專利名稱：利用iPS細(xì)胞和胚泡互補(bǔ)的器官再生法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用iPS細(xì)胞在生物體內(nèi)制作來(lái)自所期望的細(xì)胞的器官的方法。
背景技術(shù)：
在以細(xì)胞移植或器官移植的形式評(píng)論再生醫(yī)療時(shí)，對(duì)具有多分化能的干細(xì)胞的期待很大。由胚泡期受精卵的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊建立的ES細(xì)胞具有多分化能，被用于各種細(xì)胞分化的研究，在體外將其分化誘導(dǎo)成特定的細(xì)胞系譜的分化控制方法的開(kāi)發(fā)是再生醫(yī)學(xué)研究的話題。在使用ES細(xì)胞的體外分化研究中，在胚發(fā)育初期進(jìn)行分化的血細(xì)胞、血管、心肌、 神經(jīng)系統(tǒng)等容易向中胚葉、外胚葉系分化。但是，已知一般的趨勢(shì)是在胚發(fā)育中期以后，通過(guò)細(xì)胞間相互作用難以向復(fù)雜的組織形成和目標(biāo)器官的分化。例如，作為哺乳類的成體腎臟的后腎在胚發(fā)育中期由中間部中胚葉發(fā)育。具體而言，利用后腎間葉細(xì)胞和輸尿管芽上皮這兩種組成部分的相互作用，腎臟開(kāi)始發(fā)育，最終利用向在數(shù)十種其他器官中見(jiàn)不到的程度的多種功能細(xì)胞分化和由上述分化產(chǎn)生的以腎小球、腎小管為中心的復(fù)雜的腎單位結(jié)構(gòu)的構(gòu)成，成體腎臟完成。由于腎臟的發(fā)育時(shí)期和該過(guò)程的復(fù)雜性，可以容易地推察在體外由ES細(xì)胞誘導(dǎo)腎臟是非常費(fèi)事的、困難的工作，認(rèn)為事實(shí)上是不可能的。此外，在腎臟等器官中，體性干細(xì)胞的鑒定尚未確定，已經(jīng)判明一時(shí)盛行研究的骨髓細(xì)胞對(duì)障害腎臟修復(fù)過(guò)程的幫助也沒(méi)有那么大。將具有多分化能的ES細(xì)胞注入胚泡期受精卵的內(nèi)腔時(shí)，產(chǎn)生個(gè)體形成嵌合小鼠。 對(duì)于缺失τ細(xì)胞、B細(xì)胞系譜的Rag-2敲除小鼠，過(guò)去有人報(bào)道了 利用應(yīng)用了該技術(shù)的胚泡互補(bǔ)作用(blastocyst complementation)進(jìn)行的T細(xì)胞、B細(xì)胞系譜的拯救實(shí)驗(yàn)(非專利文獻(xiàn)1)。該嵌合小鼠 測(cè)定被用作確認(rèn)不存在體外測(cè)定系統(tǒng)的T細(xì)胞系譜的分化的體內(nèi)測(cè)定系統(tǒng)。但是，即使一旦明確了在某器官中可以使用這樣的技術(shù)，但由于器官在體內(nèi)的作用、例如缺失器官時(shí)的致死性等不同，所以實(shí)際上難以預(yù)測(cè)在其他器官中是否成功，受各種要因的影響。而且，認(rèn)為這次選擇的器官缺失模型的缺失基因也是重要的要因，這是由于必需選擇在缺失的基因的產(chǎn)生過(guò)程中的功能、特別是在器官形成過(guò)程中的各器官的干/前體細(xì)胞等的分化、維持所必需的轉(zhuǎn)錄因子的緣故。預(yù)想若利用由于體液因子或分泌因子的缺失的原因而顯示出器官缺失的模型，則只有其釋放的因子通過(guò)從來(lái)自ES細(xì)胞的細(xì)胞中釋放出來(lái)而得到補(bǔ)充，在器官水平形成嵌合狀態(tài)。由此認(rèn)為在本發(fā)明中，在器官方面選擇適當(dāng)?shù)哪Ｐ蛣?dòng)物是解決問(wèn)題的要因，考慮到在其他器官中的應(yīng)用時(shí)，難以在其他器官中使用與本發(fā)明顯示出同樣的表型的模型。作為器官再生方法，本發(fā)明人等申請(qǐng)了 PCT/JP2008/51U9。此外，最近誘導(dǎo)型多能性干(iPS)細(xì)胞受到關(guān)注(例如非專利文獻(xiàn)2)。認(rèn)為iPS 細(xì)胞與ES細(xì)胞具有同等的功能。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Chen J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 90 卷，第 45沘_4532 頁(yè)，1993非專利文獻(xiàn) 2 :0kita K 等人，Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448 (7151)313_7、200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于使用可以簡(jiǎn)便制作的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，提供適合產(chǎn)業(yè)用的器官再生的技術(shù)。即，以提供根據(jù)個(gè)人的特性，由皮膚等體細(xì)胞再生“自己的器官”的技術(shù)為課題。此外，本發(fā)明的課題還在于根據(jù)具有目標(biāo)基因組的細(xì)胞，生產(chǎn)誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)以實(shí)施本發(fā)明，從而進(jìn)行使用來(lái)自各種基因組的器官的研究開(kāi)發(fā)。 并且，本發(fā)明還以回避在ES細(xì)胞方面成為問(wèn)題的有關(guān)倫理的問(wèn)題為課題。解決課題的方法本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在胚泡互補(bǔ)方法中，通過(guò)向發(fā)育的胚泡中注入誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞 (iPS細(xì)胞)來(lái)補(bǔ)償胰臟等器官的缺失時(shí)，誕生下一代；本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)胰臟得到補(bǔ)償?shù)霓D(zhuǎn)基因動(dòng)物可以作為建立者(founder)向下一代傳遞表型，由此明確了 可以使用這樣的建立者進(jìn)行器官再生，從而解決了上述課題。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)例如，向以胰臟等器官的缺失為特征的敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (例如小鼠)中移植作為多能細(xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)以補(bǔ)償胰臟，可以高效率地得到作為建立者的產(chǎn)仔。本發(fā)明中明確了 即使使用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，根據(jù)基因型分型的結(jié)果，胰臟得到補(bǔ)償?shù)那贸∈笠舱５匕l(fā)育成成體。得到補(bǔ)償?shù)那贸?本說(shuō)明書以下還稱作“K0”。)小鼠，由于作為建立者向下一代傳遞其表達(dá)型的KO與異型小鼠的交配，理論上按照孟德?tīng)栠z傳定律，應(yīng)該以1/2的概率形成KO或異型個(gè)體，發(fā)現(xiàn)實(shí)際上就是這樣。認(rèn)為當(dāng)為補(bǔ)償了胰臟的KO之間的交配時(shí)，100% 可以在下一代中得到KO個(gè)體，使用了 KO個(gè)體的分析明顯變得容易進(jìn)行。另外，將誘發(fā)器官缺失的導(dǎo)入基因放入卵細(xì)胞中，之后進(jìn)行移植，這即使在以往的轉(zhuǎn)基因(Tg)動(dòng)物制作方法中，通過(guò)向發(fā)育的胚泡中注入ES細(xì)胞來(lái)補(bǔ)償胰臟的缺失時(shí)，以及即使在誕生下一代的較新的方法中，判明也能夠使用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。而且， 即使是誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，也確認(rèn)到胰臟得到補(bǔ)償?shù)霓D(zhuǎn)基因動(dòng)物可以作為建立者向下一代傳遞表型。因此明確了 使用這樣的建立者，即使使用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS 細(xì)胞)，也可以進(jìn)行器官再生。一旦明確了可以對(duì)某器官應(yīng)用本發(fā)明的方法，則理解為對(duì)于該器官，可以根據(jù)成功的事例，加入適當(dāng)?shù)淖兏髴?yīng)用。其理由如下。當(dāng)存在適當(dāng)?shù)娜笔?dòng)物時(shí)，如本說(shuō)明書中所示，使用熒光標(biāo)記的iPS細(xì)胞(例如來(lái)自從皮膚或尾端采集的成纖維細(xì)胞)等，利用同樣的分析方法時(shí)，可以明確所構(gòu)建的器官是來(lái)自宿主還是來(lái)自iPS細(xì)胞等，可以判定能否構(gòu)建器官，根據(jù)同樣的理論，理解為可以再生產(chǎn)下一代的動(dòng)物。
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因此，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。在一種局面中，本發(fā)明提供制造目標(biāo)器官的方法，該方法是在具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常的非人哺乳動(dòng)物的生物體內(nèi)，制造來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的該目標(biāo)器官，該方法包括以下步驟a)制備來(lái)自該異個(gè)體哺乳動(dòng)物的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的步驟；b)將該細(xì)胞移植到該非人哺乳動(dòng)物的胚泡期的受精卵中的步驟；c)使該受精卵在非人臨時(shí)代理(仮親)哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔的步驟·’以及d)由該產(chǎn)仔個(gè)體獲得該目標(biāo)器官的步驟。在一實(shí)施方案中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自人、大鼠或小鼠。
在一實(shí)施方案中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠或小鼠。在一實(shí)施方案中，上述要制造的器官選自胰臟、腎臟、胸腺和毛。在一實(shí)施方案中，上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。在一實(shí)施方案中，上述小鼠為Salll敲除小鼠、Pdxl-Hesl轉(zhuǎn)基因小鼠、Pdx-I敲除小鼠或裸鼠。在一實(shí)施方案中，上述目標(biāo)器官是完全來(lái)自上述異個(gè)體哺乳動(dòng)物的器官。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括使初期化因子與體細(xì)胞接觸而得到上述iPS細(xì)胞的步驟。在一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，上述iPS細(xì)胞和上述非人哺乳動(dòng)物是異種的關(guān)系。在一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠，上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。在另一局面中，本發(fā)明提供非人哺乳動(dòng)物，其具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常，該非人哺乳動(dòng)物是通過(guò)包括下述步驟的方法生產(chǎn)的a)制備來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞的步驟；b)將該iPS細(xì)胞移植到該非人哺乳動(dòng)物的胚泡期的受精卵中的步驟；以及c)使該受精卵在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔的步驟。在又一局面中，本發(fā)明涉及具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常的非人哺乳動(dòng)物在使用iPS細(xì)胞的該目標(biāo)器官的制造中的應(yīng)用。在另一局面中，本發(fā)明提供用于制造目標(biāo)器官的組合，該組合具備A)非人哺乳動(dòng)物，其具有在發(fā)育期該目標(biāo)器官未發(fā)育的異常；以及B)來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞或初期化因子以及所需的體細(xì)胞。在又一局面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)目標(biāo)器官或身體部分的方法，該方法包括以下步驟A)提供動(dòng)物的步驟，所述動(dòng)物包含編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的缺失原因基因、且該器官或身體部分通過(guò)胚泡互補(bǔ)而得到補(bǔ)償， 該步驟中上述缺失原因基因是編碼該目標(biāo)器官或身體部分的缺失原因的基因；B)由該動(dòng)物獲得卵子，并使之發(fā)育成胚泡的步驟；
C)將具有所期望的基因組的目標(biāo)iPS細(xì)胞導(dǎo)入該胚泡中，以生產(chǎn)嵌合胚泡的步驟，該所期望的基因組具有補(bǔ)償由該缺失原因基因引起的缺失的能力；以及D)由該嵌合胚泡生產(chǎn)個(gè)體，再由該個(gè)體獲得該目標(biāo)器官或身體部分的步驟。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括通過(guò)使初期化因子與體細(xì)胞接觸而得到上述iPS細(xì)胞的步驟。在一實(shí)施方案中，上述D)步驟包含使上述嵌合胚泡在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔，再由該產(chǎn)仔個(gè)體獲得該目標(biāo)器官。在另一實(shí)施方案中，上述目標(biāo)iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠或小鼠。在又一實(shí)施方案中，上述目標(biāo)器官或身體部分選自胰臟、腎臟、胸腺和毛。并且，在又一實(shí)施方案中，上述動(dòng)物為小鼠。在又一實(shí)施方案中，上述小鼠為Salll敲除小鼠、Pdx-I敲除小鼠、Pdxl-Hesl轉(zhuǎn)基因小鼠或裸鼠。并且，在又一實(shí)施方案中，上述目標(biāo)器官或身體部分完全來(lái)自上述目標(biāo)多能細(xì)胞。并且，在又一實(shí)施方案中，上述iPS細(xì)胞和上述非人哺乳動(dòng)物是異種的關(guān)系。并且，在又一實(shí)施方案中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠，而上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。在另一局面中，本發(fā)明提供用于制造目標(biāo)器官或身體部分的組合，該組合具備A)非人動(dòng)物，該非人動(dòng)物包含編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的基因、且該器官或身體部分通過(guò)互補(bǔ)(complement)而得到補(bǔ)償；以及B)來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞或初期化因子和所需的體細(xì)胞的組合。在一實(shí)施方案中，上述非人動(dòng)物和上述iPS細(xì)胞是異種的關(guān)系。在本發(fā)明中，根據(jù)要制造的器官的動(dòng)物種制備移植的細(xì)胞。例如，想要制造人的器官時(shí)，制備來(lái)自人的細(xì)胞；想要制造人以外的哺乳動(dòng)物的器官時(shí)，制備來(lái)自該哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。在本發(fā)明中，所移植的細(xì)胞可以使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。在本發(fā)明的方法中，作為要制造的器官，只要是腎臟、心臟、胰臟、小腦、肺臟、甲狀腺、毛和胸腺等具有一定形狀的固形器官，可以是任一種器官，但優(yōu)選列舉腎臟、胰臟、毛和胸腺。這樣的固形器官，通過(guò)在作為接受者的胚中產(chǎn)生全能細(xì)胞或多能細(xì)胞，而在產(chǎn)仔的體內(nèi)制造。通過(guò)在胚中產(chǎn)生全能細(xì)胞或多能細(xì)胞，可以形成所有的器官，所以可以依賴于使用的全能細(xì)胞或多能細(xì)胞的種類而制造的固形器官并不受限制。另一方面，本發(fā)明的特征在于在來(lái)自作為接受者的非人胚的產(chǎn)仔個(gè)體的體內(nèi)形成只來(lái)自所移植的細(xì)胞的器官，并不希望具有來(lái)自作為接受者的非人胚的細(xì)胞與所移植的細(xì)胞的嵌合的細(xì)胞構(gòu)成。因此，作為接受者的非人胚優(yōu)選使用來(lái)自在發(fā)育期要制造的器官未發(fā)育、在出生兒中具有缺失該器官的異常的動(dòng)物的胚。只要是發(fā)生這樣的器官缺失的動(dòng)物，可以是通過(guò)特定的基因缺失而缺失器官的敲除動(dòng)物，或者可以是通過(guò)插入特定的基因而缺失器官的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?；蛘?，可以是本說(shuō)明書中所說(shuō)明的“建立者”動(dòng)物。例如，當(dāng)制造作為器官的腎臟時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用具有在發(fā)育期腎臟未發(fā)育的異常的Salll敲除動(dòng)物(Nishinakamura, R.