專利名稱：利用內(nèi)部校正定量檢測rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)與化學(xué)領(lǐng)域。具體說，本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體說， 本發(fā)明屬于核酸定量與實時PCR領(lǐng)域。此外，本發(fā)明涉及經(jīng)校正的靶核糖核酸定量檢測。
背景技術(shù)：
核酸混合物中特定靶核糖核酸(本文中也稱特定RNAs)的定量檢測對分子生物學(xué)的許多應(yīng)用，如基因表達(dá)分析、或核酸混合物中特定RNA的純化至關(guān)重要。在定量檢測方法中，需確定樣品中特定RNA的濃度和/或相對或絕對含量。具體說，對于基因表達(dá)分析，例如測定生物樣品中的mRNA水平，需要一種可重現(xiàn)和比較的方法。例如，不總是能獲得具有相當(dāng)體積、核酸含量、細(xì)胞材料等的生物樣品。此外，生物樣品中核酸檢測和定量的靈敏度和選擇性至關(guān)重要。為了更好地比較兩種或多種不同(生物學(xué))樣品中特定RNA的含量或者比較一個樣品中兩種或多種不同特定RNA的含量，必須把特定RNA的含量按輸入核酸或輸入核酸中的特定種類為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。例如，特定RNA的含量可以通過將這些含量與樣品中的內(nèi)標(biāo)或全部(即總)核酸量或樣品中特定種類核酸的含量相關(guān)聯(lián)而進(jìn)行校正。對于(生物學(xué))樣品中核酸的常規(guī)定量，廣泛采用了定量(實時)PCR(qPCR)。對于RNA，具體是mRNA，本領(lǐng)域采用定量實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)。已采用不同的方法對定量PCR方法得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。將特定mRNA的含量按不同的參比基因，例如持家或保持基因如β-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (HPRT)基因、或者28S或18S核糖體RNA的一種或多種mRNA的含量進(jìn)行校正就是其中一種方法。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些校正基因的表達(dá)水平取決于實驗條件、樣品的制備和來源(如組織或細(xì)胞類型)而不同，因此它們不是輸入核酸的可靠指示。所以，通常需要在費力易錯的過程中測試各種不同的持家基因以鑒定在所研究的樣品之間沒有變化的那些基因。其它方法有，例如，依靠DNA和/或RNA總量或如核糖體RNA (rRNA)總量進(jìn)行的校正。由于生物細(xì)胞和樣品中核糖體RNA的含量同樣取決于多種因素而有差異，用rRNA校正也不太優(yōu)選。本領(lǐng)域現(xiàn)有的依賴于按例如核酸總量、RNA總量或基因組DNA總量進(jìn)行校正的方法也有局限性，如這些含量變化或核酸樣品的質(zhì)量有所不同。用外來或人造分子如摻入樣品(如細(xì)胞抽提物或者組織衍生樣品)中的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行校正也不總是充分的方案，因為它們不能代表細(xì)胞內(nèi)的核酸(如基因組DNA、RNA、mRNA)含量。此外，為了比較經(jīng)校正的數(shù)據(jù)以及實驗方案的重現(xiàn)性，需要對所用的實驗條件編制詳盡的文檔。當(dāng)分別測定或用不同方法測定感興趣的核酸與校正核酸的含量時，這一點特別相關(guān)。因此，本發(fā)明主要的技術(shù)問題是開發(fā)和提供一種改進(jìn)的、特別是較不費力不易錯的方法來校正靶核糖核酸的含量。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種定量測定樣品中一種或多種靶核糖核酸的方法，包括以下步驟
(i)提供包含所述一種或多種靶核糖核酸的樣品；(ii)在允許所述染料與所述樣品中一種或多種核糖核酸結(jié)合的條件下，使所述樣品與核糖核酸特異性熒光染料接觸；(iii)測定所述樣品中所述RNA-結(jié)合染料的熒光；(iv)將所述測得的熒光與樣品中的RNA總量相關(guān)聯(lián)；(ν)逆轉(zhuǎn)錄所述一種或多種核糖核酸，從而產(chǎn)生雙鏈核酸；(vi)擴增所述一種或多種產(chǎn)生的雙鏈核酸，其中在擴增期間和/或之后，在允許一種或多種探針與樣品中產(chǎn)生的所述一種或多種雙鏈核酸結(jié)合的條件下，存在所述一種或多種擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針；(vii)測定擴增期間和/或之后結(jié)合于所述一種或多種擴增產(chǎn)物的所述一種或多種探針的熒光，并把所述測得的熒光與樣品中靶RNA序列的量相關(guān)聯(lián)；(viii)按樣品中RNA的總量校正樣品中靶RNA序列的含量。樣品至少含有需定量的核糖核酸的核酸分子。所述核酸可以包含在細(xì)胞或者生物體內(nèi)，但也可以存在于無細(xì)胞系統(tǒng)中。樣品可以是液體、裂解液、固體基質(zhì)或其它含有核酸分子的任何物質(zhì)。在本發(fā)明中，樣品可以是所有生物組織和所有液體如淋巴液、尿液、腦液。 