專利名稱：培養(yǎng)細(xì)胞的方法
培養(yǎng)細(xì)胞的方法本發(fā)明涉及培養(yǎng)保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞的方法。干細(xì)胞和具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞在許多治療領(lǐng)域越來越被關(guān)注。這樣的細(xì)胞一般通過培養(yǎng)錨定在固相支持培養(yǎng)基上的細(xì)胞來產(chǎn)生。小鼠胚胎干細(xì)胞已經(jīng)顯示了在Sigma SoloHill (纖連蛋白包被的聚苯乙烯)和Cytodex 3 (膠原蛋白)微載體上在攪動(dòng)的懸浮培養(yǎng)物中生長。(i^ok EY et al, Stem Cells 2005, 23 (9): 1333-42)。豬的骨髓衍生的原代間質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)顯示了在Cytodex 1、2和3型(膠原蛋白)微載體上生長(Frauschuh S et al, Biotechnol Prog. 2007，23 (1): 187-193)。貓的胚胎肺成纖維細(xì)胞已經(jīng)顯示在波浪和攪動(dòng)罐生物反應(yīng)器中在Cytodex 1上生長(Hundt B et al, Vaccine 2007, 25(10): 3987-95)。小鼠胚胎干細(xì)胞也顯示了在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在Cytodex 3微載體上生長(Abranches E et al, Biotechnol Bioeng. 2007, 96 (6): 1211-21)。在產(chǎn)生本發(fā)明的研究期間，發(fā)現(xiàn)的是，這樣的微載體受到許多缺陷的困擾，使得它們不適合于保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞的可靠的和可規(guī)?；纳a(chǎn)。US2007/0264713公開了，可以采用許多不同的微載體來生長許多不同類型的干細(xì)胞。在人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)中舉例了明膠微載體以及膠原蛋白微載體。結(jié)果顯示了， 膠原蛋白微載體得到了為明膠微載體三倍大的細(xì)胞增加。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了培養(yǎng)保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞的方法，其包括培養(yǎng)錨定在微載體上的保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞，所述微載體選自由明膠微載體和季銨衍生化的聚苯乙烯微載體構(gòu)成的組。所述細(xì)胞通過本領(lǐng)域已知的方法錨定在所述微載體上，例如，包括通過附著到微載體的表面，通過附著到大孔微載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，或通過在大孔微載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)之內(nèi)的物理俘獲。可以在本發(fā)明的方法中采用的明膠微載體可以由明膠顆粒、交聯(lián)的明膠顆?；蛴米鬏d體材料上的包被物的明膠組成，所述載體材料例如聚苯乙烯或玻璃顆粒。明膠可以是天然來源的，或是重組地或合成地生產(chǎn)的。明膠或膠原蛋白可以通過賴氨酸的胺基基團(tuán)、通過谷氨酸或天冬氨酸的羧基基團(tuán)、或其組合來交聯(lián)。明膠微載體一般是近似球形的，但可以具有其他形狀，可以是多孔的或?qū)嵭牡?。多孔的和?shí)心型的微載體都是商業(yè)上可獲得的。微載體可以具有帶有凹痕的密實(shí)表面以便于細(xì)胞的錨定。例如，大孔明膠微載體可從Percell Biolytica AB, Sweden 以商品名稱 Cultispher，特別是 Cultispher G 和 Cultispher S 來獲得。明膠大孔微載體一般包含基于高度交聯(lián)的明膠基質(zhì)的顆粒，常常具有10-500 μπι的顆粒大小，形成包圍了一般具有1-50 μ m直徑的大量空腔的聚合物基質(zhì)。通常選擇微載體的顆粒大小范圍以足夠大來容納干細(xì)胞的錨定，而又足夠小以形成具有適用于細(xì)胞培養(yǎng)物生物反應(yīng)器的性質(zhì)的懸浮物，所述生物反應(yīng)器例如搖瓶、滾瓶、旋轉(zhuǎn)燒瓶、波浪(wave)生物反應(yīng)器和攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)。可以在本發(fā)明中采用的季銨衍生化的聚苯乙烯微載體包含附著于聚苯乙烯的氨基基團(tuán)，所述氨基基團(tuán)被季銨化，優(yōu)選的通過三個(gè)烷基基團(tuán)，特別是三個(gè)CV4烷基基團(tuán)。這樣的微載體的實(shí)例包括 HyQSphere HLXl 1-170，可從 Hyclone/ThermoFisher ScientificInc.商業(yè)上獲得。明膠微載體特別適合于一些應(yīng)用，其中細(xì)胞在不同批次的微載體上培養(yǎng)，其中細(xì)胞在第一批次的微載體上培養(yǎng)，然后擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，收獲細(xì)胞并且然后任選地在保存一段時(shí)間之后，例如，在冷凍器中保存后，再次附著到微載體，一般是更大批量的微載體上，或總和起來更大數(shù)量微載體的多個(gè)培養(yǎng)器上。