等人，Development，第1 卷，第 3105-3115頁(yè)，2001)的胚等。當(dāng)制造作為器官的胰臟時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用具有在發(fā)育期胰臟未發(fā)育的異常的Pdx-I敲除動(dòng)物(0ffield，M. F.等人，Development，第122卷，第983-995頁(yè)，1996)的胚；當(dāng)制造作為器官的小腦時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用 具有在發(fā)育期小腦未發(fā)育的異常的Wnt-I (int-Ι)敲除動(dòng)物(McMahon，Α. P.和Bradley， Α.，Cell，第62卷，第1073-1085頁(yè)，1990)的胚；當(dāng)制造作為器官的肺臟、甲狀腺時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用具有在發(fā)育期肺臟和甲狀腺未發(fā)育的異常的T/ebp敲除動(dòng)物 (Kimura, S.等人，Genes and Development，第 10 卷，第 60-69 頁(yè)，1996)的胚等。此外，還可以使用引起腎臟、肺等多個(gè)器官的缺失、且使成纖維細(xì)胞增殖因子(FGF)受體(FGFR)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的缺失型過(guò)度表達(dá)的顯性負(fù)性型轉(zhuǎn)基因突變體動(dòng)物模型(Celli，G.，等人，EMBO J.，第17卷，第1642-655頁(yè)，1998)的胚?；蛘?，可以使用裸鼠，以用于生產(chǎn)毛或胸腺。本發(fā)明中，當(dāng)提及作為接受者的胚的來(lái)源的非人動(dòng)物時(shí)，只要是豬、大鼠、小鼠、 牛、綿羊、山羊、馬、狗、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨、倭黑猩猩等人以外的動(dòng)物，可以是任何動(dòng)物。優(yōu)選從成體大小與要制造的器官的動(dòng)物種相似的非人動(dòng)物中采集胚。另一方面，作為為了形成要制造的器官而被移植到作為接受者的胚泡期的受精卵中的細(xì)胞的來(lái)源的哺乳動(dòng)物，可以是人或人以外的哺乳動(dòng)物、例如豬、大鼠、小鼠、牛、綿羊、 山羊、馬、狗、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨、倭黑猩猩等中的任一種。作為接受者的胚與所要移植的細(xì)胞的關(guān)系可以是同種的關(guān)系，也可以是異種的關(guān)系。將如上操作制備的所要移植的細(xì)胞移植到作為接受者的胚泡期的受精卵的腔內(nèi)， 在胚泡期受精卵的內(nèi)腔中可以形成來(lái)自胚泡的內(nèi)部細(xì)胞和所要移植的細(xì)胞的嵌合的細(xì)胞混合物。將如此操作移植有細(xì)胞的胚泡期受精卵移植到來(lái)自作為臨時(shí)代理的胚泡期受精卵的種的偽妊娠或妊娠雌性動(dòng)物的子宮內(nèi)。使該胚泡期受精卵在臨時(shí)代理子宮內(nèi)發(fā)育，得到產(chǎn)仔。然后，可以由該產(chǎn)仔獲得目標(biāo)器官，作為來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的目標(biāo)器官。因此，關(guān)于本發(fā)明的上述及其他優(yōu)點(diǎn)，閱讀以下的詳細(xì)說(shuō)明即可明白。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供了適于產(chǎn)業(yè)用的器官再生技術(shù)。而且，還提供根據(jù)個(gè)人的特性， 由皮膚等體細(xì)胞再生“自己的器官”的技術(shù)。另外，通過(guò)根據(jù)具有目標(biāo)基因組的細(xì)胞生產(chǎn)誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)以實(shí)施本發(fā)明，還可以進(jìn)行使用來(lái)自各種基因組的器官的研究開(kāi)發(fā)。這在現(xiàn)有技術(shù)中是完全不可能的技術(shù)。此外，本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)關(guān)于在ES細(xì)胞方面成為問(wèn)題的有關(guān)倫理的問(wèn)題， 通過(guò)使用iPS細(xì)胞也可以部分回避，并且可以發(fā)揮同樣的效果。


圖1顯示使用了利用胚泡互補(bǔ)進(jìn)行的來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟構(gòu)建的治療模型。圖2中，a.顯示建立來(lái)自GFP小鼠的iPS細(xì)胞的策略。建立來(lái)自GFP小鼠尾端的成纖維細(xì)胞(Tail tip fibroblast :TTF)后，導(dǎo)入3因子(初期化因子)，用ES細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)25 30天，挑選iPS集落和建立iPS細(xì)胞株。b.顯示使用帶有照相機(jī)的顯微鏡拍攝所建立的iPS細(xì)胞的形態(tài)的照片。左邊顯示GFP-iPS細(xì)胞#2的照片，右邊顯示#3的照片。c.顯示堿性磷酸酶活性的測(cè)定。在熒光顯微鏡下拍攝iPS細(xì)胞，并用堿性磷酸酶染色試劑盒(Vector公司Cat. No. SK-5200)進(jìn)行染色。左起顯示亮視野像、GFP熒光像和堿性磷酸酶染色。d.顯示通過(guò)使用了基因組DNA的PCR導(dǎo)入的3因子(初期化因子)的特定。從 iPS細(xì)胞中提取基因組DNA并進(jìn)行PCR的結(jié)果。上起顯示Klf4、Sox2、0ct3/4、c_Myc和Myog 的基因的表達(dá)。左起顯示GFP-iPS細(xì)胞#2、#3,Nanog-iPS(4因子的圖像)、作為對(duì)照的ES 細(xì)胞(NC)的圖像。最右邊顯示在蒸餾水中的結(jié)果。確認(rèn)到本發(fā)明中使用的iPS細(xì)胞中的 3因子的插入。e.顯示通過(guò)RT-PCR進(jìn)行的本發(fā)明中使用的細(xì)胞中的ES細(xì)胞的特征性基因表達(dá)圖像的分析和導(dǎo)入基因的表達(dá)確認(rèn)。上起為Klf4、Sox2、0ct3/4、c-Myc。顯示Nanog、 ReXl、Gapdh的基因的表達(dá)。最下方顯示陰性對(duì)照(RT(-))。關(guān)于Klf4、SoX2、0ct3/4，分成總RNA和轉(zhuǎn)基因(Tg)來(lái)確認(rèn)表達(dá)。左起顯示GFP-iPS細(xì)胞#2、#3、作為對(duì)照的ES細(xì)胞(NC) 和作為另一對(duì)照的TTF(陰性對(duì)照)的表達(dá)的形態(tài)。最右邊顯示在蒸餾水中的結(jié)果。f.顯示使用iPS細(xì)胞的嵌合小鼠的制作。顯示將所建立的iPS細(xì)胞注入通過(guò)C57BL6與BDFl系統(tǒng)的小鼠的交配而得到的胚泡中，制作嵌合小鼠的結(jié)果。上方顯示胎生第13. 5天的亮視野像(左)、GFP熒光像(右)。下方顯示新生兒期的圖像。記作NC的是陰性對(duì)照。圖3顯示通過(guò)胚泡互補(bǔ)構(gòu)建的胰臟的形態(tài)(出生后第5天)。在同型小鼠中，胰臟的邊緣清晰地由GFP陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成，但在異型小鼠胰臟中，形成點(diǎn)狀的嵌合。圖4顯示來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟的組織學(xué)分析(出生后第5天)。這里，制作來(lái)自iPS 細(xì)胞的胰臟的冷凍切片標(biāo)本，利用DAPI和抗GFP抗體、抗胰島素抗體進(jìn)行染色作為核染色， 利用正象熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行觀察、拍攝。左起顯示亮視野像、GFP+DAPI 的圖像，以及右側(cè)顯示利用抗胰島素抗體進(jìn)行的染色。上圖示板(〃才、^ )顯示向本發(fā)明的PdxlLaeZ/LaeZ中導(dǎo)入GFP-iPS細(xì)胞的圖像，下圖示板顯示向作為對(duì)照的PdXlwtAaeZ中導(dǎo)入 GFP-iPS細(xì)胞的圖像。圖5顯示通過(guò)沉默而成為GFP陰性的細(xì)胞存在的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。從圖3所示的同一小鼠中采集骨髓細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分選GFP-的造血干/前體細(xì)胞(c-Kit+、Sca-I+, Linage標(biāo)記-:KSL細(xì)胞)，在96孔板的每孔中加入1個(gè)細(xì)胞。在添加細(xì)胞因子的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞12天，形成集落，從這些集落中提取基因組DNA，用于基因型判定。由此，即使在 GFP-側(cè)含有通過(guò)基因沉默使GFP的表達(dá)消失的細(xì)胞，也可以進(jìn)行來(lái)自1個(gè)細(xì)胞的克隆的基因判定，可以簡(jiǎn)便地區(qū)別宿主的細(xì)胞、發(fā)生了基因沉默的細(xì)胞。a.顯示使用由骨髓細(xì)胞純化的KSL細(xì)胞的集落形成法的策略；b.顯示培養(yǎng)第12天時(shí)血細(xì)胞集落的形態(tài)；c.顯示使用由各集落提取的DNA的嵌合個(gè)體的基因型判定。a中的圖示板自左起顯示骨髓中的造血干/ 前體細(xì)胞的c-Kit+、ka-l+、Linage-(KSL)的FACS圖像。b中的照片自左起分別顯示培養(yǎng)第12天的集落、中央顯示亮視野像、左邊顯示GFP熒光像。c中顯示按照使用上述Qiagen 公司的試劑盒的方法，從來(lái)自單細(xì)胞的集落中提取DNA，利用PCR法進(jìn)行其基因型判定的結(jié)果。PCR法在與Pdxl產(chǎn)仔判定時(shí)相同的引物和條件下進(jìn)行。圖5A顯示向STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中移植來(lái)自iPS的胰島。a和b顯示胰島的分離。來(lái)自iPS的胰臟從總膽管(a.箭頭)起進(jìn)行膠原酶灌流，密度梯度沉淀后，濃縮來(lái)自表達(dá)EGFP的iPS的胰島(b)。c顯示自胰島移植起2個(gè)月后的腎臟被膜。表達(dá)EGFP的位置 (7 卜)(箭頭)是所移植的胰島。d顯示腎臟切片的HE染色(左圖示板)和利用DAPI 進(jìn)行的GFP染色(右圖示板)。e顯示向STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中移植來(lái)自iPS的150的胰島。箭頭顯示給予抗體混合物(力夕歹>，cocktail)(抗INF- γ、抗TNF- α、抗IL-1 β )的時(shí)刻。自移植起到2個(gè)月后，每隔1周測(cè)定腹腔內(nèi)的血糖值。移植了 iPS胰島的STZ誘發(fā)糖尿病小鼠以▲(黑三角)(n = 6)表示，未移植iPS胰島的STZ誘發(fā)糖尿病小鼠以·(黑四角)表示。f顯示自胰島移植起2個(gè)月后的葡萄糖耐性試驗(yàn)(GTT)。圖6顯示Mill敲除小鼠的利用胚泡互補(bǔ)進(jìn)行的腎臟再生。上方顯示Mill等位基因的基因型判定結(jié)果?？芍?3的小鼠是Salll同型KO小鼠。下方顯示以#3小鼠為宿主，利用iPS細(xì)胞進(jìn)行胚泡互補(bǔ)，再生的腎臟的形態(tài)(生后第1天)?？芍谕蚄O小鼠中，整個(gè)腎臟清晰地由GFP陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成。明確了 使用Salll敲除小鼠，可以制作來(lái)自iPS 細(xì)胞的腎臟。圖7顯示使用來(lái)自B6的iPS細(xì)胞進(jìn)行胚泡互補(bǔ)，確認(rèn)生出的嵌合小鼠長(zhǎng)有毛的照片。#1是C57BL/6(B6)野生型(對(duì)照)小鼠，可見(jiàn)黑色的毛。#3是KSN裸鼠(對(duì)照)，沒(méi)有毛。#2、#4和#5顯示得到的3只嵌合小鼠，這些個(gè)體長(zhǎng)有毛。圖8是確認(rèn)嵌合小鼠和對(duì)照小鼠的胸腺的發(fā)育的圖。在C57BL/6(B6)野生型小鼠 (對(duì)照)中確認(rèn)到胸腺。裸鼠中不存在胸腺。另一方面，在嵌合小鼠中確認(rèn)到胸腺。圖9顯示分別將來(lái)自C57BL/6 (B6)野生型(對(duì)照)小鼠和圖7的嵌合小鼠(#2、 #4和#5)的末梢血分離成CD4、CD8陽(yáng)性細(xì)胞(T細(xì)胞)，分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)果。由GFP 陰性細(xì)胞和GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布顯示出嵌合度。圖10顯示使雄性Pdxl(-/_)小鼠(建立者利用小鼠iPS細(xì)胞來(lái)補(bǔ)償胰臟的 PdxK-/-)小鼠)與雌性Pdxl (+/-)小鼠交配，采集受精卵，使其在體外發(fā)育直至胚泡期，在顯微鏡下向得到的胚泡中微量注射10個(gè)用EGFP標(biāo)記的大鼠iPS細(xì)胞。將其移植到疑似妊娠臨時(shí)代理中，妊娠期滿開(kāi)腹，分析所得的新生兒的結(jié)果。在熒光實(shí)體顯微鏡下觀察EGFP 熒光時(shí)，由體表的EGFP表達(dá)可知個(gè)體編號(hào)#1、#2、#3為嵌合小鼠。開(kāi)腹時(shí)在#1、#2中可見(jiàn)一樣表達(dá)EGFP的胰臟。另一方面，#3的胰臟雖然部分性地呈現(xiàn)EGFP的表達(dá)，但為馬賽克狀。#4和#1 3是同腹仔，但在體表沒(méi)有見(jiàn)到EGFP熒光，由于開(kāi)腹時(shí)缺失胰臟，所以是非嵌合的Pdxl(-/-)小鼠。此外，從這些新生兒中摘出脾臟，將從中制備的血細(xì)胞用抗小鼠或大鼠的CD45的單克隆抗體進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。其結(jié)果，在個(gè)體編號(hào)#1 #3中同時(shí)確認(rèn)到小鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞和大鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞，由此確認(rèn)它們是夾雜有來(lái)自宿主小鼠和大鼠的iPS細(xì)胞的細(xì)胞的小鼠-大鼠異種間嵌合個(gè)體。并且，大鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞分離中的細(xì)胞幾乎全部呈現(xiàn)EGFP熒光，所以大鼠⑶45陽(yáng)性細(xì)胞是來(lái)自用EGFP標(biāo)記的大鼠iPS細(xì)胞的細(xì)胞。圖IOA顯示利用PCR進(jìn)行的個(gè)體編號(hào)#1 #3的宿主小鼠的Pdxl基因型的確認(rèn)。 為了確認(rèn)宿主小鼠的基因型，從與圖10相同的脾臟樣品中回收?qǐng)D10的用點(diǎn)線方框圍起來(lái)的小鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞，提取基因組DNA，使用可以識(shí)別Pdxl的突變型等位基因或野生型等位基因的引物進(jìn)行PCR。其結(jié)果，在#1和#2中只確認(rèn)到突變型的譜帶，在個(gè)體編號(hào)#3中檢測(cè)到突變型和野生型兩者的譜帶。由此可知在#1和#2中，宿主的基因型為Pdxl(-/_)； 在個(gè)體編號(hào)#3中，宿主的基因型為Pdxl (+/")。由該結(jié)果可知在本來(lái)不應(yīng)該形成胰臟的 PdxK-/")小鼠即#1、#2中，通過(guò)應(yīng)用以大鼠iPS細(xì)胞為供體的異種間胚泡互補(bǔ)技術(shù)，成功地在小鼠個(gè)體內(nèi)構(gòu)建了大鼠的胰臟。
具體實(shí)施方式
