專利名稱：：對通過添加殼聚糖對預處理生物質的酶水解的增強的制作方法
技術領域：
：公開了用于從含木素纖維素材料產生發(fā)酵產物的方法，更具體而言，公開了通過用殼聚糖或殼聚糖樣聚合物處理含木素纖維素材料來增加從該材料產生發(fā)酵產物的效率的方法。
背景技術：
：含木素纖維素材料，即生物質，可用于產生可發(fā)酵的糖類，其又可用于產生發(fā)酵產物如可再生的(renewable)燃料和化學物。含木素纖維素材料具有纖維素纖維包裹于木質素和半纖維素鞘中的復雜結構。從含木素纖維素材料產生發(fā)酵產物包括預處理、水解并發(fā)酵所述含木素纖維素材料。將含木素纖維素材料轉化為可再生的燃料和化學物常常涉及對生物質的物理、生物、化學和/或(用酶進行)酶處理。具體而言，酶將纖維素水解為D-葡萄糖，其為簡單的可發(fā)酵的糖。在含木素纖維素材料中，需要高劑量的酶以高產量降解纖維素，因為認為木質素和木質素衍生物抑制酶對纖維素的水解。上述抑制可至少以兩種方式進行木質素或木質素衍生物優(yōu)選結合所述酶，從而阻止該酶與纖維素結合或水解纖維素，和/或木質素或木質素衍生物覆蓋纖維素的一部分，從而減少酶與纖維素的接近。結果，當加工含木質素的生物質時，能用來降解纖維素的酶可能較少，因為木質素或其衍生物可清除所述酶或阻斷其活性。即使對于能用來降解纖維素的酶，可用的酶也常常無法與纖維素接觸，因為木質素覆蓋纖維素。因此，降低了消化纖維素的方法的有效性。此外，酶成本高。因此，當降解纖維素所需的酶量較高時，加工成本高昂，在經(jīng)濟上不可取。獲得令人滿意的糖產量所需的酶量的減少可對工藝經(jīng)濟有顯著的影響。因此，提高酶使用效率是生物轉化方法中的主要需求。認為數(shù)種因素影響纖維素的酶水解。這些因素包括木質素含量、半纖維素含量、乙?；俊⒗w維素的表面積和纖維素結晶性。通常應理解的是，存在于復雜底物中的木質素對酶活性具有負面作用。尚難確定木質素和木質素衍生物在限制水解中的準確作用。然而，已知去除木質素及其衍生物增加纖維素的水解并增加可發(fā)酵的糖的產量。木質素及其衍生物的去除可能打開了更多纖維素表面積以供酶攻擊，且可減少非特異性吸附于木素纖維素底物上的酶量?？墒褂没衔飦砣コ举|素及其衍生物的作用從而使得纖維素更易受酶降解。
發(fā)明內容公開了在殼聚糖或殼聚糖樣聚合物存在下通過預處理和/或水解含木素纖維素材料從該材料產生發(fā)酵產物的方法。還公開了用于從含木素纖維素材料產生發(fā)酵產物的方法，包括預處理含木素纖維素材料；將殼聚糖或殼聚糖樣聚合物引入所述經(jīng)預處理的含木素纖維素材料；將所述經(jīng)預處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和用發(fā)酵微生物發(fā)酵以產生發(fā)酵產物。在一個方面，所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物可在將所述含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶之前引入所述含木素纖維素材料。所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物可以以少于10%w/w殼聚糖/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述含木素纖維素材料。例如，所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物可以以約少于2%w/w殼聚糖/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述含木素纖維素材料。附圖簡述圖1殼聚糖劑量對來自稀酸PCS水解的葡萄糖產量隨時間的作用。圖2殼聚糖劑量對來自稀酸PCS水解的糖轉化率隨時間的作用。具體實施例方式公開了改進的并更有效的通過使用殼聚糖或殼聚糖樣聚合物酶水解含木質素的生物質的方法。木質素是可通過松柏醇和/或芥子醇的脫氫聚合獲得的酚聚合物，并見于多種植物的細胞壁中。如本文中使用的術語“木質素”指木質素聚合物的完整結構以及由木質素結構的破壞得到的所述完整聚合物的任何衍生片段或化合物，包括可溶性木質素衍生物、縮合的(condensed)木質素衍生物和不可溶性木質素衍生物。木質素衍生物可變化它們與殼聚糖的相互作用。例如，不溶性沉淀的木質素和縮合的木質素具有從水溶液吸附殼聚糖的能力，而與之相對，殼聚糖吸附可溶性木質素衍生物。如本文中使用的術語“生物質漿料”指經(jīng)歷酶水解的水性生物質材料。生物質漿料通過將生物質例如玉米秸稈、甘蔗渣等與水、緩沖液和其它預處理材料混合而產生。在水解之前可預處理生物質漿料。如本文中使用的術語“木質素阻斷(ligninblocking)”意指減少或消除木質素對生物質轉化為發(fā)酵產物的方法的有害作用。在一個實施方案中，本方法利用了殼聚糖，其優(yōu)選地比纖維素更易結合木質素?？捎脷ぞ厶翘幚砗举|素的生物質漿料，例如通過將粉末形式的殼聚糖直接傾入生物質漿料。殼聚糖優(yōu)選與木質素結合從而妨礙木質素與水解酶結合或覆蓋纖維素的部分使水解酶無法接近。然后纖維素水解酶可更有效地和迅速地水解纖維素。如果不用殼聚糖處理含木質素的生物質漿料，木質素可與纖維素水解酶的一部分結合使其無法水解纖維素，或可覆蓋纖維素的部分，使其無法被水解酶接近。不拘于任何具體理論，認為木質素以多種方式作用以抑制酶對生物質中纖維素的水解。對木質素抑制酶活性的模式的理解能夠減少傳統(tǒng)上由生物質中木質素含量導致的有害作用。如下詳述，可在水解含木素纖維素材料或生物質之前對其進行預處理。例如，預處理可為蒸汽預處理、堿性預處理、酸性預處理或其某種組合的形式。蒸汽預處理物理地打開生物質的結構，即至少部分地打斷連接木質素、纖維素和半纖維素的鍵。堿性預處理通常包括用堿性物質如銨處理生物質。堿性預處理化學地改變生物質。對于生物質的木質素組分，認為堿性預處理至少部分地降解木質素，形成木質素衍生物和小的酚類片段，其可不利地影響酶的性能以及酵母的生長和發(fā)酵能力。酸性預處理也化學地改變生物質的木質素組分，形成包括縮合的木質素的木質素衍生物，其沉淀于纖維素纖維表面。所述縮合的木質素通過覆蓋纖維素纖維的表面抑制酶到達纖維素。其它在酸性預處理過程中形成的木質素衍生物包括可抑制酶功能的小的含酚片段和化合物。還認為用殼聚糖或殼聚糖樣聚合物處理生物質漿料是有效的，至少部分是通過結合木質素，因而減少和/或抑制木質素對纖維素水解酶的非生產性吸附。此外，認為殼聚糖或殼聚糖樣聚合物作為針對酶的表面活性劑起作用，使酶保持在溶液中，從而潛在地使酶遠離木質素，穩(wěn)定酶，并延長酶具有生產性的時間(productivelife)。用殼聚糖處理生物質漿料因此通過抑制木質素對酶的結合和改進酶的活性改進了對含木質素底物的加工。殼聚糖減少了酶的使用和/或改進了性能，因為所述酶可能不會結合于木質素從而仍可用其更有效地水解生物質漿料。此外，通過殼聚糖的表面活性劑作用延長了酶具有生產性的時間。本方法在含木質素的生物質漿料的水解中減少酶加載。通過用殼聚糖或殼聚糖樣聚合物處理生物質漿料顯著減少了提供水解所需的酶量。減少酶加載量減少了生物質轉化方法的總成本。根據(jù)一個實施方案，所述方法增強了纖維素的酶水解。該方法包括用殼聚糖或殼聚糖樣聚合物處理含木質素的生物質漿料以提供經(jīng)處理的具有阻斷的木質素組分的生物質漿料，并將所述經(jīng)處理的生物質漿料暴露于有效量的水解酶的步驟。所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物可在預處理過程中或之后，或者水解之前或過程中直接添加至生物質漿料。優(yōu)選將殼聚糖在添加纖維素水解酶和發(fā)酵生物之前添加至生物質漿料。殼聚糖殼聚糖通常對于含木質素的生物質而言不是原本可固有地獲得的。通常將殼聚糖以相對純化和分離的制備物，以及不存在于自然界的濃度提供。因此，例如在糖化或發(fā)酵培養(yǎng)基中殼聚糖的偶然存在，并不會提供本文中限定的制備物的木質素阻斷作用。如本文中使用的術語“木聚糖”意指由β-(1-4)連接的D-葡糖胺和N-乙?；?D-葡糖胺構成的直鏈多糖。本發(fā)明還包括其它殼聚糖樣聚合物作為木聚糖阻斷物的用途。殼聚糖樣聚合物包括與殼聚糖具有類似結構的直鏈多糖，即其它在側鏈具有氨基的直鏈多糖。殼聚糖樣聚合物是荷正電的，并可溶于酸性至中性溶液，其電荷密度取決于ΡΗ。殼聚糖通常在商業(yè)上通過甲殼質的脫乙酰產生，所述甲殼質為甲殼類(蟹、蝦等)外骨骼中的結構元件。殼聚糖中的氨基具有6.5的pKa值，因此，殼聚糖荷正電并可溶于酸性至中性溶液。殼聚糖具有生物粘附性(bioadhesive)并容易地結合于荷負電的表面。殼聚糖具有許多產業(yè)用途。例如，其已用作植物生長增強劑，以及作為促進植物防衛(wèi)真菌感染能力的物質。其還已在水處理工程中用作過濾方法的一部分。其導致細微的沉積顆粒彼此結合，隨后在砂濾過程中隨沉積物去除。殼聚糖還可用于其它需要從液體中去除懸浮顆粒的過濾情形。然而，之前未知殼聚糖可作為木質素阻斷物用于酶水解方法。涵蓋了首先用殼聚糖或其具有木質素阻斷作用的片段處理生物質漿料，然后添加纖維素水解酶，提供了纖維素轉化的最高效率。生物質漿料的殼聚糖處理還可與將纖維素水解酶添加至生物質漿料同時進行。用殼聚糖處理生物質漿料產生的從纖維素的水解產量可測量為最終糖產量或纖維素轉化率改進的百分數(shù)。舉例而言，與來自未經(jīng)殼聚糖處理的生物質漿料的纖維素的水解產量相比，可于最終的糖產量方面得到大約的改進。此外，再舉一例，與來自未經(jīng)殼聚糖處理的生物質漿料的纖維素的水解產量相比，可于纖維素轉化率方面得到大約的提高。