這樣的培養(yǎng)-收獲和再附著可以按照生產(chǎn)期望數(shù)量的細(xì)胞所需的頻繁度來重復(fù)。明膠微載體可以用作起始的微載體或用作隨后的微載體， 或可選擇的微載體，特別是季銨衍生化的聚苯乙烯微載體，可以被采用作為起始微載體，隨后收獲后的再附著為到明膠微載體。季銨衍生化的聚苯乙烯微載體適合于一些應(yīng)用，其中細(xì)胞接種到微載體上和在該微載體上培養(yǎng)直到收獲，沒有分離和再附著，或作為起始微載體，帶有隨后的收獲和對(duì)明膠微載體的再附著。另外，季銨衍生化的聚苯乙烯微載體可以被采用作為最終的微載體，其他微載體被采用用于較早的培養(yǎng)步驟?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法生產(chǎn)的保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的，優(yōu)選地是成體細(xì)胞，特別是間充質(zhì)細(xì)胞，最優(yōu)選地是真皮細(xì)胞，包括adiposyte細(xì)胞。 特別優(yōu)選的細(xì)胞包括真皮鞘細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞，特別是EP-A-0980270 中描述的真皮鞘細(xì)胞，US5851831中描述的真皮乳頭細(xì)胞，最特別地是共同待決英國專利申 it no. 0913469. 3 中描述的真皮纖維形成細(xì)胞(dermal fibroplast cells)。根據(jù)本發(fā)明方法可以在本領(lǐng)域已知的容器中進(jìn)行，包括組織培養(yǎng)燒瓶、搖瓶、旋轉(zhuǎn)燒瓶、攪拌罐生物反應(yīng)器、基于可棄袋的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，例如波浪細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)，和膨脹床生物反應(yīng)器系統(tǒng)。大規(guī)模生產(chǎn)的選項(xiàng)還包括滾瓶、空心纖維系統(tǒng)、單片、多片或堆疊的平板培養(yǎng)系統(tǒng)和單元立方體。本發(fā)明的方法通常通過在攪拌罐培養(yǎng)容器系統(tǒng)中培養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行。一般地，細(xì)胞、 微載體和營養(yǎng)培養(yǎng)基被提供給培養(yǎng)容器，并在有助于細(xì)胞增殖的條件下保存。如果期望， 其他的培養(yǎng)培養(yǎng)基可以添加到培養(yǎng)容器系統(tǒng)，直到培養(yǎng)最后終止和收獲細(xì)胞。本發(fā)明的方法通過在有助于細(xì)胞生長同時(shí)保持細(xì)胞的干細(xì)胞潛能的條件下培養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行。培養(yǎng)物條件，例如，溫度、PH值、溶解氧(包括低氧條件)等等，是已知對(duì)特定細(xì)胞最佳的那些條件， 對(duì)于技術(shù)人員是顯而易見的(參見，例如，Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed. , Rickwood, D. and Hames, B. D. , eds. , Oxford University Press, New York (1992))。一般地，細(xì)胞在約中性pH的pH值下，通常在6. 5到7. 5的范圍內(nèi)，以及在約30 到38°C的范圍內(nèi)的溫度下培養(yǎng)。在本發(fā)明的某些方面中，細(xì)胞在用攪拌器攪動(dòng)的容器中培養(yǎng)，所述攪拌器包含位于培養(yǎng)容器內(nèi)不同深度的兩個(gè)或更多個(gè)葉輪，通常為旋轉(zhuǎn)攪拌子(stirrer)。優(yōu)選的，所述葉輪在共同的軸周圍固定。在采用兩個(gè)葉輪時(shí)，一個(gè)葉輪優(yōu)選地位于接近培養(yǎng)容器中培養(yǎng)基的底部，例如，在容器的下三分之一處內(nèi)，第二葉輪位于接近容器中培養(yǎng)基的中部，例如， 在中間三分之一內(nèi)，或接近容器中培養(yǎng)基的頂部，例如在上三分之一處內(nèi)。在許多實(shí)施方式中，每個(gè)葉輪包含兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)葉片，其相對(duì)葉輪軸的軸線成角度，例如螺旋槳型葉片。優(yōu)選的，其中旋轉(zhuǎn)的攪拌子被用作葉輪，選擇攪拌子以使攪拌子直徑容器直徑比為至少0. 25 :1，例如，在0. 3 :1到0.7 1的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的其他方面中，細(xì)胞在用攪拌器攪動(dòng)的容器中培養(yǎng)，所述攪拌器包含至少一個(gè)螺旋葉片，優(yōu)選的如國際專利申請(qǐng)W000/66258中描述的螺旋攪拌子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法在一個(gè)培養(yǎng)容器中運(yùn)行，細(xì)胞直接接種到含有微載體的培養(yǎng)容器內(nèi)，增殖細(xì)胞，直到達(dá)到期望的細(xì)胞密度和收獲細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法在至少兩個(gè)不同的細(xì)胞培養(yǎng)物容器中運(yùn)行。培養(yǎng)可以在一個(gè)或更多個(gè)種子擴(kuò)增容器中發(fā)生，隨后在細(xì)胞生產(chǎn)容器中培養(yǎng)，從其中可以收獲細(xì)胞產(chǎn)物。