以下，說(shuō)明本發(fā)明。在整篇本說(shuō)明書中，只要沒(méi)有特別言及，則單數(shù)形式的表達(dá)應(yīng)理解為還包含其復(fù)數(shù)形式的概念。因此，只要沒(méi)有特別言及，則單數(shù)形式的冠詞(例如英語(yǔ)的“a”、“an”、“the”等)應(yīng)理解為還包含其復(fù)數(shù)形式的概念。此外，本說(shuō)明書中使用的用語(yǔ)，只要沒(méi)有特別言及，則應(yīng)理解為以該領(lǐng)域中通常使用的意義使用。因此，只要沒(méi)有另外定義，則本說(shuō)明書中使用的所有專業(yè)用語(yǔ)和科學(xué)技術(shù)用語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的意義相同的意義。發(fā)生矛盾時(shí)，本說(shuō)明書(包含定義)優(yōu)先。為了具體說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，以下記載例示的實(shí)施方案。以下，作為例示，說(shuō)明在小鼠的生物體內(nèi)制造來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的腎臟的方法。可理解為胰臟、毛、胸腺也可以通過(guò)這樣的方法來(lái)制作。(非人動(dòng)物)為了在小鼠等動(dòng)物的生物體內(nèi)制造來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的腎臟，準(zhǔn)備具有在發(fā)育期腎臟未發(fā)育的異常的小鼠等動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為具有在發(fā)育期腎臟未發(fā)育的異常的小鼠，可以使用Salll敲除小鼠(Nishinakamura，R.等人， Development，第1 卷，第3105-3115頁(yè)，2001)。該動(dòng)物具有以下特征當(dāng)為Salll (-/") 的同型接合體敲除基因型時(shí)，只有腎臟沒(méi)有發(fā)育，在產(chǎn)仔個(gè)體中不存在腎臟。或者，還可以使用本說(shuō)明書中說(shuō)明的建立者動(dòng)物。該小鼠在Mill基因的缺失為同型的狀態(tài)(Salll(-/-))下，腎臟沒(méi)有形成，無(wú)法存活，所以以Salll基因的缺失為異型的狀態(tài)(Salll(+/-))維持。使這樣的異型狀態(tài)的小鼠之間交配(&ι ιι(+/-)χ&ι ιι(+/-))，從子宮內(nèi)采集受精卵。受精卵在概率上以 SallK+/+) SallK+/") Salll (-/") =1:2: 1 的概率產(chǎn)生。本發(fā)明中使用以 25% 的概率產(chǎn)生的Mill (-/-)的胚。但是，在初期胚的階段難以確定基因型，現(xiàn)實(shí)中是在出生后確定產(chǎn)仔的基因型，在之后的步驟中只使用具有目標(biāo)Mill (-/-)的基因型的個(gè)體。對(duì)于該敲除小鼠，可以在制作階段敲除Salll基因，同時(shí)在可表達(dá)的狀態(tài)下向 Mill基因區(qū)敲入檢測(cè)用的熒光蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)的基因(Takasato，M.等， Mechanisms of Development (發(fā)育機(jī)理)，第 121 卷，第 547-557 頁(yè)，2004)。若通過(guò)敲入這樣的熒光蛋白，該基因的調(diào)節(jié)區(qū)被激活，則GFP代替Salll產(chǎn)生表達(dá)，可以通過(guò)熒光檢測(cè)確定Mill基因的缺失狀態(tài)。本發(fā)明中，作為接受者的胚與所移植的細(xì)胞的關(guān)系可以是同種的關(guān)系，也可以是異種的關(guān)系。關(guān)于這樣的異種間的嵌合動(dòng)物的制作，一直以來(lái)在該技術(shù)領(lǐng)域有許多報(bào)道，例如，實(shí)際中有人報(bào)道了大鼠-小鼠間的嵌合制作(Mulnard, J. G.，C. R. Acad. Sci. Paris. 276,379-381 (1973) ；Stern, Μ. S. , Nature. 243,472-473(1973) ；Tachi, S. & Tachi， C. Dev. Biol. 80，18-27(1980) ； Zei lmarker, G.，Nature, 242,115-116 (1973))、綿羊-山羊間的嵌合制作(Fehilly,C. B.，等人，Nature，307，634-636 (1984))等近緣動(dòng)物種間的胚泡嵌合動(dòng)物。因此，本發(fā)明中，例如在小鼠的生物體內(nèi)制作來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的腎臟時(shí)，根據(jù)這些一直以來(lái)已知的嵌合制作方法(例如將移植的細(xì)胞插入作為接受者的胚泡中的方法(Fehilly, C. B.，等人，Nature，307，6；34_636 (1984)))，可以在作為接受者的胚中制作異種的某器官。本說(shuō)明書中，“非人哺乳動(dòng)物”是指使用所移植的細(xì)胞制作嵌合動(dòng)物或嵌合胚等的對(duì)方的哺乳動(dòng)物。本說(shuō)明書中，“異個(gè)體哺乳動(dòng)物”是指不同于上述非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的任意的哺
11乳動(dòng)物，可以是同種異個(gè)體，也可以是異種的。本說(shuō)明書中，“非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物”是指，通過(guò)移植來(lái)自不同于非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的細(xì)胞而生成的受精卵在其母胎中發(fā)育(作為臨時(shí)代理)的哺乳動(dòng)物。需要說(shuō)明的是，“非人哺乳動(dòng)物”和“非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物”有時(shí)稱作“非人宿主哺乳動(dòng)物”或“宿主”，應(yīng)該理解為“非人哺乳動(dòng)物”和“非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物”是互不相同的動(dòng)物，在本發(fā)明的上下文中是指哪一個(gè)，本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的。制造作為器官的胰臟時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用具有在發(fā)育期胰臟未發(fā)育的異常的PdX-I敲除動(dòng)物(Offield，M.F.，等人，Development，第122卷，第983-995頁(yè)， 1996)、或本說(shuō)明書中說(shuō)明的建立者動(dòng)物的胚。制造作為器官的毛時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用沒(méi)有長(zhǎng)毛的裸鼠的胚。制造作為器官的胸腺時(shí)，作為接受者的非人胚可以使用裸鼠的胚。(所要移植的細(xì)胞)接下來(lái)，以腎臟為例，說(shuō)明所要移植的細(xì)胞時(shí)，作為用于制造來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的腎臟的所要移植的細(xì)胞，準(zhǔn)備iPS細(xì)胞(參照非專利文獻(xiàn)2等)等。該細(xì)胞具有Mill基因的野生型的基因型(Mill (+/+))，并具有在腎臟的所有細(xì)胞中發(fā)育的能力。該細(xì)胞在移植前可以以可表達(dá)的狀態(tài)插入用于特異性檢測(cè)的熒光蛋白。例如，作為這樣的檢測(cè)用熒光蛋白，可以對(duì)DsRed的基因突變體、DsRed. !^(Bevis B. J.和Glick B. S.，Nature Biotechnology第20卷，第83-87頁(yè)，2002)進(jìn)行序列設(shè)計(jì)，使之通過(guò)CAG啟動(dòng)子(巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子)的調(diào)節(jié)幾乎在全身器官中表達(dá)，之后利用電穿孔法插入iPS細(xì)胞中。作為這樣的熒光蛋白，可以使用綠色熒光蛋白(GFP)等該領(lǐng)域中公知的熒光蛋白。通過(guò)對(duì)這樣的移植用細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以容易地檢測(cè)所制造的器官是否只由所移植的細(xì)胞構(gòu)成。將該小鼠iPS細(xì)胞等移植到具有上述的&illl(-/_)的基因型的胚泡期受精卵的內(nèi)腔中，制作具有嵌合的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊的胚泡期受精卵，使具有嵌合的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊的該胚泡期受精卵在臨時(shí)代理的子宮內(nèi)發(fā)育，得到產(chǎn)仔。使用未標(biāo)記的iPS細(xì)胞時(shí)，在用于嵌合制作時(shí)無(wú)法與宿主的胚側(cè)進(jìn)行區(qū)別，無(wú)法識(shí)別器官是否得到補(bǔ)償。因此，為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)向iPS細(xì)胞株中導(dǎo)入熒光色素，可以利用實(shí)施例等中記載的常規(guī)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(繁殖用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法)本發(fā)明中使用的繁殖用的建立者動(dòng)物具有以下特征包含編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的基因、且該器官或身體部分通過(guò)胚泡互補(bǔ)而得到補(bǔ)償。通過(guò)使用該動(dòng)物(在本說(shuō)明書中還稱作“建立者動(dòng)物”。)生產(chǎn)下一代動(dòng)物， 可以使目標(biāo)器官缺失，對(duì)于該器官，生產(chǎn)具有所期望的基因組型的器官。而且判明利用該方法進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，在下一代中也可以生產(chǎn)器官，可知就連iPS細(xì)胞也可以使用，所以為本發(fā)明在產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用打開(kāi)了道路。本說(shuō)明書中，“若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分”是指，當(dāng)言及某因子時(shí)，若通過(guò)該因子使器官或身體部分缺失或功能不全(例如不正常)，則無(wú)法存活或難以存活。例如，當(dāng)為外來(lái)基因時(shí)，將該基因?qū)肷镏?，若該基因正常表達(dá)，則某器官或身體部分中發(fā)生缺損，其結(jié)果，無(wú)法存活或難以存活。難以存活包括下一代沒(méi)有留下子孫、以及當(dāng)為人時(shí)在社會(huì)生活中伴有障礙。作為器官或身體部分，例如有胰臟、肝臟、毛、胸腺等，但并不限于這些。作為與這樣的現(xiàn)象有關(guān)的基因，例如可以列舉Pdx-I (其所對(duì)應(yīng)的胰臟)等。需要說(shuō)明的是，用于器官生產(chǎn)時(shí)，應(yīng)該選擇補(bǔ)償器官、且不會(huì)因?yàn)槌艘酝獾囊?(無(wú)法從母親小鼠攝取乳汁等)而在出生后死亡的基因。作為這樣的基因，可以列舉Pdx-1。 可以使用具有這種性質(zhì)的基因來(lái)實(shí)施本發(fā)明。而且，例如，即使表型與胰臟的缺失相同，但含義也大不相同，具體而言，具有以下特征通過(guò)敲除，生產(chǎn)效率提高；通過(guò)轉(zhuǎn)基因，除生產(chǎn)效率提高以外，還可以進(jìn)行致死表型的克隆分析。本說(shuō)明書中，“若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活”是指，關(guān)于某要因，若該要因發(fā)揮功能，則作為宿主的動(dòng)物完全無(wú)法存活而死亡，或者，雖然能夠存活，但由于難以成長(zhǎng)或難以生殖等原因，之后的存活實(shí)質(zhì)上是不可能的，在該領(lǐng)域可以使用通常的知識(shí)來(lái)理解。本說(shuō)明書中，“器官”在該領(lǐng)域以通常的意義使用，是指構(gòu)成動(dòng)物身體的一般器官。本說(shuō)明書中，“身體部分”是指身體的任一部分，通常還包括不被稱作器官的部分。 例如，以腎臟為例，當(dāng)具有正?；驎r(shí)，雖然生成完全的腎臟，但若某基因缺失或存在異常， 則雖然形成腎臟這樣的器官，但其中一部分出現(xiàn)異?；蛉笔?，出現(xiàn)這樣的異?；蛉笔У牟糠挚梢宰鳛樵摗吧眢w部分”的例子。基因的缺失或異常未必對(duì)應(yīng)于每一個(gè)器官，但往往會(huì)對(duì)其一部分產(chǎn)生影響，所以考慮到與基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系時(shí)，最好還要考慮到在身體部分的對(duì)應(yīng)， 在本說(shuō)明書中，也會(huì)考慮這種對(duì)應(yīng)關(guān)系。本說(shuō)明書中，“胚泡互補(bǔ)(作用)”(英文中稱作blastocyst complementation)是指，若將具有多分化能的ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等多能細(xì)胞注入胚泡期受精卵的內(nèi)腔，則產(chǎn)生個(gè)體形成嵌合小鼠，利用這種現(xiàn)象，補(bǔ)償缺失的器官或身體部分的技術(shù)。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)關(guān)于被認(rèn)為是困難的胚泡互補(bǔ)，可以在動(dòng)物、特別是非人動(dòng)物的生物體內(nèi)制作腎臟、胰臟、毛和胸腺等具有包含多種細(xì)胞的復(fù)雜的細(xì)胞構(gòu)成的哺乳動(dòng)物的器官，并確認(rèn)這即使使用iPS 細(xì)胞也可以實(shí)施。因此，該技術(shù)在本發(fā)明中可以使用iPS細(xì)胞進(jìn)行全面利用。本說(shuō)明書中，“標(biāo)記”只要是用于識(shí)別所補(bǔ)償?shù)钠鞴?，可以是任何因子。例如，通過(guò)使特定的基因(例如表達(dá)熒光蛋白的基因等)只在所補(bǔ)償?shù)钠鞴僦斜磉_(dá)，可以根據(jù)該特定基因產(chǎn)生的性質(zhì)(例如熒光)，從補(bǔ)償?shù)乃拗髦凶R(shí)別要補(bǔ)償?shù)钠鞴佟Ｈ绱瞬僮?，可以區(qū)別是來(lái)自外部細(xì)胞的細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)償而成為完全的動(dòng)物、還是來(lái)自內(nèi)部細(xì)胞的細(xì)胞得到補(bǔ)償而成為完全的動(dòng)物，由此可以更簡(jiǎn)單地選擇本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物。該細(xì)胞在移植前可以以可表達(dá)的狀態(tài)插入用于特異性檢測(cè)的熒光蛋白。例如，作為這樣的檢測(cè)用熒光蛋白，可以對(duì) DsRed 的基因突變體、DsRed. T4 (Bevis B. J.和 Glick B. S.，Nature Biotechnology 第 20卷，第83-87頁(yè)，200 進(jìn)行序列設(shè)計(jì)，使之通過(guò)CAG啟動(dòng)子(巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子)的調(diào)節(jié)幾乎在全身器官中表達(dá)，之后利用電穿孔法插入ES細(xì)胞中。通過(guò)對(duì)這樣的移植用細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以容易地檢測(cè)所制造的器官是否只由所移植的細(xì)胞構(gòu)成。這樣的標(biāo)記的例子有例如綠色熒光蛋白(GFP)基因、紅色熒光蛋白(RFP)、藍(lán)色熒光蛋白(CFP)、其他熒光蛋白和LacZ等。生產(chǎn)本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的方法包括以下步驟A)提供具有上述基因的第一多能細(xì)胞的步驟；B)使該第一多能細(xì)胞發(fā)育成胚泡的步驟；C)向該胚泡中導(dǎo)入具有補(bǔ)償該基因所引起的缺失的能力的第二多能細(xì)胞，以生產(chǎn)嵌合胚泡的步驟；D)由該嵌合胚泡生產(chǎn)個(gè)體，選擇通過(guò)該第二多能細(xì)胞使上述器官或其一部分得到補(bǔ)償?shù)膫€(gè)體的步驟。本說(shuō)明書中，“編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的(缺失原因)基因”或“缺失原因基因”可以交換使用，當(dāng)言及某基因時(shí)，是指若通過(guò)該因子發(fā)揮功能(例如，當(dāng)為外來(lái)基因時(shí)，將其導(dǎo)入并表達(dá)；或者，當(dāng)為內(nèi)源性基因時(shí)，這樣的基因在發(fā)揮功能的條件下等)，器官或身體部分缺失或功能不全(例如不正常)，則無(wú)法存活或難以存活的基因。本說(shuō)明書中，“多能細(xì)胞”可以列舉卵細(xì)胞、胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞)或誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)、多能生殖干細(xì)胞(mGS細(xì)胞)等。本說(shuō)明書中，“第一多能細(xì)胞”是指，被用作適合作為建立者動(dòng)物等的宿主(本說(shuō)明書中也稱作宿主。)的起源的多能細(xì)胞或來(lái)自該多能細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊，優(yōu)選使用受精卵、 胚。本說(shuō)明書中，言及“第二多能細(xì)胞”時(shí)，是指以要生產(chǎn)的器官為目的而使用的多能細(xì)胞，使用iPS細(xì)胞。本說(shuō)明書中，關(guān)于“具有補(bǔ)償缺失的能力”，當(dāng)言及因子或基因等時(shí)，是指可以補(bǔ)償器官或身體部分的能力。本說(shuō)明書中，“嵌合胚泡”是指，來(lái)自第一多能細(xì)胞的細(xì)胞與來(lái)自第二多能細(xì)胞的細(xì)胞形成嵌合狀態(tài)而形成的胚泡。這樣的嵌合胚泡，除了利用注入法來(lái)生產(chǎn)以外，還可以通過(guò)利用稱作“凝集法”的使“胚+胚”或“胚+細(xì)胞”在培養(yǎng)皿內(nèi)密著來(lái)制作嵌合胚泡的方法等來(lái)生產(chǎn)。此外，本發(fā)明中，作為接受者的胚與所移植的細(xì)胞的關(guān)系可以是同種的關(guān)系， 也可以是異種的關(guān)系。關(guān)于這樣的異種間的嵌合動(dòng)物的制作，一直以來(lái)在該技術(shù)領(lǐng)域有許多報(bào)道，例如，實(shí)際上有人報(bào)道了大鼠-小鼠間的嵌合制作(Mulnard,J. G.，C. R. Acad. Sci. Paris. 276,379-381 (1973) ；Stern, Μ. S. , Nature. 243,472-473(1973) ；Tachi, S. & Tachi, C. Dev. Biol. 80，18-27(1980) ； Zei lmarker, G.，Nature, 242,115-116 (1973))、綿羊-山羊間的嵌合制作(Fehilly,C. B.，等人，Nature，307，634-636 (1984))等近緣動(dòng)物種間的胚泡嵌合動(dòng)物。因此，本發(fā)明中，例如在小鼠的生物體內(nèi)制作來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的腎臟時(shí)，根據(jù)上述一直以來(lái)已知的嵌合制作方法(例如將移植的細(xì)胞插入作為接受者的胚泡中的方法(Fehilly, C. B.，等人，Nature，307，6；34_636 (1984)))，可以在作為接受者的胚中制作異種的某器官。在本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法中，提供具有編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的基因(在本說(shuō)明書中，還稱作“缺失原因基因”。)的第一多能細(xì)胞的步驟，例如，可以通過(guò)供給攜帶該基因的多能細(xì)胞、或向多能細(xì)胞中導(dǎo)入該基因以生產(chǎn)攜帶該基因的多能細(xì)胞來(lái)實(shí)施。這樣的基因?qū)敕椒ㄔ谠擃I(lǐng)域眾所周知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇以實(shí)施這樣的基因?qū)搿?yōu)選使用電穿孔。其理由在于 通過(guò)對(duì)細(xì)胞懸浮液施加電脈沖，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生微小的孔，之后使DNA送達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，從而發(fā)生轉(zhuǎn)化即目標(biāo)基因的導(dǎo)入，所以之后的損傷少等，但并不限于此。在本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法中，使第一多能細(xì)胞(例如受精卵、胚等)發(fā)育成胚泡的步驟，可以利用用于使多能細(xì)胞成為胚泡的任意的公知的成長(zhǎng)方法來(lái)實(shí)施。這樣的條件在該領(lǐng)域眾所周知,記載在Manipulating the Mouse Embryo A LABORATORY