不拘于任何具體理論，認為殼聚糖對木質素的非特異性結合可減少了酶對木質素表面的非生產性結合或由于與木質素的相互作用對酶活性的抑制。因此，在用于木素纖維素轉化的方法中使用殼聚糖處理有利地促使酶加載水平下降而取得了相同的目標轉化百分數(shù)?！飪︵l(xiāng)千麵遍“木素纖維素”或“含木素纖維素材料”意指主要由纖維素、半纖維素和木質素組成的材料。上述材料常常被稱作“生物質”。生物質具有纖維素纖維包裹于木質素和半纖維素鞘中的復雜結構。生物質的結構使其不易受酶水解。為了增強酶水解，必須預處理生物質例如通過在足夠的壓力和溫度條件下進行酸水解以打破木質素的密封，糖化并溶解半纖維素，并破壞纖維素的晶體結構。然后可將纖維素用酶水解，例如通過纖維素分解酶水解，來將糖聚合物轉化為可發(fā)酵為所需發(fā)酵產物如乙醇的可發(fā)酵的糖。還可使用半纖維素分解酶處理來水解經(jīng)預處理的生物質中任何殘留的半纖維素。生物質可為任何含有木素纖維素的材料。在一個優(yōu)選實施方案中，生物質含有至少約30wt.%，優(yōu)選至少約50wt.%，更優(yōu)選至少約70wt.%，甚至更優(yōu)選至少約90wt.%木素纖維素。應理解的是，所述生物質還可包含其它成分如蛋白質材料、淀粉和糖如可發(fā)酵或不可發(fā)酵的糖，或其混合物。生物質通常見于例如植物的莖、葉、殼/莢(hull)、殼/皮/莢/苞(husk)和穗軸或樹的葉、枝和木材。生物質包括但不僅限于草本材料、農業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。應理解的是，生物質可為在混合的基質中含有木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料的形式。其它合適的生物質的實例包括玉米纖維、稻稈、松木、刨花、甘蔗渣、紙和紙漿加工廢物、玉米秸稈、玉米穗軸、硬木如楊木和樺木、軟木、谷物秸稈如麥稈、稻稈、柳枝稷、芒屬(Miscanthus)、稻殼、城市固體廢物(MSW)、工業(yè)有機廢物、辦公室用紙或其混合物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述生物質選自玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、麥稈、稻稈、柳枝稷和甘蔗渣中的一種或多種。預處理所述生物質可用任何合適的方式進行預處理。根據(jù)本發(fā)明，預處理可包括將殼聚糖或類似化合物引入生物質。預處理在水解和/或發(fā)酵之前進行。預處理的目標是分離或釋放纖維素、半纖維素和木質素，從而增加水解的速率或效率。預處理方法(包括濕法氧化和堿性預處理)靶向木質素釋放，而稀酸處理和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纖維素釋放。蒸汽爆炸是靶向纖維素釋放的預處理方法。預處理步驟可包括其中將殼聚糖添加至生物質的步驟。如前所示，當添加殼聚糖時，生物質通常為生物質漿料的形式。如果殼聚糖是在預處理過程中添加至所述生物質漿料的，則預處理方法的其余步驟仍為常規(guī)的。然而，或者可將殼聚糖在水解步驟過程中添加，從而使得所述預處理步驟為使用本領域眾所周知的技術的常規(guī)預處理步驟。殼聚糖可以以約0.l-30wt.%總漿料的范圍添加。優(yōu)選地，殼聚糖以約IOwt.%或更少總漿料的量添加，更優(yōu)選以約2wt.%或更少總漿料的量添加。在一個優(yōu)選實施方案中，預處理發(fā)生于水性漿料中。在預處理過程中生物質可以以約IO-SOwt.%，優(yōu)選約20-70wt.%，特別是約30-60wt.%，如約50wt.%的量存在?；瘜W、機械和/或牛物預處理在水解之前或過程中，所述生物質可經(jīng)化學、機械、生物預處理，或其任意組合。優(yōu)選所述化學、機械或生物預處理實在水解之前進行的。或者，所述化學、機械或生物預處理可與水解同時進行，如與添加一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性同時，以釋放例如可發(fā)酵的糖如葡萄糖或麥芽糖。在一個實施方案中，經(jīng)預處理的生物質可以以另一種方式洗滌或解毒。然而，洗滌或解毒并非必需的。在一個優(yōu)選實施方案中，經(jīng)預處理的生物質未經(jīng)洗滌或解毒。化學預處理短語“化學預處理”指促進纖維素、半纖維素或木質素的分離或釋放的任何化學預處理。合適的化學預處理方法的實例包括用例如稀酸、石灰、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫或二氧化碳進行處理。此外，濕法氧化和控制PH的水熱解(hydrothermolysis)亦視為化學預處理。在一個優(yōu)選實施方案中，所述化學預處理為酸處理，更優(yōu)選，為連續(xù)的稀酸或弱酸(mildacid)處理，例如，用硫酸，或用其它有機酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、鹽酸或其混合物處理。也可使用其它酸。弱酸處理意為處理的PH在約pH1-5，優(yōu)選在約pH1-3的范圍內。在一個具體實施方案中，所述酸濃度在0.1到2.Owt%酸的范圍內，并優(yōu)選為硫酸。該酸可與所述生物質相接觸，且混合物可保持在約160-220°C，如約165-195°C范圍內的溫度，處理時間為數(shù)分鐘到數(shù)秒，例如，1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘?？商砑訌娝?如硫酸)來移除半纖維素。上述強酸的添加增強了纖維素的可消化性。根據(jù)本發(fā)明亦涵蓋其它化學預處理技術。已經(jīng)顯示纖維素溶劑處理將約90%的纖維素轉化為葡萄糖。也顯示了當木素纖維素結構被破壞時，極大增強了酶水解。堿、H2O2、臭氧、有機溶劑(使用含水醇中的路易斯酸，F(xiàn)eCl3,(Al)2SO4)、甘油、二噁烷，苯酚或乙二醇屬于已知破壞纖維素結構并促進水解的溶劑(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96673-686)。本發(fā)明也涵蓋了使用堿，例如NaOH，Na2CO3和氨等的堿性化學預處理。使用氨的預處理方法描述于例如WO2006/11089UW02006/110899、W02006/110900、W02006/110901,其通過提述并入本文。濕氧化技術涉及使用氧化劑，如，基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預處理的實例包括用DMSO(二甲亞砜)等的處理?；瘜W預處理通常進行1到60分鐘，如5到30分鐘，但可依賴于待進行預處理的材料進行較短或較長的時間。其它合適的預處理方法的實例描述于khell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.105-108卷69-85禾口Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686，以及美國申請公開2002/0164730號，其每一篇均在此通過提述并入。機械預處理短語“機械預處理”指任何機械的或物理的預處理，其促進自生物質分離或釋放纖維素、半纖維素或木質素。舉例而言，機械預處理包括多種類型的磨制、輻射、汽蒸/蒸汽爆炸(steamexplosion)，以及水熱解。機械預處理包括粉碎，即機械減小大小。粉碎包括干磨、濕磨和振動球磨(vibratoryballmilling)。機械預處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)?！案邏骸币庵笁毫υ诩s300到600psi，優(yōu)選400到500psi，例如約450psi的范圍內。高溫意指溫度在約100到300°C，優(yōu)選約140到235°C的范圍內。在一個優(yōu)選實施方案中，機械預處理是分批方法的蒸汽槍水解器系統(tǒng)，其使用如上定義的高壓和高溫。也可為此使用SimdsHydrolyzer(可由SundsDefibratorAB(Sweden)得至Ij)。組合的化學和機械預處理在一個優(yōu)選實施方案中，對生物質進行了化學和機械預處理。例如，所述預處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。所述化學和機械預處理可根據(jù)需要順序或同時進行。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，對生物質進行化學和機械預處理以促進纖維素、半纖維素或木質素的分離或釋放。在一個優(yōu)選實施方案中，所述預處理作為稀酸或弱酸預處理步驟進行。在另一個優(yōu)選實施方案中，預處理作為氨纖維爆炸(ammoniafiberexplosion)步驟(或AFEX預處理步驟)進行。牛物預處理短語“生物預處理”指促進自生物質分離或釋放纖維素、半纖維素或木質素的任何生物預處理。生物預處理技術可涉及應用溶解木質素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-Α.,1996,Pre-treatmentofbiomass,HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,1994,Pre—treatinglignocellulosicbiomass-.areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L.