專利名稱：檢測核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及與檢測核酸有關(guān)的方法和材料。例如，本申請涉及與用限制性內(nèi)切核酸酶的酶促擴(kuò)增級聯(lián)檢測核酸有關(guān)的方法和材料。
2.
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種常用的擴(kuò)增和檢測核酸的技術(shù)。例如，實(shí)時PCR可用于擴(kuò)增和檢測樣品中的少量模板DNA。通常PCR涉及向認(rèn)為含有待擴(kuò)增目標(biāo)核酸的樣品中加入一對核酸引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。使含有引物對和聚合酶的樣品經(jīng)歷熱循環(huán)啟動鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中位于引物之間的目標(biāo)核酸模板指數(shù)擴(kuò)增?？捎媚z電泳等技術(shù)檢測擴(kuò)增的模板是否存在，或擴(kuò)增的模板量可以采用涉及使用熒光標(biāo)記探針的技術(shù)評估。

發(fā)明內(nèi)容
本申請?zhí)峁┝藱z測目標(biāo)核酸的方法和材料。例如，本申請?zhí)峁┝藱z測樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法和材料，檢測樣品中目標(biāo)核酸量的方法和材料，檢測樣品中目標(biāo)核酸存在與否的試劑盒，檢測樣品中存在的目標(biāo)核酸量的試劑盒，以及制備該試劑盒的方法。總的說，本文提供的方法和材料可包括進(jìn)行如本文所述的限制性內(nèi)切核酸酶的酶促擴(kuò)增級聯(lián)，以迅速、低廉、靈敏、特異的方式檢測目標(biāo)核酸。在一些情況下，本文提供的方法和材料能夠補(bǔ)充或代替目前基于PCR的核酸檢測方法。
本文提供的方法和材料能夠讓臨床人員、專業(yè)醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室人員、和研究人員檢測任何類型的目標(biāo)核酸。例如，本文提供的方法和材料能夠用于基因定型應(yīng)用，以檢測核酸突變(例如單核苷酸多態(tài)性(SNP))、基因組重組和基因組表觀遺傳事件(例如DNA甲基化事件)，可用于診斷和預(yù)后應(yīng)用，以檢測病毒或微生物(例如細(xì)菌、真菌、和原生動物)，可用于基因表達(dá)應(yīng)用，以檢測特定細(xì)胞類型中的mRNA水平，還可用于法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，以比較樣品之間的一致性或評估樣品來源。在一些情況下，本文提供的方法和材料可被醫(yī)學(xué)/生物技術(shù)專業(yè)以外的人用于檢測目標(biāo)核酸。例如，本文提供的檢測細(xì)菌(例如大腸桿菌)的試劑盒可以設(shè)計用作家用檢測試劑盒，從而讓使用者能夠檢測其獲得的生物學(xué)樣品(例如血樣、 黏液樣品、或唾液樣品)中大腸桿菌核酸的存在與否 一般說，本發(fā)明的一個方面是一種評估樣品中目標(biāo)核酸的方法。該方法包括或主要由以下組成(a)使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和在下述條件下與所述目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列如果所述目標(biāo)核酸存在于所述樣品中，所述目標(biāo)核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使所述核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，所述限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開所述核酸的雙鏈部分所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述核酸的雙鏈部分，從而使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與所述探針核酸的至少一部分分離；(c)使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與含有核酸雙鏈部分的報道核酸接觸，所述核酸雙鏈部分含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是其中所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述報道核酸，從而使所述報道核酸的一部分與所述報道核酸的至少另一部分分離，和 (d)確定所述報道核酸的所述部分是否存在，其中所述報道核酸的所述部分存在表明所述樣品含有所述目標(biāo)核酸，其中所述報道核酸的所述部分不存在表明所述樣品不含所述目標(biāo)核酸。探針核酸可以是單鏈探針核酸。探針核酸可以結(jié)合在固相載體上。探針核酸可以直接結(jié)合在固相載體上。包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分通過所述步驟(b) 從固相載體上釋放。步驟(a)和步驟(b)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。步驟(a)和步驟(b)在第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟(c)是在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟(a)和步驟(b)是通過將所述樣品加到含有探針核酸和識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。探針核酸包含(i)單鏈部分，單鏈部分含有與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。探針核酸包含第一核酸鏈，其含有與所述目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈的一部分與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一個部分在步驟(b)中分離，探針核酸的部分包含第一核酸鏈的一部分和全部第二鏈。包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟(b)中分離，探針核酸的部分包含目標(biāo)核酸的至少一部分。該方法包括在步驟(a)中使用多個所述探針核酸。該方法包括在步驟(c)中使用多個報道核酸。步驟(c)中的報道核酸相對于來自步驟(b)的含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分摩爾過量。在步驟(b)中與所述探針核酸的至少另一部分分離的含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分的分子數(shù)基本上與所述樣品中存在的所述目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。報道核酸可結(jié)合在固相載體上。報道核酸可直接結(jié)合在固相載體上。報道核酸可包含核酸的單鏈部分。報道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。與報道核酸的所述至少另一部分分離的報道核酸的部分可包含所述標(biāo)記。報道核酸可包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈可包含所述標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈的一部分可與第二核酸鏈雜交，形成包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。報道核酸可包含第三核酸鏈。第三核酸鏈的一部分可與所述第二核酸鏈雜交，形成包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。報道核酸可結(jié)合在固相載體上，報道核酸的部分與報道核酸的至少另一部分分離，且含有標(biāo)記，該部分在步驟(c)中從固相載體上釋放。確定步驟(d) 可包括檢測所述標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記，確定步驟(d)可包括檢測熒光標(biāo)記。確定步驟(d)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與報道核酸的至少另一部分分離的報道核酸的部分。步驟(a)、(b)和(C)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。步驟(a), (b)，(c)，和(d)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。確定步驟可包括確定存在于樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸的量。
在另一個方面，本文描述了一種評估樣品中的目標(biāo)核酸的方法。該方法包括或主要由以下步驟組成(a)使樣品與探針核酸接觸，探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和在下述條件下與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列如果目標(biāo)核酸存在于樣品中， 目標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開核酸的雙鏈部分識別性限制性內(nèi)切核酸酶在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開核酸的雙鏈部分，從而使探針核酸含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與探針核酸的至少一部分分離；(C)使探針核酸含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與第一信號放大核酸接觸，第一信號放大核酸包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第一信號放大核酸，從而將包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的部分與第一核酸的至少另一部分分離； (d)使包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的部分與第二信號放大核酸接觸，第二信號放大核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第二信號放大核酸，從而使含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸的部分與第二信號放大核酸的至少另一部分分離；(e)使(i)包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分，(ii)包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二信號放大核酸的部分，(iii)包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的部分，或(iv)其任何組合與包含核酸的雙鏈部分的報道核酸接觸，該部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)和/或第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開報道核酸，從而將報道核酸的一部分與報道核酸的至少另一部分分開， 和(f)確定所述報道核酸部分是否存在，其中所述報道核酸部分存在表明樣品含有目標(biāo)核酸，其中所述報道核酸部分不存在表明樣品不含目標(biāo)核酸。探針核酸可以是單鏈探針核酸。 探針核酸可結(jié)合在固相載體上。探針核酸可直接結(jié)合在固相載體上。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分通過所述步驟(b)從固相載體上釋放。步驟(a)和步驟(b) 可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟(c)和步驟⑷可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟(a)和步驟(b)可在第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟(c)和步驟(d)可在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟(a)和步驟(b)是通過將所述樣品加到含有所述探針核酸和所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。步驟 (c)和步驟(d)是通過將含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分加入到含有所述第一信號放大核酸和第二信號放大核酸的區(qū)室中進(jìn)行的。探針核酸可包含(i)單鏈部分，單鏈部分含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。探針核酸可包含第一核酸鏈，第一核酸鏈可含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈的一部分可與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟(b) 中分離，探針核酸的該部分可包含第一核酸鏈的一部分和全部第二鏈。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟(b)中分離，探針核酸的該部分可包含目標(biāo)核酸的至少一部分。該方法可包括在步驟(a)中使用多個所述探針核酸。該方法可包括在步驟(e)中使用多個報道核酸。步驟(e)中的報道核酸相對于來自步驟(b)的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的部分摩爾過量。在步驟 (b)中與所述探針核酸的至少另一部分分離的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分的分子數(shù)基本上與樣品中存在的目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可結(jié)合在固相載體上。第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可直接結(jié)合在固相載體上。第一信號放大核酸和第二信號放大核酸在同一區(qū)室中結(jié)合在固相載體上。第一信號放大核酸中包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過步驟(c)從固相載體上釋放。第二信號放大核酸中包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過步驟(d) 從固相載體上釋放。第一信號放大核酸可包含第一核酸鏈，該第一核酸鏈包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二信號放大核酸可包含第一核酸鏈，其包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該雙鏈部分包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。報道核酸可結(jié)合在固相載體上。報道核酸可直接結(jié)合在固相載體上。 報道核酸可包含核酸的單鏈部分。報道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。與報道核酸的至少另一部分分離的報道核酸的部分包含標(biāo)記。報道核酸可包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈的一部分與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。報道核酸可包含第三核酸鏈。第三核酸鏈可與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。報道核酸可結(jié)合在固相載體上，報道核酸中與報道核酸的至少另一部分分離并含有標(biāo)記的部分在步驟(e)中從固相載體上釋放。確定步驟(f)可包括檢測標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記， 確定步驟(f)可包括檢測熒光標(biāo)記。確定步驟(f)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與報道核酸的至少另一部分分離的報道核酸部分。步驟(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。 步驟(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。確定步驟可包括確定存在于樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸的量。
在另一方面，本文描述了一種評估樣品中的目標(biāo)核酸的方法。該方法包括，或主要由以下步驟組成(a)使樣品與探針核酸接觸，探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和在下述條件下與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列如果目標(biāo)核酸存在于樣品中，目標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開核酸的雙鏈部分識別性限制性內(nèi)切核酸酶在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開核酸的雙鏈部分，從而使探針核酸中含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與探針核酸的至少另一部分分離；(C)使探針核酸中含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與第一報道核酸(或第一信號放大核酸)接觸，其包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第一報道核酸，從而將包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一核酸的部分與第一核酸的至少另一部分分離；(d)使包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一報道核酸的部分與第二報道核酸(或第二信號放大核酸)接觸，其包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第二核酸，從而使含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸的部分與第二核酸的至少另一部分分離；和(e)確定第一報道核酸，第二報道核酸，或第一和第二報道核酸的部分是否存在，其中存在表明樣品含有目標(biāo)核酸，而不存在表明樣品不含目標(biāo)核酸。探針核酸可以是單鏈探針核酸。探針核酸可結(jié)合在固相載體上。探針核酸可直接結(jié)合在固相載體上。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分通過步驟(b)從固相載體上釋放。步驟(a) 和步驟(b)可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟(c)和步驟(d)可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟(a)和步驟(b)可在第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟(c)和步驟(d)可在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟(a)和步驟(b)可通過將所述樣品加到含有探針核酸和識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行。步驟(c)和步驟(d)可通過將含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分加入含有第一報道核酸和所述第二報道核酸的區(qū)室中進(jìn)行。探針核酸可包含(i)單鏈部分，單鏈部分含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。探針核酸包含第一核酸鏈，其含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈的一部分可與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟(b)中分離，探針核酸的部分包含第一核酸鏈的一部分和全部第二鏈。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一個部分在步驟(b)中分離，探針核酸的該部分可包含目標(biāo)核酸的至少一部分。該方法可包括在步驟(a)中使用多個所述探針核酸。該方法可包括在步驟(c)中使用多個所述第一報道核酸。步驟(c)中的所述第一報道核酸相對于來自步驟 (b)的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分摩爾過量。該方法可包括在步驟(d)中使用多個第二報道核酸。