、甲氧基-Χ04、匹茲堡化合物B (PiB)、DDNP、重氮黃G， 及其組合。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)選自光譜儀、熒光顯微鏡、立體顯微鏡、 水銀燈、可變波長光源、氙燈、CCD門控照相機(jī)、彩色數(shù)字照相機(jī)、基于聲光可調(diào)濾光器的光譜圖像采集系統(tǒng)、自適應(yīng)光學(xué)儀器、成像軟件及其組合。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為姜黃，并且施用的姜黃量小于12.0克并大于7. 5mg。
11.鑒定哺乳動物視網(wǎng)膜中的Αβ肽的方法，其包括 向所述哺乳動物施用用于染色Aβ肽的熒光標(biāo)記物； 用光學(xué)成像系統(tǒng)對該哺乳動物的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像；和檢查所述圖像中被染色的Aβ肽。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述光學(xué)成像在體內(nèi)進(jìn)行。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自姜黃、姜黃衍生物、硫磺素S及衍生物、硫磺素T及衍生物、剛果紅及衍生物、甲氧基-Χ04、匹茲堡化合物B(PiB)、DDNP、重氮黃 G，及其組合。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)選自光譜儀、熒光顯微鏡、立體顯微鏡、水銀燈、可變波長光源、氙燈、CCD門控照相機(jī)、彩色數(shù)字照相機(jī)、基于聲光可調(diào)濾光器的光譜圖像采集系統(tǒng)、自適應(yīng)光學(xué)儀器、成像軟件及其組合。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為姜黃，并且施用的姜黃量小于12.0克并大于7. 5mg。
16.治療哺乳動物中阿爾茲海默病的方法，其包括提供治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑；和向所述哺乳動物施用所述治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑。
17.評價哺乳動物中阿爾茲海默病治療的有效性的方法，其包括向所述哺乳動物施用用于染色Aβ肽的熒光標(biāo)記物；用光學(xué)成像系統(tǒng)對哺乳動物的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像；檢查所述圖像中被染色的Αβ肽；并且根據(jù)在所述哺乳動物視網(wǎng)膜中染色的Aβ肽的水平來評價所述阿爾茲海默病治療的有效性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述光學(xué)成像在體內(nèi)進(jìn)行。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自姜黃、姜黃衍生物、硫磺素S及衍生物、硫磺素T及衍生物、剛果紅及衍生物、甲氧基-Χ04、匹茲堡化合物B(PiB)、DDNP、重氮黃 G，及其組合。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)選自光譜儀、熒光顯微鏡、立體顯微鏡、水銀燈、可變波長光源、氙燈、CCD門控照相機(jī)、彩色數(shù)字照相機(jī)、基于聲光可調(diào)濾光器的光譜圖像采集系統(tǒng)、自適應(yīng)光學(xué)儀器、成像軟件及其組合。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為姜黃，并且施用的姜黃量小于12.0克并大于7. 5mg。
22.治療哺乳動物中Αβ肽相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括提供治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑；和向所述哺乳動物施用所述治療有效量的髓磷脂衍生肽和/或髓磷脂衍生肽激動劑。
23.評價哺乳動物中Αβ肽相關(guān)視網(wǎng)膜疾病治療的有效性的方法，其包括向所述哺乳動物施用用于染色Aβ肽的熒光標(biāo)記物；用光學(xué)成像系統(tǒng)對哺乳動物的視網(wǎng)膜進(jìn)行成像；檢查所述圖像中被染色的Αβ肽；和根據(jù)在所述哺乳動物視網(wǎng)膜中染色的Aβ肽的水平來評價所述Αβ肽相關(guān)視網(wǎng)膜疾病治療的有效性。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述視網(wǎng)膜疾病選自視力喪失、白內(nèi)障、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、其中有淀粉樣蛋白斑的視網(wǎng)膜累積的神經(jīng)退行性病癥，及其組合。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述光學(xué)成像在體內(nèi)進(jìn)行。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述熒光標(biāo)記物選自姜黃、姜黃衍生物、硫磺素S及衍生物、硫磺素T及衍生物、剛果紅及衍生物、甲氧基-Χ04、匹茲堡化合物B(PiB)、DDNP、重氮黃 G，及其組合。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述光學(xué)成像系統(tǒng)選自光譜儀、熒光顯微鏡、立體顯微鏡、水銀燈、可變波長光源、氙燈、CCD門控照相機(jī)、彩色數(shù)字照相機(jī)、基于聲光可調(diào)濾光器的光譜圖像采集系統(tǒng)、自適應(yīng)光學(xué)儀器、成像軟件及其組合。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述熒光標(biāo)記物為姜黃，并且施用的姜黃量小于12. 0克并大于7. 5mg。
全文摘要
本發(fā)明的主題涉及用于監(jiān)測阿爾茲海默病(AD)特異性的早期病理事件(如淀粉樣蛋白斑的發(fā)生、數(shù)量和位置)的非介入性光學(xué)成像法。監(jiān)測這些事件的能力為AD診斷、預(yù)后和評價潛在療法等提供了基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的主題引入了用于治療AD和與AD相關(guān)的視網(wǎng)膜病變的新方法。Aβ斑塊檢測在活體腦中非常受限，尤其是高分辨率檢測；因此，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的研究著眼于眼部，因為其可作為腦源性組織的替代而被直接、重復(fù)且非介入性地成像。
文檔編號C12Q1/00GK102186504SQ200980136743
公開日2011年9月14日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者優(yōu)素福·科龍尤, 馬亞·科龍尤, 基思·L·布萊克, 米卡爾·施瓦茨, 丹尼爾·L·法爾卡斯 申請人:西塞醫(yī)療中心, 耶達(dá)研究開發(fā)公司