專利名稱：由超產(chǎn)酵母生產(chǎn)角鯊烯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及角鯊烯的生產(chǎn)，角鯊烯可以用于，例如，水包油乳液。
背景技術(shù)：
鯊魚肝油含有一種稱為角鯊烯的支鏈、不飽和類萜，2，6，10，15，19，23-六甲基_2，6，10，14，18，22- 二十四碳己烯。角鯊烯被用于人用疫苗的水包油乳液，例如用作流感疫苗佐劑的MF59乳液。角鯊烯還可用于其他藥品(例如膏劑、栓劑等)和化妝品。目前角鯊烯的來源主要是魚油，尤其是鯊魚肝油。采用提取自鯊魚肝油的角鯊烯會有一些問題，尤其是，如果沒有堅(jiān)持嚴(yán)格的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)(例如諾華(Novartis)在MF59生產(chǎn)過程中采用的標(biāo)準(zhǔn))。例如，鯊魚會被某些病原體感染，而這些病原體可能同樣會感染人或產(chǎn)生某些對人有害的物質(zhì)，還可能有TSE或TSE樣鯊源物質(zhì)存在[參考文獻(xiàn)1-3]。并且，鯊魚可能含有對人有害的毒素，例如毒素carchatoxin。因此，低價、低端的角鯊烯源不適合用于制造人用藥。當(dāng)角鯊烯是免疫佐劑的組成部分時，這些有害風(fēng)險(xiǎn)可能更嚴(yán)重，因?yàn)?，根?jù)佐劑的定義，它可能誘導(dǎo)針對雜質(zhì)的強(qiáng)烈的副反應(yīng)。所以，藥用角鯊烯(例如用于制造MF59)不能采用低價、低端鯊魚角鯊烯，而需采用高級別的原材料，但這些高質(zhì)角鯊烯十分昂貴，且來源有限。如此昂貴的來源是不適用的，例如對發(fā)展中國家而言。需要找到一種既能滿足藥用高標(biāo)準(zhǔn)又不那么貴的角鯊烯來源。所以，需要新的角鯊烯來源，尤其是對于非胃腸給藥人用藥使用的角鯊烯和/或用于免疫佐劑的角鯊烯而言。低廉的藥用級角鯊烯來源對于某些發(fā)展中國家來說特別有用，這些國家或者鯊魚資源有限，或者無法承擔(dān)目前所用(例如諾華所用)昂貴的藥用級原材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及由超量生產(chǎn)角鯊烯的酵母生產(chǎn)角鯊烯的方法。酵母是GRAS(通常認(rèn)為安全的)微生物，因此適合用作藥用角鯊烯的來源。并且，由此制備角鯊烯可避免病原體、 朊病毒和環(huán)境毒素的污染，例如，已知酵母是不含汞的。由于疫苗領(lǐng)域已經(jīng)在使用酵母(例如用于乙肝表面抗原的重組表達(dá))，所以不會產(chǎn)生特別的規(guī)則問題，換言之，來自酵母的角鯊烯特別適合用于制備免疫佐劑。最后，酵母培養(yǎng)技術(shù)廣為人知，非常容易進(jìn)行技術(shù)轉(zhuǎn)用?；诖?，本發(fā)明提供了一種制備純角鯊烯的方法，包括以下步驟(a)培養(yǎng)在培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母；和(b)從步驟(a)培養(yǎng)的酵母中純化角鯊烯。純化得到的角鯊烯可用于制備藥物、食品、食品添加劑和化妝品等。本發(fā)明還提供一種制備含角鯊烯產(chǎn)品的方法，包括以下步驟(a)獲取業(yè)已從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化的角鯊烯；和(b)將步驟(a)的角鯊烯與非角鯊烯組分組合形成含角鯊烯的產(chǎn)品。本發(fā)明還提供培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母用于制備純化角鯊烯的用途。本發(fā)明還提供一種制備純化角鯊烯的方法，包括以下步驟(a)在能使酵母高產(chǎn)率地生產(chǎn)角鯊烯的條件下培養(yǎng)酵母；(b)從培養(yǎng)的酵母中純化角鯊烯，得到純度彡97wt%的角鯊烯。本發(fā)明還提供一種制備水包油乳液的方法，包括以下步驟(a)從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化角鯊烯；和(b)將步驟(a)中純化的角鯊烯與水性組分組合形成水包油乳液。本發(fā)明還提供一種制備水包油乳液的方法，包括以下步驟(a)獲取業(yè)已從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化的角鯊烯；和(b)將步驟(a)的角鯊烯與水性組分組合形成水包油乳液。本發(fā)明還提供一種制備免疫原性組合物(例如疫苗)的方法，包括如上所述制備水包油乳液，將所得乳液與免疫原混合。本發(fā)明還提供一種制備試劑盒的方法，所述試劑盒是用于按照本發(fā)明方法制備免疫原性組合物的，所述制備試劑盒的方法包括如上所述制備水包油乳液，將所得乳液裝入第一容器，將該第一容器與含有免疫原的第二容器組合成試劑盒。所述免疫原可以是無水形式的，或者是含水形式的。