14MANUAL (小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南)第 3 版 2002 (Cold Spring Harbar Labolatory Press, Cold Spring Harbor, New York)(在本說(shuō)明書中作為參考而引用。)。在本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法中，向胚泡中導(dǎo)入作為具有補(bǔ)償由該基因引起的缺失的能力的第二多能細(xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)以生產(chǎn)嵌合胚泡的步驟，只要能夠?qū)⒆鳛榈诙嗄芗?xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)導(dǎo)入胚泡中，可以使用該領(lǐng)域中公知的任何方法。作為這樣的方法，例如有注入法或凝集，但并不限于這些方法。本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法中，由嵌合胚泡生產(chǎn)個(gè)體的方法可以使用該領(lǐng)域中公知的方法。通常是將上述嵌合胚泡放回臨時(shí)代理的胎中，使其臨時(shí)妊娠，并在臨時(shí)代理的胎內(nèi)成長(zhǎng)，但并不限于這種方法。在本發(fā)明中使用的建立者動(dòng)物的生產(chǎn)方法中，選擇器官或其身體部分得到補(bǔ)償?shù)钠鞴倩蚱渖眢w部分，這可以采用能夠確認(rèn)該器官或身體部分的補(bǔ)償?shù)娜我獾姆椒▉?lái)實(shí)施。作為這樣的例子，可以列舉識(shí)別來(lái)自作為第二多能細(xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞 (iPS細(xì)胞)的識(shí)別子。本說(shuō)明書中，“識(shí)別子”是指，可以特定某個(gè)體或種等、且特定其來(lái)源的任意的因子，還簡(jiǎn)稱為“ID”。這樣的識(shí)別子例如可以是作為第二多能細(xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)所特有的基因組的序列、表達(dá)型等?；蛘?，這樣的選擇可以通過(guò)使用標(biāo)記的細(xì)胞或可被標(biāo)記的細(xì)胞(還包括通過(guò)基因表達(dá)形成標(biāo)記的細(xì)胞)作為第二多能細(xì)胞， 鑒定該標(biāo)記，來(lái)實(shí)施本發(fā)明的建立者小鼠的生產(chǎn)方法中的選擇。此外，可以理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)馗纳圃摲椒ê髮?shí)施。(使用建立者動(dòng)物的器官再生方法)在另一局面中，本發(fā)明提供使用建立者動(dòng)物，利用誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞) 來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)器官或身體部分的方法。該方法包括以下步驟提供建立者動(dòng)物的步驟，該步驟中建立者動(dòng)物中的缺失原因基因是編碼該目標(biāo)器官或身體部分的缺失原因的基因；B)由該動(dòng)物得到卵子，使其發(fā)育成胚泡的步驟；C)向該胚泡中導(dǎo)入具有所期望的基因組的目標(biāo)多能細(xì)胞的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，以生產(chǎn)嵌合胚泡的步驟，該所期望的基因組具有補(bǔ)償由該基因引起的缺失的能力；以及D)由該嵌合胚泡生產(chǎn)個(gè)體，再由該個(gè)體獲得該目標(biāo)器官或身體部分的步驟。這里，該D)步驟可以如下實(shí)施使上述嵌合胚泡在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育，得到產(chǎn)仔，再由該產(chǎn)仔個(gè)體得到該目標(biāo)器官，由此即可實(shí)施。(胰臟的形成)關(guān)于胰臟的形成，可以采用肉眼之所見(jiàn)、染色后的顯微鏡觀察、或利用熒光的觀察等方法，進(jìn)行宏觀或微觀的形態(tài)學(xué)分析、基因表達(dá)分析等，從而可以研究胰臟的形成。例如，通過(guò)進(jìn)行肉眼觀察，可以研究器官是否實(shí)際存在、或器官的外觀等特征。還可以與這樣的宏觀形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，利用顯微鏡在微觀上觀察蘇木素-伊紅染色等一般的組織染色后的組織。通過(guò)這樣的微觀觀察，就連具體的胰臟內(nèi)部的各種細(xì)胞的構(gòu)成也可以一并研究。并且，根據(jù)條件，還可以以發(fā)熒光的方式，進(jìn)行使用熒光的基因表達(dá)分析。例如，當(dāng)為通過(guò)上述的Pdxl-Lac-Z敲入而產(chǎn)生的敲除小鼠時(shí)，在野生型(+/+)或異型(+/-)個(gè)體中，使用熒光標(biāo)記的ES細(xì)胞時(shí)，即使可見(jiàn)其有用之處，但顯示出斑雜的嵌合狀態(tài)的熒光，而在同型(-/_)個(gè)體中，由于胰臟完全由來(lái)自ES細(xì)胞的細(xì)胞構(gòu)建，所以具有均勻地呈現(xiàn)出一樣的熒光的特征。利用這樣的特質(zhì)，可以簡(jiǎn)便地研究目標(biāo)器官或構(gòu)成器官的細(xì)胞的PdXl 基因是哪一種基因型。使用未標(biāo)記的iPS細(xì)胞時(shí)，在用于制作嵌合的情況下，無(wú)法與宿主的胚側(cè)進(jìn)行區(qū)別，無(wú)法確認(rèn)器官是否得到補(bǔ)充。因此，為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)向iPS細(xì)胞株中導(dǎo)入熒光色素，可以按照上述同樣的操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。而且，當(dāng)使用以上那樣的細(xì)胞時(shí)，可以按照與使用iPS細(xì)胞的情形相同的操作規(guī)程制作器官，并明確其來(lái)源。(腎臟的形成)關(guān)于腎臟的形成，可以采用肉眼之所見(jiàn)、染色后的顯微鏡觀察、或利用熒光的觀察等方法，進(jìn)行宏觀或微觀的形態(tài)學(xué)分析、基因表達(dá)分析等，從而可以研究腎臟的形成。例如，通過(guò)進(jìn)行肉眼觀察，可以研究器官是否實(shí)際存在、器官的外觀等特征。還可以與這樣的宏觀形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，利用顯微鏡在微觀上觀察蘇木素-伊紅染色等一般的組織染色后的組織。通過(guò)這樣的微觀觀察，就連具體的腎臟內(nèi)部的各種細(xì)胞的構(gòu)成也可以一并研究。并且，根據(jù)條件，還可以以發(fā)熒光的方式，進(jìn)行使用熒光的基因表達(dá)分析。例如，當(dāng)為上述的Salll基因敲除小鼠時(shí)，在Salll基因的缺失為同型狀態(tài)(Salll(-/-))的情況下，由于GFP的熒光由兩個(gè)烯丙基產(chǎn)生，所以具有下述特征與只從一方的烯丙基產(chǎn)生熒光的Mill基因的缺失為異型狀態(tài)(Salll(+/-))的熒光相比，熒光量變少。利用這樣的特質(zhì)， 可以簡(jiǎn)便地研究目標(biāo)器官或構(gòu)成器官的細(xì)胞的Mill基因是哪一種基因型。使用未標(biāo)記的 iPS細(xì)胞時(shí)，在用于嵌合制作時(shí)，無(wú)法與宿主的胚側(cè)進(jìn)行區(qū)別，無(wú)法識(shí)別器官是否得到補(bǔ)充。 因此，為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)向iPS細(xì)胞株中導(dǎo)入熒光色素，可以明確其來(lái)源。(毛的形成)關(guān)于毛的形成，可以采用肉眼之所見(jiàn)、或利用熒光的觀察等方法，進(jìn)行宏觀或微觀的形態(tài)學(xué)分析、基因表達(dá)分析等，從而可以研究毛的形成。例如，通過(guò)進(jìn)行肉眼觀察，可以研究毛是否實(shí)際存在、毛的外觀等特征。還可以與這樣的宏觀形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，利用顯微鏡在微觀上觀察蘇木素-伊紅染色等一般的組織染色后的組織。通過(guò)這樣的微觀觀察，就連具體的毛內(nèi)部的各種細(xì)胞的構(gòu)成也可以一并研并且，根據(jù)條件，還可以以發(fā)熒光的方式，進(jìn)行使用熒光的基因表達(dá)分析。例如，當(dāng)為上述的裸鼠時(shí)，由于毛本身的熒光強(qiáng)，所以在熒光顯微鏡下用肉眼判斷產(chǎn)生的毛是來(lái)自裸鼠還是來(lái)自iPS細(xì)胞非常困難，但也可以通過(guò)適當(dāng)觀察熒光的方法來(lái)觀察。利用這樣的特質(zhì)，可以簡(jiǎn)便地研究目標(biāo)器官或構(gòu)成器官的細(xì)胞是哪一種基因型。使用未標(biāo)記的iPS細(xì)胞時(shí)，在用于嵌合制作時(shí)，無(wú)法與宿主的胚側(cè)進(jìn)行區(qū)別，無(wú)法識(shí)別器官是否得到補(bǔ)充。因此， 為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)向iPS細(xì)胞株中導(dǎo)入熒光色素，可以按照與上述相同的操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。而且，使用以上那樣的細(xì)胞時(shí)，可以按照與使用iPS細(xì)胞時(shí)相同的操作規(guī)程制作器官，并明確其來(lái)源。(胸腺的形成)關(guān)于胸腺的形成，可以利用肉眼之所見(jiàn)、顯微鏡照片、利用FACS或熒光的觀察等方法，進(jìn)行宏觀或微觀的形態(tài)學(xué)分析、基因表達(dá)分析等，從而可以研究胸腺的形成。例如，通過(guò)進(jìn)行肉眼觀察，可以研究器官是否實(shí)際存在、器官的外觀等特征。還可以與這樣的宏觀形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，利用顯微鏡在微觀上觀察蘇木素-伊紅染色等一般的組織染色后的組織。通過(guò)這樣的微觀觀察，就連具體的胸腺內(nèi)部的各種細(xì)胞的構(gòu)成也可以
一并研究。并且，根據(jù)條件，還可以以發(fā)熒光的方式，進(jìn)行使用熒光的基因表達(dá)分析。例如，當(dāng)為上述的裸鼠時(shí)，以往雖然不具有胸腺，但不影響存活，所以以缺失的狀態(tài)自然出生、存活。 通過(guò)胚泡互補(bǔ)向其中注入熒光標(biāo)記的iPS細(xì)胞時(shí)，確認(rèn)到iPS細(xì)胞的有用之處的個(gè)體中多數(shù)具有持有呈現(xiàn)熒光的胸腺的特征。利于這樣的特質(zhì)，可以簡(jiǎn)便地研究目標(biāo)器官或構(gòu)成器官的細(xì)胞是哪一種基因型。(iPS 細(xì)胞)iPS細(xì)胞還可以通過(guò)其他方法來(lái)制作。即，通過(guò)使初期化因子(可以是單個(gè)或多個(gè)因子的組合)與體細(xì)胞接觸，誘導(dǎo)初期化，可以生產(chǎn)iPS細(xì)胞。作為這樣的初期化和初期化因子的例子，可以列舉如下。例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用3個(gè)因子(Klf4、Sox2、 0ct3/4 ；它們是本發(fā)明中使用的代表性的“初期化因子”。)，使用從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的尾端采集的成纖維細(xì)胞，本發(fā)明人等獨(dú)自制作iPS細(xì)胞，但也可以使用除此以外的組合、例如被稱作Yamanaka因子的0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc這4個(gè)因子，還可以利用其改良法。即使用n-Myc代替c-Myc，并使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種即慢病毒載體，也可以建立iPS細(xì)胞(Blelloch R等人，(2007). Cell Stem Cell 1 :245-247)。此外，通過(guò)向來(lái)自胎兒肺的成纖維細(xì)胞或來(lái)自新生兒包皮的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入0ct3/4、SOX2、NanOg、Lir^8這4種基因， 成功地建立了人 iPS 細(xì)胞(Yu J，等人，(2007). Science 318:1917-1920)。還可以使用在小鼠iPS細(xì)胞的建立中使用的、作為小鼠基因的人同源基因的 0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc,由成纖維樣滑膜細(xì)胞和來(lái)自新生兒包皮的成纖維細(xì)胞生產(chǎn)人 iPS 細(xì)胞(Takahashi K，等人，(2007). Cell 131:861-872·)。使用在 0ct3/4、Sox2、Klf4、 c-Myc這4種基因中加入了 hTERT · SV40 large T的6種基因，也可以建立人iPS細(xì)胞 (Park IH，等人，(2007). Nature 451:141-146.)。此外，研究顯示不導(dǎo)入 c_Myc 的基因， 只使用Oct-4、Sox2和Klf4這3種因子，雖然效率低，但也可以在小鼠和人中建立iPS細(xì)胞，成功地抑制了 iPS細(xì)胞變化為癌細(xì)胞，所以在本發(fā)明中也可以加以利用(Nakagawa M， 等人，(2008). Nat Biotechnol 26:101-106. ；Wering M，等人，(2008). Cell Stem Cell 2 10-12)。本發(fā)明中得到的目標(biāo)器官的特征在于是完全來(lái)自上述異個(gè)體哺乳動(dòng)物的器官。 在以往的方法中是嵌合器官再生。雖然不希望受理論束縛，但認(rèn)為原因在于其是缺失的基因的發(fā)育過(guò)程中的功能、特別是器官形成過(guò)程中的各器官的干/前體細(xì)胞的分化、維持所必需的轉(zhuǎn)錄因子?？梢允褂胕PS細(xì)胞。iPS細(xì)胞的制作如上所述。需要說(shuō)明的是，當(dāng)為稱作Nanog-iPS的iPS細(xì)胞株時(shí)，由于沒(méi)有進(jìn)行標(biāo)記，所以在用于嵌合制作時(shí)，無(wú)法與宿主的胚側(cè)進(jìn)行區(qū)別，無(wú)法識(shí)別器官是否得到補(bǔ)償。因此，為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)向該Nanog-iPS 細(xì)胞株中導(dǎo)入熒光色素，可以按照與上述ES細(xì)胞的情形同樣的操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。而且， 使用以上那樣的細(xì)胞時(shí)，可以按照與使用ES細(xì)胞時(shí)同樣的操作規(guī)程制作器官，并明確其來(lái)源。本發(fā)明還提供通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物。具有這樣的目標(biāo)器官的動(dòng)物以往是無(wú)法生產(chǎn)的，由此認(rèn)為動(dòng)物本身也具有作為發(fā)明的價(jià)值。雖然不希望受理論束縛，但迄今為止無(wú)法制作這樣的動(dòng)物，認(rèn)為其原因在于通過(guò)基因缺失而顯示的缺失器官是存活所必須的，而救濟(jì)它們的方法并不存在。本發(fā)明還提供非人哺乳動(dòng)物在目標(biāo)器官的制造中的使用，所述非人哺乳動(dòng)物具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常。