組織可以是，例如上皮組織、結(jié)締組織如骨骼或血液、肌肉組織如內(nèi)臟或平滑肌和骨骼肌， 以及神經(jīng)組織。在一種實施方式中，樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)抽提物。本文中，靶核糖核酸可以是任何來源，如病毒、細(xì)菌、原始細(xì)菌、真菌、核糖體、真核或原核細(xì)胞來源?？梢詠碜匀魏紊飳W(xué)樣品和任何生物體、組織、細(xì)胞、或亞細(xì)胞區(qū)室。例如，可以是來自植物、真菌、動物的核酸，特別是人的核酸。在定量之前，可預(yù)先處理RNA，如分離、純化或修飾。也可以定量測定人造RNA。RNA的長度可以不同?？梢孕揎桼NA，例如可含有一種或多種修飾的核苷堿基或修飾的糖基(如含甲氧基團(tuán))。在肽核酸(PNA)中，RNA 骨架可含一個或多個肽鍵。RNA可含堿基類似物如非嘌呤或非嘧啶類似物或者核苷酸類似物。也可含其它附著物如蛋白質(zhì)、肽和/或氨基酸。本文的“引物”指包含與待轉(zhuǎn)錄核酸(“模板”)基本互補序列的寡核苷酸。在復(fù)制過程中，聚合酶將各核苷酸加到與模板各對應(yīng)核苷酸基本互補的引物的3’末端上。本文的“RNA特異性染料”定義如下"RNA特異性染料”的光譜性質(zhì)不得干擾用來檢測靶RNA的光譜性質(zhì)，允許進(jìn)行同時檢測。用于檢測靶RNA的反應(yīng)混合物含有可能干擾RNA的測定的各種物質(zhì)，如DNA、核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、洗滌劑、鹽。因此，所選的RNA特異性染料受這些物質(zhì)影響的程度必須不會干擾對RNA的定量測定。在上述物質(zhì)存在時，要求將RNA的濃度與熒光值之間相關(guān)連。"RNA特異性染料”可以是能與RNA特異性結(jié)合、并且基本上不與樣品中通常存在的其它核酸如DNA或其它成分結(jié)合的染料。結(jié)合后，RNA特異性染料的光譜特性可以改變， 如熒光增強?；蛘撸癛NA特異性染料”也可以是與樣品中的核酸非特異性結(jié)合的染料，但其光譜特性如熒光僅在與RNA結(jié)合時才發(fā)生顯著改變。因此，"RNA特異性染料”允許選擇性檢測 RNA而不受樣品中通常存在的其它核酸或蛋白質(zhì)、洗滌劑、鹽或其它成分顯著干擾。本文的“DNA特異性染料”定義如下“DNA特異性染料”的光譜性質(zhì)不得干擾用來檢測總RNA的染料的光譜性質(zhì)，允許進(jìn)行同時檢測?！癉NA特異性染料”需要對擴增產(chǎn)物有特異性，要么選擇對雙鏈DNA有選擇性的染料，要么選擇對擴增產(chǎn)物序列有選擇性的探針。本文的“熒光探針”是DNA特異性染料或者標(biāo)記了熒光染料的核酸探針。本發(fā)明的核酸探針是與特定核酸序列基本互補的寡核苷酸、核酸或其片段。RNA特異性染料的光譜性質(zhì)不同于DNA特異性染料或者熒光染料，因此它們都可以被檢出。本發(fā)明還涉及定量測定樣品中靶RNA的試劑盒，其包含，(i)與RNA特異性結(jié)合的熒光染料，和(ii) 一種或多種DNA擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針。本文所用的試劑盒是一種包裝組件，任選地包括組件的使用說明和/或用于該用途的其它反應(yīng)物和組分。本發(fā)明還涉及RNA特異性熒光染料如Quant-iTTM-RNA在按樣品中RNA總量校正樣品中靶RNA序列含量中的應(yīng)用。發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些染料允許對RNA進(jìn)行校正。本發(fā)明涉及一種定量測定樣品中一種或多種靶核糖核酸的方法，包括以下步驟(i)提供包含所述一種或多種靶核糖核酸的樣品；(ii)在允許所述染料與所述樣品中一種或多種核糖核酸結(jié)合的條件下，使所述樣品與核糖核酸特異性熒光染料接觸；(iii)測定所述樣品中所述RNA-結(jié)合染料的熒光；(iv)將所述測得的熒光與樣品中的RNA總量相關(guān)聯(lián)；(ν)逆轉(zhuǎn)錄所述一種或多種核糖核酸，從而產(chǎn)生雙鏈核酸；(vi)擴增所述一種或多種產(chǎn)生的雙鏈核酸，其中在擴增期間和/或之后，在允許一種或多種探針與樣品中產(chǎn)生的所述一種或多種雙鏈核酸結(jié)合的條件下，存在所述一種或多種擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針；(vii)測定擴增期間和/或之后結(jié)合于所述一種或多種擴增產(chǎn)物的所述一種或多種探針的熒光，并把所述測得的熒光與樣品中靶RNA序列的量相關(guān)聯(lián)；(viii)按樣品中RNA的總量校正樣品中靶RNA序列的含量。在所述方法的一種實施方式中，樣品為總RNA制品。在另一種具體實施方式
中， 需定量測定的靶 RNA 是選自下組的 RNA :mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、 scaRNA、microRNA、dsRNA、核酶、核開關(guān)(riboswitcti)和病毒RNA，所述RNA總量選自下組 RNA總量、mRNA總量、rRNA總量、tRNA總量、nRNA總量、siRNA總量、snRNA總量、snoRNA總量、scaRNA總量、microRNA總量、dsRNA總量、核酶總量、核開關(guān)(riboswitch)總量、病毒 RNA總量。優(yōu)選地，需定量測定的靶RNA是mRNA。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述RNA特異性染料選自下組化合物6
