專利名稱：寡核苷酸檢測(cè)方法
寡核苷酸檢測(cè)方法本發(fā)明涉及檢測(cè)寡核苷酸的新的簡(jiǎn)單方法，所述的寡核苷酸包括RNA、DNA和混合寡核苷酸、反義寡核苷酸、短干擾RNA(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、適體和鏡像體 (spiegelmer)。此外，本發(fā)明涉及在單個(gè)測(cè)定中同時(shí)檢測(cè)雙鏈寡核苷酸兩條鏈的方法，例如用于siRNA。已知序列的寡核苷酸普遍地用于各種化學(xué)和生物應(yīng)用中，并且在疾病的診斷和治療中起著重要的作用。具體地，反義寡核苷酸、短干擾RNA(SiRNA)和適體是有希望的醫(yī)藥工具和治療劑。對(duì)例如細(xì)胞、組織或血漿等樣本中的這些寡核苷酸的定性和定量檢測(cè)是評(píng)估它們的治療用途以及監(jiān)測(cè)它們體內(nèi)穩(wěn)定性的前提。文獻(xiàn)中引證了檢測(cè)寡核苷酸的不同方法，并且在公開的專利申請(qǐng)中也公開了這類方法，例如W0/2008/046645。許多已建立的定量和定性的寡核苷酸檢測(cè)方法均基于與互補(bǔ)寡核苷酸通過Watson-Crick堿基對(duì)的雜交。肽核酸(PNA)是寡核苷酸模擬物，其中通過N-氨乙基甘氨酸單體的假肽鏈置換糖骨架。它們通常用于基于探針的寡核苷酸檢測(cè)方法中，因?yàn)樗鼈円愿哂H和力、特異性和穩(wěn)定性與互補(bǔ)DNA或RNA序列結(jié)合(美國(guó)專利 6，395，474)。W0/2008/046645提及了 PNA探針在基于RT-PCT寡核苷酸檢測(cè)測(cè)試法中的用途。美國(guó)專利6，045，995描述了通過毛細(xì)管凝膠電泳的寡核苷酸定量和定性檢測(cè)。Rossi 等描述了在陰離子高效液相色譜(HPLC)中通過PNA探針對(duì)PCR擴(kuò)增的寡核苷酸的鑒定 (J. Agric. Food Chem. 2007，55，2509-2516)。然而，多數(shù)現(xiàn)存的確定生物樣本中寡核苷酸的測(cè)試法不能檢測(cè)代謝物或不能區(qū)分代謝物信號(hào)和完整寡核苷酸產(chǎn)生的信號(hào)。例如，在基于PCR的方法中，通常僅產(chǎn)生完整藥物的信號(hào)，或作為與完整藥物一起的各種代謝物的總和產(chǎn)生信號(hào)。與熒光檢測(cè)聯(lián)合的毛細(xì)管凝膠電泳導(dǎo)致了完整寡核苷酸與其代謝物的定量分離，但這一方法在樣本制備階段需要提取和脫鹽步驟。此外，分析分子的回收是可變的，并且需要內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)用于標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)前使用的寡核苷酸檢測(cè)方法的另一主要限制是，在一個(gè)檢測(cè)中僅可檢測(cè)兩條鏈中的一條，這對(duì)于寡核苷酸雙鏈(例如，siRNA)檢測(cè)而言尤其不利。因此，擁有能夠分析樣本中的寡核苷酸和其代謝物的檢測(cè)樣本中寡核苷酸的可重復(fù)且快速的方法是非常有利的。而且，考慮到siRNA和其衍生物在治療和診斷中的逐漸升高的重要性，需要有能夠在一次檢測(cè)中檢測(cè)寡核苷酸兩條鏈和其代謝物的可重復(fù)且快速的方法。本發(fā)明公開了定性和定量檢測(cè)寡核苷酸的方法，包括以下步驟選擇含有或懷疑含有所述寡核苷酸的樣本；通過使該樣本與熒光標(biāo)記的肽核酸(PNA)探針接觸形成雜交混合物，其中所述的肽核酸探針與所述寡核苷酸的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)；通過陰離子交換高效液相色譜(alEX-HPLC)將所述寡核苷酸和所述PNA探針形成的雜交部分與未雜交部分分開；以及通過熒光光譜法定性和/或定量檢測(cè)所述雜交部分。本發(fā)明與其他寡核苷酸檢測(cè)方法相比的主要優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)前的簡(jiǎn)單樣本制備，例如，不需要提純步驟、擴(kuò)增或提取步驟。因此，關(guān)于分析物回收的任何可變性均可避免。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在含有 SDS的緩沖液中用蛋白酶K處理樣本，隨后用飽和KCl溶液沉淀SDS。由此有效避免樣本中寡核苷酸的降解。過量的未雜交PNA探針在HPLC的空隙體積(void volume)中洗脫，并且預(yù)期在梯度分離期間沒有來自該探針的干擾信號(hào)。因此，可應(yīng)用高度過量的PNA探針動(dòng)力學(xué)地控制雜交過程，無需建立從樣本中提取過量探針的步驟。PNA探針的應(yīng)用還消除了來自生物基質(zhì)的全部背景熒光，因?yàn)槠渑calEX-HPLC的空隙體積一起洗脫。從PNA探針與來自生物基質(zhì)的RNA或DNA的非特異雜交產(chǎn)生的信號(hào)也在HPLC梯度的洗滌步驟中分別被洗脫。