本發(fā)明還提供一種增強(qiáng)動物(例如哺乳動物)免疫應(yīng)答的方法，包括給予動物按照本發(fā)明方法制備的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供用于制造增強(qiáng)哺乳動物免疫應(yīng)答的藥物的角鯊烯，所述角鯊烯是 (i)從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化的，并且，(ii)與水性組分組合形成水包油乳液，該水包油乳液將包含在所述藥物中。本發(fā)明提供一種制備水包油乳液的方法，包括以下步驟(a)在能使酵母高產(chǎn)率地生產(chǎn)角鯊烯的條件下培養(yǎng)酵母；(b)從培養(yǎng)的酵母中純化角鯊烯；和(c)將步驟(b)純化的角鯊烯與水性組分組合形成水包油乳液。在角鯊烯的使用中，本發(fā)明的改進(jìn)之一在于采用了純化自培養(yǎng)期間能高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母的角鯊烯。在酵母中生產(chǎn)角鯊烯本發(fā)明采用純化自酵母的角鯊烯。所述酵母可以是篩選得到的角鯊烯高產(chǎn)天然株或突變株，但通常它們會是基因工程株，經(jīng)遺傳改造從而高產(chǎn)率地生產(chǎn)角鯊烯。另一種可能是在存在提高角鯊烯產(chǎn)率的因子的條件下培養(yǎng)天然、突變或工程酵母菌。角鯊烯的產(chǎn)率可表示為占特定酵母細(xì)胞干重(Cdw)的百分比(％ )。普通野生型解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)率一般約為0. 5% cdw，而普通&iccharomyces uvanim釀酒酵母則約為1.4% cdw[4]0 “高產(chǎn)率”地生產(chǎn)角鯊烯的酵母指這樣的酵母，其角鯊烯產(chǎn)率至少為2% cdw，例如彡7%, ^ 8%, ^ 9%, ^ 10%, ^ 11%, ^ 12%, ^ 13%, ^ 14%、彡 15% cdw 或更高。角鯊烯產(chǎn)率也可以表示為占特定酵母內(nèi)總脂質(zhì)的百分比(％)。普通S.uvarum釀酒酵母生產(chǎn)的角鯊烯占總脂質(zhì)的33% W]?！案弋a(chǎn)率”地生產(chǎn)角鯊烯的酵母生產(chǎn)的角鯊烯可達(dá)到總脂質(zhì)的彡40%，例如彡50%，彡60%等。
所得角鯊烯的優(yōu)點(diǎn)之一在于至少95%為反式(天然異構(gòu)體)，例如> 96%，> 97%, > 98%，> 99%或 100%為反式。屬于天然突變株的角鯊烯高產(chǎn)酵母菌是本領(lǐng)域已知的，例如參考文獻(xiàn)5所述的德爾布有孢圓酵母(Torulasopra delbrueckii)?？梢杂贸Ｒ?guī)誘變法(隨機(jī)誘變或定向誘變) 獲得突變株，例如參考文獻(xiàn)6和7所述，然后從誘變細(xì)胞中篩選角鯊烯高產(chǎn)菌株。參考文獻(xiàn) 8描述了一類酵母菌，其具有4- α -羧基留醇-C3-脫氫酶0-a-carboxysterol-C3-dehydr ogenase) (ERG26)溫敏突變，因此能在以合適溫度培養(yǎng)時形成角鯊烯累積。通常，本發(fā)明會采用基因改造過的酵母。有多種方法可以來提高起始菌株的角鯊烯產(chǎn)率。可通過調(diào)控留醇代謝來提高角鯊烯產(chǎn)率，例如提高角鯊烯合成代謝和/或降低角鯊烯分解代謝(包括其降解和/或自然轉(zhuǎn)化為麥角留醇)。參與角鯊烯生物合成的基因包括甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶， HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)和角鯊烯合成酶。參與角鯊烯向麥角甾醇轉(zhuǎn)化的基因包括角鯊烯環(huán)氧酶(ERGl)，羊毛醇合成酶，C14-二甲基酶(C14-dimethylase)， dl4-還原酶(dl4-reductase)，C4-甲基氧化酶(C4_methyloxidase)，C4-脫羧酶 (C4-decarboxylase) (ERG^)，3_ 酮還原酶(3-ketoreductase)，CM-甲基轉(zhuǎn)移酶，C8-異構(gòu)酶，C5-去飽和酶，d22-去飽和酶和d24-還原酶。其它代謝酶包括LEU2 ( β -異丙基蘋果酸脫氫酶)，氧化鯊烯環(huán)化酶，酵母留醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和麥角留_5，7，24( )-三烯甘油酯-22-脫氫酶。相關(guān)調(diào)控是已知的，例如參考文獻(xiàn)9中所述。可用各種合適的方法提高或降低相關(guān)酶的活性水平，通常采用基因改造的方法。 可用標(biāo)準(zhǔn)方法對酵母進(jìn)行基因改造，包括參考文獻(xiàn)7和10中所述的方法?？捎酶鞣N方法將基因?qū)虢湍福缬觅|(zhì)粒，或通過染色體整合。酵母內(nèi)基因敲除技術(shù)也已相當(dāng)成熟。