禾口Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander,L.禾口Eriksson,K.-Ε.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。^CM在發(fā)酵經(jīng)預處理的生物質(優(yōu)選為生物質漿料的形式)之前，可將其水解以將纖維素和半纖維素降解為可發(fā)酵的糖。在一個優(yōu)選實施方案中，經(jīng)預處理的材料在發(fā)酵之前經(jīng)水解，優(yōu)選酶水解。水解過程中的干固體含量可為約5_50wt.%，優(yōu)選約10_40wt.%，優(yōu)選約20-30wt.%的范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，水解可作為補料分批工藝進行，其中將經(jīng)預處理的生物質(即，底物)逐漸加料于例如含有酶的水解溶液。在一個優(yōu)選實施方案中，水解是通過酶進行的。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)預處理的生物質漿料可由一種或多種纖維素分解酶(如纖維素酶或半纖維素酶或其組合)來水解。在一個優(yōu)選實施方案中，水解是使用下述纖維素分解酶制備物來進行的，其包含一種或多種具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，具有纖維素分解增強活性的多肽是家族GH61A來源的。合適和優(yōu)選的纖維素分解酶制備物和具有纖維素分解增強活性的多肽的實例描述于下面的“纖維素分解酶”部分和“纖維素分解增強多肽”部分。因為生物質可含有除了木質素、纖維素和半纖維素之外的組分，水解和/或發(fā)酵可在其它酶活性(如蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖生成酶活性和酯酶活性如脂肪酶活性)存在下進行。酶水解優(yōu)選在合適的水性環(huán)境中在本領域技術人員可容易地確定的條件下進行。在一個優(yōu)選實施方案中，水解在對所述酶合適的，優(yōu)選為最佳的條件下進行。合適的方法時間、溫度和pH條件可容易地由本領域技術人員確定。優(yōu)選地，水解在25-70°C，優(yōu)選40-60°C，特別是約50°C的溫度進行。水解優(yōu)選在pH3_8，優(yōu)選pH4_6，特別是約PH5的pH范圍中進行。此外，水解通常進行12-96小時，優(yōu)選16-72小時，更優(yōu)選24-48小時。鐘來自經(jīng)預處理和/或水解的生物質的可發(fā)酵糖可以通過一種或多種發(fā)酵生物發(fā)酵，所述發(fā)酵生物能夠直接或間接地將糖類，如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖發(fā)酵成想要的發(fā)酵產物。發(fā)酵條件依賴于想要的發(fā)酵產物和發(fā)酵生物，并且能夠由本領域普通技術人員容易地確定。特別是在乙醇發(fā)酵的情況下，發(fā)酵可以進行1-48小時，優(yōu)選I-M小時。在一個實施方案中，所述發(fā)酵在20-40°C，優(yōu)選，特別是大約32°C的溫度進行。在一個實施方案中，PH大于5。在另一個實施方案中，pH為pH3-7，優(yōu)選4-6。然而，某些發(fā)酵生物，例如細菌發(fā)酵生物具有較高的最佳發(fā)酵溫度。因此，在一個實施方案中，發(fā)酵在40-60°C，如50-60°C的溫度進行。本領域技術人員能夠容易地確定合適的發(fā)酵條件。發(fā)酵可以在分批、補料分批或連續(xù)反應器中進行。補料分批發(fā)酵可以是固定體積或可變體積的補料分批。在一個實施方案中，采用補料分批發(fā)酵。補料分批發(fā)酵的體積和速率依賴于，例如，發(fā)酵生物、可發(fā)酵糖類的性質(identity)和濃度、和想要的發(fā)酵產物。這樣的發(fā)酵速率和體積能夠由本領域普通技術人員容易地確定。SSF、HHF和SHF水解和發(fā)酵可作為同時水解和發(fā)酵步驟(SSF)進行。通常這意味組合的/同時水解和發(fā)酵在對所述發(fā)酵生物合適，優(yōu)選最佳的條件(例如，溫度和/或PH)下進行。水解步驟和發(fā)酵步驟可作為混合水解和發(fā)酵(HHF)進行。HHF通常以單獨的部分水解步驟開始，并以同時水解和發(fā)酵步驟結束。單獨的部分水解步驟為酶法纖維素糖化步驟，通常在對所述的水解酶合適，優(yōu)選最佳的條件(例如在較高溫度)下進行。后續(xù)的同時水解和發(fā)酵步驟通常在對發(fā)酵生物合適的條件(常常在比所述單獨水解步驟更低的溫度)下進行。水解和發(fā)酵步驟也可作為單獨的水解和發(fā)酵步驟進行，其中所述水解在起始發(fā)酵之前已經(jīng)完成。這常常稱作“SHF”。回收在發(fā)酵之后，可任選地自發(fā)酵培養(yǎng)基中以任何合適的方式分離發(fā)酵產物。例如，可蒸餾發(fā)酵培養(yǎng)基以提取發(fā)酵產物，或可自發(fā)酵培養(yǎng)基中通過微濾或膜過濾技術提取發(fā)酵產物。或者，可通過汽提(stripping)回收發(fā)酵產物?；厥辗椒ㄔ诒绢I域為眾所周知的。在一個實施方案中，通過蒸餾回收發(fā)酵產物。發(fā)酵產物本發(fā)明可用于產生任何發(fā)酵產物。優(yōu)選的發(fā)酵產物包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；以及激素。其它產物包括消費醇類工業(yè)產物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工業(yè)產物，例如，發(fā)酵的乳制品；皮革工業(yè)產物和煙草工業(yè)產物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述發(fā)酵產物是醇，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的發(fā)酵產物(如乙醇)可優(yōu)選用作燃料醇/乙醇。然而，對于乙醇，其亦可用作飲用乙醇。發(fā)酵牛物短語“發(fā)酵生物”指任何適于產生所需的發(fā)酵產物的生物，包括細菌和真菌生物。發(fā)酵生物可為C6或C5發(fā)酵生物，或其組合。C6和C5發(fā)酵生物在本領域均為眾所周知的。合適的發(fā)酵生物能夠將可發(fā)酵的糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖直接或間接發(fā)酵(即轉化)為所需的發(fā)酵產物。發(fā)酵生物的實例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)白勺，牛寺另0酉良(Saccharomycescerevisiae)##(Saccharomycesuvarum)的菌株，畢赤酵母屬(Pichia)的菌株，特別是樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株如樹干畢赤酵母CBS5773或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假絲酵母屬(Candida)的菌株，特別是產朊假絲酵母(Candidautilis)，阿糖發(fā)酵假絲酵母(Candidaarabinofermentans),ii^fKjix^if^fiJ(Candidadiddensii),Candidasonorensis,^Ρ^塔假絲酵母(Candidashehatae)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)或博伊丁氏假絲酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它發(fā)酵生物包括漢遜酵母屬(Hansenula)的菌株，特別是多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)或異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌株，特別是脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)或馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的菌株；和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，牛寺另0-(Schizosaccharomycespombe)的菌株。