在這樣的用途中使用宿主細(xì)胞，這在以往沒(méi)有被充分設(shè)想的。因此，認(rèn)為這樣的動(dòng)物本身也具有作為發(fā)明的價(jià)值。雖然不希望受理論束縛，但迄今為止無(wú)法制作這樣的動(dòng)物，認(rèn)為其原因在于通過(guò)基因缺失而顯示的缺失器官是存活所必需的，而目標(biāo)個(gè)體不可能維持到達(dá)到性成熟的周齡。(使用各種動(dòng)物時(shí)的留意點(diǎn))使用小鼠以外的動(dòng)物時(shí)，通過(guò)留意以下各點(diǎn)，可以應(yīng)用本說(shuō)明書的實(shí)施例中記載的方法來(lái)實(shí)施。例如，關(guān)于其他種類動(dòng)物中的嵌合制作，與在小鼠以外的種中具有嵌合形成能的多能干細(xì)胞建立的報(bào)道相比，在胚或胚中注入了作為ES細(xì)胞的起源的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊的嵌合的 艮告(大鼠(Mayer, J. R. Jr. & Fretz，H. I. The culture of preimplantation rat embryos and the production of allophenic rats (小鼠胚月臺(tái)移植前的培養(yǎng)禾口異表型大鼠的產(chǎn)生).J. R 印 rod. Fertil. 39，1-10(1974))；牛(Brem, G.等人· Production of cattle chimerae through embryo microsurgery(通過(guò)胚胎顯微夕卜禾斗手術(shù)生產(chǎn)牛嵌合體)· Theriogenology. 23，182 (1985))；豬(Kashiwazaki N 等人，Production of chimeric pigs by the blastocyst injection method (通過(guò)胚泡注入法生產(chǎn)嵌合豬)， Vet. Rec. 130，186-187 (1992)))多，但即使使用注入有內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊的嵌合，也可以應(yīng)用本說(shuō)明書中記載的方法。象這樣通過(guò)使用內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊來(lái)補(bǔ)償缺失動(dòng)物所失去的器官，這在事實(shí)上是可能的。即，例如可以將上述細(xì)胞均在體外培養(yǎng)直至形成胚泡，再以物理方式從得到的胚泡中剝離一部分內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊，將其注入胚泡中。使中途的8細(xì)胞期或桑椹胚彼此之間凝集，可以制作嵌合胚。(一般技術(shù))本說(shuō)明書中使用的分子生物學(xué)方法、生化學(xué)方法、微生物學(xué)方法，在該領(lǐng)域是眾所周知且慣用的方法，例如記載在Sambrook J.等人.(1989). Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，Cold Spring Harbor 及其第 3 版· (2001)； Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范),Greene 出版.Associates and Wiley-Interscience ；Ausubel, F. Μ. (1989). Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (源自分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范的方法綱要)，Greene出版.Associates and Wiley-Interscience；Innis, Μ. Α. (1990). PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 實(shí)驗(yàn)規(guī)范方法和應(yīng)用指南)，Academic Press ；Ausubel, F. Μ. (1992). Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (源自分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范的方法綱要)，Greene出版.Associates；Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(源自分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范的方法綱要)，Greene出版· Associates ；Innis, Μ. Α.等人· (1995) · PCR Strategies, Academic Press ；Ausubel, F. Μ. (1999). Short Protocols in Molecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (源自分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范的方法綱要)，Wiley，and annual updates ；Sninsky, J. J.等人· (1999). PCR Applications :Protocols for Functional Genomics, Academic Press ； 別冊(cè)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)“遺伝子導(dǎo)入&発現(xiàn)解析実験法”(基因?qū)?amp;表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)法)羊土社、1997 等中，在本說(shuō)明書中，這些文獻(xiàn)的相關(guān)部分(可以是全部)作為參考而引用。關(guān)于用于制作人工合成基因的DNA合成技術(shù)和核酸化學(xué)，例如記載在(iait， Μ. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRLPress ；Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach,IRL Press ；Eckstein,
F.(1991). Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approac, IRL Press ；Adams, R.L.等人· (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids(核酸生物化學(xué))，Chapman & Hall ；Shabarova, Ζ.等人· (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids (核酸的高等有機(jī)化學(xué))，Weinheim ;Blacliburn，G.M·等人·(1996) · Nucleic Acids in Chemistry and Biology (化學(xué)禾口生物學(xué)中的核酸)，Oxford University Press ；Hermanson,
G.Τ. (1996). Bioconjugate Techniques,Academic Press 等中，在本說(shuō)明書中，這些文獻(xiàn)的相關(guān)部分作為參考而引用。本說(shuō)明書中引用的科學(xué)文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)等參考文獻(xiàn)，其全體以與各自具體記載的相同的程度在本說(shuō)明書中作為參考而引用。以上，為了容易理解，給出優(yōu)選的實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。以下，根據(jù)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但上述的說(shuō)明和以下的實(shí)施例只是為了例示而提供，并不是為了限定本發(fā)明而提供。因此，本發(fā)明的范圍既不受本說(shuō)明書中具體記載的實(shí)施方案的限定，也不受實(shí)施例的限定，只通過(guò)權(quán)利要求書來(lái)限定。實(shí)施例在本實(shí)施例中，根據(jù)動(dòng)物保護(hù)的精神，按照東京大學(xué)規(guī)定的動(dòng)物處理相關(guān)規(guī)范進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。(iPS細(xì)胞的制備例)本發(fā)明人等使用從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠尾端采集的成纖維細(xì)胞，利用3因子(Klf4、 Sox2、0ct3/4)生產(chǎn)誘導(dǎo)型多能干(iPS)細(xì)胞。其操作規(guī)程如下。其圖解見(jiàn)圖1，詳細(xì)地顯示在圖加中。(來(lái)自GFP小鼠尾端的成纖維細(xì)胞(Tailtip fibroblast :TTF)的建立)從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠身上取下約Icm的尾端，剝皮，切成2 3片。將其放在MF_start 培養(yǎng)基(Τ0Υ0Β0，日本)中，培養(yǎng)5天。將其中出現(xiàn)的成纖維細(xì)胞重新接種在新的培養(yǎng)皿中進(jìn)行多次傳代，以其作為來(lái)自尾端的成纖維細(xì)胞(TTF)。(+3因子(初期化因子)的導(dǎo)入)導(dǎo)入目標(biāo)基因和病毒包膜蛋白，從制作的產(chǎn)生病毒的細(xì)胞株0938 或四36 6細(xì)胞株)中回收上清，離心濃縮后冷凍保存，將得到的病毒液在前一天加入到已傳代的TTF細(xì)胞的培養(yǎng)液中，使達(dá)到IXlO5細(xì)胞/6孔板，將其作為3因子(初期化因子)的導(dǎo)入。(用ES細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)25 30天)導(dǎo)入3因子(初期化因子)后，第2天置換成ES培養(yǎng)用的培養(yǎng)液，培養(yǎng)25 30 天。此時(shí)，每天進(jìn)行培養(yǎng)液的置換。(挑選iPS集落和建立iPS細(xì)胞株)
使用黃色微量吸管頭(例如可以從Watson獲取)挑選培養(yǎng)后出現(xiàn)的iPS細(xì)胞樣集落，分散在0. 25 %胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen公司)中，直至形成單細(xì)胞，將其接種在新準(zhǔn)備的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)上。(結(jié)果)結(jié)果證實(shí)利用上述方法建立的iPS細(xì)胞株具有圖2b_f所示的作為iPS細(xì)胞的特征、即未分化性和全能性。上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2b所示，使用帶有照相機(jī)的顯微鏡拍攝所建立的兩株iPS細(xì)胞株的形態(tài)。其條件如下。將挑選后的iPS細(xì)胞傳代，之后在皿上在形成半?yún)R合的階段進(jìn)行觀察和拍攝?？芍谛螒B(tài)上形成ES細(xì)胞樣的未分化集落。如圖2c所示，在熒光顯微鏡下拍攝iPS細(xì)胞，并用堿性磷酸酶染色試劑盒(Vector 公司Cat. No. SK-5200)進(jìn)行染色。其條件如下。使用帶有照相機(jī)的顯微鏡觀察、拍攝亮視野像、GFP熒光像，之后除去培養(yǎng)液，在用磷酸緩沖生理鹽水(PBQ清洗的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)皿中添加含有10%福爾馬林、90%甲醇的固定液，實(shí)施1 2分鐘的固定處理。將其用清洗液(0. IM Tris-HCl (pH9. 5))清洗一次后， 添加上述試劑盒的染色液，在暗處?kù)o置15分鐘。之后，再次用清洗液清洗，之后進(jìn)行觀察、 拍攝。如圖2c所示，可知由于本實(shí)施例中制作的iPS細(xì)胞來(lái)自GFP小鼠，所以恒定表達(dá) GFP，并顯示出未分化細(xì)胞的特征性的高堿性磷酸酶活性。如圖2d所示，為了鑒定在iPS細(xì)胞建立時(shí)插入在基因組DNA上的3因子，從iPS 細(xì)胞中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR。其條件如下。關(guān)于基因組DNA，使用DNA mini試劑盒(Qiagen公司)，按照制造業(yè)者的操作規(guī)程從1 X IO6個(gè)細(xì)胞中提取DNA。以其DNA為模板，使用以下引物進(jìn)行PCR。0ct3/4Fw(m0ct3/4-S1120) :CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG (SEQ ID NO :1)Rv(pMX/L3205) :CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA (SEQ ID NO :2)Klf4Fw(Klf4-S1236) :GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC(SEQ ID NO :3)Rv(pMXs-AS3200) :TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG(SEQ ID NO :4)Sox2Fw(Sox2-S768) :GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG (SEQ ID NO :5)Rv (pMX-AS3200)同上(SEQ ID NO :4)c-MycFff(c-Myc-S1093) :CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC (SEQ ID NO :6)Rv (pMX-AS3200)同上(SEQ ID NO :4)其結(jié)果，如圖2d所示，確認(rèn)到3因子的插入。如圖加所示，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法確認(rèn)ES細(xì)胞的特征性基因表達(dá)圖案和導(dǎo)入的基因的表達(dá)。其條件如下。使用流式細(xì)胞儀分選1 X IO5個(gè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞到Trizol-LS Reagent (invitrogen公司)中，使用Thermc^cript RT-PCR系統(tǒng)試劑盒(invitrogen公司)，按照附錄的操作規(guī)程由從上述GFP陽(yáng)性細(xì)胞中提取的mRNA合成cDNA。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。 在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(圖中記作Tg)中，所用引物使用與上述圖2d相同的引物；而在除此以外的基因表達(dá)中，使用根據(jù) Takahashi K & Yamanaka S 的報(bào)道(Cell 2006 Aug 25 ； 126 (4) 652-5.)等合成引物而得到的引物。如圖2e所示，可知所有株均顯示出與ES細(xì)胞幾乎相同的表達(dá)圖案，利用iPS細(xì)胞的高的基因沉默活性，所導(dǎo)入的基因(Tg)的表達(dá)被抑制。如圖2f所示，將所建立的iPS細(xì)胞注入胚泡中，制作嵌合小鼠。其條件如下。使用從BDFl系統(tǒng)的小鼠(早，8周齡)采集的卵子和來(lái)自C57BL/6的精子，進(jìn)行體外受精(IVF ；in vitro fertilizaiton)，得到受精卵，所述BDFl系統(tǒng)的小鼠通過(guò)給予PMSG 和hCG激素進(jìn)行了過(guò)排卵誘起處理。培養(yǎng)該受精卵直至8細(xì)胞期/桑椹胚，之后冷凍保存至進(jìn)行胚泡注入的前一天。對(duì)于iPS細(xì)胞，利用0. 25%胰蛋白酶/EDTA剝離形成半?yún)R合的部分，之后懸浮在ES細(xì)胞培養(yǎng)液中，用于注入。與胚泡互補(bǔ)中的方法一樣，在顯微鏡下使用顯微操縱器進(jìn)行胚泡注入，經(jīng)過(guò)注入后的培養(yǎng)，對(duì)ICR系統(tǒng)的臨時(shí)代理子宮施行子宮移植。 分析中，于胎生第13天和出生后第1天在熒光實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍攝。如圖2f所示，在胎兒期和新生兒期可以確認(rèn)來(lái)自iPS細(xì)胞的細(xì)胞(GFP陽(yáng)性)，提示所建立的iPS細(xì)胞株具有高的多分化能。(實(shí)施例1)在本實(shí)施例中，選擇小鼠作為建立者動(dòng)物，選擇胰臟作為要缺失的器官。并且，為了制作以胰臟缺失為特征的敲除小鼠使用了 PdXl基因。(使用的小鼠)作為以胰臟缺失為特征的敲除小鼠，使用了 PdXlwt~eZ*PdXlkzAaeZ(建立者)。使用了來(lái)自向Pdxl基因座位中敲入(也可以是敲除)了 LacZ基因的小鼠(Pdxl-LacZ敲入小鼠)的胚泡。(Pdxl-LacZ 敲入小鼠)關(guān)于構(gòu)建物成的制作，詳細(xì)而言，可以根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的論文(Development 122， 983-995(1996))來(lái)制作。簡(jiǎn)述如下。同源區(qū)的臂可以使用由包含Pdxl區(qū)的λ克隆進(jìn)行克隆的臂。在本實(shí)施例中，使用由京都大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)研究科腫瘤外科學(xué)研究室川口義彌先生提供的同源臂。(轉(zhuǎn)基因、敲入的方法=Pdxl-LacZ敲入小鼠)通過(guò)電穿孔將上述的構(gòu)建物導(dǎo)入如上制備的iPS細(xì)胞中，進(jìn)行陽(yáng)性/陰性選擇后， 通過(guò)DNA印跡進(jìn)行篩選，將得到的克隆注入胚泡中，制作嵌合小鼠。之后，確立與生殖系列附和的譜系，使遺傳背景與C57BL/6系統(tǒng)回交，即可制作。(建立者小鼠)(使用的小鼠)作為以胰臟缺失為特征的轉(zhuǎn)基因小鼠，使用將在Pdxl啟動(dòng)子區(qū)下接合有Hesl基因的構(gòu)建物注入小鼠前核期卵中制作的小鼠(Pdxl-Hesl小鼠)。關(guān)于構(gòu)建物的制作，可以向已報(bào)道的論文(Diabetologia 43,332-339(2000))中使用的、包含Pdxl啟動(dòng)子區(qū)的構(gòu)建物的1^x6基因位點(diǎn)插入Hesl基因(NCBI檢索號(hào)NM_008235的mRNA)，制作構(gòu)建物。