提高酶活的方法包括但不限于提高菌株內(nèi)自有酶的拷貝數(shù)，例如增加一個或更多個基因，通常是加載中質(zhì)粒上；提高自有酶的表達(dá)水平(超表達(dá))，例如采用強(qiáng)啟動子；增加異源酶，即并非菌株自有的酶；降低或避免阻抑或抑制因子的表達(dá)；改變自有酶的序列從而提高穩(wěn)定性、去除引起抑制的氨基酸殘基、改變蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)聚集等等。例如， 已知將酶的序列截短可將其由膜蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榘麧{蛋白，并由此形成角鯊烯積累。降低酶活的方法包括但不限于消除菌株內(nèi)的自有酶；降低自有酶的表達(dá)水平， 例如采用弱啟動子；提高阻抑或抑制因子的表達(dá)；改變自有酶的序列從而降低穩(wěn)定性、改變誘導(dǎo)酶活的氨基酸殘基、刪除功能域、改變蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)聚集等等。弱表達(dá)或過表達(dá)水平以及活性提高或降低通過與不含相應(yīng)改造的野生型菌株的比較來表示?，F(xiàn)有技術(shù)中已有不少關(guān)于酵母內(nèi)適宜基因操作的報(bào)道。例如，參考文獻(xiàn)11記載了一種酵母，由于HMGR超表達(dá)且酵母留醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或麥角留-5，7，M (28)-三烯甘油酯-22-脫氫酶表達(dá)降低，由此提高了角鯊烯積累。參考文獻(xiàn)12記載了一種酵母， 表達(dá)膜結(jié)合區(qū)缺失的截短HMGR(HMG1異構(gòu)酶)，使之成為胞漿酶，由此獲得角鯊烯積累。 破壞角鯊烯環(huán)氧酶導(dǎo)致角鯊烯積累[13]。參考文獻(xiàn)14對解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)進(jìn)行了改造，抑制乙酰輔酶A脫羧酶而超表達(dá)HMGR，結(jié)果，采用廉價的碳源，例如乳酪乳清(cheese whey)或甘蔗，該酵母菌能夠以2% cdw的產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯。氧化鯊烯環(huán)化酶(ERG7)突變也能導(dǎo)致角鯊烯積累[8]。已知，沒有膽甾醇則無法在3-酮甾醇上生長的麥角甾醇營養(yǎng)缺陷型酵母能積累角鯊烯[15]。血紅素合成不良的酵母能積累角鯊烯 [16]?？蓪⒍喾N方法聯(lián)用，例如表達(dá)胞漿型截短HMGR并且敲除角鯊烯環(huán)氧酶基因。優(yōu)選表達(dá)截短HMGR的釀酒酵母(S. cerevisiae)，例如參考文獻(xiàn)12所述的那些。 表達(dá)可溶性非膜結(jié)合形式的HMG1，最好是在組成型啟動子(例如ADHl啟動子)調(diào)控下表達(dá)，可獲得高水平的角鯊烯積累(40X野生型)。該截短蛋白可能含有HMGlp的部分間隔區(qū)和C-末端催化域，但缺失了 N-末端的跨膜區(qū)。一株菌株可表達(dá)一份或多拷貝的該基因。可在存在能夠提高角鯊烯產(chǎn)率的因子的條件下培養(yǎng)酵母(天然、突變或工程菌)。 例如，烯丙胺類抗真菌劑(例如特比萘芬(terbinafine)、萘替芬(naftifine))能抑制角鯊烯環(huán)氧酶，造成麥角留醇缺乏和角鯊烯胞內(nèi)積累[17]。如果存在非致死水平的角鯊烯環(huán)氧酶抑制劑或者采用耐受型菌株等，培養(yǎng)物的角鯊烯產(chǎn)率可得到提高。據(jù)參考文獻(xiàn)18記載， 特比萘芬(terbinafine)存在下，角鯊烯產(chǎn)率可提高約100-倍。不同假絲酵母(Candida sp.)內(nèi)角鯊烯環(huán)氧酶對特比萘芬(terbinafine)敏感度的差異因數(shù)約為10，所以，可能需要對特定目標(biāo)酵母菌進(jìn)行因子濃度優(yōu)化。能夠引起角鯊烯積累的其它抗真菌劑包括但不限于伏力康唑(voriconazole) [19]、6_氨基-2-正-戊基硫代苯并噻唑[20]和硫代氨基甲酸酯(鹽)類(thiocarbamate)抗真菌劑(例如托萘酯(tolnafiate)和托西拉酯 (tolciclate))[21]0硫胺存在下培養(yǎng)也能提高角鯊烯產(chǎn)率[22]。合適的酵母包括各種產(chǎn)角鯊烯或經(jīng)調(diào)控后生產(chǎn)角鯊烯的酵母。