因此，在HPLC梯度期間僅能高度特異地檢測(cè)分析物特異信號(hào)。因此，即使上樣高生物學(xué)背景， alEX-HPLX裝配也能健全地運(yùn)作。由于PNA不帶電的骨架，其顯示出對(duì)相應(yīng)寡核苷酸鏈的高度親和力(沒有如DNA/ DNA、DNA/RNA和RNA/RNA雙鏈體那樣的靜電排斥)，這使得即使存在競(jìng)爭(zhēng)性RNA鏈(例如在siRNA雙鏈體的情況下)，也能熱動(dòng)態(tài)地控制雜交。這一方法與其他方法相比的另一主要改進(jìn)是能夠檢測(cè)代謝物，以及能夠?qū)⒋x物信號(hào)與由完整寡核苷酸產(chǎn)生的信號(hào)相區(qū)分。對(duì)代謝物的更高的分離能力是PNA探針不帶電骨架的另一結(jié)果。洗脫強(qiáng)烈地依賴于代謝物長(zhǎng)度，代謝物越短，其在梯度內(nèi)越早從HPLC柱中洗脫。還能將5’ -磷酸化的寡核苷酸與未磷酸化的相同長(zhǎng)度的同一序列相區(qū)分。由于5’ -磷酸化僅在siRNA遞送至細(xì)胞后發(fā)生，這可用于區(qū)分組織中的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)遞送的siRNA。然后，細(xì)胞內(nèi)5’ -磷酸化的siRNA可用作與遞送至該器官的藥物總量相比較的組織中活性藥物量的標(biāo)記物。本文描述的寡核苷酸檢測(cè)方法的靈敏度和可重復(fù)性對(duì)于模式序列(RD-1003)， 應(yīng)用存量校準(zhǔn)方法(Stock calibration approach)，血漿中的定量下限(LLOQ)為約 250amol寡核苷酸。該測(cè)試法以高可重復(fù)性運(yùn)作(差異< 5% )。本發(fā)明與其他公開的基于HPLC的寡核苷酸定量方法相比的主要優(yōu)點(diǎn)是快速和簡(jiǎn)單的樣本制備、檢測(cè)前無需擴(kuò)增步驟、高靈敏度和可重復(fù)性、測(cè)試法的穩(wěn)健性、高通量能力以及在一個(gè)測(cè)試中檢測(cè)寡核苷酸的兩條鏈和其代謝物的能力。Rossi等人描述了在陰離子交換HPLC中鑒定寡核苷酸(J. Agric. Food Chem. 2007，55，2509-2516)。與本發(fā)明相反，在檢測(cè)之前需要額外的樣本制備步驟以及通過PCR擴(kuò)增寡核苷酸。此外，不可能同時(shí)檢測(cè)兩條鏈，因?yàn)殡s交方案需要溶核切割(nucleolytic cleavage)其中的一條鏈。許多之前描述的測(cè)試法需要個(gè)別的校準(zhǔn)曲線，因?yàn)閬碜圆煌M織或血漿的非特異性背景不同。相反，非特異性背景信號(hào)不會(huì)干擾本發(fā)明的測(cè)試法。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，從在緩沖液中系列稀釋產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線可用于組織和血漿樣本。在本發(fā)明方法的另一方面，提供了用于從一個(gè)樣本中平行地定性和定量檢測(cè)寡核苷酸雙鏈體的兩條鏈的方法，其包括以下步驟選擇含有或懷疑含有所述寡核苷酸的樣本； 通過使該樣本與熒光標(biāo)記的肽核酸(PNA)探針接觸形成雜交混合物，其中所述的肽核酸探針與所述寡核苷酸有義鏈的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)；使該雜交混合物與第二熒光標(biāo)記的PNA探針接觸，其中該P(yáng)NA探針與所述寡核苷酸反義鏈的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)；通過alEX-HPLC將所述寡核苷酸和所述PNA探針之間形成的雜交部分與未雜交部分分開；通過熒光光譜法定性和/或定量檢測(cè)所述雜交部分。這是第一個(gè)能夠從一個(gè)樣本中平行檢測(cè)寡核苷酸雙鏈體兩條鏈的方法。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用兩個(gè)熒光標(biāo)記的PNA探針檢測(cè)寡核苷酸二聚體。每一個(gè)探針與該寡核苷酸的有義鏈或反義鏈之一特異性雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用相同的熒光標(biāo)記檢測(cè)兩條鏈。設(shè)計(jì)雙鏈體為具有不同長(zhǎng)度的兩條鏈，或如此設(shè)計(jì)這兩個(gè)探針，這樣使得雜交導(dǎo)致兩條單鏈在alEX-HPLC分析中有不同的保留時(shí)間。在另一實(shí)施方案中，應(yīng)用兩個(gè)不同的熒光標(biāo)記，用于在一個(gè)HPLC配置中用兩個(gè)熒光檢測(cè)器檢測(cè)兩條鏈。這開啟了新的可能性，即不僅能夠從生物樣本中定量，還能夠CMC表征寡核苷酸雙鏈體，例如，作為各鏈峰面積的比例直接表征siRNA雙鏈體中兩條單鏈的比例。