步驟(d)中的第二報道核酸相對于來自步驟(b)的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分摩爾過量。在步驟(b)中與探針核酸的至少另一部分分離的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分的分子數(shù)基本上與樣品中存在的目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。第一報道核酸和第二報道核酸可結(jié)合在固相載體上。第一報道核酸和第二報道核酸可直接結(jié)合在固相載體上。第一報道核酸和第二報道核酸在同一區(qū)室中結(jié)合在固相載體上。第一報道核酸中包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過步驟(C)從固相載體上釋放。第二報道核酸中包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過步驟(d)從固相載體上釋放。第一報道核酸可包含標(biāo)記。該標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第二報道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第一報道核酸和第二報道核酸可包含標(biāo)記。第一報道核酸和第二報道核酸可包含相同標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第一報道核酸可結(jié)合在固相載體上，其中第一報道核酸中與第一報道核酸的至少另一部分分離的部分含有標(biāo)記，與第一報道核酸的至少另一部分分離并含有標(biāo)記的第一報道核酸的部分在步驟(C)中從固相載體上釋放。第一報道核酸可包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈可包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，與第二核酸鏈雜交，形成包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第二核酸鏈可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第二報道核酸可結(jié)合在固相載體上，其中第二報道核酸中與第二報道核酸的至少另一部分分離的部分含有標(biāo)記，與第二報道核酸的至少另一部分分離并含有標(biāo)記的第二報道核酸的部分在步驟(d)中從固相載體上釋放。第二報道核酸可包含第一核酸鏈，第一核酸鏈可包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，與第二核酸鏈雜交，形成包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第二核酸鏈可包含標(biāo)記。 標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。第一報道核酸中與第一報道核酸的至少另一部分分離的部分包含熒光標(biāo)記，其中第二報道核酸中與第二報道核酸的至少另一部分分離的部分包含熒光標(biāo)記，和其中確定步驟(e)包括檢測熒光標(biāo)記。確定步驟 (e)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與第一報道核酸的所述至少另一部分分離的第一報道核酸的部分。確定步驟(e)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與第二報道核酸的至少另一部分分離的第二報道核酸的部分。步驟(a)、(b)、(c)和(d)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。步驟(a), (b)，(c)， (d)和(e)可不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。確定步驟包括確定存在于樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸的量。
在另一方面，本文描述了一種用于評估樣品中目標(biāo)核酸的試劑盒。該試劑盒包含， 或主要由以下組成包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，和與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的探針核酸，其中目標(biāo)核酸的至少一部分能夠與探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。探針核酸可以是單鏈探針核酸。試劑盒可包含固相載體，其中探針核酸可結(jié)合在固相載體上。探針核酸中包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分可以通過用識別性限制性內(nèi)切核酸酶切割從固相載體上釋放，識別性限制性內(nèi)切核酸酶能夠在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切割。該試劑盒還包含識別性限制性內(nèi)切核酸酶。探針核酸可包含(i)單鏈部分，其包含與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，和(ii) 雙鏈部分。探針核酸可包含第一核酸鏈，其包含與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。該試劑盒還可包含報道核酸，其包含核酸的雙鏈部分，核酸的雙鏈部分包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。試劑盒可包含固相載體，其中報道核酸可結(jié)合在固相載體上。報道核酸可直接結(jié)合在所述固相載體上。報道核酸可包含核酸的單鏈部分。報道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。報道核酸中包含標(biāo)記的一部分能通過由擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶切割與報道核酸的至少另一部分分離。報道核酸可包含含有標(biāo)記的第一核酸鏈，并與第二核酸鏈雜交。該試劑盒還可包含(a)第一信號放大核酸，核酸包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和雙鏈區(qū)段，雙鏈區(qū)段具有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，和(b)第二信號放大核酸，核酸含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和雙鏈區(qū)段，雙鏈區(qū)段具有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
在另一個方面，本文描述了一種組合物，其包含，或主要由以下組成與能夠切割雙鏈DNA分子的限制性內(nèi)切核酸酶共價結(jié)合的核酸。核酸可包含能夠與目標(biāo)核酸雜交的單鏈區(qū)段。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意思與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所共知的一樣。雖然與本文所描述的方法和材料類似或等效的方法和材料可被用來實(shí)施本發(fā)明，但在下文描述合適的方法和材料。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利和其他文獻(xiàn)都全文參考結(jié)合于本文。在抵觸的情況，以本說明書包括定義在內(nèi)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和例子都只是說明性的，并不構(gòu)成限制。
在附圖和以下描述中詳細(xì)說明了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施方式。通過描述、附圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。


圖1是示意圖，描述了用探針核酸、識別性限制性內(nèi)切核酸酶和報道核酸檢測目標(biāo)核酸的示范性方法。
圖2是可用于本文所述方法和材料來檢測目標(biāo)核酸的探針核酸的示范性結(jié)構(gòu)。
圖3是示意圖，描述了用探針核酸、識別性限制性內(nèi)切核酸酶、第一信號放大核酸、第二信號放大核酸、和報道核酸檢測目標(biāo)核酸的示范性方法。
圖4是可用于本文所述方法和材料來檢測目標(biāo)核酸的第一信號放大核酸和第二信號放大核酸的示范性結(jié)構(gòu)。這樣的第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可以與或不與報道核酸一起使用。當(dāng)不經(jīng)獨(dú)立的報道核酸步驟使用時，這樣的信號放大核酸可稱為報道核酸。
圖5顯示了可用于本文所述方法和材料來檢測目標(biāo)核酸的第一信號放大核酸和第二信號放大核酸的示范性結(jié)構(gòu)。這樣的第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可以與或不與報道核酸一起使用。當(dāng)不經(jīng)獨(dú)立的報道核酸步驟使用時，這樣的信號放大核酸可稱為報道核酸。
圖6含有線狀圖，顯示目標(biāo)寡核苷酸濃度(A)與識別性限制性內(nèi)切核酸酶濃度(B) 通過形成著色反應(yīng)產(chǎn)物對HRP-標(biāo)記的核酸酶切的作用。
發(fā)明詳述 本文提供了檢測目標(biāo)核酸的方法和材料。例如，本文提供了用于檢測樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法和材料，用于檢測樣品中目標(biāo)核酸存在量的方法和材料，用于檢測樣品中目標(biāo)核酸存在與否的試劑盒，用于檢測樣品中目標(biāo)核酸存在量的試劑盒，和制備這些試劑盒的方法。
在一個實(shí)施例中，檢測目標(biāo)核酸的方法可包括使樣品(例如要測試或懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品)與探針核酸接觸。探針核酸可被設(shè)計成具有單鏈部分，其核苷酸序列與要檢測的目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)。在這種情況下，樣品內(nèi)存在的目標(biāo)核酸可與探針核酸的該單鏈部分的互補(bǔ)序列雜交，形成雙鏈區(qū)段，其中一條鏈?zhǔn)悄繕?biāo)核酸，另一條鏈?zhǔn)翘结樅怂?。另外，具有與要檢測的目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列的探針核酸的單鏈部分可以設(shè)計成與目標(biāo)核酸雜交時，形成限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。因此，樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸可與探針核酸的單鏈部分的互補(bǔ)序列雜交，形成雙鏈區(qū)段，從而產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。目標(biāo)核酸和探針核酸雜交產(chǎn)生的酶切位點(diǎn)可稱作識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。另外，在這樣的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切核酸的限制性內(nèi)切核酸酶可被稱作識別性限制性內(nèi)切核酸酶。
探針核酸也可被設(shè)計成含有限制性內(nèi)切核酸酶。該限制性內(nèi)切核酸酶可以是探針核酸的一個組分，可被稱作擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶通常是與用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的不同限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶作為識別性限制性內(nèi)切核酸酶時，除EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶以外的限制性內(nèi)切核酸酶(例如HindIII限制性內(nèi)切核酸酶)用作擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。因此一般來說，探針核酸設(shè)計成含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶并具有這樣的核苷酸序列，即，使目標(biāo)核酸能與探針核酸雜交，產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在一些情況下，探針核酸可結(jié)合在固相載體上(例如微量滴定板孔上)。 例如，探針核酸可結(jié)合在固相載體上，從而當(dāng)識別性限制性內(nèi)切核酸酶在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切時，釋放探針核酸含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一部分。
當(dāng)可能含或不含目標(biāo)核酸的樣品接觸與固相載體結(jié)合的探針核酸后，如果存在于樣品中，目標(biāo)核酸會與探針核酸雜交，形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。此時，加到反應(yīng)中或已經(jīng)存在于反應(yīng)中的識別性限制性內(nèi)切核酸酶會在通過目標(biāo)核酸和探針核酸雜交形成的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切探針核酸，從而從固相載體上釋放含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分。從固相載體上釋放的含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分的數(shù)量和與探針核酸雜交，形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)核酸分子數(shù)量成基本線性關(guān)系(例如基本是1對1的關(guān)系)。
可收集從固相載體上釋放的含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分，使其與報道核酸接觸。例如，如果存在，探針核酸釋放的部分可從微量滴定板(例如96孔板) 的一個含有探針核酸的孔轉(zhuǎn)移到微量滴定板的另一個含有報道核酸的孔中?？稍O(shè)計報道核酸具有雙鏈部分，其中含有探針核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。該擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可稱作擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。如果含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分存在并與報道核酸接觸，那么可在擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切酶切位點(diǎn)用擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切報道核酸。由于探針核酸釋放部分的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能夠自由地反復(fù)進(jìn)行酶切，被酶切的報道核酸分子數(shù)將能夠大大超過反應(yīng)中存在的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶數(shù)。例如，酶切的報道核酸分子數(shù)可以大大超過(例如指數(shù)性超過)反應(yīng)中的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶數(shù)，從而能大大超過(例如指數(shù)性超過)存在于樣品中與探針核酸接觸的目標(biāo)核酸分子數(shù)。 這樣的高度放大關(guān)系(例如指數(shù)關(guān)系)能輕易檢測于樣品中存在的極少量目標(biāo)核酸。
如存在，在探針核酸釋放部分與報道核酸接觸后，可確定經(jīng)酶切的報道核酸的存在與否。酶切的報道核酸的存在可表明樣品中含有目標(biāo)核酸，而不存在酶切的報道核酸可表明樣品中不含目標(biāo)核酸。在一些情況下，可測定酶切的報道核酸量。在這些情況下，酶切的報道核酸量可表示樣品中存在的目標(biāo)核酸量。用已知量的目標(biāo)核酸繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可幫助確定樣品中存在的目標(biāo)核酸量。
在一些情況下，報道核酸可含有標(biāo)記，以幫助測定酶切的報道核酸。例如，報道核酸可含有熒光標(biāo)記和淬滅劑，從而使酶切的報道核酸提供熒光信號，而未酶切的報道核酸不提供熒光信號。在一些情況下，報道核酸可含有標(biāo)記(例如比色標(biāo)記，熒光標(biāo)記或酶，如辣根過氧化物酶)，并結(jié)合在固相載體上(例如微量滴定板孔)上。例如，報道核酸可結(jié)合在固相載體上，從而使得擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的酶切釋放含有標(biāo)記的報道核酸部分?？墒占玫降姆磻?yīng)混合物，利用標(biāo)記評估其中報道核酸釋放部分的存在與否及其量。例如，如存在，報道核酸的釋放部分可從含有報道核酸的微量滴定板(例如96孔板)的孔中轉(zhuǎn)移到微量滴定板的另一個孔中，在該處評估被轉(zhuǎn)移物質(zhì)中來自標(biāo)記的信號。
包括用探針核酸和報道核酸檢測目標(biāo)核酸的方法的一個例子如圖1所示。參考圖 1，第一反應(yīng)室100(例如微量滴定板孔)可含有探針核酸101。探針核酸101可以結(jié)合在 (例如固定在)固相載體102上，并可包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103 (Ra)。探針核酸101 可以結(jié)合在固相載體102上，從而在探針核酸101的核酸部分酶切后使擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103從固相載體102上釋放。探針核酸101可以具有單鏈部分，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸104的至少一部分互補(bǔ)。探針核酸101可以與含或不含目標(biāo)核酸104的樣品接觸。 如果目標(biāo)核酸104存在，目標(biāo)核酸104的至少一部分與探針核酸101可以雜交，形成核酸的雙鏈區(qū)段。這樣的雙鏈區(qū)段可以含有至少一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)105。在第一反應(yīng)室100中加入識別性限制性內(nèi)切核酸酶106 (Rr)可導(dǎo)致在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)105酶切探針核酸101，該位點(diǎn)由探針核酸的一條鏈和目標(biāo)核酸的一條鏈形成， 從而從固相載體102釋放探針核酸101的部分107。部分107可包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103。
如果目標(biāo)核酸104存在，來自第一反應(yīng)室100的含有釋放部分107的反應(yīng)產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移到(例如手工或自動化)第二反應(yīng)室120中。第二反應(yīng)室120可含有報道核酸121。 報道核酸121可結(jié)合在(例如固定在)固相載體122上，可包括標(biāo)記物(marker)(例如標(biāo)記)123 (M)。報道核酸121可結(jié)合在固相載體122上，從而在酶切報道核酸121的核酸組分后從固相載體122上釋放標(biāo)記123。報道核酸121可具有至少一個雙鏈部分，其中含有至少一個擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)124。將來自第一反應(yīng)室100的反應(yīng)產(chǎn)物加到第二反應(yīng)室120中可導(dǎo)致報道核酸121在擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)IM被切開，如果反應(yīng)產(chǎn)物含有部分107的話。報道核酸121這樣的酶切可導(dǎo)致部分127從固相載體122上釋放。部分127可包含標(biāo)記物123。
可評估來自第二反應(yīng)室120的反應(yīng)產(chǎn)物，測定部分127的存在與否及其量。部分 127的存在可表示樣品含有目標(biāo)核酸104，而部分127不存在則表示樣品不含目標(biāo)核酸104。在一些情況下，可測定部分127的量。在這樣的情況下，目標(biāo)127的量可表示存在于樣品中的目標(biāo)核酸104的量。部分127的存在與否及其量可用標(biāo)記物123測定，具有標(biāo)記123的部分127可與未酶切的報道核酸121區(qū)分開，因?yàn)樵谶@個例子中，部分127從固相載體122 上釋放，而未酶切的報道核酸121仍然與固相載體122結(jié)合。例如，在一些情況下，來自第二反應(yīng)室120的反應(yīng)產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)移到第三反應(yīng)室中，在其中通過標(biāo)記物123評估部分127 的存在與否。如果部分127存在，可定量部分127的存在量。