例如以下各屬子囊酵母(Arthroascus)，雙極酵母(Arxiozyma)，Arxula，布勒擲孢酵母(Bullera)，假絲酵母(Candida)，德巴利氏酵母(Debaryomyces)，德克氏酵母(Dekkera)，Dipodascopsis，內(nèi)孢酵母(Endomyces)，阿氏假囊酵母(Eremothecium)，地霉菌屬(Geotrichum)，有孢漢生酵母(Hanseniaspora),漢遜酵母(Hansenula), Hormoascus,伊薩酵母(Issatchenkia), 克勒克氏酵母(Kloeckera)，克魯維酵母(Kluyveromyces)，油脂酵母(Lipomyces)， 婁德酵母(Lodderomyces)，Metschnikowia )，囊酵母(Pachysolen)，特地厚邊孢酵母(Pachytichospora)，畢赤酵母(Pichia)，球紅冬孢酵母(Rhodosporidium)，紅酵母(Rhodotorula),釀酒酵母(Saccharomyces), Saccharomycodes,裂芽酵母孢子屬 (Schizoblastosporion)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces), Schwaniomyces,擲抱酵母 (Sporobolomyces),梗孢酵母(Sterigmatomyces),合軸酵母(Sympodiomyces)，夕卜囊屬 (Taphrina)，圓酵母(Torula)，有孢圓酵母(Torulaspora)，球擬酵母(Torulopsis)，絲孢酵母CTrichosporon)，耶氏酵母(Yarrowia)，接合漢氏酵母(Zygohansenula)和小橢圓結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces)。本發(fā)明用的是釀酒酵母(Saccharomyces)和有孢圓酵母 (Torulaspora)。本發(fā)明優(yōu)選的是戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)，最好是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)?？赏ㄟ^大規(guī)模酵母發(fā)酵來生產(chǎn)角鯊烯，這樣，角鯊烯的產(chǎn)量幾乎沒有上限，并可由此降低單位生產(chǎn)成本?？捎酶鞣N已知的培養(yǎng)系統(tǒng)或發(fā)酵系統(tǒng)來培養(yǎng)酵母。適用于本發(fā)明的酵母發(fā)酵系統(tǒng)包括分批發(fā)酵(batch)系統(tǒng)和連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)。也可采用兩階段培養(yǎng)系統(tǒng)?？梢韵仍谟醒鯒l件下培養(yǎng)酵母從而提高生物質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入(至少部分)無氧發(fā)酵階段來提高角鯊烯生產(chǎn)。兩階段培養(yǎng)系統(tǒng)能將角鯊烯積累與生長期分開?？赏ㄟ^無氧條件下培養(yǎng)酵母來提高角鯊烯產(chǎn)率[23-25]，碳源對此可能也有影響。
因?yàn)榻湍改苡谜{(diào)配培養(yǎng)基來培養(yǎng)，由此可確保培養(yǎng)物不含致病物質(zhì)、環(huán)境毒素或其他污染物。合適的培養(yǎng)基取決于酵母種類和發(fā)酵系統(tǒng)。合適的培養(yǎng)基包括含有或不含補(bǔ)充成分的富營養(yǎng)培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基。例如，可用以下培養(yǎng)基來培養(yǎng)酵母:MM，EMM，YPD， YPDS, YPG, YPGS, YT, YAPD, YEPD, YPL, YEP, YNBD和SD。理想的是不含任何動物來源產(chǎn)物 (例如乳清)的培養(yǎng)基。如果細(xì)胞培養(yǎng)需用到動物(尤其是牛)材料，它們必須是來自無海綿狀腦病(TSEs)尤其是牛海綿狀腦病(BSE)的來源。由于對培養(yǎng)條件的控制，本發(fā)明純化自酵母的角鯊烯不受病原體、病原體代謝物、 毒素及其它有害物質(zhì)的污染，并且不含來自致TSE物質(zhì)(酵母中不存在此類物質(zhì))的朊蛋白。從酵母中分離角鯊烯的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如層析，液-液溶劑萃取，臨界氣相萃取[26]和采用例如(X)2的超臨界液相萃取(可以通過冷凍干燥進(jìn)行)，氯仿-甲醇溶劑萃取[5，23，27]。理想的是，純化角鯊烯的純度高于97%純(重量)，更好的是，高于98%、 99%,99. 5%,99. 9%,99. 99%,甚至100%純。理想的是，純化角鯊烯中的PCB/ 二惡英含量低于每克角鯊烯6153pg，此為毒性當(dāng)量(TEQ)。TEQ能用一個數(shù)字來表示PCB類/ 二惡英混合物的毒性。每種PCB (多氯聯(lián)苯)的毒性表示為相對于2，3，7，8-TCDD 二惡英毒性(設(shè)為參比值1)的分?jǐn)?shù)(毒性當(dāng)量因子，TEF ;WH0 2005)。要計(jì)算一個混合物的總TEQ，將每一 PCB的質(zhì)量乘以其TEF，然后將所得值加和得到TEQ。