多個(gè)種子擴(kuò)增方法可以在大小遞增的培養(yǎng)容器中進(jìn)行，直到獲得用于最終生產(chǎn)性細(xì)胞培養(yǎng)容器接種的足夠數(shù)量的細(xì)胞。種子擴(kuò)增培養(yǎng)容器可以是相同類型的(例如，組織培養(yǎng)燒瓶、搖瓶、滾瓶、旋轉(zhuǎn)燒瓶、波浪生物反應(yīng)器、攪拌罐生物反應(yīng)器)，但是隨著種子擴(kuò)增進(jìn)展而大小遞增，或可以是大小遞增的培養(yǎng)系統(tǒng)的混合，隨著種子培養(yǎng)物被擴(kuò)增準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)生物反應(yīng)器(例如，組織培養(yǎng)燒瓶到搖瓶到旋轉(zhuǎn)燒瓶到攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)，等等)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方面，設(shè)計(jì)進(jìn)料分批或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)條件來增強(qiáng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中的生長。培養(yǎng)條件，例如，溫度、PH值、溶解氧(d02)等等，是特定細(xì)胞使用的那些，對(duì)于普通技術(shù)人員將是顯而易見的。一般地，利用酸(例如，CO2)或堿(例如，Na2CO3或NaOH)將 PH值調(diào)整到約6. 5和7. 5之間的水平。培養(yǎng)細(xì)胞的適合的溫度范圍常常在約30°C到38°C 之間，適合的(1 常常是5-90%的空氣飽和度之間。細(xì)胞可以利用本領(lǐng)域已知的方法從明膠微載體上釋放，其限制了在細(xì)胞回收方法期間對(duì)細(xì)胞收獲物的潛在損傷。細(xì)胞通常借助于蛋白裂解酶，例如，膠原酶從明膠微載體上釋放。在細(xì)胞生長的終止之后，在希望時(shí)，使用這樣的蛋白裂解酶從載體上釋放細(xì)胞。通過容許微載體沉積到細(xì)胞培養(yǎng)容器底部，之后除去選定百分比的細(xì)胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基體積，添加相應(yīng)百分比的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)容器，可以進(jìn)行培養(yǎng)基交換。微載體然后重懸浮在培養(yǎng)基中，一般地重復(fù)這種培養(yǎng)基去除和替換的方法。各種術(shù)語被用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！凹?xì)胞培養(yǎng)物”一般是指取自活的有機(jī)體、并且在控制的條件下生長的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)物是在第一次傳代培養(yǎng)之前直接取自有機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官的培養(yǎng)物。當(dāng)細(xì)胞置于在一定條件下的生長培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增，所述條件促進(jìn)生長和/或分裂，產(chǎn)生更大的細(xì)胞群體。細(xì)胞系是通過原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一次或更多次傳代培養(yǎng)形成的細(xì)胞的群體。每一輪傳代培養(yǎng)被稱為一次傳代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的是，在傳代期間可以有多次群體倍增。適用于本發(fā)明的方法的培養(yǎng)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的，包括，補(bǔ)充有血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基或化學(xué)成分確知的生長培養(yǎng)基?？梢允褂谩皸l件”培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)了特定的細(xì)胞或細(xì)胞群體，然后被去除。當(dāng)這些細(xì)胞被培養(yǎng)在培養(yǎng)基中時(shí)，它們分泌可為其他細(xì)胞提供支持的細(xì)胞因子。含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。用于條件化培養(yǎng)基的細(xì)胞可以是與隨后培養(yǎng)的細(xì)胞相同類型的，不同的細(xì)胞類型，或兩者的組合。通過以下實(shí)施例非限制性地說明本發(fā)明。細(xì)胞系的建立