探針核酸101和報道核酸121可具有不同構(gòu)型。例如，參考圖1，可將探針核酸101 設(shè)計成具有一條核酸鏈，在與目標(biāo)核酸104接觸前，探針核酸101的整個核酸組成都是單鏈。在另一個例子中，參考圖2，可將探針核酸101設(shè)計成具有第一鏈1 和第二鏈108。第一鏈1 可結(jié)合于固相載體102，并可設(shè)計成具有單鏈區(qū)段，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸104 的至少一部分互補(bǔ)。第二鏈108可包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103，可以具有單鏈區(qū)段， 其核苷酸序列可與第一鏈1 雜交。在一些情況下，第一鏈1 和第二鏈108可分別合成或獲得，然后混合在一起，形成探針核酸101。例如，可合成第一鏈128，生物素化并結(jié)合在鏈霉親和素包被的固相載體上。合成第二鏈108的核酸組分并將擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103結(jié)合到合成的核酸組分上后，可將第二鏈108與第一鏈1 一起溫育，形成核酸探針101。在一些情況下，探針核酸101可含有兩條以上的鏈。例如，探針核酸可包含第一鏈 150、第二鏈152，和第三鏈154。在這種情況下，第一鏈150可結(jié)合在固相載體102上，第二鏈152可與第一鏈150雜交，并可包含單鏈區(qū)段，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸104的至少一部分互補(bǔ)，而第三鏈巧4可與第二鏈152雜交，并可與擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶103結(jié)合。類似的，可用一條、兩條、三條或更多鏈的構(gòu)型制備報道核酸。
在另一個實(shí)施方式中，檢測目標(biāo)核酸的方法可包括使樣品(例如要測試或懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品)接觸探針核酸。探針核酸可設(shè)計成具有單鏈部分，其核苷酸序列與要檢測的目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)。在這種情況下，樣品內(nèi)存在的目標(biāo)核酸可與探針核酸的該單鏈部分的互補(bǔ)序列雜交，形成雙鏈區(qū)段，其中一條鏈?zhǔn)悄繕?biāo)核酸，另一條鏈?zhǔn)翘结樅怂?。另外，具有與要檢測的目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列的探針核酸的單鏈部分可以設(shè)計成當(dāng)與目標(biāo)核酸雜交時，形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。因此，樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸可與探針核酸的單鏈部分的互補(bǔ)序列雜交，形成雙鏈區(qū)段，從而產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。還可將探針核酸設(shè)計成含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。由于該方法包括使用兩種或多種不同的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，作為探針核酸的一個組分的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶可被稱作第一或起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，而額外的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶被稱作第二、第三或類推，或稱作二級、三級或類推的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。該起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶通常是與用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶不同的限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶作為識別性限制性內(nèi)切核酸酶時，用與EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶不同的限制性內(nèi)切核酸酶(例如HindIII限制性內(nèi)切核酸酶)作為起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。 因此一般來說，探針核酸設(shè)計成含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶并具有這樣的核苷酸序列，即，使目標(biāo)核酸能與探針核酸雜交，產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在一些情況下，探針核酸可結(jié)合在固相載體上(例如微量滴定板孔上)。 例如，探針核酸可結(jié)合在固相載體上，從而當(dāng)識別性限制性內(nèi)切核酸酶在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切時，釋放探針核酸中含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一部分。
當(dāng)可能含或不含目標(biāo)核酸的樣品接觸與固相載體結(jié)合的探針核酸后，如果存在于樣品中，目標(biāo)核酸會與探針核酸雜交，形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。此時，加到反應(yīng)中或已經(jīng)存在于反應(yīng)中的識別性限制性內(nèi)切核酸酶會在通過目標(biāo)核酸和探針核酸雜交形成的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切探針核酸，從而從固相載體上釋放含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分。從固相載體上釋放的含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分的數(shù)量和與探針核酸雜交，形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)核酸分子數(shù)量成基本線性關(guān)系(例如基本是1對1的關(guān)系)。
可收集從固相載體上釋放出的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分，使其與第一信號放大核酸和第二信號放大核酸接觸?？蓪⒌谝恍盘柗糯蠛怂嵩O(shè)計成具有雙鏈部分，其中含有探針核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。該起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可稱作起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第一信號放大核酸還可設(shè)計成含有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。可將第二信號放大核酸設(shè)計成具有雙鏈部分，其含有第一信號放大核酸的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的該限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可稱作第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第二信號放大核酸也可設(shè)計成含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶作為識別性限制性內(nèi)切核酸酶和HindIII限制性內(nèi)切核酸酶作為探針核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶時，用SmaI限制性內(nèi)切核酸酶作為第一信號放大核酸的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，并用HindIII限制性內(nèi)切核酸酶作為第二信號放大核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。
在一些情況下，第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可結(jié)合在固相載體(例如微量滴定板)上。例如，第一信號放大核酸可結(jié)合在固相載體上，從而當(dāng)起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切時，釋放含有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的一部分，第二信號放大核酸可結(jié)合在固相載體上，從而當(dāng)?shù)诙U(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切時，釋放含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二信號放大核酸的一部分。第一信號放大核酸可結(jié)合在含有第二信號放大核酸的同一固相載體上(例如較大區(qū)室中的兩個不同亞區(qū)室)，條件是未酶切的第一信號放大核酸的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶不能酶切第二信號放大核酸，而且未酶切的第二信號放大核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶不能酶切第一信號放大核酸。在一些情況下，第一信號放大核酸可結(jié)合在一個聯(lián)合區(qū)室內(nèi)的同一固相載體上，從而使第一信號放大核酸在聯(lián)合區(qū)室的第一區(qū)室內(nèi)，第二信號放大核酸在聯(lián)合區(qū)室的第二區(qū)室內(nèi)。在這種情況下，第一區(qū)室內(nèi)的未酶切的第一信號放大核酸的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶不能酶切位于第二區(qū)室內(nèi)的第二信號放大核酸，而切開的第一信號放大核酸的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能夠從第一區(qū)室移動(例如擴(kuò)散)到第二區(qū)室，酶切第二區(qū)室中的第二信號放大核酸。另外，第二區(qū)室中的未酶切的第二信號放大核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶不能酶切位于第一區(qū)室中的第一信號放大核酸，而經(jīng)酶切的第二信號放大核酸的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能夠從第二區(qū)室移動(例如擴(kuò)散)到第一區(qū)室，酶切位于第一區(qū)室中的第一信號放大核酸。
如果含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分存在并與第一信號放大核酸接觸，那么第一信號放大核酸可以在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)由起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切，從而從固相載體上釋放含有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的部分。含有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的釋放部分可自由地在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切第二信號放大核酸，從而從固相載體上釋放含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二信號放大核酸的部分。由于探針核酸釋放部分的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶、第二信號放大核酸釋放部分的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和第一信號放大核酸釋放部分的第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能自由進(jìn)行反復(fù)酶切，含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的釋放部分的數(shù)量會從識別性限制性內(nèi)切核酸酶釋放的數(shù)量大大增加。例如，經(jīng)酶切的第一信號放大核酸分子數(shù)會大大超過(例如指數(shù)性超過)探針核酸釋放部分的數(shù)量，而經(jīng)酶切的第二信號放大核酸分子數(shù)會大大超過 (例如指數(shù)性超過)探針核酸釋放部分的數(shù)量。這樣的高度放大關(guān)系(例如指數(shù)關(guān)系)能輕易檢測樣品中存在極少量的目標(biāo)核酸。
在一些情況下，該方法可用結(jié)合在固相載體上的第一信號放大核酸進(jìn)行，該固相載體不同于含有第二信號放大核酸的固相載體。例如，第一信號放大核酸可以結(jié)合在微量滴定板的一個孔上，而第二信號放大核酸可結(jié)合在微量滴定板的不同孔上。在這種情況下， 可從第一孔收集含第一信號放大核酸的所得反應(yīng)物，轉(zhuǎn)移到含有第二信號放大核酸的孔中。
可收集該反應(yīng)中從含有第二信號放大核酸的固相載體釋放的含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二信號放大核酸的部分，以及任何其它在該反應(yīng)中釋放的部分(例如含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的釋放部分和含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號放大核酸的釋放部分)，使其與報道核酸接觸。例如，如果存在，釋放的部分能從微量滴定板(96孔板)的含有第二信號放大核酸的一個孔轉(zhuǎn)移到含有報道核酸的微量滴定板的另一個孔中。報道核酸可設(shè)計成具有雙鏈部分，其含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。如果含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的釋放部分存在， 并與報道核酸接觸，那么可在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)由起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切報道核酸。由于釋放部分的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能自由反復(fù)酶切，經(jīng)酶切的報道核酸分子數(shù)大大超過存在于反應(yīng)中的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子數(shù)。例如，經(jīng)酶切的報道核酸分子數(shù)可大大超過(例如指數(shù)性超過)反應(yīng)中的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶數(shù)，從而大大超過(例如指數(shù)性超過)存在于樣品中與探針核酸接觸的目標(biāo)核酸分子數(shù)。這樣的高度放大關(guān)系(例如指數(shù)關(guān)系)能輕易檢測樣品中存在極少量的目標(biāo)核酸。
如存在，在含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的釋放部分與報道核酸接觸后，可確定經(jīng)酶切的報道核酸存在與否。酶切的報道核酸的存在可表明樣品中含有目標(biāo)核酸，而不存在酶切的報道核酸可表明樣品中不含目標(biāo)核酸。在一些情況下，可測定酶切的報道核酸量。在這些情況下，酶切的報道核酸量可表示樣品中存在的目標(biāo)核酸量。
在一些情況下，報道核酸可含有標(biāo)記，以幫助測定酶切的報道核酸。例如，報道核酸可含有熒光標(biāo)記和淬滅劑，從而使酶切的報道核酸提供熒光信號，而未酶切的報道核酸不提供熒光信號。在一些情況下，報道核酸可含有標(biāo)記(例如比色標(biāo)記，熒光標(biāo)記或酶，如辣根過氧化物酶)，并可結(jié)合在固相載體上(例如微量滴定板孔)上。例如，報道核酸可結(jié)合在固相載體上，從而使得起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的酶切釋放含有標(biāo)記的報道核酸部分?？墒占玫降姆磻?yīng)混合物并用標(biāo)記評估報道核酸釋放部分的存在與否及其量。例如，如存在，報道核酸的釋放部分可從含有報道核酸的微量滴定板(例如96孔板)的一個孔中轉(zhuǎn)移到微量滴定板的另一個孔中，在該處評估被轉(zhuǎn)移物質(zhì)中來自標(biāo)記的信號。
在一些情況下，可測定經(jīng)酶切的第一信號放大核酸，經(jīng)酶切的第二信號放大核酸， 或兩者的存在與否。這些經(jīng)酶切的核酸的存在表明樣品含有目標(biāo)核酸，而這些經(jīng)酶切的核酸不存在表明樣品不含目標(biāo)核酸。在一些情況下，可測定經(jīng)酶切的第一信號放大核酸，經(jīng)酶切的第二信號放大核酸，或兩者的量。在這些情況下，經(jīng)酶切的核酸的量可表示樣品中目標(biāo)核酸的存在量。在這些情況下，除了用獨(dú)立的報道核酸步驟以外，還可用經(jīng)酶切的第一信號放大核酸，經(jīng)酶切的第二信號放大核酸，或兩者評估樣品中的目標(biāo)核酸，或可代替使用獨(dú)立的報道核酸步驟。在一些情況下，第一信號放大核酸、第二信號放大核酸或兩者可用與本文所述報道核酸相似的方式標(biāo)記以幫助檢測。當(dāng)測定經(jīng)酶切的第一信號放大核酸、經(jīng)酶切的第二信號放大核酸，或兩者的存在與否或量，以評估樣品中的目標(biāo)核酸時，第一信號放大核酸可稱作第一報道核酸，而第二信號放大核酸可稱作第二報道核酸，甚至它們可包括擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。
包括使用探針核酸、第一信號放大核酸、第二信號放大核酸、和報道核酸的檢測目標(biāo)核酸的方法的一個例子如圖3-5所示。參考圖3，第一反應(yīng)室200(例如微量滴定板孔) 可含有探針核酸201。探針核酸201可結(jié)合在(例如固定在)固相載體202上，并可包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶203 (Ra)。探針核酸201可固定在固相載體202上，從而在酶切探針核酸201的核酸組件后，從固相載體202釋放起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶203。 探針核酸201可以具有單鏈區(qū)段，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸204的至少一部分互補(bǔ)。探針核酸201可與含或不含目標(biāo)核酸204的樣品接觸。如果存在目標(biāo)核酸204，目標(biāo)核酸204的至少一部分與探針核酸201可雜交，形成核酸的雙鏈區(qū)段。這樣的雙鏈區(qū)段可含有至少一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)205。在第一反應(yīng)室200中加入識別性限制性內(nèi)切核酸酶206 (Rr)可導(dǎo)致在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)205酶切探針核酸201，該酶切位點(diǎn)205是由探針核酸的一條鏈和目標(biāo)核酸的一條鏈形成的，從而從固相載體202上釋放探針核酸201的部分207。部分207可包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶203。
如果目標(biāo)核酸204存在，含有釋放部分207的第一反應(yīng)室200的反應(yīng)產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移 (手工或自動化)到第二反應(yīng)室220。第二反應(yīng)室220可含有第一信號放大核酸2 和第二信號放大核酸225。第一信號放大核酸2 可具有至少一個雙鏈部分，其包含至少一個起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)230。第一信號放大核酸2 可結(jié)合于(例如固定在)固相載體222上，并可包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶223(Rb)。第一信號放大核酸2 可結(jié)合在固相載體222上，從而在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)230酶切第一信號放大核酸2 后，使含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶223的部分234從固相載體 222上釋放。出于清楚，圖3的框E部分省略了第一信號放大核酸2 和第二信號放大核酸核酸225經(jīng)酶切形式的一條鏈。