優(yōu)選的細菌發(fā)酵生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)，特別是大腸桿菌(Escherichiacoli)的菌株，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的菌株，特別是運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株，發(fā)酵細菌屬(ZymcAacter)的菌株，特別是棕櫚發(fā)酵細菌(ZymcAactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的菌株，特別是產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌屬(Leuconostoc)的菌株，特別是腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌屬(Clostridium)的菌株，特另Ij是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，腸桿菌屬(Enterobacter)的菌株，特別是產H^lflii(Enterobacteraerogenes)的胃_，^,δ,^ΜΙΤlifM(Thermoanaerobacter)的菌株，特別是熱厭氧桿菌BGlLl(App1.Micrbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇熱厭氧桿|if(Thermoanarobacterethanolicus)StJlifttlif(ThermoanaerobacterthermosaccharoIyticum)S^^iffifK^MilIflif(Thermoanaerobactermathrani)還涵蓋了乳桿菌屬(Lactobacillus)以及谷氨酸棒桿菌R(CorynebacteriumglutamicumR)，熱葡糖苷酶芽孢桿菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。在一個實施方案中，所述發(fā)酵生物為C6糖類發(fā)酵生物，例如，釀酒酵母的菌株。與發(fā)酵木素纖維素衍生材料相關，涵蓋了C5糖發(fā)酵生物。大多數(shù)C5糖發(fā)酵生物也發(fā)酵C6糖。C5糖發(fā)酵生物的實例包括畢赤酵母屬的菌株，例如樹干畢赤酵母菌種的菌株。C5糖發(fā)酵細菌也是已知的。而且，一些釀酒酵母菌株發(fā)酵C5(和C6)糖。實例為能夠發(fā)酵C5糖的酵母屬菌種的經(jīng)遺傳修飾的菌株，包括，例如，Ho等，1998，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,ρ·1852-1859禾口Karhumaa等，2006,MicrobialCellFactories5:18和Kuyper等，2005，F(xiàn)EMSYeastResearch5:925-934中關注的那些。某些發(fā)酵生物如酵母需要足夠的氮源以供繁殖和發(fā)酵。許多氮源可供使用，且上述氮源在本領域是眾所周知的。可使用低成本的氮源。這樣的低成本氮源可為有機的，如尿素，DDG，濕餅(wetcake)或玉米醪(cornmash)，或無機的，例如氨或氫氧化銨。適用于乙醇產生的商業(yè)上可得到的酵母包括，例如，ETHAN0LRED酵母(可由Fermentis/Lesaffre,USA得到)，F(xiàn)ALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)，SUPERSTART和THERM0SACC新鮮酵母(可由EthanoljTechnology，WI，USA得到)，BIOFERMAFT禾ΠXR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA得到)，GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)，以及FERMIOL(可由DSMSpecialties得到)。發(fā)酵培養(yǎng)基短語“發(fā)酵培養(yǎng)基”指進行發(fā)酵的環(huán)境，并包括發(fā)酵底物，即，由發(fā)酵生物代謝的糖源，且可包括發(fā)酵生物。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可包括供發(fā)酵生物的營養(yǎng)物和生長刺激劑。營養(yǎng)物和發(fā)酵刺激劑廣泛用于發(fā)酵領域，且包括氮源，如氨、維生素和礦物質，或其組合。在發(fā)酵后，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可進一步包含發(fā)酵產物。酶在本發(fā)明的方法或工藝的上下文中，即使未特別提及，也可理解的是酶以及其它化合物是以有效量使用的?？墒褂靡环N或多種酶。本文所使用的短語“纖維素分解活性”應理解為包括具有纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)的酶，例如，纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及具有內切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述纖維素分解活性可為真菌來源的酶制備物的形式，如來自木霉屬(Trichoderma)的菌株，優(yōu)選里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株；腐質霉屬(Humicola)的菌株，優(yōu)選特異腐質霉(Humicolainsolens)的菌株；或金孢子菌屬(Chrysosporium)的菌株，優(yōu)選ChrysosporiumIucknowense的菌株。所述纖維素分解酶制備物可含有一種或多種下述活性酶、半酶(hemienzyme)、纖維素分解酶增強活性、β-葡糖苷酶活性、內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或木糖異構酶。所述酶可為如PCT/US2008/065417中定義的組合物，其通過提述并入本文。例如，所述纖維素分解酶制備物包括具有纖維素分解增強活性的多肽，優(yōu)選家族GH61A的多肽，優(yōu)選WO2005/074656(Novozymes)中公開的多肽。所述纖維素分解酶制備物還可包括β-葡糖苷酶，例如來源于木霉屬、曲霉屬或青霉屬(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括WO2008/057637中公開的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。所述纖維素分解酶制備物還可包括CBHII酶，優(yōu)選土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶IICEL6A。所述纖維素分解酶制備物還可包含纖維素分解酶，優(yōu)選來源于里氏木霉或特異腐質霉的纖維素分解酶。所述纖維素分解酶制備物還可包含WO2005/074656中公開的具有纖維素分解增強活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(公開于WO2008/057637中的融合蛋白)以及來源于里氏木霉的纖維素分解酶。纖維素分解酶可為商業(yè)上可以獲得的產品CELLUCLAST1.5L或CELLUZYME(可得自NovozymesA/S，Denmark)或ACCELERASE1000(來自GenencorInc.USA)。可以加入纖維素分解酶以供水解經(jīng)預處理的生物質漿料。纖維素分解酶可以以0.1-100FPU每克總固體(TS)，優(yōu)選0.5-50FPU每克TS，特別是1-20FPU每克TS范圍內的劑量加入。在另一個實施方案中，將至少0.Img纖維素分解酶每克總固體(TS)，優(yōu)選至少;3mg纖維素分解酶每克TS，如5-10mg纖維素分解酶每克TS用于水解。內切葡聚糖酶(EG)在水解過程中可存在一種或多種內切葡聚糖酶。術語“內切葡聚糖酶”意指內-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Ε.C.No.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纖維素組分的植物材料中β-1，4-鍵的內水解。內切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據(jù)(ihOSe，1987，PUreandApp1.Chem.59:257-268的方法確定。內切葡聚糖酶可來源于木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉的菌株；腐質霉屬的菌株，如特異腐質霉的菌株；或金孢子菌屬的菌株，優(yōu)選Chrysosporiumlucknowense的菌株。纖維二糖水解酶(CBH)在水解過程中可存在一種或多種纖維二糖水解酶。術語“纖維二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纖維素，纖維寡糖或任何含有β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中催化l，4-i3-D-葡糖苷鍵的水解，自鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶的實例為上述的，包括來自里氏木霉、特異腐質霉的CBHI和CBHII；和來自土生梭孢霉的CBHII纖維二糖水解酶(CELL6A)。纖維二糖水解酶活性可根據(jù)由Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149:152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985,FEBSLetters187:283-288描述的方法來確定。