信號(hào)強(qiáng)度僅取決于雜交過程后的熒光信號(hào)，并且不依賴于單鏈特異性UV消光系數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將已知濃度的需檢測(cè)寡核苷酸添加至未知樣本中，并且還添加至校準(zhǔn)和空白樣本中。稱為存量校準(zhǔn)方法的這一方法改進(jìn)了該測(cè)試法的靈敏度， 如在實(shí)施例一節(jié)詳細(xì)描述的那樣。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣本是血漿，在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣本是組織。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于定量和定性檢測(cè)SiRNA和其衍生物。在另一實(shí)施方案中，該方法可用于定量和定性檢測(cè)治療或診斷siRNA的體內(nèi)代謝。在一個(gè)實(shí)施方案中，從已轉(zhuǎn)染所述siRNA的體外細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)所述siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于定量和定性檢測(cè)微小RNA和其衍生物。優(yōu)選從組織裂解物中檢查所述微小RNA。在另一實(shí)施方案中，該方法用于定量和定性檢測(cè)適體。優(yōu)選地，所述適體是具有 L-核糖(L-RNA)或L-脫氧核糖(L-DNA)的鏡像體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述適體是聚乙二醇化的。在另一實(shí)施方案中，該方法可用于區(qū)分組織中細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)遞送的siRNA。已描述了許多用于熒光標(biāo)記寡核苷酸的染料。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括Atto 610、 Atto 425和Atto 520，但任一其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的熒光標(biāo)記也可用于本方法中。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒，其適于實(shí)施在樣本中檢測(cè)寡核苷酸和其代謝物的一條鏈或兩條鏈的存在、不存在或數(shù)量的測(cè)試法。本發(fā)明的試劑盒包含隨時(shí)可用的板制備物，其包含一種或多種PNA探針，以及所有其他實(shí)施該測(cè)試法所需的試劑或組分。 試劑盒的使用使測(cè)試法的實(shí)施更簡(jiǎn)單并且改進(jìn)了測(cè)試法的可重復(fù)性。本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒使用了檢測(cè)寡核苷酸的完全自動(dòng)的機(jī)器人系統(tǒng)，其中通過移液管機(jī)械手添加所有的試劑。 由此進(jìn)一步改進(jìn)了該測(cè)試法的可重復(fù)性。此外，這一配置可用于高通量分析不同樣本中的寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒包含96孔板制備物，在另一實(shí)施方案中，該試劑盒包含384孔板制備物。為了方便，以下提供了詳細(xì)說明、實(shí)施例和權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語和短語的含義。如果術(shù)語在這一詳細(xì)說明其他部分的用法與在這一節(jié)提供的其定義之間存在明顯地差異，則以這一節(jié)提供的定義為準(zhǔn)。本文所使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，以及非天然存在的寡核苷酸。非天然存在的寡核苷酸是含有非天然存在的核堿基(nucleobase)序列的寡聚體或多聚體，或含有天然存在的核堿基、糖或糖間連接的功能等價(jià)物的種類，例如適體、鏡像體、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸(LNA)或甘油核酸(GNA)。這一術(shù)語包括含有天然存在的核酸核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的寡聚體，以及含有堿基類似物或經(jīng)修飾的核堿基的寡聚體。 因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語“寡核苷酸”包含但不限于RNA、DNA和混合寡核苷酸、反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、適體以及鏡像體。寡核苷酸可衍生自各種天然來源，諸如病毒、細(xì)菌和真核生物DNA和RNA。其他寡核苷酸可衍生自合成來源，并且包括任何制備用作研究試劑、診斷試劑或潛在和明確的治療劑的多種寡核苷酸。