第二信號放大核酸225可具有至少一個雙鏈部分，其含有至少一個第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)232。第二信號放大核酸225可結(jié)合在(例如固定在)固相載體 222上，并可包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶224。第二信號放大核酸225可結(jié)合在固相載體222上，從而在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)232酶切第二信號放大核酸225 后，使含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶224的部分236從固相載體222上釋放。探針核酸 201的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶203和第二信號放大核酸225的起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶2 可以是相同的限制性內(nèi)切核酸酶。例如，它們都可以是EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶。
在第二反應(yīng)室220中加入來自第一反應(yīng)室200的反應(yīng)產(chǎn)物可導(dǎo)致第一信號放大核酸2 在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)230酶切，如果反應(yīng)產(chǎn)物含有部分207的話。對第一信號放大核酸226的該酶切可導(dǎo)致部分234從固相載體222上釋放?？砂诙U(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶223的部分234可導(dǎo)致第二信號放大核酸225在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)232酶切。第二信號放大核酸225的這種酶切可導(dǎo)致部分236從固相載體222上釋放。因此，該反應(yīng)導(dǎo)致釋放部分234和236的聚集。
如果目標(biāo)核酸204存在，含有釋放部分207、釋放部分234和釋放部分236的來自第二反應(yīng)室220的反應(yīng)產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移到(手工或自動)第三反應(yīng)室M0。第三反應(yīng)室240可含有報道核酸Ml。報道核酸241可結(jié)合在(例如固定在)固相載體242上，并可包含標(biāo)記物(例如標(biāo)記)243 (M)。報道核酸241可結(jié)合在固相載體242上，從而使標(biāo)記物243在報道核酸241的核酸組件酶切后從固相載體242上釋放。報道核酸241可具有至少一個雙鏈部分，其含有至少一個起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)對6。將來自第二反應(yīng)室 220的反應(yīng)產(chǎn)物加到第三反應(yīng)室MO中，可導(dǎo)致報道核酸241在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)246酶切，如果反應(yīng)產(chǎn)物含有部分207和236的話。在一些情況下，報道核酸 241可含有至少一個雙鏈部分，其含有第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶223的至少一個酶切位點(diǎn)。在這樣的情況下，在第三反應(yīng)室MO中加入來自第二反應(yīng)室220的反應(yīng)產(chǎn)物可導(dǎo)致報道核酸241在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶223的酶切位點(diǎn)酶切，如果反應(yīng)產(chǎn)物含有部分234的話。酶切報道核酸Ml可導(dǎo)致部分247從固相載體242上釋放。部分247可含有標(biāo)記物M3。
可評估來自第三反應(yīng)室MO的反應(yīng)產(chǎn)物，測定部分M7的存在與否及其量。部分 247的存在可表明樣品含有目標(biāo)核酸204，而部分247不存在可表明樣品不含目標(biāo)核酸204。 在一些情況下，可測定部分M7的量。在這些情況下，部分M7的量可表明存在于樣品中的目標(biāo)核酸量?？捎脴?biāo)記物243測定部分247的存在與否及其量，具有標(biāo)記物243的部分 247可與具有標(biāo)記物M3的未酶切的報道核酸241區(qū)分開，因?yàn)樵谶@個例子中，部分247從固相載體242上釋放，而未酶切的報道核酸241仍然于固相載體242結(jié)合。例如，在一些情況下，來自第三反應(yīng)室M的反應(yīng)產(chǎn)物可轉(zhuǎn)移到第四反應(yīng)室中，在其中通過標(biāo)記物243評估部分M7的存在與否及其量。如果存在部分347，可定量測定部分247的存在量。
在一些情況下，參考圖4和5，第一信號放大核酸2 可包含標(biāo)記物(例如標(biāo)記)243 (M)，第二信號放大核酸225可包含標(biāo)記物(例如標(biāo)記)243 (M)。在這些情況下，可用標(biāo)記物243評估第一信號放大核酸226的酶切和第二信號放大核酸225的酶切，以評估樣品中目標(biāo)核酸的存在與否及其量。例如，可用檢測器250檢測從固相載體222上釋放的標(biāo)記物M3。
探針核酸201、第一信號放大核酸226、第二信號放大核酸225和報道核酸241可具有不同構(gòu)型。例如，參考圖3，探針核酸201可設(shè)計成具有一條核酸鏈，其中探針核酸201 的整個核酸組件在與目標(biāo)核酸204接觸前是單鏈的。在另一個例子中，探針核酸201可設(shè)計成象探針核酸101—樣，具有兩條或多條鏈。見例如圖2。例如，探針核酸201可具有第一鏈和第二鏈。第一鏈可結(jié)合在固相載體上，可設(shè)計成具有單鏈區(qū)段，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)。第二鏈可包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，并可具有單鏈區(qū)段， 其核苷酸序列可與第一鏈雜交。在一些情況下，第一鏈和第二鏈可分別合成或獲得，然后混合在一起，形成探針核酸201。例如，可合成第一鏈并生物素化，然后結(jié)合在鏈霉親和素包被的固相載體上。在合成第二鏈的核酸組件，并將起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)合到合成的核酸組件上以后，可將第二鏈和第一鏈一起溫育，形成核酸探針201。在一些情況下，探針核酸201可含有兩條以上的鏈。例如，探針核酸可包括第一鏈、第二鏈和第三鏈。在這種情況下，第一鏈可與固相載體結(jié)合，第二鏈可與第一鏈雜交，并可包括單鏈區(qū)段，其核苷酸序列與目標(biāo)核酸的至少一部分互補(bǔ)，而第三鏈可與第二鏈雜交，并可與起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)合。類似的一條、兩條、三條、或更多條鏈的構(gòu)型可用于制備第一信號放大核酸， 第二信號放大核酸，或報道核酸。例如，第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可設(shè)計成具有如圖4和5所示的構(gòu)型。
本文所述的探針核酸通常包括至少一個單鏈DNA區(qū)段，其設(shè)計成與所需的目標(biāo)核酸雜交，從而形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。探針核酸的其它部分可包含DNA、RNA 或其它分子。例如，探針核酸可包含生物素，從而使探針核酸能夠與鏈霉親和素包被的固相載體結(jié)合。在一些情況下，探針核酸的單鏈部分設(shè)計成與所需的目標(biāo)核酸雜交，產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，該單鏈部分可以是RNA或核酸類似物(例如肽核酸(PNA))，只要這種單鏈部分可以(i)與所需目標(biāo)核酸雜交，和(ii)與互補(bǔ)目標(biāo)核酸序列產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，其能夠被識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切。可用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶，在探針核酸的RNA區(qū)段和目標(biāo)核酸的DNA區(qū)段之間形成的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于Hhal，AluI, TaqI, HaeIII, EcoRI, HindII, Sail，和MspI限制性內(nèi)切核酸酶。
本文所述的探針核酸可以是任意長度，只要設(shè)計成與所需目標(biāo)核酸雜交的探針核酸的單鏈區(qū)段能與目標(biāo)核酸雜交并在探針核酸被識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，探針核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶能酶切其擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。一般說來，設(shè)計成與所需目標(biāo)核酸雜交的探針核酸的單鏈區(qū)段可以長約10-500個或更多的核苷酸(例如在約10-400個核苷酸之間，在約10-300個核苷酸之間，在約10-200個核苷酸之間，在約 10-100個核苷酸之間，在約10-50個核苷酸之間，在約10-25個核苷酸之間，在約20-500個核苷酸之間，在約30-500個核苷酸之間，在約40-500個核苷酸之間，在約50-500個核苷酸之間，在約15-50個核苷酸之間，在約15-25個核苷酸之間)。通過目標(biāo)核酸與該探針核酸的單鏈區(qū)段雜交產(chǎn)生的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以位于單鏈區(qū)段的任何位置。 例如，識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可朝向5’末端，朝向3’末端，或靠近探針核酸單鏈區(qū)段的中間產(chǎn)生。一般來說，本文所述探針核酸的總長度可以是約10-2500個或更多核苷酸(例如，約10-2000個核苷酸之間，約10-1000個核苷酸之間，約10-500個核苷酸之間，約10-400個核苷酸之間，約10-300個核苷酸之間，約10-200個核苷酸之間，約10-100個核苷酸之間，約10-50個核苷酸之間，約10-25個核苷酸之間，約20-500個核苷酸之間， 約30-500個核苷酸之間，約40-500個核苷酸之間，約50-500個核苷酸之間，約75-500個核苷酸之間，約100-500個核苷酸之間，約15-50個核苷酸之間，約15-25個核苷酸之間，約 20-50個核苷酸之間，或約18-25個核苷酸之間)。
通過目標(biāo)核酸與探針核酸雜交產(chǎn)生的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以是任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。另外，可用任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作為識別性限制性內(nèi)切核酸酶在目標(biāo)核酸雜交后酶切探針核酸?？捎米髯R別性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI，EcoRII, BamHI, Hindlll，TaqI, NotI, HinfI, Sau3A, PovII, SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, Sac I, Sail, Seal, SphI, StuI, XbaI, AarI, BanII, BseGI, BspPI, CfrI, EcoNI, Hsp92II, NlaIV, RsaI, TaiI，AasI，BbsI，BseJI，BspTI，ClaI，Eco0109I，I-PpoI，NmuCI，RsrII，TaqaI,AatII, BbuI， BseLI, BsrBI, CpoI,, KasI, Acc65I, BbvCI, BseMI, BsrDI, Csp45I，，Kpn2I, NruI, SacII, TasI, AccB7I, BbvI, BseMII, BsrFI, Csp6I, EheI, KpnI, NsbI, Sail, TatI, AccI, BceAI, BseNI,BsrGI,CspI,Esp3I,KspAI,Nsi I，SapI 和 TauI 限制性內(nèi)切核酸酶。在一些情況下， 編碼天然存在的限制性內(nèi)切核酸酶的核酸可經(jīng)遺傳工程改造，產(chǎn)生修飾的限制性內(nèi)切核酸酶，它能夠識別獨(dú)特酶切位點(diǎn)?？捎贸Ｒ?guī)的計算機(jī)算法確定任何所需目標(biāo)核酸的核苷酸序列上限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。一旦確定，可用沿著額外側(cè)接序列(例如5’側(cè)接序列， 3’側(cè)接序列或5’和3’側(cè)接序列兩者)的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的序列設(shè)計用于和目標(biāo)核酸雜交的探針核酸的互補(bǔ)序列，并在目標(biāo)核酸雜交后產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
一般說，探針核酸可以設(shè)計成具有單鏈區(qū)段，該單鏈區(qū)段設(shè)計成與所需目標(biāo)核酸雜交，在與目標(biāo)核酸雜交后形成一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在一些情況下，探針核酸可設(shè)計成具有單鏈區(qū)段，其設(shè)計成與所需目標(biāo)核酸雜交，在與目標(biāo)核酸雜交后形成一個以上(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。當(dāng)使用一個以上的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)時，多個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以是同一限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，或不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。例如，探針核酸可設(shè)計成具有單鏈區(qū)段，其設(shè)計成與所需目標(biāo)核酸雜交，在目標(biāo)核酸雜交后形成EcoRI識別性限制性內(nèi)切核酸酶的一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)和)(bal識別性限制性內(nèi)切核酸酶的一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。 在這樣的情況下，各識別性限制性內(nèi)切核酸酶可單獨(dú)或聯(lián)合使用(例如作為混合物)酶切與目標(biāo)核酸雜交，并通過此類雜交形成相應(yīng)的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的探針核酸。
探針核酸可設(shè)計成能夠檢測任何目標(biāo)核酸?？捎帽疚奶峁┑姆椒ê筒牧蠙z測的目標(biāo)核酸的例子包括但不限于人類核酸、微生物核酸(例如細(xì)菌、真菌或原生動物核酸)、病毒核酸、含點(diǎn)突變、SNP或基因重排的核酸、哺乳動物核酸、甲基化核酸和mRNA。當(dāng)檢測RNA 目標(biāo)核酸時，可用能夠酶切識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)(該酶切位點(diǎn)在探針核酸的 DNA區(qū)段和RNA目標(biāo)核酸之間形成)的限制性內(nèi)切核酸酶作為識別性限制性內(nèi)切核酸酶。 這樣的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于Hhal，AluI, TaqI, HaeIII, EcoRI, HindII, Sail，和MspI限制性內(nèi)切核酸酶。當(dāng)檢測甲基化目標(biāo)核酸時(例如與癌癥相關(guān)的甲基化目標(biāo)核酸)，能夠酶切包括要評估的甲基化核苷酸的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶可用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶。能夠識別甲基化核苷酸的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于DpnI, GlaI, HpaII，MspI，AciI，Hhal，和SssI限制性內(nèi)切核酸酶。在這種情況下，對照可包括檢測不含甲基化核苷酸的相同目標(biāo)核酸。在一些情況下，可用甲基化不敏感和甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶組合評估樣品中甲基化的目標(biāo)核酸。例如，用為相同位點(diǎn)設(shè)計的甲基化不敏感和甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶都產(chǎn)生類似酶切產(chǎn)物，可指示目標(biāo)核酸在該位點(diǎn)缺少甲基化，而用甲基化不敏感的限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物與使用為相同位點(diǎn)設(shè)計的甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物水平相比有所增加，可表示該目標(biāo)核酸在該位點(diǎn)有甲基化。
要檢測的目標(biāo)核酸的核苷酸序列可獲自例如，常規(guī)核酸數(shù)據(jù)庫，如GenBank等。 可用基于計算機(jī)的程序選擇目標(biāo)核苷酸序列的部分。例如，可用基于計算機(jī)的程序檢測目標(biāo)核酸一部分中的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。這樣的信息可用于設(shè)計探針核酸，從而使得單鏈區(qū)段在與目標(biāo)核酸雜交后形成至少一個識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
可用任何合適的方法獲得探針核酸的核酸組分。例如，可用常規(guī)的分子克隆和化學(xué)核酸合成技術(shù)獲得探針核酸的核酸組分。在一些情況下，探針核酸的核酸組分可以用市售自動化核苷酸合成儀，例如加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems,Foster City,CA)的那些合成。在一些情況下，可用任何數(shù)量的本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的方法從頭合成探針核酸。這樣的合成方法的例子包括但不限于氰基乙基亞磷酰胺法(Beaucage等，四面體通信，22 :1859-1862(1981))和核苷H-膦酸鹽法(Garegg等，四面體通信，27 :4051-4054 (1986) ；Froehler 等，核酸研究，14 :5399-5407 (1986) ；Garegg 等.， 四面體通信，27 :4055-4058(1986)；和 Gaffney 等，四面體通信，29 :2619-2622 (1988)) 這些方法可以用各種市售自動化核苷酸合成儀進(jìn)行。在一些情況下，諸如PCR等重組核酸技術(shù)和包括使用限制性酶消化和連接現(xiàn)存核酸序列(例如基因組DNA或cDNA的)的那些可用于獲得探針核酸的核酸組分。
本文所述的探針核酸結(jié)合在固相載體上。固相載體的例子包括但不限于微量滴定板孔(例如96-孔微量滴定板孔或ELISA板)，珠(例如磁性、玻璃、塑料或金包被的珠)， 載玻片(例如玻璃或金包被的載玻片)、微米或納米顆粒(例如碳納米管)、鉬固相載體、鈀固相載體和微流化裝置中室或通道的表面。在一些情況下，固相載體可以是基于氧化硅的固相載體、基于塑料聚合物的固相載體(例如尼龍、硝基纖維素或基于聚氟乙烯的固相載體)，或基于生物聚合物(例如交聯(lián)葡聚糖或基于纖維素的固相載體)的固相載體。探針核酸可直接或間接結(jié)合于固相載體。例如，生物素可以是探針核酸的組分，含有生物素的探針核酸可通過生物素-鏈霉親和素相互作用間接結(jié)合在鏈霉親和素包被的固相載體上。在一些情況下，探針核酸可通過共價或非共價作用結(jié)合于固相載體。例如，探針核酸可與他處描述的磁珠共價結(jié)合(Albretsen等，分析生物化學(xué)，189 (1) :40-50 (1990))。