所述Lever等的方法適用于評估玉米秸桿中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等的方法適用于基于熒光二糖衍生物確定纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶在水解過程中可存在一種或多種β-葡糖苷酶。術語“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，及β-D-葡萄糖的釋放。就本發(fā)明而言，葡糖苷酶的活性根據(jù)由Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法確定，只是如本文所述使用不同的條件。一單位的β-葡糖苷酶活性定義為在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%TWEEN20中在50°C、pH5自作為底物的4mMp-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分鐘產生1.0微摩爾的ρ-硝基苯酚。所述β-葡糖苷酶可為真菌來源的，例如木霉屬、曲霉屬或青霉屬的菌株。所述β-葡糖苷酶可來源于里氏木霉，如由bgll基因編碼的β-葡糖苷酶(參見ΕΡ562003的圖1)。所述β-葡糖苷酶可來源于米曲霉(根據(jù)WO2002/095014在米曲霉中重組產生)，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)(根據(jù)WO2002/095014的實施例22在米曲霉中重組產生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.3:157-163)。半纖維素酶半纖維素可由半酶和/或酸水解分解以釋放其五和六碳糖組分。木素纖維素衍生材料可用一種或多種半纖維素酶進行處理?？墒褂萌魏芜m用于水解半纖維素(優(yōu)選水解為木糖)的半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、內切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶，內切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述兩種或更多種的混合物。優(yōu)選的，用于本發(fā)明的半纖維素酶為外作用的(exo-acting)半纖維素酶，且更優(yōu)選地，所述半纖維素酶為下述的外作用的半纖維素酶，其具有在PH以下，優(yōu)選3-7的酸性條件下水解半纖維素的能力。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實例包括VISC0ZYME(可自NovozymesA/S,Denmark得至Ij)。所述半纖維素酶可為木聚糖酶。所述木聚糖酶可優(yōu)選為微生物來源的，如真菌來源的(例如，木霉屬、多孔菌屬(Meripilus)、腐質霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium))或來自細菌(例如，芽孢桿菌屬(Bacillus))。所述木聚糖酶可來源于絲狀真菌，優(yōu)選來源于曲霉屬，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株，或腐質霉屬，優(yōu)選疏棉狀腐質霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可優(yōu)選為內切_1，4-β-木聚糖酶，更優(yōu)選GHlO或GHll的內切-1，4_β-木聚糖酶。商業(yè)木聚糖酶的實例包括來自NovozymesA/S，Denmark的SHEARZYME和BIOFEEDWHEAT。所述半纖維素酶也可以有效水解半纖維素的量添加，如，以約0.001到0.5wt.%總固體(TQ，更優(yōu)選約0.05到0.5wt.%TS的量添加。木聚糖酶也可以0.001-1.Og/kg干物質(DM)底物的量，優(yōu)選以0.005-0.5g/kgDM底物的量，且最優(yōu)選以0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。木糖異構酶木糖異構酶(D-木糖酮異構酶)(E.C5.3.1.5)為催化D-木糖變?yōu)镈-木酮糖的可逆異構化反應的酶。葡糖異構酶轉化D-葡萄糖到D-果糖的可逆異構化。然而，葡糖異構酶時稱作木糖異構酶。木糖異構酶可用于本發(fā)明方法或工藝，且可為任何具有木糖異構酶活性的酶，且可得自任何來源，優(yōu)選細菌或真菌來源，如絲狀真菌或酵母。細菌木糖異構酶的實例包括屬于鏈霉菌屬(Str印tomyces)、游動放線菌屬(Actinoplanes)、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬(Flavobacterium)的那些，以及棲熱袍菌屬(Thermotoga)的，例如新阿波羅棲熱袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海棲熱袍菌(T.maritime)。真菌木糖異構酶的實例為擔子菌綱(Basidiomycetes)來源的菌種。優(yōu)選的木糖異構酶來源于酵母假絲酵母屬的菌株，優(yōu)選博伊丁氏假絲酵母，特別是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.,52(7):1817-1824公開的博伊丁氏假絲酵母木糖異構酶。所述木糖異構酶可優(yōu)選來源于博伊丁氏假絲酵母的菌株(Kloeckera2201)，其以DSM70034和ATCC48180保藏，公開于Ogata等，Agric.Biol.Chem,33,1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem,52(2)，1519-1520。在一個實施方案中，所述木糖異構酶來源于鏈霉菌屬的菌株，例如，來源于鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomycesmurinus)的菌株(美國專利號4，687，742)、黃微綠鏈霉菌(S.flavovirens)、白色鏈霉菌(S.albus)、不產色鏈霉菌(S.achromogenus)、多刺鏈霉菌(S.echinatus)、威德莫爾鏈霉菌(S.wedmorensis)，其均公開于美國專利3，616，221號。其它的木糖異構酶公開于美國專利3，622，463號，美國專利4，351，903號，美國專利4，137，126號，美國專禾Ij3，625，828號，HU專利12,415號，DE專利2，417，642，JP專利69，觀，473號，以及WO2004/044129，每個均通過提述并入本文。所述木糖異構酶可為固定化或液體形式。優(yōu)選液體形式。商業(yè)上可得到的木糖異構酶的實例包括來自NovozymesA/S,Denmark的SWEETZYMET。添加的木糖異構酶的量提供0.01-100IGIU每克總固體范圍內的活性水平。α-淀粉酶可使用一種或多種α-淀粉酶。優(yōu)選的淀粉酶是微生物來源的，如細菌或真菌來源。雖然最適合的α-淀粉酶是基于工藝條件確定的，但本領域技術人員可容易地確定。優(yōu)選的α-淀粉酶為酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或細菌酸性α-淀粉酶。短語“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(Ε.C.3.2.1.1)，當其以有效量添加時，在3到7，優(yōu)選3.5到6，或更優(yōu)選4-5的范圍內的ρΗ具有最佳活性。細菌α-淀粉酶可使用一種或多種α-淀粉酶。所述α-淀粉酶可為芽孢桿菌屬來源的。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶可優(yōu)選來源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),枯草桿菌(Bacillussubtilis)或嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株，但也可來源于其它芽孢桿菌屬菌種。涵蓋的α-淀粉酶的特定實例包括示于W01999/19467的SEQIDNO4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，示于WO1999/19467的SEQIDNO:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，和示于WO1999/19467的SEQIDNO3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(所有序列通過提述并入本文)。在一個實施方案中，所述α-淀粉酶可為與分別示于WO1999/19467(通過提述并入本文)的SEQIDNO:1、2或3中的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶也可為變體和/或雜合體，特別是描述于W01996/23873,WO1996/23874、WO1997/41213、WO1999/19467、WO2000/60059和WO2002/10355(所有文件通過提述并入本文)中任一的變體和/或雜合體。