例如，角鯊烯中的二惡英/PCB含量低于 5000pg/g、4000pg/g、3000pg/g、2000pg/g、1000pg/g、500pg/g、100pg/g、50pg/g (TEQ)。由酵母中純化得到角鯊烯后，其可用于制造藥物、水包油乳液佐劑等下游產(chǎn)品。水包油乳液水包油乳液尤其適合用作疫苗的佐劑。本發(fā)明制備的乳液除包含水性組分之外還含有角鯊烯和至少一種表面活性劑。本發(fā)明乳液還可含有其它油類。理想的是，所述油類和表面活性劑是可生物降解(代謝)且生物相容的?？刹捎媒酋徬┡c生育酚的油性組合物。對于含生育酚的組合物，α、β、γ、δ、ε 或ξ生育酚均可使用，優(yōu)選的是α-生育酚。生育酚可以是多種形式的，例如不同的鹽和/ 或異構(gòu)體。所述鹽包括有機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。D- α -生育酚和DL- α -生育酚均可采用。優(yōu)選的α -生育酚是DL- α -生育酚。油含量一般為2-20%體積)。乳液中油滴的直徑一般小于5 μ m，甚至可以是亞微米的，用微流化機(jī)即可達(dá)到如此小的粒徑并獲得穩(wěn)定的乳液。優(yōu)選小于220nm的油滴，因?yàn)樗鼈兡軌蛲ㄟ^除菌過濾。表面活性劑可根據(jù)其‘HLB’ (親水性/親脂性平衡)來分類。本發(fā)明優(yōu)選表面活性劑的HLB至少為10，優(yōu)選至少15，至少16更好。本發(fā)明可用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇酐酯類表面活性劑(通常稱為Tweens)，具體例如聚山梨醇酯 20(polysorbate 20)和聚山梨醇酯 80 (polysorbate 80)；環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO) 和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚醚，商品名為D0WFAX ，例如線性Ε0/Ρ0嵌段共聚醚；辛苯聚醇， 乙氧基(氧-1，2-乙二基)重復(fù)數(shù)各自不同，重要的有辛苯聚醇-9(Trit0n X-100，或異辛基苯基聚氧乙烯醚)；辛基苯基聚氧乙烯醚(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂類，例如磷酯膽堿(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如Tergitol NP系列；月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的脂肪醇聚氧乙烯醚(即Brij表面活性劑)，例如三聚乙二醇單月桂醚(Brij 30)；脫水山梨酸酯(即SPANs)，例如脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和山梨醇酐單月桂酸酯。優(yōu)選非離子表面活性劑。本發(fā)明乳液中的表面活性劑最好是聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯；Tween 80)?？梢圆捎帽砻婊钚詣┗旌衔?，例如Tween 80/Span 85混合物。適合的還有聚氧乙烯山梨醇酐酯與辛苯聚醇組合。另一個有用的組合含月桂醇聚醚-9(laUreth 9)加聚氧乙烯山梨醇酐酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑(％重量)優(yōu)選含量是聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(例如Tween 80)， 0. 01-2% ；辛基或壬基苯基聚氧乙烯醚(例如Triton X-100或其它1Triton系列除垢劑)， 0. 001-0. 1% ；聚氧乙烯醚(例如桂醇聚醚_9)，0. 1-20%。優(yōu)選含有聚山梨醇酯80的含角鯊烯水包油乳液?？捎帽景l(fā)明純化的角鯊烯制備的具體的水包油乳液佐劑包括但不限于 角鯊烯，聚山梨醇酯80和脫水山梨糖醇三油酸酯的亞微米乳液。按體積計(jì)，該組合物可含約5%角鯊烯，約0.5%聚山梨醇酯80和約0.5% Span 85。按重量計(jì)則為4. 3% 角鯊烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.48% Span 85。該佐劑稱為‘MF59，[28-30]，參考文獻(xiàn) 31第10章和參考文獻(xiàn)32第12章對其有詳細(xì)描述。較好的是，MF59乳液含有檸檬酸根離子，例如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 角鯊烯，生育酚和聚山梨醇酯80的亞微米乳液。此類乳液含2-10%角鯊烯， 2-10%生育酚和0. 3-3%聚山梨醇酯80，角鯊烯生育酚的重量比< 1(例如0. 90)為宜， 這樣，乳液更穩(wěn)定。角鯊烯與聚山梨醇酯80的體積比可以是約5 2，重量比約11 5。