探針核酸可設(shè)計成含有任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。一般說，探針核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶通常是與用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶不同的限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶時，用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶以外的限制性內(nèi)切核酸酶(例如HindIII限制性內(nèi)切核酸酶)作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶?？捎米鲾U(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于 EcoRI，EcoRII，BamHI，Hindi11，TaqI,NotI, HinfI，Sau3A, PovII， SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, SacI, Sail, Seal, SphI, StuI, XbaI, AarI, BanII, BseGI, BspPI, CfrI, EcoNI, Hsp92II, NlaIV, RsaI, Tail, AasI, BbsI, BseJI, BspTI, ClaI, Eco0109I, I-PpoI, NmuCI, RsrII, TaqaI, AatII, BbuI, BseLI, BsrBI, CpoI, KasI, Acc65I, BbvCI, BseMI, BsrDI, Csp45I，，Kpn2I, NruI, SacII, TasI, AccB7I, BbvI, BseMII, BsrFI, Csp6I, EheI, KpnI, NsbI, Sail, TatI, AccI, BceAI, BseNI, BsrGI, CspI, Esp3I,KspAI,NsiI, SapI，和TauI限制性內(nèi)切核酸酶。任何數(shù)量的同一擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的分子可結(jié)合于一個探針核酸分子。例如，一個探針核酸分子可含有一個、兩個、三個、四個、五個、或更多個EcoRI擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子。在一些情況下，一個探針核酸分子可含有兩個或多個(例如兩個、三個、四個、五個或更多個)不同類型的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。例如，一個探針核酸分子可含有三個EcoRI擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子和兩個BanII擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子。
可用任何合適的方法將擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶與探針核酸的核酸組分結(jié)合。在一些情況下，可通過離子或共價結(jié)合使擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)合。例如，可用共價鍵， 例如酰胺鍵、二硫鍵、和硫醚鍵，或交聯(lián)劑形成的鍵。在一些情況下，可使用非共價鍵。結(jié)合可以是直接結(jié)合或間接結(jié)合。例如，可用連接基將擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶與探針核酸的核酸組分結(jié)合。在一些情況下，核酸可包含巰基修飾，限制性內(nèi)切核酸酶可基于4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)，使用與他處所述類似的技術(shù)偶聯(lián)于含巰基的核酸(Dill等，生物傳感器和生物電子學(xué)，20:736-7420004))。在一些情況下，可將生物素化核酸和含鏈霉親和素的限制性內(nèi)切核酸酶通過生物素-鏈霉親和素作用互相結(jié)合?？捎美?-(3’-[2-吡啶基二巰基]-丙酰胺)己酸磺基琥珀酯使限制性內(nèi)切核酸酶與鏈霉親和素偶聯(lián)。可將擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)合于探針核酸的核酸組分的任何位置。例如，擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶可結(jié)合在核酸組分的任何一端(例如5’末端或3’末端)，核酸組分的中間，或沿核酸組分長度的任何位置。
本文所述的信號放大核酸(例如第一信號放大核酸和第二信號放大核酸)和報道核酸通常包含至少一個雙鏈DNA區(qū)段，其包括擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)(例如起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，或第三擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn))。信號放大核酸或報道核酸的其它部分可包括DNA、RNA 或其它分子。例如，報道核酸可包括生物素，從而使報道核酸能夠結(jié)合于鏈霉親和素包被的固相載體。在一些情況下，包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的信號放大核酸或報道核酸的雙鏈區(qū)段的一條或兩條鏈可以是RNA或核酸類似物(例如肽核酸(PNA))，條件是這樣的雙鏈區(qū)段能夠被擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切?？梢杂米鲾U(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切信號放大核酸或報道核酸的DNA:RNA雜交區(qū)段的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于Hhal， AluI, TaqI, HaeIII, EcoRI，HindII, Sail，和 MspI 限制性內(nèi)切核酸酶。
本文所述的信號放大核酸或報道核酸可以是任何長度，條件是含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的雙鏈區(qū)段能夠被擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切。一般說，信號放大核酸或報道核酸的雙鏈部分可以長約10-500個或更多個核苷酸(例如約10-400個核苷酸、約10-300個核苷酸、約10-200個核苷酸、約10-100個核苷酸、約10-50個核苷酸、約 10-25個核苷酸、約20-500個核苷酸、約30-500個核苷酸、約40-500個核苷酸、約30-500個核苷酸、約40-500個核苷酸、約50-500個核苷酸、約15-50個核苷酸、約15-25個核苷酸、約20-50個核苷酸、約18-25個核苷酸)。在一些情況下，信號放大核酸或報道核酸的雙鏈區(qū)段可以長5-50個核苷酸。信號放大核酸或報道核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可位于雙鏈區(qū)段的任何位置。例如，擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以朝向5’ 端，朝向3’端，或靠近信號放大核酸或報道核酸的雙鏈區(qū)段的中央。一般說，本文所述的信號放大核酸或報道核酸的總長度可以是約10-2500或更多個核苷酸(例如約10-2000個核苷酸，約10-1000個核苷酸，約10-500個核苷酸，約10-400個核苷酸，約10-300個核苷酸， 約10-200個核苷酸，約10-100個核苷酸，約10-50個核苷酸，約10-25個核苷酸，約20-500 個核苷酸，約30-500個核苷酸，約40-500個核苷酸，約50-500個核苷酸，約75-500個核苷酸，約100-500個核苷酸，約150-500個核苷酸，約15-50個核苷酸，約15-25個核苷酸，約 20-50個核苷酸，或約18-25個核苷酸)。
本文所述的信號放大核酸或報道核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以是任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。另外，可用任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶來酶切信號放大核酸或報道核酸。可用作擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI，EcoRII，BamHI，Hindi11，TaqI ,NotI, Hinfl, Sau3A, PovII, SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, Sac I, Sail, Seal, SphI, StuI, XbaI, AarI, BanII, BseGI, BspPI, CfrI, EcoNI, Hsp92II, NlaIV, RsaI, TaiI，AasI，BbsI，BseJI，BspTI，ClaI，Eco0109I，I-PpoI，NmuCI，RsrII，TaqaI,AatII, BbuI， BseLI，BsrBI,CpoI,KasI，Acc65I，BbvCI，BseMI，BsrDI，Csp45I，，Kpn2I，NruI，SacII，TasI， AccB7I, BbvI, BseMII, BsrFI, Csp6I, EheI, KpnI, NsbI, Sail, TatI, AccI, BceAI, BseNI, BsrGI, Cspl，Esp3I, KspAI, Nsil，SapIjP TauI 限制性內(nèi)切核酸酶。
一般說，信號放大核酸或報道核酸可設(shè)計成具有雙鏈區(qū)段，其含有一個擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在一些情況下，本文所述的信號放大核酸或報道核酸可設(shè)計成具有雙鏈區(qū)段，其含有一個以上(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。當(dāng)使用一個以上擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)時，多個擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以是同一限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)或不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。例如，報道核酸可設(shè)計成具有雙鏈區(qū)段，其含有EcoRI起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一個起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)和 ^CbaI第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一個第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
可用任何合適的方法獲得信號放大核酸或報道核酸的核酸組分。例如，可用常用的分子克隆和化學(xué)核酸合成技術(shù)獲得信號放大核酸或報道核酸的核酸組分。在一些情況下，信號放大核酸或報道核酸的核酸組分可以用市售的自動化核苷酸合成儀合成，例如那些購自加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的。在一些情況下，信號放大核酸或報道核酸可用任意數(shù)量的本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的方法從頭合成。這樣的合成方法的例子包括但不限于β-氰基乙基亞磷酰胺法(Beaucage等，四面體通信，22 :1859-1862(1981))和核苷H-膦酸鹽法(Garegg等，四面體通信，27 =4051-4054 (1986) ；Froehler等，核酸研究，14 5399-5407(1986) ；Garegg 等.，四面體通信，27 :4055-4058(1986)；和 Gaffney 等，四面體通信，29 :2619力622(1988))。這些方法可以用各種市售自動化核苷酸合成儀進(jìn)行。在一些情況下，諸如PCR等重組核酸技術(shù)和包括使用限制性酶消化和連接現(xiàn)存核酸序列(例如基因組DNA或cDNA的)的那些技術(shù)可用于獲得探針核酸的核酸組分。
本文所述的信號放大核酸或報道核酸可結(jié)合在固相載體上。固相載體的例子包括但不限于微量滴定板孔(例如96-孔微量滴定板孔或ELISA板)，珠(例如磁性、玻璃、塑料或金包裹的珠)，載玻片(例如玻璃或金包裹的載玻片)、微米或納米顆粒(例如碳納米管)、鉬固相載體、鈀固相載體和微流化裝置中室或通道的表面。在一些情況下，固相載體可以是基于氧化硅的固相載體、基于塑料聚合物的固相載體(例如尼龍、硝基纖維素或基于聚氟乙烯的固相載體)，或基于生物聚合物(例如交聯(lián)葡聚糖或基于纖維素的固相載體) 的固相載體。
信號放大核酸或報道核酸可直接或間接結(jié)合于固相載體。例如，生物素可以是信號放大核酸或報道核酸的組分，含有生物素的信號放大核酸或報道核酸可通過生物素-鏈霉親和素相互作用間接結(jié)合在鏈霉親和素包被的固相載體上。在一些情況下，信號放大核酸或報道核酸可通過共價或非共價相互作用結(jié)合于固相載體。例如，信號放大核酸或報道核酸可與他處描述的磁珠共價結(jié)合(Albretsen等，分析生物化學(xué)，189 (1) :40-50 (1990))。
信號放大核酸可設(shè)計成含有任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶(例如起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶、第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶、或第三擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶)。一般說，信號放大核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶通常是與用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶不同的限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)EcoRI 限制性內(nèi)切核酸酶用作識別性限制性內(nèi)切核酸酶時，用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶以外的限制性內(nèi)切核酸酶(例如HeaIII限制性內(nèi)切核酸酶)作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶?？捎米鲾U(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于EC0RI，EC0RII，BamHI， HindIII，TaqI，NotI，HinfI，Sau3A，PovII，SmaI，HaeIII，HgaI，AluI，EcoRV，EcoP15I，KpnI， PstI，SacI，SalI，ScaI，SphI，StuI，XbaI，AarI，BanII，BseGI，BspPI，CfrI，EcoNI，Hsp92II， NlaIV,RsaI,Tail,AasI,BbsI,BseJI,BspTI,ClaI,Eco0109I,I-PpoI，NmuCI，RsrII，TaqaI， AatII,BbuI，BseLI，BsrBI,CpoI,KasI，Acc65I，BbvCI，BseMI，BsrDI，Csp45I，，Kpn2I，NruI， SacII, TasI, AccB7I, BbvI, BseMII, BsrFI, Csp6I, EheI, KpnI, NsbI, Sail, TatI, AccI, BceAI, BseNI, BsrGI, CspI, Esp3I, KspAI, NsiI, SapIjP TauI 限制性內(nèi)切核酸酶。任何數(shù)量的同一擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的分子可結(jié)合于一個信號放大核酸分子。例如，一個信號放大核酸分子可含有一個、兩個、三個、四個、五個、或更多個EcoRI擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子。在一些情況下，一個信號放大核酸分子可含有兩個或多個(例如兩個、三個、四個、五個或更多個)不同類型的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。例如，一個信號放大核酸分子可含有三個BanII擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子和兩個^cII擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子。
報道核酸可設(shè)計成含有標(biāo)記，以幫助檢測酶切的報道核酸。在一些情況下，信號放大核酸可設(shè)計成含有標(biāo)記。在這些情況下，含有標(biāo)記的信號放大核酸可與報道核酸一起使用，或代替報道核酸檢測目標(biāo)核酸?？梢允菆蟮篮怂峄蛐盘柗糯蠛怂岬慕M分的標(biāo)記的例子包括但不限于熒光標(biāo)記(使用或不使用淬滅劑)、染料、抗體、放射性物質(zhì)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或熒光酶)、氧化還原標(biāo)記物(例如鐵氧還標(biāo)記)、金屬顆粒(例如金納米顆粒)、基于綠色熒光蛋白的標(biāo)記。在一些情況下，對于氧化還原標(biāo)記例如二茂鐵，檢測儀可以是氧化還原分子的安培測試的電極。例如，如果氧還標(biāo)記以二茂鐵的還原形式存在，那么在高電極電勢下的電極可氧化還原形式的二茂鐵，從而將其轉(zhuǎn)換成二茂鐵的氧化形式。產(chǎn)生的電流與溶液中的二茂鐵標(biāo)記濃度成比例。
在一個實(shí)施例中，報道核酸或信號放大核酸可含有熒光標(biāo)記和淬滅劑，從而使得酶切的報道核酸提供熒光信號，未酶切的報道核酸不提供熒光信號。在一些情況下，報道核酸或信號放大核酸可以含有標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記或辣根過氧化物酶等酶)，并可結(jié)合于固相載體(例如微量滴定板孔)。例如，報道核酸或信號放大核酸可結(jié)合于固相載體，使得擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切能夠釋放報道核酸或信號放大核酸中含有標(biāo)記的部分?？墒占玫降幕旌衔铮脴?biāo)記評估報道核酸或信號放大核酸釋放部分的存在與否及其量。例如，報道核酸或信號放大核酸釋放的部分如果存在，可從含有報道核酸或信號放大核酸的微量滴定板孔(例如96-孔板)的一個孔轉(zhuǎn)移到微量滴定板孔的另一個孔，在該處評估轉(zhuǎn)移的物質(zhì)來自標(biāo)記的信號?？蓪⑷魏螖?shù)量的標(biāo)記分子結(jié)合于一個報道核酸分子或一個信號放大核酸分子。例如，一個報道核酸分子或一個信號放大核酸分子可含有一個、兩個、三個、四個、五個或更多個熒光分子。
可用任何合適的方法將標(biāo)記結(jié)合在報道核酸或信號放大核酸的核酸組分上。在一些情況下，標(biāo)記可通過離子或共價結(jié)合結(jié)合。例如，可用共價鍵，例如酰胺鍵、二硫鍵、和硫醚鍵，或交聯(lián)劑形成的鍵。在一些情況下，可使用非共價鍵。結(jié)合可以是直接結(jié)合或間接結(jié)合。例如，可用連接基將標(biāo)記與報道核酸或信號放大核酸的核酸組分結(jié)合。在一些情況下， 核酸可包含巰基修飾，標(biāo)記可基于4-(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯 (SMCC)，使用與他處所述類似的技術(shù)偶聯(lián)于含巰基的核酸(Dill等，生物傳感器和生物電子學(xué)，20 :736-742(2004)) 0在一些情況下，可將生物素化核酸和含鏈霉親和素的限制性內(nèi)切核酸酶通過生物素-鏈霉親和素作用互相結(jié)合?？捎美?- (3’ - [2-吡啶基二巰基]-丙酰胺)己酸磺酸琥珀酯使標(biāo)記與鏈霉親和素偶聯(lián)?？蓪?biāo)記結(jié)合于報道核酸或信號放大核酸的核酸組分的任何位置。例如，標(biāo)記可結(jié)合在報道核酸或信號放大核酸的核酸組分的任何一端(例如5’末端或3’末端)，核酸組分的中間，或沿核酸組分長度的任何位置。
本文提供的方法和材料可用于檢測任何類型樣品中的目標(biāo)核酸。例如，可收集血液樣品、血清樣品、唾液樣品、鼻拭子樣品、糞便樣品、尿樣、組織樣(例如組織活檢樣品)、 環(huán)境樣品(例如水樣、土樣和空氣樣品)、食物樣品(例如肉樣、產(chǎn)品樣品或飲料樣)、和工業(yè)樣品(例如空氣過濾器樣品和從工作站收集到的樣品)并評估目標(biāo)核酸。一旦獲得，可處理要評估的樣品以獲得目標(biāo)核酸。例如，可在組織樣上進(jìn)行核酸抽提，以獲得富含核酸的樣品。在一些情況下，可加熱樣品或用細(xì)胞裂解劑處理，以從存在于樣品中的細(xì)胞內(nèi)釋放核酸。