基本上如EP980270中描述的分離毛囊間充質(zhì)細(xì)胞，具有以下描述的修改。人類皮膚組織樣品用含有1 μ g/ml兩性霉素和10 μ g/ml慶大霉素的最低必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma) 洗滌3次。在解剖顯微鏡下，毛發(fā)生長初期(anagen) “末端球”利用精細(xì)手術(shù)剪解剖，置入小體積(一般100-200 μ 1)的MEM中。球的末端用針頭翻轉(zhuǎn)，解剖乳突，提取鞘。乳突和鞘然后單獨(dú)地轉(zhuǎn)移到4孔細(xì)胞培養(yǎng)物平板(Nunc)。在補(bǔ)充有20%胎兒牛血清、0. 5μ g/ml兩性霉素和5 μ g/ml慶大霉素的1 ml MEM中每個(gè)反應(yīng)孔轉(zhuǎn)移十個(gè)乳突和10個(gè)鞘。四孔細(xì)胞培養(yǎng)物平板在無菌的和標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C，5% 二氧化碳)下孵育。在10天的細(xì)胞生長之后，從每個(gè)反應(yīng)孔分離細(xì)胞(利用本領(lǐng)域良好地建立的標(biāo)準(zhǔn)方法)，單獨(dú)地轉(zhuǎn)移到35 mm直徑細(xì)胞培養(yǎng)物平皿(Nunc)中。當(dāng)細(xì)胞生長匯合時(shí)，真皮鞘(以下稱為“AVDS”)和真皮乳頭(以下稱為“AVDP”)細(xì)胞系如早先描述的分離，轉(zhuǎn)移到T25細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶(Nunc)用于在如上所述的條件下進(jìn)一步擴(kuò)增。AVDS和AVDP細(xì)胞系從許多不同的人類組織樣品建立。在以下實(shí)施例中描述的這些細(xì)胞系的概述在下文的表1中提供。真皮成纖維細(xì)胞系的建立
真皮成纖維細(xì)胞(以下稱為“AVDF”)細(xì)胞系從如上所述相同的人類皮膚組織樣品建立。 從脂肪層分離真皮，然后在顯微鏡下解剖成大約2-3 mm2表面積的碎片。解剖的組織轉(zhuǎn)移到 T25細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶(Nunc)，所述燒瓶含有如對(duì)真皮鞘和真皮乳頭細(xì)胞系描述的補(bǔ)充的MEM。 含有真皮成纖維細(xì)胞(AVDF)細(xì)胞系的T25細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶在無菌的和標(biāo)準(zhǔn)條件(如早先描述的)下孵育。真皮成纖維細(xì)胞(AVDF)細(xì)胞系然后使用在培養(yǎng)物達(dá)到匯合時(shí)相同的條件來進(jìn)一步擴(kuò)增。AVDF細(xì)胞系從許多不同的人類組織樣品建立。在以下實(shí)施例中描述的這些細(xì)胞系的概述在下文的表1中提供。表1 細(xì)胞系的概述
權(quán)利要求
1.一種用于保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞的培養(yǎng)的方法，其包括培養(yǎng)錨定到微載體的保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞，所述微載體選自由明膠微載體和季銨衍生化的聚苯乙烯微載體構(gòu)成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是成體細(xì)胞，優(yōu)選的是間充質(zhì)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞是真皮細(xì)胞，優(yōu)選真皮鞘細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞或真皮乳頭細(xì)胞。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述培養(yǎng)方法包括細(xì)胞的培養(yǎng)、所述細(xì)胞的收獲以及用于進(jìn)一步培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)微載體的重附著。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在整個(gè)所述培養(yǎng)方法中采用明膠微載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中作為起始或最終的微載體采用季銨衍生化的聚苯乙烯微載體。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其利用進(jìn)料分批或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)條件來操作。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述培養(yǎng)容器用圍繞共同的軸固定的兩個(gè)或更多個(gè)葉輪攪動(dòng)，至少一個(gè)葉輪位于所述培養(yǎng)容器中培養(yǎng)基的下三分之一內(nèi)，至少一個(gè)葉輪位于所述容器中培養(yǎng)基的中間三分之一內(nèi)，或所述容器中培養(yǎng)基的上三分之一內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中每個(gè)葉輪包含相對(duì)于所述葉輪軸的軸線成角度的兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)葉片。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述葉輪具有至少0.25:1，例如，在0.3 :1到 0. 7 1的范圍內(nèi)的直徑容器直徑比例。
全文摘要
提供了用于保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞的培養(yǎng)的方法。所述方法包括培養(yǎng)錨定到微載體的保持了干細(xì)胞潛能的分化的人類細(xì)胞，所述微載體選自由明膠微載體和季銨衍生化的聚苯乙烯微載體構(gòu)成的組。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102171333SQ200980139345
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者A·奈特, B·V·卡拉, R·Y·博迪 申請(qǐng)人:富士膠片戴奧辛思生物技術(shù)英國有限公司