此類乳液可如下制備將Tween 80溶于PBS制成2%溶液，將90ml該溶液與(5g DL-α -生育酚和5ml角鯊烯)混合物混合，然后將該混合物微流化。所得乳液含亞微米油滴，例如平均直徑100-250nm之間，約180nm為佳。該乳液還可包含3-脫氧-乙酰單磷酰酯A (3d_MPL)。 另一種有用的此型乳液包含，按每次人用劑量計(jì)，0. 5-10mg角鯊烯，0. 5-1 Img生育酚和 0. Hmg聚山梨醇酯80 [33]?！そ酋徬?，生育酚和Triton除垢劑(例如"Triton X-100)的乳液。該乳液還可包含3d-MPL(見下文)。該乳液可含磷酸鹽緩沖液。·包含角鯊烯，水性溶劑，聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯(1 鯨蠟醇醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如脫水山梨醇酯或二縮甘露醇酯，例如山梨醇酐單油酸酯或‘Span 80’)的乳液。較好的是，該乳液是熱可逆型的，并且/或者，至少90% (體積)的油滴小于200nm[34]。該乳液還可包含一種或多種以下物質(zhì)醛醇，冷凍保護(hù)劑(例如糖，例如十二烷基麥芽糖苷(dodecylmaltoside)和/或蔗糖)，和/或烷基多糖苷。該乳液可包括TLR4激動劑[35]。該乳液可冷凍干燥。 角鯊烯，泊洛沙姆105(poloxamer 105)和Abil-Care[36]的乳液。在含佐劑疫苗中，這些組分的最終濃度(重量)為5%角鯊烯，4%泊洛沙姆105(復(fù)合多元醇(pluronic polyol))和 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 聚二甲基硅氧燒；辛
酸/癸酸三酸甘油酯)?？梢栽诮o藥時或者在疫苗生產(chǎn)過程中現(xiàn)場將本發(fā)明乳液與含抗原組分混合。如果這兩種組分都是液體，兩者的體積比是可變的，例如可以是5 1至1 5，但通常約為
1 Io因此，本發(fā)明的方法還可以包括將本發(fā)明乳液與免疫原混合的步驟。本發(fā)明的方法還可包括包裝乳液或乳液/免疫原混合物的步驟?？蓪凑毡景l(fā)明制備的乳液裝入試劑盒內(nèi)的第一容器內(nèi)，該試劑盒還包括裝有免疫原的第二容器?？蓪⑦@兩個容器內(nèi)的物質(zhì)混合后給予受主(例如人)，也可以分開的方式聯(lián)合給藥。總則“包含”涵蓋“包括”以及“由...構(gòu)成”，例如某組合物“包含” X表示該組合物可能僅由X構(gòu)成，或者還含有其他物質(zhì)，例如X+Y。就數(shù)值而言，“約”是可選的，表示，例如，x+10%。本發(fā)明的實(shí)施方式用基因工程技術(shù)制備了多種突變酵母菌。這些突變株或者過表達(dá)或者低表達(dá)參與角鯊烯代謝的酶。其中之一是酵母菌株ATC1551，見參考文獻(xiàn)11，該菌株在適宜培養(yǎng)條件下的角鯊烯產(chǎn)率可高達(dá)16% cdw。培養(yǎng)完成后，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用玻璃珠研磨機(jī)破碎細(xì)胞。用O 1)氯仿-甲醇溶劑萃取來純化角鯊烯，或者，為了提高產(chǎn)率，可以采用參考文獻(xiàn)5的方法，冷凍干燥后進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取。由此得到高純度(> 95% )的角鯊烯。將所得純化角鯊烯與Tween 80與Span 85表面活性劑的混合物以及檸檬酸鹽緩沖液混合，制成含5%角鯊烯、0.5% Tween 80和0.5% Span 85 (體積)的混合物。將該混合物微流化，制成平均液滴小于500nm的乳液。該乳液即‘MF59’，可用作疫苗佐劑。以上所說僅是舉例，本發(fā)明的范圍和主旨包含各種修改和調(diào)整。參考文獻(xiàn)[I]Borucinska & Frasca (2002) J Fish Diseases (魚類疾病雜志)25 :287-98[2]Bertone 等(1996) J Fish Diseases (魚類疾病雜志)19 :429-34[3]Briones 等(1998) J Vet Med B (獸醫(yī)系列雜志 B 系列)45 :443-5[4]Blagovic 等，(2001)Food technol Biotechnol (食品技術(shù)與生物技術(shù))，39 175-81[5] Bhattachar jee 等(2003) World Journal of Micorbiology 禾口 Biotechnology (世界微生物與生物技術(shù)雜志)，19 =605-608[6]Boeke 等，(1984)Mol. Gen. Genet.