權(quán)利要求
1.檢測樣品中一種或多種靶核糖核酸的方法，包括以下步驟(i)提供包含所述一種或多種靶核糖核酸的樣品；(ii)在允許所述染料與所述樣品中一種或多種核糖核酸結(jié)合的條件下，使所述樣品與核糖核酸特異性熒光染料接觸；(ill)測定所述樣品中所述RNA-結(jié)合染料的熒光； (iv)將所述測得的熒光與樣品中的RNA總量相關(guān)聯(lián)； (ν)逆轉(zhuǎn)錄所述一種或多種核糖核酸，從而產(chǎn)生雙鏈核酸；(vi)擴增所述一種或多種產(chǎn)生的雙鏈核酸，其中在擴增期間和/或之后，在允許一種或多種探針與樣品中產(chǎn)生的所述一種或多種雙鏈核酸結(jié)合的條件下，存在所述一種或多種擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針；(vii)測定擴增期間和/或之后結(jié)合于所述一種或多種擴增產(chǎn)物的所述一種或多種探針的熒光，并把所述測得的熒光與樣品中靶RNA序列的量相關(guān)聯(lián)；(viii)按樣品中RNA的總量校正樣品中靶RNA序列的含量。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，其中所述反應(yīng)在一個反應(yīng)容器中進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，其中所述樣品為總RNA制品。
4.如上述權(quán)利要求中任一項所述方法，其特征在于，其中所述RNA特異性熒光染料是 Quant-iT -RNA 試劑。
5.如上述權(quán)利要求中任一項所述方法，其特征在于，其中所述DNA特異性熒光探針是雙鏈DNA的異性熒光染料。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，其中所述熒光染料選自下組STORGreen I、 SYT0-9、SYT0-13、SYT0-16、SYTO-64、SYT0-82、YO-PRO-1、SYT0-60、SYT0-62、SYTOX 橙、SYBR 綠 I、T0-PR0-3、T0T0-3、P0P0-3 和 B0B0-3。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述方法，其特征在于，其中所述DNA特異性熒光探針是標(biāo)記有熒光染料的寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針與由靶RNA序列所產(chǎn)生的DNA序列基本互補。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述方法，其特征在于，其中定量檢測樣品中的兩種或多種的靶核糖核酸，每種需要定量檢測的靶RNA采用一種標(biāo)記有不同熒光染料的寡核苷酸探針。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述方法，其特征在于，其中所述擴增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)是定量實時PCR。
11.定量檢測樣品中靶RNA的試劑盒，其包含 (i)與RNA特異性結(jié)合的熒光染料，( ) 一種或多種DNA擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針。
12.RNA特異性熒光染料在按樣品中RNA總量校正樣品中靶RNA序列含量中的應(yīng)用。
13.如利要求10所述試劑盒在按樣品中RNA總量校正樣品中靶RNA序列含量中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1-9中任一項所述方法或權(quán)利要求10所述試劑盒在基因表達(dá)分析中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量樣品中一種或多種靶核糖核酸的方法，包括以下步驟，(i)提供包含所述一種或多種靶核糖核酸的樣品，(ii)在允許所述染料與所述樣品中的一種或多種核糖核酸結(jié)合的條件下，使所述樣品與核糖核酸特異性熒光染料接觸，(iii)檢測所述樣品中所述RNA-結(jié)合染料的熒光值，(iv)將所測得的熒光值與樣品中的RNA總量相關(guān)聯(lián)，(v)逆轉(zhuǎn)錄所述一種或多種核糖核酸，從而產(chǎn)生雙鏈核酸，(vi)擴增所述一種或多種產(chǎn)生的雙鏈核酸，其中在擴增期間和/或之后，在允許樣品中產(chǎn)生的所述一種或多種雙鏈核酸結(jié)合所述一種或多種探針的條件下，存在所述一種或多種擴增產(chǎn)物的一種或多種特異性熒光探針，(vii)檢測擴增期間和/或之后，結(jié)合于所述一種或多種擴增產(chǎn)物的所述一種或多種探針的熒光值，并將所測得的熒光值與樣品中靶RNA序列的含量相關(guān)聯(lián)，(viii)按樣品中RNA的總量校正樣品中靶RNA序列的含量。
文檔編號C12Q1/68GK102203289SQ200980142616
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
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