特別涵蓋的α-淀粉酶變體公開于美國專利6，093，562,6,297,038或6，187，576號(通過提述并入本文)，并包括在位置R179到G182缺失一個或兩個氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α_淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體，優(yōu)選WO1996/023873公開的雙缺失-參見，例如，第20頁第1_10行(通過提述并入本文)，優(yōu)選與WO1999/19467公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比對應于Δ(181-182)，或使用WO1999/19467中的SEQIDNO3的編號方式缺失氨基酸R179和G180。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其較之WO99/19467公開的SEQIDNO3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有對應于Δ(181-182)的雙缺失，且進一步包括N193F取代(也表示為I181*+G182*+N193F)。細菌雜合體α-淀粉酶可使用一種或多種細菌雜合體淀粉酶。特別涵蓋的雜合體α-淀粉酶包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO4)的445個C-末端氨基酸殘基，以及來源于解淀粉芽孢桿菌的α淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO5)的37個N-末端氨基酸殘基，并具有下列取代中的一個或多個，特別是全部G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢桿菌編號方式)。也優(yōu)選具有一個或更多下述突變的變體(或在其它芽孢桿菌屬α-淀粉酶骨架中的對應突變)Η1ΜΥ，Α181Τ，N190F,A209V和收64S和/或位置176和179之間兩個殘基的缺失，優(yōu)選Ε178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDΝ0:5編號方式)。真菌α-淀粉酶可使用一種或多種真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶包括來源于曲霉屬菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌α-淀粉酶為Fimgamyl樣α-淀粉酶，其來源于米曲霉的菌株。短語“Fungamyl樣α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，其與WO1996/23874的SEQIDNO10中所示氨基酸序列的成熟部分顯示高同一性，即，多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。另一個優(yōu)選的酸性α-淀粉酶來源于黑曲霉的菌株。所述酸性真菌α-淀粉酶可為來自黑曲霉，作為“AMYA_ASPNG”以原始登錄號P56271公開于Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫中，并描述于WO1989/01969(實施例3)。來源于黑曲霉的商業(yè)上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。其它涵蓋的野生型α-淀粉酶包括來源于根毛霉屬(I^hizomucor)和多孔菌屬(Meripilus)的菌株，優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178通過提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述α-淀粉酶來源于川地曲霉，并如Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii”公開，并進一步作為EMBL:#AB008370公開。所述真菌α-淀粉酶也可為包含淀粉結合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非雜合體)或其變體。在一個實施方案中，所述野生型α-淀粉酶可來源于川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株。真菌雜合體α-淀粉酶可使用一種或多種真菌雜合體α-淀粉酶。所述真菌酸性α_淀粉酶可為雜合體α-淀粉酶。真菌雜合體α-淀粉酶的實例包括公開于WO2005/003311或美國申請公開2005/0054071號(Novozymes)或美國專利申請60/638，614號(Novozymes)中的那些，將其通過提述并入本文。雜合體α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和糖結合域/模塊(CBM)，如淀粉結合域，以及任選的接頭。所涵蓋的雜合體α-淀粉酶的特定實例包括美國專利申請?zhí)?0/638，614實施例中的表1到5中公開的那些，包括具有催化域JA118和羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD(US申請60/638，614號中的SEQIDNO100)的Fungamyl變體，具有羅耳阿太菌AMG接頭和SBD(US申請60/638，614號中的SEQIDNO=IOl)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作為美國申請?zhí)?1/316，535中氨基酸序列SEQIDNO:20、SEQIDNO72和SEQIDNO96的組合公開于表5)，或作為W02006/06^90中表5中的V039，和具有羅耳阿太菌葡糖淀粉酶接頭和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US60/638,614中的SEQIDNO:102)。其它特別涵蓋的雜合體α-淀粉酶為美國申請?zhí)?1/316，535和WO2006/06擬90(每個均通過提述并入本文)的實施例4中表3、4、5和6中所列的任何雜合體α-淀粉酶。涵蓋的雜合體α-淀粉酶的其它特定實例包括美國申請公開2005/0054071號中公開的那些，包括第15頁表3公開的那些，如具有川地曲霉接頭和淀粉結合域的黑曲霉α-淀粉酶。也涵蓋下述α-淀粉酶，其與任何上述的α-淀粉酶顯示高同一性，g卩，與成熟酶序列顯示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%同一性。酸性α-淀粉酶可根據(jù)本發(fā)明以0.1至10AFAU/gDS,優(yōu)選0.10至5AFAU/gDS,特別是0.3至2AFAU/gDS的量添加。商業(yè)性α-淀粉酶產品優(yōu)選的包含α-淀粉酶的商業(yè)組合物包括來自DSM的MYC0LASE，BAN、TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQU0ZYMEX禾口SANtmSUPER、SANEXTRAL(NovozymesA/S)禾ΠCLARASEL-40,000,DEX-L0,SPEZYMEFRED、SPEZYMEAA禾ΠSPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.)，以及以商品名出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由NovozymesA/S,Denmark得至丨J)。糖源生成酶短語“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其為葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和產麥芽糖淀粉酶(其為麥芽糖生成者)。糖源生成酶能夠產生碳水化合物，其可由所述發(fā)酵生物用作能量源，例如，當用于工藝以供產生發(fā)酵產物，例如乙醇時。所產生的碳水化合物可直接或間接的轉化為期望的發(fā)酵產物，優(yōu)選乙醇。可存在糖源生成酶的混合物。特別涵蓋的混合物為至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特別是酸性淀粉酶，甚至更優(yōu)選酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。葡糖淀粉酶可使用一種或多種葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可來源于任何合適的來源，例如來源于微生物或植物。優(yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌或細菌來源的，選自下組曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBOJ.3(5):ρ.1097-1102)，及其變體，如公開于WO1992/00381，W02000/04136和WO2001/04273(來自Novozymes，Denmark)的那些；公開于WO1984/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4):p.941-949)，及其變體或片段。