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(轉(zhuǎn)基因的方法)使用微量注射器，將上述的構(gòu)建物注入將C57BL6小鼠和BDFl小鼠(從日本SLC 株式會(huì)社購(gòu)入)交配而得到的前核期卵中，之后移植到臨時(shí)代理中，制作轉(zhuǎn)基因小鼠。胰臟的形成程度依賴于在PdX 1 (特別是在胎生期的胰臟中表達(dá))的啟動(dòng)子下表達(dá)的Hesl的表達(dá)量而不同。若高度表達(dá)(=拷貝數(shù)多)，則顯示出胰臟的缺失。顯示 PdXl-Hesl轉(zhuǎn)基因小鼠的通過(guò)胚泡互補(bǔ)進(jìn)行的胰臟再生?？梢允褂孟嗤男∈笾谱鱽?lái)自 iPS細(xì)胞的胰臟。由此證實(shí)與PdXl敲除小鼠一樣，如此操作而制作的轉(zhuǎn)基因小鼠也可以補(bǔ)償胰臟。(建立者轉(zhuǎn)基因小鼠的制作)已知上述轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后死亡，所以制作這樣的小鼠的建立者。簡(jiǎn)述如下培養(yǎng)注入有PdX I-Hesl轉(zhuǎn)基因的胚，直至形成胚泡，之后使用顯微操縱器，在顯微鏡下向其中注入iPS細(xì)胞等，從而補(bǔ)償胰臟的缺失。此時(shí)的iPS細(xì)胞中，與敲除項(xiàng)一樣，使用用GFP等標(biāo)記的iPS細(xì)胞?？梢允褂门c其同等的標(biāo)記的iPS細(xì)胞等。將注入后的胚移植到臨時(shí)代理的子宮中，可以得到產(chǎn)仔。這樣，通過(guò)進(jìn)行向?qū)胗修D(zhuǎn)基因的胚注入iPS細(xì)胞這樣的雙重胚操作，可以由第1代的轉(zhuǎn)基因補(bǔ)償胰臟，這些小鼠能夠作為可向下一代傳遞胰臟缺失的表達(dá)型的建立者動(dòng)物。(交配)接下來(lái)，在本實(shí)施例中，使如此操作建立的小鼠的異型小鼠之間交配后使用。由于上述敲入小鼠無(wú)法在同型間維持(出生后1周左右死亡)。所以使PdXrtAac;Z和PdxlLac^ ^z(建立者)彼此之間交配，回收胚。(小鼠的維持順序和確認(rèn))使用顯微操縱器，在顯微鏡下向胚泡中注入上述iPS細(xì)胞(圖1 iPS細(xì)胞的胚泡注入)。按照以往的方法，必需用GFP標(biāo)記，但這次由于預(yù)先由GFP小鼠的體細(xì)胞建立iPS 細(xì)胞，所以之后不必作標(biāo)記，直接使用。當(dāng)然，可以使用與其同等的標(biāo)記的其他iPS細(xì)胞等。 將注入后的胚移植到臨時(shí)代理的子宮中，得到產(chǎn)仔。當(dāng)產(chǎn)仔為敲入小鼠時(shí)，成為同型的概率為1/4，所以必需判定目標(biāo)“胰臟缺失+來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟”的小鼠是哪一個(gè)。因此，從兩者的體內(nèi)采集血液和組織細(xì)胞，利于流式細(xì)胞儀分選顯示GFP陰性的細(xì)胞(不是來(lái)自iPS細(xì)胞，而是來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞)，提取基因組DNA、之后利用PCR法檢測(cè)基因型，從而判定每一只小鼠。使用的引物如下。正向(Fw)=ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG(SEQ ID NO 7)反向1 (Rvl) =TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC (SEQ ID NO :8)反向(Rv2):TGT GAG CGA GTA ACA ACC (SEQ ID NO :9)。利用該方法進(jìn)行制作時(shí)，由于是異型之間的交配，所以根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，預(yù)想其仔為野生型異型KO=I 2 1。因此，為了特定其中的KO個(gè)體，如此地使用末梢血中的來(lái)自宿主的細(xì)胞進(jìn)行基因型分析，特定其基因型。作為確認(rèn)被補(bǔ)償?shù)钠鞴偈欠裾５匕l(fā)揮功能的最初步驟，在胰臟的形態(tài)觀察容易的新生兒期進(jìn)行功能標(biāo)志物的表達(dá)分析。顯示對(duì)由在新生兒期解剖的小鼠胰臟制作的冷凍切片施行免疫染色的像。作為抗體，使用作為內(nèi)分泌組織的指標(biāo)的抗胰島素抗體(從株式會(huì)社二 f X K 4才寸4 -> ^購(gòu)入cat. #422421)，顯示已染色的抗體。此外，還可以將作為外分泌組織的指標(biāo)的抗 α-淀粉酶抗體(從SIGMA公司購(gòu)入cat. #A8273)、抗胰高血糖素抗體(從株式會(huì)社二千 k 4 才寸4工> 7購(gòu)入cat. #422271)、抗生長(zhǎng)抑素抗體(從株式會(huì)社二 f ^ 4廣4才寸4工> ；^購(gòu)入cat. #422651)、以及作為胰管的指標(biāo)的DBA-凝集素(從Vector公司購(gòu)入 cat. #RL-1032)分別染色。胰島素為陽(yáng)性，由此理解為即使不在其他抗體中進(jìn)行染色，被補(bǔ)償?shù)囊扰K也正常地發(fā)揮功能。由該結(jié)果確認(rèn)到幾乎所有的功能標(biāo)志物的表達(dá)，認(rèn)為具有足以存活的正常的功能。接下來(lái)，作為確認(rèn)被補(bǔ)償?shù)钠鞴偈欠裾５匕l(fā)揮功能的下一步驟，利用成體小鼠測(cè)定血糖值。可以參考以血糖值為指標(biāo)的胰臟補(bǔ)償小鼠的胰功能評(píng)價(jià)結(jié)果。作為恒定狀態(tài)的血糖值，可以參考利用Medisefumini GR_102(從TERUMO公司購(gòu)入)測(cè)定成熟的胰臟補(bǔ)償小鼠的血糖值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。作為對(duì)照，可以使用攜帶異型PdXl等位基因的嵌合小鼠和胰臟功能低下的STZ-DM模型的值。此外，可以參考利用同一 Medisefumini測(cè)定糖負(fù)荷后的血糖值的變化的結(jié)果。這些結(jié)果顯示出血糖調(diào)節(jié)能的正常性，提示所制作的胰臟補(bǔ)償小鼠在被用作建立者時(shí)也可以長(zhǎng)期存活。S卩，糖負(fù)荷后，一度上升的血糖值也和用作對(duì)照的異型(+/_)嵌合一樣回復(fù)到正常值，所以所制作的KO嵌合(建立者)沒(méi)有顯示出糖尿病等癥狀，顯示出長(zhǎng)期存活的可能性。接下來(lái)，嘗試著由通過(guò)與異型個(gè)體的交配得到的產(chǎn)仔，明確能否作為建立者小鼠向下一代傳遞其表型。從得到的產(chǎn)仔的尾端提取基因組DNA，使用在(小鼠的維持順序和確認(rèn))項(xiàng)中使用的引物進(jìn)行PCR。其結(jié)果，明確了只得到了異型或敲除個(gè)體，這強(qiáng)烈暗示建立者是敲除個(gè)體，可以向下一代傳遞其表型。S卩，由于是敲除小鼠(KO)與異型小鼠的交配，理論上按照孟德?tīng)栠z傳定律，應(yīng)該以1/2的概率形成KO或異型個(gè)體，結(jié)果的確如此。由此認(rèn)為例如當(dāng)為補(bǔ)償了胰臟的KO之間的交配時(shí)，可以100%在下一代中得到 KO個(gè)體，使用KO個(gè)體的分析變得極容易進(jìn)行。(嵌合的確認(rèn))嵌合可以根據(jù)毛的顏色來(lái)判斷。由于供體的iPS細(xì)胞來(lái)自GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，而宿主的胚來(lái)自野生型的C57BL6XBDF1 (黑)，所以可以利用GFP的熒光進(jìn)行判斷。利用從尾端提取的基因組DNA的PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因，由此進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的判定。產(chǎn)仔為轉(zhuǎn)基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因向下一代傳遞的概率1/2，所以必需判定目標(biāo)“胰臟缺失 +來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟”小鼠是哪一個(gè)。因此，使其與野生型小鼠交配，使用從產(chǎn)仔的尾端提取的基因組DNA，利用PCR法測(cè)定基因型，由此確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的傳遞，同時(shí)觀察這些產(chǎn)仔的胰臟形態(tài)。PCR中使用以下的引物組合。正向(Fw)=TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG (SEQ ID NO :10)反向(Rv)-.Ckk TGA TGG CTC CAG GGT AA(SEQ ID NO: 11)。以與PdXl啟動(dòng)子區(qū)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列雜交的方式制作所使用的正向引物，以與Hesl cDNA(檢索號(hào)為NM_008235的mRNA)核苷酸序列雜交的方式制作反向引物。附近存在這樣的PdXl啟動(dòng)子和Hesl cDNA，這在野生型小鼠中不會(huì)發(fā)生，所以利用使用這些引物的 PCR，可以高效率檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。由以上實(shí)驗(yàn)得到了 提示是在下一代中能夠發(fā)生胰臟缺失的建立者小鼠的結(jié)果。不限于小鼠、還對(duì)其他大型動(dòng)物等應(yīng)用上述方法，從而應(yīng)該可以高效率地生產(chǎn)具有致死性表型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和敲除動(dòng)物。使制作的轉(zhuǎn)基因且嵌合的個(gè)體與野生型交配。通過(guò)產(chǎn)仔的胰臟形態(tài)分析、或基因組DNA的PCR，明確了胰缺失的表型向下一代傳遞。如果轉(zhuǎn)基因-嵌合小鼠能夠成為建立者，則下一代產(chǎn)生缺失了胰臟的小鼠?？梢栽谙乱淮羞x擇成功地缺失胰臟的小鼠。由于這樣的小鼠在制作階段補(bǔ)償了胰臟，所以出生后顯示出正常性。這樣，即使使用轉(zhuǎn)基因小鼠，也可以使用可以高效率地生產(chǎn)象器官缺失小鼠這樣的在胎生期和剛剛出生后死亡的小鼠的建立者，與iPS細(xì)胞一起實(shí)現(xiàn)器官再生。以上結(jié)果顯示使用iPS細(xì)胞，無(wú)論是包含通過(guò)HES-I的強(qiáng)制表達(dá)而無(wú)法形成胰臟的物質(zhì)的小鼠、還是Pdx-I敲除小鼠，利用胚泡互補(bǔ)拯救器官不全動(dòng)物的死亡，可以用作建立者。(胰臟的再生)圖3顯示胰臟的再生。這里，在顯微鏡下解剖出生后第5天的新生兒，露出胰臟。 在熒光顯微鏡下觀察和拍攝該胰臟。其結(jié)果的照片見(jiàn)圖3。(來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟的形態(tài))圖4顯示來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟的形態(tài)。這里，制作來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟的冷凍切片標(biāo)本，利用DAPI和抗GFP抗體、抗胰島素抗體進(jìn)行染色，作為核染色，使用正象熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行觀察、拍攝。由圖3和圖4認(rèn)為在形態(tài)上胚泡互補(bǔ)成立。圖5顯示宿主小鼠的基因型判定的方法。從圖3所示的同一小鼠中采集骨髓細(xì)胞， 利用流式細(xì)胞儀分選GFP陰性的造血干/前體細(xì)胞(c-Kit+，Sca-I+, Linage標(biāo)記-:KSL 細(xì)胞)，在96孔板的每孔中加入1個(gè)細(xì)胞。將其在添加細(xì)胞因子的條件下培養(yǎng)12天，形成集落，從中提取基因組DNA，用于基因型判定。由此，即使在GFP-側(cè)含有通過(guò)基因沉默而使 GFP的表達(dá)消失的細(xì)胞，也可以進(jìn)行來(lái)自1個(gè)細(xì)胞的克隆基因判定，可以簡(jiǎn)便地區(qū)別宿主細(xì)胞、發(fā)生了基因沉默的細(xì)胞。需要說(shuō)明的是，圖5中的實(shí)驗(yàn)作為確認(rèn)胚泡互補(bǔ)的確立的證據(jù) (或許由于器官是空的(=敲除(KO))，所以才進(jìn)行確認(rèn))的實(shí)驗(yàn)，為了慎重起見(jiàn)通過(guò)基因型分析確認(rèn)是K0，考慮到基因沉默的影響，進(jìn)行來(lái)自單細(xì)胞的基因型判定(圖5)。a.顯示其策略，b.顯示培養(yǎng)后形成的集落像，c.顯示判定結(jié)果。(考察)如上所述，證實(shí)iPS細(xì)胞是利用3因子(Klf4、Sox2、0ct3/4)，使用從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的尾端采集的成纖維細(xì)胞獨(dú)自制作的器官的器官再生。Pdxl敲除小鼠由于同型和異型交配，所以應(yīng)該以50%的概率生出同型的胰臟缺失小鼠，這已得到證實(shí)。而且，由圖4所示的來(lái)自iPS細(xì)胞的胰臟的形態(tài)、以及如圖5所示分離回收GFP陽(yáng)性細(xì)胞、GFP陰性細(xì)胞進(jìn)行 PCR的結(jié)果，應(yīng)該以50%的概率生出同型的胰臟缺失小鼠，這已得到證實(shí)。(向STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中移植來(lái)自iPS的胰島)
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(使用的小鼠)使用的C57BL/6小鼠、BDFl小鼠、DBA2小鼠和ICR小鼠從日本SLC株式會(huì)社購(gòu)入。使Pdxl異型接合性(Pdxl (+/-))小鼠(由京都大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)研究科川口義彌先生和 Vanderbilt University 的 Dr. Wright 提供)與 DBA2 小鼠或 BDFl 小鼠交配。C57BL/6 小鼠用于鏈脲霉素(STZ)誘發(fā)糖尿病模型的供體。絕食16 20小時(shí)后，靜脈內(nèi)給予STZ (200mg/ kg)，然后，自該STZ注射起1周后，將血中葡萄糖水平超過(guò)400mg/dL的小鼠視作高血糖糖尿病小鼠。(mES/miPS 細(xì)胞的培養(yǎng))在明膠包被的皿中，在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS ； 二才寸4工
制)、0· ImM 2-巰基乙醇 anvitrogen，San Diego, CA) ,0. ImM非必需氨基酸 Gnvitrogen)、 ImM丙酮酸鈉(Invitrogen)、1% L-谷氨酰胺青霉素鏈霉素(Sigma)和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF ；Millipore, Bedford, ΜΑ)的 Glasgow 改良 Eagle 培養(yǎng)基(GMEM ； Sigma, St. Louis, MO)中，在沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下維持未分化的小鼠胚性干(mES)細(xì)胞 (G4. 2)。該G4. 2細(xì)胞(由RIKEN⑶B的丹羽仁史先生提供)來(lái)自EB3ES細(xì)胞，而且，在 CAG表達(dá)單元的調(diào)節(jié)下攜帶改良型綠色熒光蛋白(EGFP)基因。EB3ES細(xì)胞是來(lái)自EHtgh ES細(xì)胞(Hooper Μ.等人，1987)的下位系統(tǒng)的細(xì)胞，是通過(guò)將0ct-3/4-IRES-BSD-pA載體的插入在Oct-3/4等位基因中標(biāo)的化而建立的細(xì)胞(Niwa H.等人，2000)，所述的 Oct-3/4-IRES-BSD-pA載體構(gòu)建成在0ct_3/4啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下表達(dá)作為耐藥性基因的殺稻瘟