該術(shù)語包括包含單鏈核酸或雙鏈核酸的寡聚體。雙鏈核酸的兩條鏈定義為“有義鏈”和“反義鏈”。本發(fā)明所使用的術(shù)語“包含序列的鏈”是指包含使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法通過所提及的序列描述的核苷酸鏈的寡核苷酸。然而，如本文詳細(xì)描述的那樣，此類“包含序列的鏈”還可包含修飾，例如修飾的核苷酸。除非另外指出，當(dāng)相對(duì)于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時(shí)，本文所使用的術(shù)語“互補(bǔ)”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力，如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的那樣。本文使用的“互補(bǔ)”序列還可包括或完全由非 Watson-Crick堿基對(duì)和/或由非天然或經(jīng)修飾的核苷酸形成的堿基對(duì)形成，只要能滿足它們雜交能力的上述需要即可。這包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)的堿基配對(duì)。本文將此類序列稱為就它們彼此而言的“完全互補(bǔ)”。術(shù)語“雜交部分”是指與PNA探針雜交的任何寡核苷酸或任何其代謝物，而“未雜交部分”是指不與PNA探針雜交的任何寡核苷酸或任何其代謝物。術(shù)語“siRNA”是指能夠以稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守調(diào)控機(jī)制阻斷基因表達(dá)的雙鏈RNA分子。因此，術(shù)語“治療siRNA”是指用作通過阻斷特定疾病或病癥相關(guān)基因的表達(dá)而治療、預(yù)防或管理受試者病癥和疾病的化合物的雙鏈RNA分子。優(yōu)選地，此類受試者是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選為人患者。術(shù)語“寡核苷酸代謝物”包括從其3’和/或5’端缺失了一個(gè)或多個(gè)核苷酸的寡核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸代謝物”還包括任何天然或合成的經(jīng)修飾的寡核苷酸，例如包含磷酸化的3’或5’端的寡核苷酸。還要求保護(hù)上文描述的方法和試劑盒，尤其是參考以下實(shí)施例。提供以下實(shí)施例、 參考文獻(xiàn)、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，其真實(shí)范圍如所附權(quán)利要求所述。應(yīng)當(dāng)理解， 在不背離本發(fā)明精神的情況下，可對(duì)所示方法進(jìn)行修改。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了檢測(cè)siRNA —條鏈的色譜圖。圖2顯示了應(yīng)用具有相同染料的兩個(gè)PNA探針對(duì)兩條鏈的同時(shí)分析。圖3顯示了應(yīng)用具有相同染料的兩個(gè)PNA探針對(duì)兩條鏈的同時(shí)分析的校準(zhǔn)曲線。圖4顯示了應(yīng)用具有不同熒光標(biāo)記的兩個(gè)PNA探針、應(yīng)用兩個(gè)熒光檢測(cè)器檢測(cè)的對(duì)兩條鏈的同時(shí)分析。圖5顯示了藥物代謝物的分離。圖6顯示了檢測(cè)miRNA的色譜圖。圖7顯示了檢測(cè)肺組織中鏡像體的色譜圖。圖8顯示了 3’ -延長(zhǎng)的反義鏈序列對(duì)保留時(shí)間的遷移。圖9顯示了通過更高組織上樣的靈敏度的升高。實(shí)施例實(shí)施例1 通過PNA探針HPLC檢測(cè)GFP-siRNA這一材料和方法部分描述了如何從生物樣本中確定GFP-siRNA的測(cè)試方法。這一方法作微小改變還可用于所有其他可形成Watson-crick堿基對(duì)的寡核苷酸。該方法在單鏈和雙鏈寡核苷酸的情況下允許僅測(cè)定一條鏈，以及允許平行定量來自雙鏈寡核苷酸(例如，siRNA)的兩條鏈。染料探針是熒光標(biāo)記的PNA(肽核酸)鏈，其可與需定量的寡核苷酸的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)(互補(bǔ)定義為完全的Watson-Crick堿基配對(duì))。在干冰上運(yùn)送血漿、血清或組織樣本，并儲(chǔ)存于_80°C直到使用。在分析之前，在冰上解凍血漿樣本，并在65°C通過Epicentre細(xì)胞和組織裂解液中的蛋白酶K處理25分鐘。 為進(jìn)行蛋白酶K處理，將30 μ 1血漿與30 μ 1 Epicentre細(xì)胞和組織裂解液、4 μ 1蛋白酶K 溶液及36 μ 1 H2O混合，至100 μ 1終體積。在冷凍狀態(tài)研磨組織樣本，并將達(dá)IOOmg的冷凍粉末懸浮于lmlEpicentre細(xì)胞和組織裂解液中，用超聲棒處理，并隨后在65°C用蛋白酶K裂解。