其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強的熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301:275-281)；二硫鍵、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35:8698-8704)；以及在位置A435和S436導入Pro殘基(Li等，1997，ProteinEng.10:1199-1204)。其它的葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(之前表示為羅耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(參見美國專利4，727，026號和Nagasaka等，1998，“Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol.50:323-330),碟節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特別是來源于埃莫森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(W01999/28448)、Talaromycesleycettanus(美國專利Re.32,153號)、杜邦踝節(jié)菌(Talaromycesduponti)、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)(美國專利4，587，215號)。涵蓋的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬，特別是熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135，138)和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(TO1986/01831)以及WO2006/06擬89中公開的瓣環(huán)栓菌(Trametescingulata)(其通過提述并入本文)。還涵蓋了雜合體葡糖淀粉酶。所述雜合體葡糖淀粉酶的實例公開于W02005/045018。具體實例包括公開于WO2005/045018實施例1表1和4的雜合體葡糖淀粉酶，其以其教導雜合體葡糖淀粉酶的程度通過提述并入本文。還涵蓋了與任何上述的葡糖淀粉酶顯示高同一性的葡糖淀粉酶，S卩，與成熟酶序列顯示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。商業(yè)上可得到的包含葡糖淀粉酶的組合物包括AMG200L、AMG300L.SANSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEtmFUEL、SPIRIZYMEB4U和AMGE(來自NovozymesA/S)；0PTIDEX300(來自GenencorInt.)；AMIGASE禾口AMIGASEPLUS(來自DSM)；G-ZYMEG900、G-ZYME和G990ZR(來自GenencorInt.)葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/gDS,優(yōu)選0.1-lOAGU/gDS,特別是在l_5AGU/gDS，如0.5AGU/gDS的量添加。g-淀粉酶可使用一種或多種β-淀粉酶。術語“β-淀粉酶”(Ε.C3.2.1.2)為傳統(tǒng)上給予外作用的(exo-acting)產麥芽糖淀粉酶的名稱，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉以及相關的葡萄糖聚合物中1，4-α_葡糖苷鍵的水解。自非還原的鏈末端以逐步的方式連續(xù)移除麥芽糖單元直至分子降解，或者，在支鏈淀粉的情況下，直至到達分枝點。釋放的麥芽糖具有β異頭物構象，由此得到淀粉酶的名稱。已經(jīng)從多種植物和微生物中分離了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly，1979，ProgressinIndustrialMicrobiology，15:112-115)。這些β-淀粉酶的特征在于具有40°C到65°C的最適溫度以及4.5到7的最適pH。來自大麥的商業(yè)上可得到的β-淀粉酶為來自NovozymesA/S,Denmark的NOVOZYMWBA和來自GenencorInt.，USA的SPEZYMEBBA1500。產壽芽糖淀粉酶可使用一種或多種產麥芽糖淀粉酶。淀粉酶也可為產麥芽糖α-淀粉酶?！爱a麥芽糖0-淀粉酶”(葡聚糖1，4-0-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠將直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成α構象的麥芽糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株NCIB11837的產麥芽糖淀粉酶商業(yè)上可由NovozymesA/S得到。產麥芽糖的α-淀粉酶描述于美國專利4，598，048，4，604，355和6，162，628號，其通過提述并入本文。所述產麥芽糖淀粉酶可以0.05-5mg總蛋白/克DS或0.05-5MANU/gDS的量添加。蛋白酶蛋白酶可在水解、發(fā)酵或同時水解和發(fā)酵的過程中添加?？商砑拥鞍酌冈诎l(fā)酵過程中反絮凝發(fā)酵生物，特別是酵母。所述蛋白酶可為任何蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶為微生物來源的酸性蛋白酶，優(yōu)選真菌或細菌來源的。酸性真菌蛋白酶是優(yōu)選的，但也可使用其它蛋白酶。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶為酸性蛋白酶，即，特征為能夠在PH7以下的酸性條件下水解蛋白質的蛋白酶。涵蓋的酸性真菌蛋白酶包括來源于曲霉屬，毛霉屬(Mucor)、根霉屬(lihizopus)、假絲酵母屬、革蓋菌屬(Coriolus)、內座殼屬(Endothia)、蟲霉屬(Enthomophtra)、耙齒菌屬(Irpex)、青霉屬(Penicillium)、絲核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特別涵蓋的是來源于黑曲霉(參見，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan,28，216)，齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(參見，例如，Yoshida,1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(W01995/02044)或米曲霉的蛋白酶，如ρ印A蛋白酶，以及來自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucormiehei)的酸性蛋白酶。還涵蓋了中性或堿性蛋白酶，如來源于芽孢桿菌屬菌株的蛋白酶。例如，本發(fā)明涵蓋的蛋白酶來源于解淀粉芽孢桿菌，且具有在Swissprot可作為登錄號P06832得到的序列。也涵蓋與在Swissprot可作為登錄號P06832得到的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特別為至少99%同一性的蛋白酶。進一步涵蓋的是與WO2003/048353中作為SEQIDNO1公開的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特別為至少99%的同一性的蛋白酶。還涵蓋木瓜蛋白酶樣蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)內的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(蘿蘑蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(獼猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(組織蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰內肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。在一個實施方案中，所述蛋白酶可來源于曲霉屬，如米曲霉的菌株的蛋白酶制備物。在另一個實施例中，所述蛋白酶可來源于根毛霉屬，優(yōu)選曼赫根毛霉(Miizomucormiehei)的菌株。在另一個涵蓋的實施方案中，所述蛋白酶可為蛋白酶制備物，優(yōu)選來源于曲霉屬(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制備物以及來源于根毛霉屬(優(yōu)選曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。天冬氛酸蛋白醇描述于,例如,HandbookofProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings禾口J.F.Woessner編，AcademicPress,SanDiego，1998，第270章)。