(分子·基因·遺傳)，197 :345-346[7]Sherman 等，(1986)Methods 和 Yeast Genetics (方法和酵母遺傳學(xué))，Cold SpringHarbor Laboratory, ^MMitl[8]Germann 等 Q005)J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)28O :35904_13[9] Veen 等 O003)FEMS Yeast Research (FEMS 酵母研究)4 :87-95[10]Sambrook, J. ， Fritsch, E. F. & Maniatis， T (1989), Molecular cloning :a laboratorymanual (分子克隆手冊),Cold Spring Harbor 出版社，Cold Spring Harbor[11]美國專利 M60949[12]Polakowski 等(1998)Appl Microbiol Biotechnol (應(yīng)用微生物學(xué)會生物技術(shù))49(1) 66-71[13] Pasrija 等(2005) J Antimicrob Chemother (抗生素和化療藥雜志)55 (6) 905-13[14] Performance of the Third 50 Completed ATP Pro jects (第三次 50 完全ATP 計(jì)劃結(jié)果 M2OO6) NIST SP 950-4，pages 59-62[15]Gachotte 等(1999)PNAS USA 96 :12655-60[16]Ness 等(1998) J Bacteriol (細(xì)菌學(xué)雜志)· 180 (7) :1913-9[17] Ryder 等(1985) Biochem J.(生物化學(xué)雜志)230 :765-770[18] Leber 等(2001) European Journal of Biochemistiy (歐洲生物化學(xué)雜志)268 :914-924[19] Sanati 等(I997)Antimicrob Agents Chemother (抗生素和化療藥雜志).41 (11) :2492-6[20] Kuchta 等(1997) FEMS Microbiol Lett (FEMS 微生物學(xué)雜志)150 :43-7[21] Ryder 等(1986) Antimicrob Agents Chemother (抗生素和化療藥雜志)20 858-60[22]Nishikawa 等(1978)Biochim Biophys Acta(生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào))531(1) 86-95[23]Bhattacharjee 等，(2001)fforld Journal of Micorbiology 禾口 Biotechnology (世界微生物與生物技術(shù)雜志)，17 =811-816[24]Jahnke & Klein(1983)J Bacteroil 155 :488-92[25] Valero 等 O001)J Bioscience Bioengin (生命科學(xué)和生物工程雜志)92 33-8[26]W094/26683[27]Foch 等，(1957) Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)，2 : 497-509[28]W090/14837[29] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines (疫苗專家評述)2 : 197-203[30]Podda QOOl) Vaccine (疫苗)19 :2673-2680[31]Vaccine Design :The Subunit 禾口 Adjuvant Approach(疫苗設(shè)計(jì)亞基與佐劑)(eds. Powell & Newman)Plenum 出版社 1995(ISBN 0-306-44867-X)[32] Vaccine Adjuvants preparation Methods 禾口 Research Protocols (疫苗佐劑制備方法和研究規(guī)程)(Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series(分子藥學(xué)方法系列第 42 卷))ISBN :1-59259-083-7. Ed. 0' Hagan[33]W02008/043774[34]US-2007/0014805[35]US-2007/0191314[36] SuIi ^ (2004) Vaccine (疫苗)22(25-26) :3464-9
權(quán)利要求
1.一種制備含角鯊烯產(chǎn)品的方法，包括以下步驟(a)獲取業(yè)已從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化的角鯊烯；和(b)將步驟(a)的角鯊烯與非角鯊烯組分組合形成含角鯊烯的產(chǎn)品。
2.一種制備水包油乳液的方法，包括以下步驟(a)純化來自于培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母的角鯊烯；和(b)將步驟(a)純化的角鯊烯與水性組分組合形成水包油乳液。