一旦獲得，將要評估的樣品與本文所述的探針核酸接觸。該接觸步驟可以在任意長度的時間和任何溫度下進(jìn)行以便目標(biāo)核酸與探針核酸雜交。例如，該步驟可以在10秒到24小時間(例如30秒到12小時，30秒到8小時，30秒到4小時，30秒到2小時，30秒到1小時，1分鐘到24小時，1分鐘到12小時，1分鐘到8小時，1分鐘到4小時，1分鐘到2 小時，1分鐘到1小時，5分鐘到1小時，10分鐘到1小時，15分鐘到1小時，或30分鐘到1 小時之間)進(jìn)行。起始溫度可以是15°C到IOO0C (；例如23°C到98°C，23°C到90°C，23°C到 85°C，23°C到 75°C，23°C到 65°C，23°C到 55°C，23°C到 45°C，23°C到 35°C，30°C到 95°C，30°C 到 85 °C, 30 0C 到 75 °C, 30 0C 到 65 °C, 30 °C 到 55 °C, 30 °C 到 45 V，20 V 到 40 V，20 V 到 30 V，到25°C到35°C )。該接觸步驟中的 溫度可以維持穩(wěn)定或可以升高或下降。例如，起始溫度可以是約40°C _85°C，然后溫度可以在30秒到30分鐘內(nèi)(例如約30秒到15分鐘，約30秒到10分鐘，約1分鐘到30 分鐘，約1分鐘到15分鐘，或約1分鐘到5分鐘)下降到室溫。
樣品(例如要測試或懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品)與探針核酸的接觸可以在識別性限制性內(nèi)切核酸酶的存在下發(fā)生，或可進(jìn)行單獨(dú)的在反應(yīng)中加入識別性限制性內(nèi)切核酸酶的步驟。識別性限制性內(nèi)切核酸酶步驟可以在允許識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切目標(biāo)核酸和探針核酸雜交形成的識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的任何時間和任意溫度下進(jìn)行。 例如，該步驟可以在1秒到M小時(例如1秒到30分鐘，1秒到1小時，5秒到1小時，30 秒到24小時，30秒到12小時，30秒到8小時，30秒到4小時，30秒到2小時，30秒到1小時，1分鐘到M小時，1分鐘到12小時，1分鐘到8小時，1分鐘到4小時，1分鐘到2小時， 1分鐘到1小時，5分鐘到1小時，10分鐘到1小時，15分鐘到1小時或30分鐘到1小時) 之間進(jìn)行。溫度可以是15°C到75°C (例如15°C到75°C，15°C到65°C，15°C到55°C，15°C至IJ 45 °C，15 °C 到 35 °C，15 °C 到 30 °C，23 °C 到 55 °C，23 °C 到 45 V，30 V 到 65 °C, 30 °C 到 55 °C, 30 °C 到45 V，30 V到40 V，35 V到40 V，到36 V到38°C )?？墒褂米R別性限制性內(nèi)切核酸酶的任意合適濃度。例如，可使用約0. 001單位到1000單位(例如約0. 001單位到750單位， 約0. 001單位到500單位，約0. 001單位到250單位，約0. 001單位到200單位，約0. 001單位到150單位，約0. 001單位到100單位，約0. 001單位到50單位，約0. 001單位到25單位，約0. 001單位到10單位，約0. 001單位到1單位，約0. 001單位到0. 1單位，約0. 01單位到1000單位，約0. 1單位到1000單位，約1單位到1000單位，約10單位到1000單位， 約50單位到1000單位，約0. 5單位到100單位，或約1單位到100單位)的限制性內(nèi)切核酸酶。可根據(jù)廠商的說明書使用其它限制性內(nèi)切核酸酶條件，例如鹽濃度。
當(dāng)本文所提供的方法中的一個步驟完成時，可將得到的含有酶切核酸的反應(yīng)產(chǎn)物用于下一步。例如，可將反應(yīng)產(chǎn)物的酶切核酸與未酶切核酸分開，用于方法的下一步。例如， 當(dāng)探針核酸結(jié)合于固相載體時，可收集釋放的含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分，如本文所述與報道核酸或信號放大核酸接觸。特定步驟得到的反應(yīng)產(chǎn)物可手工或自動化(例如用機(jī)器人)轉(zhuǎn)移到含有下一步的核酸(例如報道核酸或信號放大核酸)的位置， 其中核酸可以與固相載體結(jié)合或不結(jié)合。在一些情況下，本文所述的方法的一個反應(yīng)可以在微流體裝置或泡罩包裝裝置的一個位置(例如一個室)中進(jìn)行，產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物可通過通道移動到含有下一步的核酸(例如報道核酸或信號放大核酸)的另一個位置(例如另一個室)。在一些情況下，可通過從反應(yīng)產(chǎn)物中分離未酶切的核酸，在方法的下一步中使用反應(yīng)產(chǎn)物的經(jīng)酶切核酸。例如，當(dāng)用磁珠作為固相載體時，可用磁力將磁珠和任何結(jié)合的未酶切的核酸與反應(yīng)產(chǎn)物分離。
可用任何合適的方法檢測經(jīng)酶切的報道核酸和/或信號放大核酸，以測定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否及其量。例如，可用尺寸分選技術(shù)評估反應(yīng)產(chǎn)物中經(jīng)酶切的報道核酸和/或信號放大核酸。這種尺寸分選技術(shù)的例子包括但不限于凝膠電泳和毛細(xì)電泳技術(shù)。 在一些情況下，可進(jìn)行解鏈曲線分析以評估反應(yīng)產(chǎn)物中經(jīng)酶切的報道核酸和/或信號放大核酸。如本文所述，可用標(biāo)記幫助檢測經(jīng)酶切的核酸(例如報道核酸和/或信號放大核酸)。 可用的標(biāo)記的例子包括但不限于熒光標(biāo)記(使用或不使用淬滅劑)、染料、抗體、放射性物質(zhì)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或熒光酶)、氧化還原標(biāo)記物 (例如鐵氧還標(biāo)記)、金屬顆粒(例如金納米顆粒)、基于綠色熒光蛋白的標(biāo)記。例如，可用常規(guī)熒光標(biāo)記檢測儀評估報道核酸和/或信號放大核酸的熒光標(biāo)記部分從固相載體上的釋放。在一些情況下，經(jīng)酶切的報道核酸和/或信號放大核酸可用電化學(xué)方法檢測。對于電化學(xué)檢測，報道核酸和/或信號放大核酸可包括二茂鐵氧還標(biāo)記。含有二茂鐵的報道核酸和/或信號放大核酸可在過量二茂鐵羧酸存在下，采用碳二亞胺反應(yīng)通過使二茂鐵羧酸與氨基修飾的寡核苷酸偶聯(lián)獲得。在一個實(shí)施例中，對于氧化還原標(biāo)記例如二茂鐵，檢測儀可以是氧化還原分子的安培測試的電極。例如，如果氧還標(biāo)記以二茂鐵的還原形式存在，那么在高電極電勢下的電極可氧化還原形式的二茂鐵，從而將其轉(zhuǎn)換成二茂鐵的氧化形式。產(chǎn)生的電流與溶液中二茂鐵標(biāo)記的濃度成比例。
本文所述的方法和材料可用于實(shí)時評估一個或多個樣品中的目標(biāo)核酸。例如，可用熒光標(biāo)記/淬滅劑系統(tǒng)或電化學(xué)氧化還原標(biāo)記系統(tǒng)實(shí)時檢測報道核酸和/或信號放大核酸的酶切。
本文提供的方法和材料可用于評估一個或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個，20個，50個，100個，500個，1000個，或更多)樣品中一種類型的目標(biāo)核酸。在一些情況下，本文提供的方法和材料可以多重形式使用，以評估一個或多個樣品中一種以上(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種,20,50,100,500, 1000種或更多種)類型的目標(biāo)核酸。例如，可用十種不同序列(例如來自一種菌種或菌株的十種不同序列，或來自十種不同細(xì)菌菌種或菌株的不同序列)的目標(biāo)核酸設(shè)計10種不同的探針核酸分子。在這些情況下，可用不同標(biāo)記對應(yīng)于各探針核酸，從而使得檢測的信號可表示十種目標(biāo)核酸中的哪一種被檢測。
本文還提供用于進(jìn)行本文所述方法的試劑盒。例如，本文提供的試劑盒可包含與固相載體結(jié)合或不結(jié)合的探針核酸，和/或與固相載體結(jié)合或不結(jié)合的報道核酸。在一些情況下，這樣的試劑盒可包含識別性限制性內(nèi)切核酸酶，第一信號放大核酸，第二信號放大核酸，或其組合。在一些情況下，試劑盒可配制成微流體裝置，其允許探針核酸、第一信號放大核酸、第二信號放大核酸、報道核酸或識別性限制性內(nèi)切核酸酶(或其任何組合)，以及任何這些核酸的酶切部分以一定方式運(yùn)動，所述方式能夠?qū)嵤┍疚奶峁┑臋z測方法，其中核酸可結(jié)合或不結(jié)合于固相載體。例如，本文提供的試劑盒可以是能夠接受樣品并使樣品與探針核酸接觸的微流體裝置。可將探針核酸設(shè)計成包含一定長度的核苷酸，其后是與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，其可產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，然后是擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)與擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶之間的距離可以較短(例如100，50，25，10，或更少的核苷酸)，而識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)到核苷酸長度起始的距離可以較長(例如50，100，150，200，500，1000，2000，個或更長)。在這樣的情況下，在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切探針核酸可得到較小部分，其含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，能比較大的未酶切的探針核酸移動更快速。該區(qū)別能夠使含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的經(jīng)酶切的部分到達(dá)含有信號放大核酸或報道核酸的微流體裝置的區(qū)域，從而能在不存在未酶切探針核酸的情況下進(jìn)行下一步反應(yīng)。在一些情況下，含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的較小的部分到達(dá)含有信號放大核酸或報道核酸的區(qū)域后，可用閥門防止未酶切的探針核酸進(jìn)入。在一些情況下，可用濾膜限制較大的未酶切的探針核酸進(jìn)入下一步反應(yīng)位置?？稍诒疚奶峁┑姆椒ǖ钠渌襟E中使用類似方法分離酶切的核酸與未酶切的核酸。
在一些情況下，本文提供的試劑盒可以是便攜式或自持裝置、包裝、器皿或容器， 可用于例如現(xiàn)場應(yīng)用。例如，這樣的試劑盒可配制成讓用戶插入樣品用于分析。一旦插入， 可用試劑盒內(nèi)的加熱或冷卻機(jī)構(gòu)加熱樣品(例如加熱到約25,26,27,28,29,30,31,32,33, 34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58， 59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，75，80，85，90，95°C或以上)和 / 或冷卻。例如， 可在試劑盒內(nèi)引發(fā)放熱或吸熱化學(xué)反應(yīng)，從而提高、降低或保持溫度。這樣的放熱或吸熱化學(xué)反應(yīng)可以在試劑盒內(nèi)進(jìn)行，而不需要與目標(biāo)核酸檢測方法的反應(yīng)物有液體交換。鐵氧化反應(yīng)是可用于加熱本文提供的試劑盒的一種放熱化學(xué)反應(yīng)?？捎糜诶鋮s本文提供的試劑盒的一種吸熱化學(xué)反應(yīng)可以是包括使用氯化銨和水、氯化鉀和水、或碳酸鈉和乙醇酸在內(nèi)的反應(yīng)。一般說，當(dāng)檢測DNA目標(biāo)核酸時，試劑盒可設(shè)計成在需要的情況下可產(chǎn)生足夠熱量， 以使得樣品內(nèi)存在的雙鏈DNA變性。試劑盒還可設(shè)計成產(chǎn)生足夠的加熱和冷卻溫度，從而能進(jìn)行本文提供的檢測方法的每一步。在一些情況下，本文提供的試劑盒可包括溫度指示計(例如顯色指示劑或溫度計)，讓用戶評估溫度。
在一些情況下，試劑盒可設(shè)計成對用戶提供測試樣品中目標(biāo)核酸存在的“是”或 “否”的指示。例如，可使用能夠產(chǎn)生PH變化的標(biāo)記和可視指示劑(例如基于pH的顯色劑)， 以通過PH的改變通知用戶目標(biāo)核酸的存在。
以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范圍。
實(shí)施例 實(shí)施例1-目標(biāo)-探針雜交物的形成和酶切 用巰基在5’末端和生物素分子在3’末端修飾的寡核苷酸探針(5’-巰基-GGT AGT GCG AAA TGC CAT TGC TAG TTG TTT-生物素-3，； SEQ ID NO 1)與辣根過氧化物酶(HRP) 偶聯(lián)。用SMCC試劑根據(jù)Dili等(生物傳感器和生物電子學(xué)，20 :736-742 0004))所述的改良技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)。HRP偶聯(lián)物溶液與鏈霉親和素包被的ELISA板一起保溫，將HRP-寡核苷酸探針通過生物素-鏈霉親和素作用固定在其表面。然后，ELISA板與不同濃度的目標(biāo)寡核苷酸(5’ -AAA CAA CTA GCA ATG GCA TTT-3’ ；SEQ ID NO 2) 一起溫育。目標(biāo)寡核苷酸序列與探針序列反向互補(bǔ)，形成雙鏈的雜交分子。洗滌后，板在含有限制性內(nèi)切核酸酶 BfaI的溶液中溫育。BfaI特異性識別序列5’-CTAG-3’，并切割雙鏈的目標(biāo)探針雜交物，將 HRP-寡核苷酸釋放到反應(yīng)溶液中。37°C溫育2小時后，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到新的ELISA板中。 切開的HRP-寡核苷酸與3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)接觸，形成有色反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)反應(yīng)混合物中加入過量的限制性內(nèi)切核酸酶BfaI時，觀察到釋放的HRP-探針和寡核苷酸目標(biāo)濃度之間有明顯的直接依賴性(圖6A)?？蓹z測目標(biāo)濃度約為InM。不經(jīng)過任何第二信號放大，通過直接測定獲得該檢測極限。如本文所述，加入限制性內(nèi)切核酸酶信號放大級聯(lián)可以進(jìn)一步提高幾個數(shù)量級的檢測極限。
當(dāng)HRP-寡核苷酸探針與過量目標(biāo)寡核苷酸(500nM)預(yù)溫育時，酶切的HRP-寡核苷酸探針量受到識別性限制性內(nèi)切核酸酶BfaI含量的限制(圖6B)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示識別性限制性內(nèi)切核酸酶能夠用于引發(fā)本文所述的限制性內(nèi)切核酸酶級聯(lián)反應(yīng)。
實(shí)施例2-用探針核酸和報道核酸檢測目標(biāo)核酸 選擇目標(biāo)核酸。一旦選定，用常用基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank 和/或基于計算機(jī)的序列分析程序鑒定出目標(biāo)核酸中含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的部分。設(shè)計與目標(biāo)核酸中至少一個含有酶切位點(diǎn)的部分互補(bǔ)的探針核酸。一旦設(shè)計并用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成法獲得探針核酸，將其與擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶偶聯(lián)，固定在微量滴定板第一孔表面。要測試的樣品在第一孔中溫育。如果樣品中存在目標(biāo)核酸，目標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸雜交，從而形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在具有樣品和探針核酸的第一孔中加入識別性限制性內(nèi)切核酸酶。微量滴定板在37°C溫育合適的時間，使酶切反應(yīng)進(jìn)行。
識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸后，含有探針核酸釋放部分的反應(yīng)溶液被轉(zhuǎn)移到第二孔中。第二孔含有固定在表面上并含有具有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的至少一個雙鏈部分的報道核酸。報道核酸還具有熒光標(biāo)記。轉(zhuǎn)移到第二室后，結(jié)合在探針核酸釋放部分的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶與報道核酸接觸。擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈化的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切報道核酸，形成至少兩個部分。將含有熒光標(biāo)記的報道核酸的釋放部分轉(zhuǎn)移到第三微量滴定板孔中，用標(biāo)準(zhǔn)熒光讀數(shù)計測定任何熒光信號。
用已知量目標(biāo)核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測試樣品中的目標(biāo)核酸量。
實(shí)施例3- 用于探針核酸、第一信號放大核酸，第二信號放大核酸和報道核酸檢測目標(biāo)核酸。
一旦選定，用常用基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank .和/或基于計算機(jī)的序列分析程序鑒定出目標(biāo)核酸中含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的部分。根據(jù)本文所述，基于所需的目標(biāo)核酸設(shè)計探針核酸。使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成法制備探針核酸，然后將其偶聯(lián)到起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶上，固定在微量滴定板第一孔表面。在第一孔中溫育將要測試目標(biāo)核酸的樣品。如果目標(biāo)核酸存在于樣品中，目標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸雜交，因此形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。將識別性限制性內(nèi)切核酸酶加到具有樣品和探針核酸的第一孔中。微量滴定板在37°C溫育一段合適的時間，讓酶切反應(yīng)進(jìn)行。
在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸目標(biāo)核酸雜交物以后，含有探針核酸游離部分的反應(yīng)溶液被轉(zhuǎn)移到另一個包含第一信號放大核酸和第二信號放大核酸的孔中。 第一信號放大核酸和第二信號放大核酸產(chǎn)生了正反饋循環(huán)，導(dǎo)致起始擴(kuò)增性限制性酶的釋放指數(shù)加快。該孔的反應(yīng)產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到另一個含有報道核酸的孔中，采用酶切報道核酸確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否及其量。用已知量的目標(biāo)核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測試樣品中的目標(biāo)核酸量。
實(shí)施例4-檢測細(xì)菌的存在與否 用酶擴(kuò)增級聯(lián)反應(yīng)檢測樣品中甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus) (MRSA)的存在與否。用常規(guī)基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank和/或基于計算機(jī)的序列分析程序分析MRSA特異性目標(biāo)核酸，以鑒定出含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)核酸部分。設(shè)計與所選目標(biāo)核酸至少一部分互補(bǔ)的探針核酸。一旦設(shè)計并用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成法獲得探針核酸，將其與擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶偶聯(lián)，固定在微量滴定板的第一孔表面。 獲得懷疑含有MRSA的生物學(xué)樣品(例如組織樣品或鼻拭子)，在第一孔中保溫來自該樣品的核酸。如果樣品中存在MRSA，至少一部分MRSA特異性核酸與探針核酸雜交，從而形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在含有樣品和探針核酸的第一孔中加入識別性限制性內(nèi)切核酸酶。微量滴定板在37°C保溫一段合適的時間，以進(jìn)行酶切反應(yīng)。