ο在補(bǔ)充了 15 %敲除血清替代添加物(KSR ；Invitrogen)、0. ImM 2_巰基乙醇 (Invitrogen) >0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen) UmM HEPES 緩沖溶液(Invitrogen) U % L-谷氨酰胺青霉素鏈霉素(Sigma)和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF ；Millipore)的 Dulbecco改良fegle培養(yǎng)基(DMEM ； Invitrogen)中，在絲裂霉素C處理的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)上維持未分化的小鼠人工多能干(miPS)細(xì)胞(GT3. 2)。GT3. 2細(xì)胞是由使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入有Klf4、Sox2、0ct3/4這3個(gè)初期化因子的、從雄性GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(由大阪大學(xué)的R部騰先生提供)的尾端采集的成纖維細(xì)胞建立的。GT3. 2細(xì)胞在CAG表達(dá)單元的調(diào)節(jié)下到處表達(dá)EGFP。(胚的培養(yǎng)和操作)Pdxl異型接合性(Pdxl (+/"))的異種交配胚的制備按照已報(bào)道的操作規(guī)程(Nagy A.等人，2003)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下從Pdxl異種接合性小鼠的交配后2. 5天的卵管和子宮中將小鼠的8細(xì)胞/桑椹胚期的胚采卵到M2培養(yǎng)基(Millipore)中。將這些胚移入KSOM-AA 培養(yǎng)基(Millipore)滴中，然后，直至胚泡期培養(yǎng)M小時(shí)。為了胚操作，將胚泡移入含有M2培養(yǎng)基的微小液滴中，然后，對(duì)mES/miPS細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，之后懸浮于該培養(yǎng)基的微小液滴中。在8細(xì)胞/桑椹胚期，將胚移入含有 HEPES緩沖mES/miPS培養(yǎng)基的微小液滴中。使用壓力驅(qū)動(dòng)的顯微操縱器、” λ>7 制)，在顯微鏡下非常小心地在透明帶和營(yíng)養(yǎng)外胚葉中開(kāi)孔，之后向胚泡腔內(nèi)的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊(ICM)附近注入10 15個(gè)mES/miPS細(xì)胞。注入后，在KSOM-AA培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚1 2 小時(shí)，之后，將胚移植到2. 5dpc的偽妊娠交配的臨時(shí)代理雌性ICR小鼠的子宮內(nèi)。(胰島的分離和移植)
通過(guò)膠原酶消化，從具有來(lái)自iPS的胰臟的小鼠中分離胰島，然后，利用Ficoll 梯度進(jìn)行離心沉淀，分離這些胰島。簡(jiǎn)單而言，屠殺10 12周齡的成體小鼠，使用27G 的蝴蝶針，從膽管起在Hanks平衡鹽溶液(HBSS =Invitrogen)中用2mg/ml的膠原酶(氣 々&卜公司制)進(jìn)行胰臟灌流。切開(kāi)灌流的胰臟，在37°C下培養(yǎng)20分鐘。用HBSS清洗已消化的組分2次，然后，使用濾網(wǎng)除去未被消化的組織。通過(guò)使用了 HBSS中的Ficoll PM400 (GE-Healthcare，Stockholm, Sweden)的密度梯度離心沉淀分離組分，然后，回收胰島已被濃縮的組分到含有10% FCS的RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)中。使用玻璃制的微量移液管，在顯微鏡下回收直徑超過(guò)約150μπι的胰島到管內(nèi)。使用玻璃制的微量移液管，將150個(gè)分離的胰島移植到STZ誘發(fā)糖尿病小鼠的腎臟被膜下。為了防止胰島的移植物立刻消失，在移植后第O天、第2天和第4天，向腹腔內(nèi)給予3次所報(bào)道的抗炎促進(jìn)性單克隆抗體的混合物[含有抗小鼠IFN-Y單克隆抗體(mAb) (R4-6A2 ；大鼠 IgGK :e_Bioscience)、抗小鼠 TNF- α mAb (MP6-XT3 ；大鼠 IgGl κ e-Bioscience)和抗小鼠 IL-1 β mAb (B122 ；美國(guó)倉(cāng)鼠 IgG :e_Bioscience)]。(免疫組織化學(xué))自胰島移植起2個(gè)月后，觀察GFP的表達(dá)(顯示所移植的胰島)。進(jìn)行腎臟切片的 HE染色和用DAPI進(jìn)行的GFP染色，確認(rèn)移植的胰島的存在。(血糖值的監(jiān)測(cè))對(duì)于沒(méi)有進(jìn)行絕食的小鼠的血糖值，在給予mAb的時(shí)刻、以及從胰島移植到2個(gè)月后為止，每隔1周采集血液樣品，監(jiān)測(cè)血糖值。使用Medisefumini GP-102 (從TERUMO公司購(gòu)入)測(cè)定血糖值。另外，自胰島移植起2個(gè)月后進(jìn)行葡萄糖耐性試驗(yàn)(GTT)。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖5A。圖5A中顯示向STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中移植來(lái)自iPS由來(lái)的胰島。 a和b顯示胰島的分離。將來(lái)自iPS的胰臟從總膽管(a.箭頭)起進(jìn)行膠原酶灌流，密度梯度離心沉淀后，濃縮來(lái)自表達(dá)EGFP的iPS的胰島(b)。c顯示自胰島移植起2個(gè)月后的腎臟被膜。表達(dá)EGFP的位置(箭頭)是移植的胰島。d顯示腎臟切片的HE染色(左圖示板)和用DAPI進(jìn)行的GFP染色(右圖示板)。e顯示向STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中移植來(lái)自 iPS的150的胰島。箭頭顯示給予抗體混合物(抗INF- γ、抗TNF- α、抗IL-1 β )的時(shí)刻。 移植起至2個(gè)月后，每隔1周測(cè)定腹腔內(nèi)的血糖值。移植了 iPS胰島的STZ誘發(fā)糖尿病小鼠以▲(黑三角)(n = 6)表示，未移植iPS胰島的STZ誘發(fā)糖尿病小鼠以·(黑四角)表示。f顯示自胰島移植起2個(gè)月后的葡萄糖耐性試驗(yàn)(GTT)。這樣，由圖5A的結(jié)果可知通過(guò)移植來(lái)自iPS的胰島，糖尿病的癥狀有所改善。因此，顯示出由使用iPS的器官再生技術(shù)產(chǎn)生的治療效果。(實(shí)施例2腎臟的情形的例子)根據(jù)實(shí)施例1，進(jìn)行腎臟的器官再生。在本實(shí)施例中，向以腎臟缺失為特征的敲除小鼠中移植作為多能細(xì)胞的如上制作的小鼠iPS細(xì)胞，研究腎臟是否發(fā)育。作為以腎臟缺失為特征的敲除小鼠，使用Salll敲除小鼠(由熊本大學(xué)發(fā)生醫(yī)學(xué)研究中心、西中村隆一先生提供)。Salll基因是果蠅(Drosophila)的前后方位點(diǎn)特異性同源異型基因Spalt(Sal)的小鼠同系物，由非洲爪蟾的前腎管誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)可知其是提示對(duì)腎的發(fā)育重要的、編碼1323氨基酸殘基的蛋白的3969bp的基因(Nishinakamura，R.等人，Development，第1 卷，第3105-3115頁(yè)，2001、東大淺島研究室)。有報(bào)道稱在小鼠體內(nèi)，該Mill基因除了在腎臟中表達(dá)外，還在中樞神經(jīng)、耳胞、心臟、肢芽、肛門中表達(dá) (Nishinakamura, R.等人，Development，第 128 卷，第 3105-3115 頁(yè)，2001)。該Mill基因的敲除小鼠(與C57BL/6系統(tǒng)回交(回交)、分析)通過(guò)缺失Mill 基因的外顯子2以后，缺失了分子內(nèi)存在的所有10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，該缺失的結(jié)果，輸尿管芽沒(méi)有嵌入后腎間葉中，認(rèn)為發(fā)生了腎臟形成初期的異常(正常個(gè)體、Salll敲除小鼠)。關(guān)于實(shí)驗(yàn)中使用的Salll敲除小鼠的基因型判定，進(jìn)行與圖5所示的宿主小鼠的基因型判定方法相同的操作來(lái)進(jìn)行。采集小鼠骨髓細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分選GFP陰性的造血干/前體細(xì)胞(c-Kit+，Sca-I+, Linage標(biāo)記-=KSL細(xì)胞)，向96孔板的每孔中加入1 個(gè)細(xì)胞。將其在添加細(xì)胞因子的條件下培養(yǎng)12天，形成集落，從中提取基因組DNA，用于基因型判定。需要說(shuō)明的是，作為確認(rèn)胚泡互補(bǔ)的確立的證據(jù)(或許由于器官是空的(=敲除(KO))，所以才進(jìn)行確認(rèn))的實(shí)驗(yàn)，為了慎重起見(jiàn)通過(guò)基因型分析來(lái)確認(rèn)是K0，進(jìn)行來(lái)自單細(xì)胞的基因型判定?；蛐团卸ㄖ惺褂玫囊锶缦隆Ｓ糜阼b定所注入的胚的來(lái)源(即宿主)的正向引物突變體檢測(cè)用AAGGGA CTG GCT GCT ATT GG (SEQ ID NO :12)野生型檢測(cè)用=GTACAC GTT TCT CCT CAG GAC (SEQ ID NO :13)用于鑒定所注入的胚的來(lái)源(即宿主)的反向引物突變體檢測(cè)用ATATCA CGG GAT GCC AAC GC (SEQ ID NO :14)野生型檢測(cè)用:TCTCCA GTG TGA GTT CTC TCG (SEQ ID NO :15)。按照該方法來(lái)制作時(shí)，由于是異型之間的交配，所以按照孟德?tīng)栠z傳定律，預(yù)想該仔的野生型異型KO=I 2 1。因此，為了特定其中的KO個(gè)體，如此地使用骨髓細(xì)胞進(jìn)行基因型分析，特定其基因型(圖6)?？芍?3的小鼠是Mill同型KO小鼠。可以確認(rèn)通過(guò)進(jìn)行這樣的基因型確定，能夠確定嵌合個(gè)體中的基因型。研究通過(guò)上述基因型確定確定為同型接合體(Salll(-/-))或異型接合體 (SallK+/-))的、出生后1天的小鼠產(chǎn)仔個(gè)體的腎臟形成時(shí)，可以顯示在異型接合體 (SallK+/-))中有腎臟形成，而在同型接合體(Salll(-/-))中，腎臟完全沒(méi)有形成。使Mill基因敲除小鼠的異型接合體個(gè)體(Salll(+/-))的雄性與雌性交配，利用子宮回流法采集胚泡期受精卵。如此操作得到的胚泡期受精卵的基因型，預(yù)想其以同型接合體(Salll(-/-))異型接合體(Salll (+/-))野生型(Salll (+/+)) = 1 2 1 的比率出現(xiàn)。通過(guò)微量注射，向采集的胚泡期受精卵中注入上述的GFP標(biāo)記的iPS細(xì)胞，每個(gè)胚泡注入15個(gè)細(xì)胞，之后放回臨時(shí)代理(ICR小鼠、從日本- ^ ^ ν -株式會(huì)社購(gòu)入)的子宮中。在通過(guò)上述基因型確定確認(rèn)為同型接合體(Salll(-/-))的新生仔的嵌合個(gè)體中，可以確認(rèn)腎臟存在于后腹膜區(qū)。在熒光實(shí)體顯微鏡下觀察這些形成的腎臟時(shí)，可以確認(rèn)GFP的陽(yáng)性所見(jiàn)(圖6)。這表明在同型接合體(SallK-/-))中，腎臟只來(lái)自移植到胚泡期受精卵的內(nèi)腔中的小鼠iPS細(xì)胞。另一方面，在異型接合體(Salll(+/-))的個(gè)體中， 腎臟由來(lái)自異型接合體(Salll(+/-))的個(gè)體的細(xì)胞和來(lái)自移植的iPS細(xì)胞的細(xì)胞的嵌合構(gòu)成，所以在GFP的熒光以及來(lái)自使用抗GFP抗體的免疫組織化學(xué)的熒光的兩者中均得到陽(yáng)性的細(xì)胞圖像，由此可以確認(rèn)。將iPS細(xì)胞移植到同型接合體(Salll(-/-))胚泡期受精卵中的結(jié)果，在所得的腎臟的組織學(xué)分析中，在蹄腔內(nèi)可以觀察到包含紅細(xì)胞的成熟功能腎小球、成熟腎小管結(jié)構(gòu)， 可以確認(rèn)在使用抗GFP抗體的免疫組織化學(xué)分析中，這些成熟細(xì)胞幾乎都是GFP陽(yáng)性。由以上結(jié)果可以確認(rèn)在利用上述方法制作的嵌合Mill敲除小鼠(Salll(-/-)) 中，產(chǎn)仔個(gè)體中形成的腎臟由移植到Mill敲除小鼠(Salll(-/-))胚泡期受精卵的內(nèi)腔中的iPS細(xì)胞形成。(實(shí)施例3毛缺失小鼠系統(tǒng)中的毛發(fā)育)關(guān)于毛，使用來(lái)自裸鼠的胚泡，向其中移植作為多能干細(xì)胞的上述生產(chǎn)的小鼠iPS 細(xì)胞，研究毛是否發(fā)育。(使用的小鼠)使用的小鼠是裸鼠，從日本SLC株式會(huì)社獲取。使用的裸鼠是在向近交系DDD/1 系統(tǒng)小鼠中導(dǎo)入BALB/c裸鼠的nu基因時(shí)制作的、繁殖效率良好且健壯的裸鼠。使用顯微操縱器，在顯微鏡下將小鼠iPS細(xì)胞注入胚泡中。該小鼠iPS細(xì)胞使用導(dǎo)入有GFP的iPS細(xì)胞。也可以使用與其同等的標(biāo)記的小鼠iPS細(xì)胞等。將注入后的胚移植到臨時(shí)代理的子宮中，得到產(chǎn)仔。裸鼠是自然發(fā)病模型，雖然可見(jiàn)胸腺、毛的缺失，但對(duì)存活、繁殖沒(méi)有任何影響，所以裸鼠之間可以交配。因此，產(chǎn)仔也全部是裸鼠，所以不必判定基因型。因此，也不必利用上述實(shí)施例那樣的PCR中的檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。用肉眼確認(rèn)毛是否發(fā)育。這是通過(guò)本發(fā)明的方法使裸鼠長(zhǎng)毛的實(shí)例。由該結(jié)果驗(yàn)證生出的毛是GFP陽(yáng)性的毛，即使使用小鼠iPS細(xì)胞，毛也可以再生。(總結(jié))以上結(jié)果顯示利用本發(fā)明的方法，即使是小鼠iPS細(xì)胞，也可以再生毛。(實(shí)施例4胸腺缺失小鼠系統(tǒng)中的胸腺發(fā)育)關(guān)于胸腺，使用來(lái)自裸鼠的胚泡，向其中移植作為多能細(xì)胞的上述生產(chǎn)的小鼠iPS 細(xì)胞，研究胸腺是否發(fā)育。(使用的小鼠)使用的小鼠是裸鼠，從日本SLC株式會(huì)社獲取。使用的裸鼠是向近交系DDD/1系統(tǒng)小鼠中導(dǎo)入BALB/c裸鼠的nu基因時(shí)制作的、繁殖效率良好且健壯的裸鼠。(小鼠的維持程序和確認(rèn))使用顯微操縱器，在顯微鏡下將小鼠iPS細(xì)胞注入胚泡中。該小鼠iPS細(xì)胞導(dǎo)入有GFP?？梢允褂门c其同等的標(biāo)記的小鼠iPS細(xì)胞等。將注入后的胚移植到臨時(shí)代理的子宮內(nèi)，得到產(chǎn)仔。在本實(shí)施例中，如實(shí)施例3中所述，由于使用了裸鼠，所以不必通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)。為了顯示胸腺是否發(fā)育，進(jìn)行⑶4陽(yáng)性、⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的染色。若存在胸腺，則成熟T細(xì)胞被分化誘導(dǎo)，而當(dāng)沒(méi)有再生時(shí)，成熟T細(xì)胞沒(méi)有被分化誘導(dǎo)，所以不存在胸腺。 但是，若向裸鼠的胚泡中移入GFP標(biāo)記的正常iPS細(xì)胞(BC，胚泡互補(bǔ))，則GFP陰性T細(xì)胞 (來(lái)自宿主的裸鼠造血干細(xì)胞)以及GFP陽(yáng)性T細(xì)胞(來(lái)自iPS細(xì)胞)兩者均被分化誘導(dǎo)，
28所以在功能上也可以確認(rèn)胸腺由小鼠iPS細(xì)胞構(gòu)建而成。并且，為了顯示裸鼠、野生型小鼠和嵌合的本發(fā)明的小鼠中的胸腺的發(fā)達(dá)，通過(guò)拍攝野生型小鼠的胸腺的普通照片以及照射熒光時(shí)的照片、裸鼠的胸腺的普通照片以及照射熒光時(shí)的照片、以上述方式進(jìn)行胚泡互補(bǔ)而生產(chǎn)的嵌合小鼠的胸腺的普通照片以及照射熒光時(shí)的照片、對(duì)從該嵌合小鼠中取出的胸腺照射熒光的照片，進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)確認(rèn)胸腺顯現(xiàn)熒光，證明了其是來(lái)自小鼠iPS細(xì)胞的組織。(總結(jié))以上結(jié)果表明使用本發(fā)明的方法，即使是小鼠iPS細(xì)胞，也可以再生胸腺。(實(shí)施例5)在本實(shí)施例中，使用以胰臟缺失為特征的Pdxl敲除小鼠作為宿主動(dòng)物，使用根據(jù)上述制備例制作的大鼠的iPS細(xì)胞(EGFP+)作為供體細(xì)胞，研究異種間的胚泡互補(bǔ)。A.使用的動(dòng)物作為以胰臟缺失為特征的敲除小鼠，與實(shí)施例1同樣，使用了 Pdxl基因敲除小鼠的異型接合個(gè)體(PdXl (+/-))、以及通過(guò)小鼠iPS細(xì)胞使胰臟得到補(bǔ)償?shù)耐徒雍蟼€(gè)體 (PdxK-/-)建立者)。B.大鼠iPS細(xì)胞的制備1)用于制作大鼠iPS細(xì)胞的載體的構(gòu)建自5，側(cè)起向慢病毒載體CS-⑶F-CG-PRE的多克隆位點(diǎn)中依次插入來(lái)自 pTRE-Tight(clontech)的 TRE、泛素 C 啟動(dòng)子、來(lái)自 pTet—on advanced (clontech)的 tTA、來(lái)自 pIRES2EGFP (clontech)的 IRES2EGFP。小鼠 0ct4、Klf4 和 Sox2 分別通過(guò)來(lái)自病毒的F2A、T2A連接，插入到上述慢病毒載體的TRE與泛素C啟動(dòng)子之間，制作載體 (LV-TRE-m0KS-Ubc-tTA-I2G)。2)大鼠iPS細(xì)胞的建立將傳代數(shù)為5以內(nèi)的Wistar大鼠胎兒成纖維細(xì)胞(E14. 5)細(xì)胞接種在0. 1 %明膠包被的皿中，用DMEM、15%FCS、1%青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺(SIGMA)進(jìn)行培養(yǎng)。在接種第二天，向培養(yǎng)液中加入使用LV-TRE-m0KS-Ubc-tTA-I2G載體制作的慢病毒，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒感染。M小時(shí)后交換培養(yǎng)基，重新接種在進(jìn)行了絲裂霉素C處理的MEF上，用添加 1 μ g/ml 強(qiáng)力霉素、1000U/ml 大鼠 LIF(Millipore)的 DMEMU5% FCS、1 %青霉素 / 鏈霉素/L-谷氨酰胺進(jìn)行培養(yǎng)。第二天交換培養(yǎng)基，每隔1天交換在無(wú)血清培養(yǎng)基N2B27培養(yǎng)基(GIBCO)中添加了 1 μ g/ml的強(qiáng)力霉素、1000U/ml大鼠LIF(Millipore)的培養(yǎng)基，從第 7 天起添加抑制劑 Qi ;3mM CHIR99021 (Axon) UmM PD0325901 (Stemgent)、3i ;2i+2mM SU5402 (CalbioChem) )0挑選第10天以后出現(xiàn)的集落，重新接種在MEF飼養(yǎng)層(feeder)上。 對(duì)于如此操作而建立的riPS細(xì)胞，每3 4天使用一次胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行傳代維持，之后將其移入非人哺乳動(dòng)物的胚泡中。C.異種間的胚泡互補(bǔ)使雄性Pdxl(-/-)小鼠與雌性Pdxl(+/-)小鼠交配，利用子宮回流法采集受精卵。 使采集的受精卵在體外發(fā)育至胚泡期，在顯微鏡下通過(guò)微量注射向得到的胚泡中注入上述 EGFP標(biāo)記的大鼠iPS細(xì)胞，每個(gè)胚泡注入10個(gè)細(xì)胞。將其移植到疑似妊娠臨時(shí)代理(ICR 小鼠、從日本工7工 >〉-株式會(huì)社購(gòu)入)的子宮中，妊娠期滿開(kāi)腹，分析所得的新生兒。