3.一種制備水包油乳液的方法，包括以下步驟(a)獲取業(yè)已從培養(yǎng)期間高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的酵母中純化的角鯊烯；和(b)將步驟(a)純化的角鯊烯與水性組分組合形成水包油乳液。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母生產(chǎn)角鯊烯的產(chǎn)率為>5% 細(xì)胞干重。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母是釀酒酵母屬 (Saccharomyces)的，例如是酸酒酵母(S. cerevisiae)。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母表達(dá)聚集于胞漿的截短HMGR酶。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母是經(jīng)過改造的菌株，其相比未經(jīng)改造的親本株超表達(dá)HMGR。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母是經(jīng)過改造的菌株，其相比未經(jīng)改造的親本株低表達(dá)酵母留醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或麥角留-5,7,24( )-三烯甘油酯-22-脫氫酶。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母表達(dá)突變氧化鯊烯環(huán)化酶。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酵母具有被破壞的角鯊烯環(huán)氧酶。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在能夠提高培養(yǎng)期間角鯊烯產(chǎn)率的因子存在下培養(yǎng)所述酵母。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述因子是烯丙胺，伏力康唑，6-氨基-2-正-戊基硫代苯并噻唑，硫胺或硫代氨基甲酸酯或鹽。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在角鯊烯純化之前，在部分無氧或完全無氧的條件下培養(yǎng)所述酵母。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在不含動物來源產(chǎn)物的調(diào)配培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述酵母。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述角鯊烯純度高于97%(重量)。
16.如權(quán)利要求2至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水包油乳液含亞微米直徑的油滴。
17.如權(quán)利要求2至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水包油乳液是微流化的乳液。
18.如權(quán)利要求2至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水包油乳液含角鯊烯和聚山梨醇酯80。
19.一種制備免疫原性組合物的方法，包括按照權(quán)利要求3至19中任一項(xiàng)所述的方法制備水包油乳液，將所得乳液與免疫原混合。
20.一種制備用于制備免疫原性組合物的試劑盒的方法，包括按照權(quán)利要求3至19中任一項(xiàng)所述的方法制備水包油乳液，將所得乳液裝入第一容器，將該第一容器與含有免疫原的第二容器組合成試劑盒。
21.一種提高哺乳動物免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述哺乳動物按照權(quán)利要求19所述方法制備的免疫原性組合物，或使用權(quán)利要求20所述的試劑盒。
22.—種制備純化角鯊烯的方法，包括以下步驟(a)在能使酵母高產(chǎn)率生產(chǎn)角鯊烯的條件下培養(yǎng)酵母；(b)從培養(yǎng)的酵母中純化角鯊烯，所得角鯊烯純度> 97%重量。
全文摘要
一種制備純化酵母的方法，其中，超量生產(chǎn)角鯊烯的酵母是角鯊烯源。角鯊烯是一種有用的制藥原料。例如，它可用來制備水包油乳液，而這樣的乳液尤其適合用作免疫佐劑。
文檔編號C12P5/02GK102257149SQ200980139111
公開日2011年11月23日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者M·布魯克 申請人:諾華有限公司