在HPLC樣本制備步驟中應(yīng)用之前，所有經(jīng)蛋白酶K處理的樣本均用Epicentre細(xì)胞和組織裂解液進(jìn)一步稀釋。在蛋白酶K處理后，將20 μ 1 3Μ KCl溶液添加至2001血漿或組織樣本中，以沉淀 SDS0隨后離心樣本15分鐘，并且上清液進(jìn)一步用于siRNA檢測(cè)。為進(jìn)行雜交，將100 μ 1含有0. 5至250 fmol siRNA的稀釋上清液在96孔PCR板中與靶向反義鏈的5 μ 1 ΙμΜ Atto6 IO-PNA探針溶液混合。添加雜交緩沖液至200 μ 1終體積(如果還需要檢測(cè)siRNA雙鏈體有義鏈的話，則添加至190 μ 1)。封閉板并在PCR儀中在95°C溫育15分鐘。將PCR儀的溫度降低至50°C。若需檢測(cè)siRNA雙鏈體的有義鏈，則將靶向有義鏈的10 μ 1 ΙμΜ Atto425-PNA"探針(或Atto610_PNA-探針)添加到每一孔中，終體積為 200 μ L·在50°C再振蕩15分鐘后，冷卻至室溫，并且將樣本倒入HPLC自動(dòng)采樣器中。在相同的條件下從siRNA系列稀釋產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在寡核苷酸兩條鏈的分析當(dāng)中使用的校準(zhǔn)曲線的代表性色譜圖提供在圖3中。 表1 用于檢測(cè)靶向GFP的siRNA的PNA探針序列
權(quán)利要求
1.檢測(cè)寡核苷酸的方法，其包括以下步驟(a)選擇含有或懷疑含有所述寡核苷酸的樣本；(b)通過使該樣本與熒光標(biāo)記的肽核酸(PNA)探針接觸形成雜交混合物，其中所述的肽核酸探針與所述寡核苷酸的至少10個(gè)或更多個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)；(c)通過陰離子交換高效液相色譜(HPLC)將所述寡核苷酸和所述PNA探針之間形成的雜交部分與未雜交部分分開；以及(d)通過熒光光譜法定性或定量檢測(cè)所述雜交部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于從一個(gè)樣本中平行地檢測(cè)寡核苷酸雙鏈體的兩條鏈， 其包括在步驟(b)之后加入第二熒光標(biāo)記的PNA探針，然后進(jìn)行步驟(c)至(d)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，用于定量或定量分析siRNA和其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，用于定量或定性分析治療性siRNA和其衍生物的體內(nèi)代謝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，用于定量或定性分析胞外和胞內(nèi)遞送的siRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法，其中將已知濃度的需待測(cè)寡核苷酸添加至樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述PNA探針用Atto610、Atto 425或Atto 520標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其中所述樣本是組織或血漿裂解物。
9.用于定性和定量檢測(cè)寡核苷酸的一條鏈或兩條鏈的試劑盒，所述試劑盒由板制備物組成，其中向所述板制備物中添加了根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法的所有組分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述的板制備物是自動(dòng)化的板制備物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述的板制備物是自動(dòng)化的96孔或384孔板制備物。
12.基本上如上文所述，尤其是參考前述實(shí)施例的方法和試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用陰離子交換高效液相色譜檢測(cè)寡核苷酸的方法。使與該寡核苷酸互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的肽核酸寡聚物與該寡核苷酸雜交。然后進(jìn)行陰離子交換高效液相色譜，并檢測(cè)和定量雜交的部分。本發(fā)明還涉及從一個(gè)樣本中平行地同時(shí)檢測(cè)寡核苷酸兩條鏈的方法，以及用于定性和定量檢測(cè)寡核苷酸一條或兩條鏈的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102186993SQ200980141009
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者I·羅爾, M·舒斯特, S·塞福爾特 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司