在用識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸目標(biāo)核酸雜交物后，第一孔中的反應(yīng)溶液被轉(zhuǎn)移到含有報道核酸的第二孔中，該報道核酸被固定在第二孔表面并具有含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的至少一個雙鏈部分。報道核酸也具有熒光標(biāo)記。在某些情況下，在報道核酸步驟前使用第一信號放大核酸和第二信號放大核酸，以提高目標(biāo)核酸的檢測水平。第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可以包括標(biāo)記，此時它們與報道核酸一起使用或者代替報道核酸使用。
將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到第二室后，探針核酸被釋放部分的擴(kuò)增性限制性核酸內(nèi)切酶接觸報道核酸，將微量滴定板在合適的溫度下(例如37°C下)培養(yǎng)一段合適的時間，以進(jìn)行酶切反應(yīng)。擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開報道核酸，形成至少兩部分。第二孔的反應(yīng)溶液被轉(zhuǎn)移到第三孔，用熒光微量滴定板讀數(shù)計檢測熒光。第三孔中的熒光表明在樣品中存在MRSA特異性核酸。如果樣品獲自病人，這樣的結(jié)果表示在該病人中有MRSA感染。如果在第三孔中沒有檢測到熒光，這樣的結(jié)果表明在樣品中不存在MRSA。
其它實(shí)施方式 應(yīng)理解，雖然已經(jīng)結(jié)合發(fā)明詳述描述了本發(fā)明，但是上面的詳述旨在說明而非限制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、益處和修改落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種評估樣品中的目標(biāo)核酸的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和在下述條件下與所述目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列如果所述目標(biāo)核酸存在于所述樣品中，所述目標(biāo)核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使所述核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，所述限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開所述核酸的雙鏈部分所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述核酸的雙鏈部分，從而使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與所述探針核酸的至少另一部分分離；(C)使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分與含有核酸雙鏈部分的報道核酸接觸，所述核酸雙鏈部分含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是其中所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述報道核酸，從而使所述報道核酸的一部分與所述報道核酸的至少另一部分分離，和(d)確定所述報道核酸所述部分的存在與否，其中所述報道核酸的所述部分的存在表明所述樣品含有所述目標(biāo)核酸，其中所述報道核酸的所述部分不存在表明所述樣品不含所述目標(biāo)核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針核酸是單鏈探針核酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針核酸結(jié)合在固相載體上。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針核酸直接結(jié)合在固相載體上。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針核酸中包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分通過所述步驟(b)從所述固相載體上釋放。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在第一區(qū)室中進(jìn)行的，所述步驟(c)是在第二區(qū)室中進(jìn)行的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是通過將所述樣品加到含有所述探針核酸和所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含(i)單鏈部分，所述單鏈部分含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，與含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈的一部分與所述第一核酸鏈雜交，形成所述雙鏈部分。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的所述至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述第一核酸鏈的一部分和全部所述第二鏈。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的所述至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述目標(biāo)核酸的至少一部分。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(a)中使用多個所述探針核酸。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(c)中使用多個所述報道核酸。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中的所述報道核酸相對于來自所述步驟(b)的含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分摩爾過量。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中與所述探針核酸的所述至少另一部分分離的含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分的分子數(shù)基本上與所述樣品中存在的所述目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述報道核酸結(jié)合在固相載體上。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述報道核酸直接結(jié)合在固相載體上。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含核酸的單鏈部分。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含標(biāo)記。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，與所述報道核酸的所述至少另一部分分離的所述報道核酸的所述部分包含所述標(biāo)記。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈的一部分與所述第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含第三核酸鏈。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述第三核酸鏈與所述第二核酸鏈雜交， 形成核酸的所述雙鏈部分，所述部分包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
32.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述報道核酸結(jié)合在固相載體上，和所述報道核酸的所述部分與所述報道核酸的所述至少另一部分分離，且含有所述標(biāo)記，所述部分通過所述步驟(c)從所述固相載體上釋放。
33.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(d)包括檢測所述標(biāo)記。
34.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記，所述確定步驟(d)包括檢測所述熒光標(biāo)記。
35.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(d)包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與所述報道核酸的所述至少另一部分分離的所述報道核酸的所述部分。
36.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)、(b)和(c)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增， 或所述步驟(a), (b)，(c)，和(d)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。
37.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定步驟包括確定存在于所述樣品內(nèi)的所述目標(biāo)核酸的量。
38.一種評估樣品中的目標(biāo)核酸的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和與所述目標(biāo)核酸在下述條件下互補(bǔ)的核苷酸序列如果所述目標(biāo)核酸存在于所述樣品中， 所述目標(biāo)核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使所述核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，所述限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開所述核酸的雙鏈部分所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述核酸的雙鏈部分，從而使所述探針核酸中含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與所述探針核酸的至少另一部分分離；(c)使所述探針核酸中含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分與第一核酸接觸，所述第一核酸包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述第一核酸，從而將包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第一核酸的部分與所述第一核酸的至少另一部分分離；(d)使包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第一核酸的所述部分與第二核酸接觸，所述第二核酸包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述第二核酸，從而使含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第二核酸的部分與所述第二核酸的至少另一部分分離；(e)使包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第二核酸的所述部分與報道核酸接觸，所述報道核酸包含核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述報道核酸，從而將所述報道核酸的一部分與所述報道核酸的至少另一部分分開，和(f)確定所述報道核酸所述部分的存在與否，其中所述報道核酸的所述部分的存在表明所述樣品含有所述目標(biāo)核酸，其中所述報道核酸的所述部分不存在表明所述樣品不含所述目標(biāo)核酸。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述探針核酸是單鏈探針核酸。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述探針核酸結(jié)合在固相載體上。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述探針核酸直接結(jié)合在固相載體上。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分通過所述步驟(b)從所述固相載體上釋放。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。
44.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)和步驟(d)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。
45.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在第一區(qū)室中進(jìn)行的，所述步驟(c)和步驟(d)是在第二區(qū)室中進(jìn)行的。
46.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是通過將所述樣品加到含有所述探針核酸和所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。
47.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)和步驟(d)是通過將含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分加入到含有所述第一核酸和所述第二核酸的區(qū)室中進(jìn)行的。
48.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含(i)單鏈部分，所述單鏈部分含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，與含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
52.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈的一部分與所述第一核酸鏈雜交，形成所述雙鏈部分。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述第一核酸鏈的一部分和全部所述第二鏈。
54.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的所述至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述目標(biāo)核酸的至少一部分。
55.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(a)中使用多個所述探針核酸。
56.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(e)中使用多個所述報道核酸。
57.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中的所述報道核酸相對于來自所述步驟(b)的含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分摩爾過量。
58.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中與所述探針核酸的至少另一部分分離的含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分的分子數(shù)基本上與所述樣品中存在的所述目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。
59.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一核酸和所述第二核酸結(jié)合在固相載體上。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述第一核酸和所述第二核酸直接結(jié)合在固相載體上。
61.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一核酸和所述第二核酸在同一區(qū)室中結(jié)合在固相載體上。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述第一核酸中包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分通過所述步驟(c)從所述固相載體上釋放。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述第二核酸中包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分通過所述步驟(d)從所述固相載體上釋放。
64.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，所述第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成核酸的所述雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
69.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述第二核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，所述第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成核酸的所述雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
72.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
74.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述報道核酸結(jié)合在固相載體上。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述報道核酸直接結(jié)合在固相載體上。
76.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含核酸的單鏈部分。
77.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含標(biāo)記。
78.如權(quán)利要求77所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
79.如權(quán)利要求77所述的方法，其特征在于，與所述報道核酸的所述至少另一部分分離的所述報道核酸的所述部分包含所述標(biāo)記。
80.如權(quán)利要求77所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
83.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈的一部分與所述第二核酸鏈雜交，形成核酸的所述雙鏈部分，所述雙鏈部分包含起始所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
84.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述報道核酸包含第三核酸鏈。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于，所述第三核酸鏈與所述第二核酸鏈雜交， 形成核酸的所述雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
86.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述報道核酸結(jié)合在固相載體上，和所述報道核酸的所述部分與所述報道核酸的所述至少另一部分分離，且含有所述標(biāo)記，所述部分通過所述步驟(e)從所述固相載體上釋放。
87.如權(quán)利要求77所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(f)包括檢測所述標(biāo)記。
88.如權(quán)利要求77所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記，所述確定步驟(f) 包括檢測所述熒光標(biāo)記。
89.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(f)包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與所述報道核酸的所述至少另一部分分離的所述報道核酸的所述部分。
90.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)、(b)、(c)、(d)和(e)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增，或所述步驟(a), (b)，(c)，(d)，(e)和(f)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。