在熒光實(shí)體顯微鏡下觀察EGFP熒光時(shí)，由體表的EGFP表達(dá)可知新生兒個(gè)體編號(hào)#1、#2、#3是嵌合小鼠。將它們開(kāi)腹時(shí)，在#1、#2中可見(jiàn)一樣表達(dá)EGFP的胰臟。另一方面，#3的胰臟雖然部分性地呈現(xiàn)EGFP的表達(dá)，但為馬賽克狀。此外，雖然#4和#1 3是同腹仔，但未見(jiàn)體表的EGFP熒光，開(kāi)腹時(shí)缺失胰臟，由此可知是非嵌合的Pdxl(-/-)小鼠(圖 10)。另外，從這些新生兒中摘出脾臟，將從中制備的血細(xì)胞用抗小鼠或大鼠的⑶45的單克隆抗體染色，利于流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。其結(jié)果，在個(gè)體編號(hào)#1 3中同時(shí)確認(rèn)到小鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞和大鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞，所以確認(rèn)它們是夾雜有來(lái)自宿主小鼠和大鼠iPS 細(xì)胞的細(xì)胞的小鼠-大鼠異種間嵌合個(gè)體。并且，由于大鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞組分中的細(xì)胞幾乎全部呈現(xiàn)EGFP熒光，所以大鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞是來(lái)自用EGFP標(biāo)記的大鼠iPS細(xì)胞的細(xì)胞 (圖 10)。并且，作為確認(rèn)確立胚泡互補(bǔ)的證據(jù)(或許由于器官是空的(=敲除(KO))，所以才進(jìn)行確認(rèn))的實(shí)驗(yàn)，為了慎重起見(jiàn)通過(guò)來(lái)自單細(xì)胞的基因型分析，確認(rèn)個(gè)體編號(hào)#1 #3 的宿主小鼠的基因型為K0，使用上述流式細(xì)胞儀，從分析的脾臟樣品中回收小鼠CD45陽(yáng)性細(xì)胞，提取基因組DNA，將其用于基因型判定。用于基因型判定的引物如下來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞鑒定用正向引物突變型、野生型通用ATTGAG ATG AGA ACC GGC ATG(SEQ ID NO :16)來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞鑒定用反向引物突變體檢測(cè)用:TTCAAC ATC ACT GCC AGC TCC (SEQ ID NO :17)野生型檢測(cè)用:TGTGAG CGA GTA ACA ACC (SEQ ID NO :18)。其結(jié)果，在#1和#2中只確認(rèn)到突變型(mutant)的譜帶，在個(gè)體編號(hào)#3中，檢測(cè)到突變型和野生型(wild type)兩者的譜帶。由此可知在#1和#2中，宿主小鼠的基因型為Pdxl(-/_)；而在個(gè)體編號(hào)#3中，宿主小鼠的基因型為Pdxl (+/-)(圖10A)。由該結(jié)果可知在本來(lái)不該形成胰臟的Pdxl(-/-)小鼠即#1、#2中，通過(guò)應(yīng)用以大鼠iPS細(xì)胞為供體的異種間胚泡互補(bǔ)技術(shù)，成功地在小鼠個(gè)體內(nèi)構(gòu)建了大鼠的胰臟。(實(shí)施例6使用小鼠以外的動(dòng)物的例子)在本實(shí)施例中證實(shí)即使在使用小鼠以外的動(dòng)物的情況下，也可以制造器官。在小鼠以外的種中，具有嵌合形成能的多能干細(xì)胞的建立，同樣可以通過(guò)根據(jù)上述制備例生產(chǎn) iPS細(xì)胞，之后生產(chǎn)嵌合，按照實(shí)施例1來(lái)實(shí)施。這里，例如也可以用大鼠、豬、牛和人代替小鼠，按照實(shí)施例1生產(chǎn)iPS細(xì)胞。例如，在本實(shí)施例中，作為小鼠以外的例子，即使是可以制作基因改變動(dòng)物的動(dòng)物種(大鼠(轉(zhuǎn)基因)、豬(轉(zhuǎn)基因、敲除)、牛(轉(zhuǎn)基因、敲除)，預(yù)想也可以參照實(shí)施例1進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。由此，可以進(jìn)行致死性基因改變建立者大鼠、豬、牛等的制造。這樣，即使在使用大鼠、豬、牛的情況下，也可以按照實(shí)施例1進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。如上所述，雖然使用本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案來(lái)例示本發(fā)明，但本發(fā)明理解為應(yīng)該只根據(jù)權(quán)利要求書來(lái)解釋其范圍。在本說(shuō)明書中，引用的專利、專利申請(qǐng)和文獻(xiàn)，理解為與其內(nèi)容本身具體地記載在本說(shuō)明書中一樣，其內(nèi)容應(yīng)作為對(duì)本說(shuō)明書的參考而引用。
序列表自由文本
SEQIDNO ；:1 為 Oct3/4 用正向引物、Fw(m0ct3/4-S1120) :CCC TGG GGA TGCTGTGAG CCAAGG
SEQIDNO ；:2 為 Oct3/4 用反向引物、Rv(pMX/L3205) :CCC TTT TTC TGG AGACTAAAT AAA
SEQIDNO ；:3 為 Klf4 用正向引物、Fw(Klf4-S 1236) :GCG AAC TCA CAC AGGCGAGAA ACC
SEQIDNO ；:4 為 Klf4、Sox2、c-Myc 用反向引物、Rv(pMXs_AS3200) :TTA TCGTCGACC ACTGTGCTG CTG
ΓΑ「SEQIDNO ::5 為 Sox2用正向引物、Fw(Sox2-S768) :GGT TAC CTC TTC CTC CCACTCUAu
SEQIDNO ；:6 為 c-Myc 用正向引物、FW(c-Myc-S1093) :CAG AGG AGG AAC GAGCTGAAG CGC
SEQIDNO:7為來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞鑒定用正向(Fw)引物ATT GAG ATGAGAACC GGCATG
SEQIDNO:8來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞鑒定用反向I(Rvl)引物TTC AAC ATCACTGCC AGCTCC
SEQIDNO:9來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞鑒定用反向(Rv2)引物TGT GAG CGAGTAACA ACC
SEQIDNO ；:10轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用正向(Fw)引物TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG
SEQIDNO ；11轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用反向(Rv)引物-.Ckk TGA TGG CTC CAG GGT AA
SEQIDNO:12來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(突變體)檢測(cè)用正向引物AAG GGACTGGCT GCTATTGG
SEQIDNO:13來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(野生型)檢測(cè)用正向引物GTA CACGTTTCT CCTCAGGAC
SEQIDNO :14來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(突變體)反向引物ATA TCA CGG GATGCCAAC GC
SEQIDNO:15來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(野生型)檢測(cè)用反向引物TCT CCAGTGTGA GTTCTCTCG
SEQIDNO:16來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞檢測(cè)用正向引物(突變體野生型通用)ATT GAGATGAGA ACC GGC ATG
SEQIDNO:17來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(突變體)檢測(cè)用反向引物TTC AACATCACT GCCAGCTCC
SEQIDNO:18來(lái)自所注入的胚的細(xì)胞(野生型)檢測(cè)用反向引物TGT GAGCGAGTA ACAACC
3權(quán)利要求
1.制造目標(biāo)器官的方法，該方法是在具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常的非人哺乳動(dòng)物的生物體內(nèi)，制造來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的該目標(biāo)器官，該方法包括以下步驟a)制備來(lái)自該異個(gè)體哺乳動(dòng)物的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞即iPS細(xì)胞的步驟；b)將該細(xì)胞移植到該非人哺乳動(dòng)物的胚泡期的受精卵中的步驟；c)使該受精卵在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔的步驟；以及d)由該產(chǎn)仔個(gè)體獲得該目標(biāo)器官的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自人、大鼠或小鼠。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠或小鼠。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述要制造的器官選自胰臟、腎臟、胸腺和毛。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中，上述小鼠為Mill敲除小鼠、Pdxl-Hesl轉(zhuǎn)基因小鼠、 Pdx-I敲除小鼠或裸鼠。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述目標(biāo)器官是完全來(lái)自上述異個(gè)體哺乳動(dòng)物的器官。
8.權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使初期化因子與體細(xì)胞接觸而得到上述iPS細(xì)胞的步驟。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞和上述非人哺乳動(dòng)物是異種的關(guān)系。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠，上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。
11.非人哺乳動(dòng)物，其具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常，該非人哺乳動(dòng)物是通過(guò)包括下述步驟的方法生產(chǎn)的a)制備來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞的步驟；b)將該iPS細(xì)胞移植到該非人哺乳動(dòng)物的胚泡期的受精卵中的步驟；以及c)使該受精卵在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔的步驟。
12.非人哺乳動(dòng)物在使用iPS細(xì)胞的目標(biāo)器官的制造中的應(yīng)用，所述非人哺乳動(dòng)物具有在發(fā)育期該目標(biāo)器官未發(fā)育的異常。
13.用于制造目標(biāo)器官的組合，該組合具備A)非人哺乳動(dòng)物，其具有在發(fā)育期該目標(biāo)器官未發(fā)育的異常；以及B)來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞或初期化因子以及所需的體細(xì)胞。
14.生產(chǎn)目標(biāo)器官或身體部分的方法，該方法包括以下步驟A)提供動(dòng)物的步驟，所述動(dòng)物包含編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的缺失原因基因、且該器官或身體部分通過(guò)胚泡互補(bǔ)而得到補(bǔ)償，該步驟中上述缺失原因基因是編碼該目標(biāo)器官或身體部分的缺失原因的基因；B)由該動(dòng)物獲得卵子，并使之成長(zhǎng)為胚泡的步驟；C)將具有所期望的基因組的目標(biāo)iPS細(xì)胞導(dǎo)入該胚泡中，以生產(chǎn)嵌合胚泡的步驟，該所期望的基因組具有補(bǔ)償由該缺失原因基因引起的缺失的能力；以及D)由該嵌合胚泡生產(chǎn)個(gè)體，再由該個(gè)體獲得該目標(biāo)器官或身體部分的步驟。
15.權(quán)利要求14所述的方法，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)使初期化因子與體細(xì)胞接觸而得到上述iPS細(xì)胞的步驟。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述D)步驟包含使上述嵌合胚泡在非人臨時(shí)代理哺乳動(dòng)物的母胎中發(fā)育以得到產(chǎn)仔，再由該產(chǎn)仔個(gè)體獲得該目標(biāo)器官。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述目標(biāo)iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠或小鼠。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述目標(biāo)器官或身體部分選自胰臟、腎臟、胸腺和毛。
19.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述動(dòng)物為小鼠。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中，上述小鼠為Salll敲除小鼠、Pdx-I敲除小鼠、 Pdxl-Hesl轉(zhuǎn)基因小鼠或裸鼠。
21.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述目標(biāo)器官或身體部分完全來(lái)自上述目標(biāo)多能細(xì)胞。
22.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞和上述非人哺乳動(dòng)物是異種的關(guān)系。
23.權(quán)利要求14所述的方法，其中，上述iPS細(xì)胞來(lái)自大鼠，上述非人哺乳動(dòng)物為小鼠。
24.用于制造目標(biāo)器官或身體部分的組合，該組合具備A)非人動(dòng)物，該非人動(dòng)物包含編碼若發(fā)揮功能則無(wú)法存活或難以存活的器官或身體部分的缺失原因的基因、且該器官或身體部分通過(guò)互補(bǔ)而得到補(bǔ)償；以及B)來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的iPS細(xì)胞或初期化因子和所需的體細(xì)胞的組合。
25.權(quán)利要求M所述的組合，其中，上述非人動(dòng)物和上述iPS細(xì)胞是異種的關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明明確了下述事實(shí)在胚泡互補(bǔ)方法中，通過(guò)向發(fā)育的胚泡中注入誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，可以補(bǔ)償胰臟等器官的缺失，利用上述事實(shí)可以進(jìn)行器官的再生，從而解決了上述課題。由此，本發(fā)明提供在具有在發(fā)育期目標(biāo)器官未發(fā)育的異常的非人哺乳動(dòng)物的生物體內(nèi)，使用iPS細(xì)胞制造來(lái)自不同于該非人哺乳動(dòng)物的個(gè)體的異個(gè)體哺乳動(dòng)物的該目標(biāo)器官的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102196722SQ200980142469
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者中內(nèi)啟光, 小林俊寬, 山口智之, 濱中早苗 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)