天冬氨酸蛋白酶的合適的實例包括，例如，Berka等，1990，Gene，96，313；Berka等，1993，Gene,125，195-198；以及Gomi等，1993,Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100公開的那些，其通過提述并入本文。商業(yè)上可得到的產品包括ALCALASE、ESPERASE、FLAV0URZYME、PR0MIX、NEUTRASE、RENNILASE、N0V0ZYMFM2.0L、以及N0V0ZYM50006(可由NovozymesA/S、Denmark得到)以及來自GenencorInt.，Inc.USA.的GC106和spezymefan。所述蛋白酶可以0.OOOl-Img酶蛋白每克DS，優(yōu)選0.001到0.Img酶蛋白每克DS的量存在?；蛘?，所述蛋白酶可以0.0001到lLAPU/gDS，優(yōu)選0.001到0.lLAPU/gDS和/或0.0001到ImAU-RH/gDS，優(yōu)選0.001到0.ImAU-RH/gDS的量存在。本申請描述和要求保護的發(fā)明的范圍不受本文公開的具體實施方案的限制，因為這些實施方案旨在說明本發(fā)明的數(shù)個方面。任何等同的實施方案以及所述實施方案中一種或多種的組合意欲在本發(fā)明的范圍內。根據(jù)上文的描述，除本文所示和描述的修飾之外對本發(fā)明的多種修飾對于本領域技術人員會是顯而易見的。這些修飾也意欲落入所附權利要求的范圍內。此處引用了多篇文獻，將它們公開的內容通過提述以整體并入。通過以下實施例進一步描述本發(fā)明，不應將這些實施例理解為對本發(fā)明范圍的限制。同一性兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列間的相關性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列間的同一性程度可通過Clustal方法(Higgins，1989,CABIOS5:151-153)使用LASERGENEMEGALIGN軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)及同一性表和下述多重比對(multiplealignment)參數(shù)確定缺口罰分為10，而缺口長度罰分為10。配對比對參數(shù)(pairwisealignmentparameter)為K元組(Ktuple)=1，缺口罰分=3，窗口=5和對角線=5。就本發(fā)明而言，兩個多核苷酸序列間的同一性可通過WiIbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGN軟件(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)及同一性表和下述多重比對參數(shù)確定缺口罰分為10，而缺口長度罰分為10。配對比對參數(shù)為K元組=3，缺口罰分=3和窗口=20。蛋白質測定法AZCL-酪蛋白測定法將藍色底物AZCL-酪蛋白的0.2%溶液攪拌懸于硼砂/NaH2PO4緩沖液pH9中。一邊攪拌一邊將所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶試樣，然后將板在Eppendorf熱混合器中在45°C和600rpm溫育30分鐘。使用變性的酶試樣(100°C沸騰20分鐘)作為空白。在溫育后，通過將微滴定板轉移至冰上而終止反應，且通過在4°C以3000rpm離心5分鐘來分離有色溶液與固體。將60μL上清轉移至微滴定板，并使用BioRad微板讀數(shù)器測量在595nm的吸光度。DNA測定法將50μL含蛋白酶的試樣添加至微滴定板，并通過添加100μLlmMpNA底物(5mg溶于100μLDMS0,并進一步用硼砂/NaH2PO4緩沖液pH9.0稀釋至IOmL)來起始所述測定法。監(jiān)測OD4tl5在室溫的增加作為蛋白酶活性的量度。葡糖淀粉酶活性(A(iU)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶單位(AGU)測定。Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標準條件下(37°C，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM,緩沖液乙酸鹽0.1M，反應時間5分鐘)每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量?？墒褂米詣臃治鰞x系統(tǒng)。將變旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脫氫酶試劑中，使得存在的任何α-D-葡萄糖轉化為β-D-葡萄糖。葡萄糖脫氫酶特異性地與β-D-葡萄糖在上述反應中反應，形成NADH，其使用光度計在340nm處測定作為起始葡萄糖濃度的量度。權利要求1.一種用于從含木素纖維素材料產生發(fā)酵產物的方法，包括(a)預處理含木素纖維素材料；(b)將殼聚糖或殼聚糖樣聚合物引入經(jīng)預處理的含木素纖維素材料；(c)用水解酶水解步驟(b)中獲得的含木素纖維素材料；和(d)用發(fā)酵生物發(fā)酵以產生發(fā)酵產物。2.權利要求1的方法，其中所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物是在用水解酶水解步驟(b)中獲得的材料之前弓I入所述含木素纖維素材料的。3.權利要求1的方法，其中所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物是在步驟(c)中的水解過程中弓丨入所述含木素纖維素材料的。4.權利要求1-3任一項所述的方法，其中所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物是以少于30%w/w殼聚糖/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述含木素纖維素材料的。5.權利要求1-4任一項所述的方法，其中所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物是以少于10%w/w殼聚糖/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述含木素纖維素材料的。6.權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述殼聚糖或殼聚糖樣聚合物是以少于2%w/w殼聚糖/含木素纖維素材料總漿料的量引入所述含木素纖維素材料的。7.權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述水解酶選自一種或多種纖維素酶、半纖維素酶或其混合物。8.權利要求1-7任一項所述的方法，其中在步驟(a)中所述含木素纖維素材料經(jīng)化學、機械或生物預處理。9.權利要求1-8任一項所述的方法，其中步驟(c)中的水解和步驟(d)中的發(fā)酵是作為混合水解和發(fā)酵步驟或同時水解和發(fā)酵步驟進行的。10.權利要求1-9任一項所述的方法，其中所述含木素纖維素材料選自玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥稈、稻稈、甘蔗渣或其混合物。11.權利要求1-10任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵產物是醇類。12.權利要求11的方法，其中所述醇類是乙醇。13.權利要求1-12任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵產物是通過蒸餾回收的。14.權利要求1-13任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母、絲狀真菌或細菌來源的。15.權利要求14的方法，其中所述發(fā)酵生物是C6或C5發(fā)酵生物。16.權利要求1-15任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母。17.權利要求16的方法，其中所述發(fā)酵生物是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。18.根據(jù)如下方法制備的發(fā)酵產物，所述方法包括(a)預處理含木素纖維素材料；(b)將殼聚糖或殼聚糖樣聚合物引入經(jīng)預處理的含木素纖維素材料；(c)將經(jīng)預處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和(d)添加發(fā)酵生物以產生發(fā)酵產物。`18.一種混合物，包含(a)含木素纖維素材料；(b)殼聚糖或殼聚糖樣聚合物；和(c)水解酶。全文摘要用于從含木素纖維素材料產生發(fā)酵產物的方法，包括預處理含木素纖維素材料；將殼聚糖或殼聚糖樣聚合物引入所述經(jīng)預處理的含木素纖維素材料；將所述經(jīng)預處理的含木素纖維素材料暴露于有效量的水解酶；和用發(fā)酵微生物發(fā)酵以產生發(fā)酵產物。文檔編號C12P19/00GK102197139SQ200980142882公開日2011年9月21日申請日期2009年8月31日優(yōu)先權日2008年8月29日發(fā)明者李鑫,陳曄申請人:諾維信北美公司