91.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述確定步驟包括確定存在于所述樣品內(nèi)的所述目標(biāo)核酸的量。
92.一種評估樣品中的目標(biāo)核酸的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和所述目標(biāo)核酸在下述條件下互補(bǔ)的核苷酸序列如果所述目標(biāo)核酸存在于所述樣品中，所述目標(biāo)核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，(b)使所述核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，所述限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開所述核酸的雙鏈部分所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述核酸的雙鏈部分，從而使所述探針核酸中含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與所述探針核酸的至少另一部分分離；(c)使所述探針核酸中含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分與第一報道核酸接觸，所述第一報道核酸包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述第一報道核酸，從而將包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第一核酸的部分與所述第一核酸的至少另一部分分離；(d)使包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第一報道核酸的所述部分與第二報道核酸接觸，所述第二報道核酸包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，所述雙鏈部分包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)， 所述接觸的條件是所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開所述第二核酸，從而使含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述第二核酸的部分與所述第二核酸的至少另一部分分離；和(e)確定所述第一報道核酸，所述第二報道核酸，或所述第一和第二報道核酸的所述部分的存在與否，其中所述報道核酸的所述部分的存在表明所述樣品含有所述目標(biāo)核酸，其中所述報道核酸的所述部分不存在表明所述樣品不含所述目標(biāo)核酸。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述探針核酸是單鏈探針核酸。
94.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述探針核酸結(jié)合在固相載體上。
95.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述探針核酸直接結(jié)合在固相載體上。
96.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分通過所述步驟(b)從所述固相載體上釋放。
97.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。
98.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)和步驟(d)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。
99.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是在第一區(qū)室中進(jìn)行的，所述步驟(c)和步驟(d)是在第二區(qū)室中進(jìn)行的。
100.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)和步驟(b)是通過將所述樣品加到含有所述探針核酸和所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。
101.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(C)和步驟(d)是通過將含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分加入到含有所述第一報道核酸和所述第二報道核酸的區(qū)室中進(jìn)行的。
102.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含(i)單鏈部分，所述單鏈部分含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，以及(ii)雙鏈部分。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈含有與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，與含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
105.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
106.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈的一部分與所述第一核酸鏈雜交，形成所述雙鏈部分。
107.如權(quán)利要求106所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的所述至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述第一核酸鏈的一部分和全部所述第二鏈。
108.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分與所述探針核酸的所述至少另一部分在步驟(b)中分離，所述探針核酸的所述部分包含所述目標(biāo)核酸的至少一部分。
109.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(a)中使用多個所述探針核酸。
110.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(C)中使用多個所述第一報道核酸。
111.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中的所述第一報道核酸相對于來自所述步驟(b)的含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分摩爾過量。
112.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述步驟(d)中使用多個所述第二報道核酸。
113.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中的所述第二報道核酸相對于來自所述步驟(b)的含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分摩爾過量。
114.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中與所述探針核酸的所述至少另一部分分離的含有所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的所述部分的分子數(shù)基本上與所述樣品中存在的所述目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。
115.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸和所述第二報道核酸結(jié)合在固相載體上
116.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸和所述第二報道核酸直接結(jié)合在固相載體上。
117.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸和所述第二報道核酸在同一區(qū)室中結(jié)合在固相載體上。
118.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸中包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分通過所述步驟(c)從所述固相載體上釋放。
119.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于，所述第二報道核酸中包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分通過所述步驟(d)從所述固相載體上釋放。
120.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸包含標(biāo)記。
121.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
122.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第二報道核酸包含標(biāo)記。
123.如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
124.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸和所述第二報道核酸包含標(biāo)記。
125.如權(quán)利要求IM所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸和所述第二報道核酸包含相同標(biāo)記。
126.如權(quán)利要求IM所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
127.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸結(jié)合在固相載體上， 其中所述第一報道核酸中與所述第一報道核酸的所述至少另一部分分離的所述部分含有標(biāo)記，與所述第一報道核酸的所述至少另一部分分離并含有所述標(biāo)記的所述第一報道核酸的所述部分在所述步驟(c)中從所述固相載體上釋放。
128.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，所述第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的所述雙鏈部分。
129.如權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
130.如權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
131.如權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
132.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體 上。
133.如權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈包含標(biāo)記。
134.如權(quán)利要求133所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
135.如權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈包含標(biāo)記。
136.如權(quán)利要求135所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
137.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第二報道核酸結(jié)合在固相載體上， 其中所述第二報道核酸中與所述第二報道核酸的所述至少另一部分分離的所述部分含有標(biāo)記，與所述第二報道核酸的所述至少另一部分分離且含有標(biāo)記的所述第二報道核酸的所述部分在所述步驟(d)中從所述固相載體上釋放。
138.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第二報道核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶，所述第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成包含所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的所述雙鏈部分。
139.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
140.如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
141.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈結(jié)合在固相載體上。
142.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈直接結(jié)合在固相載體上。
143.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第一核酸鏈包含標(biāo)記。
144.如權(quán)利要求143所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
145.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第二核酸鏈包含標(biāo)記。
146.如權(quán)利要求145所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
147.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述第一報道核酸中與所述第一報道核酸的至少另一部分分離的所述部分包含熒光標(biāo)記，與所述第二報道核酸的所述至少另一部分分離的所述第二報道核酸的所述部分包含熒光標(biāo)記，和其中所述確定步驟(e)包括檢測所述熒光標(biāo)記。
148.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(e)包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與所述第一報道核酸的所述至少另一部分分離的所述第一報道核酸的所述部分。
149.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述確定步驟(e)包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測與所述第二報道核酸的所述至少另一部分分離的所述第二報道核酸的所述部分。
150.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)、(b)、(c)和(d)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增，或所述步驟(a), (b)，(c)，(d)和(e)不經(jīng)過核酸擴(kuò)增。
151.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述確定步驟包括確定存在于所述樣品內(nèi)的所述目標(biāo)核酸的量。
152.一種用于評估樣品中目標(biāo)核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和與所述目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的探針核酸， 其中所述目標(biāo)核酸的至少一部分能夠與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。
153.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述探針核酸是單鏈探針核酸。
154.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含固相載體，其中所述探針核酸結(jié)合在所述固相載體上。
155.如權(quán)利要求IM所述的試劑盒，其特征在于，所述探針核酸中包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的至少一部分通過用識別性限制性內(nèi)切核酸酶切割從所述固相載體上釋放，所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶能夠在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切割。
156.如權(quán)利要求155所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶。
157.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述探針核酸包含(i)單鏈部分，所述單鏈部分包含與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列， 和(ii)雙鏈部分。
158.如權(quán)利要求157所述的試劑盒，其特征在于，所述探針核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含與所述目標(biāo)核酸的所述序列互補(bǔ)的所述核苷酸序列，與包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。
159.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含報道核酸，所述報道核酸包含核酸的雙鏈部分，所述核酸的雙鏈部分包含所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
160.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，所述試劑盒包含固相載體，其中所述報道核酸結(jié)合在所述固相載體上。
161.如權(quán)利要求160所述的試劑盒，其特征在于，所述報道核酸直接結(jié)合在所述固相載體上。
162.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述報道核酸包含核酸的單鏈部分。
163.如權(quán)利要求161所述的試劑盒，其特征在于，所述報道核酸包含標(biāo)記。
164.如權(quán)利要求163所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、 酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。
165.如權(quán)利要求163所述的試劑盒，其特征在于，所述報道核酸中包含所述標(biāo)記的一部分能通過由所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶切割與所述報道核酸的至少另一部分分離。
166.如權(quán)利要求163所述的試劑盒，其特征在于，所述報道核酸包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含所述標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。
167.如權(quán)利要求152所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含(a)第一信號放大核酸，所述核酸包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和雙鏈區(qū)段，所述雙鏈區(qū)段具有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，和(b)第二信號放大核酸，所述核酸含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和雙鏈區(qū)段，所述雙鏈區(qū)段具有所述第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
168.—種組合物，其特征在于，包含核酸，所述核酸與限制性內(nèi)切核酸酶共價結(jié)合，所述限制性內(nèi)切核酸酶能酶切雙鏈DNA分子。
169.如權(quán)利要求168所述的組合物，其特征在于，所述核酸含有單鏈區(qū)段，所述單鏈區(qū)段能與目標(biāo)核酸雜交。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測目標(biāo)核酸的方法和材料。提供了例如，用于檢測目標(biāo)核酸存在與否的方法和材料，用于檢測存在于樣品中的目標(biāo)核酸量的方法和材料，用于檢測目標(biāo)核酸存在與否的試劑盒，用于檢測存在于樣品中的目標(biāo)核酸量的試劑盒，以及制備這樣的試劑盒的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102186997SQ200980141331
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者K·D·史密斯, N·亞茲溫科, M·施密特 申請人:卡斯凱德生物體系股份有限公司