專利名稱：Oip5作為用于癌癥治療和診斷的靶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥研究、癌癥診斷和癌癥治療領(lǐng)域。 此外，本發(fā)明涉及篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑的方法。
背景技術(shù)：
肺癌是全世界癌癥死亡的首要原因，而非小細胞肺癌(NSCLC)占到那些病例的幾乎 80% (Greenlee RT, et al.，CA Cancer J Clin 2001;51:15-36)。食道鱗狀細胞癌 (ESCC)是消化道的最致命惡性腫瘤之一，而且在診斷時大多數(shù)患者處于晚期(Shimada H， et al.，Surgery 2003 ；133 :486-94)。盡管使用與各種治療模態(tài)(諸如放療和化療)組合的現(xiàn)代手術(shù)技術(shù)，ESCC的總體5年存活率仍然保持于40%至60% (Tamoto E，et al., Clin Cancer Res 2004 ;10 :36四_38)，而肺癌的總體 5 年存活率只有 15% (Greenlee RT, et al.，CA Cancer J Clin 2001 ；51 15-36)。為了分離用于診斷、治療、和/或預(yù)防肺癌和食道癌的潛在治療分子靶，使用含有27，648種基因的cDNA微陣列對來自101名肺癌和19名ESCC患者的癌細胞的基因表達序型實施了基因組范圍的分析(W02004/031413，W02007/013665, W02007/013671, Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, et al. , Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, et al. , Hum Mol Genet 2004 ；13 :3029-43,Kikuchi Τ,et al. ，Int J Oncol 2006 ；28 :799-805, Taniwaki M, et al. ， Int J Oncol 2006 ；29 567—75，& Yiimiibuki T, et al. , Int JOncol 2006;28:1375-84)。為了驗證各基因產(chǎn)物的生物學(xué)和臨床病理意義，借助RNAi技術(shù)及使用臨床肺癌材料的腫瘤組織微陣列分析，實施了功能喪失效果的高 fflfiffit (Suzuki C, et al. ， Cancer Res 2003 ；63 :7038-41, Ishikawa N, et al. ， Clin Cancer Res 2004 ；10 :8363-70, Kato T, et al.，Cancer Res2005 ；65 :5638-46, Furukawa C, et al. , Cancer Res 2005 ；65 :7102-10, Ishikawa N, et al. , Cancer Res 2005 ；65 9176-84, Suzuki C, et al. , Cancer Res2005；65 :11314-25, Ishikawa N, et al. , Cancer Sci 2006 ；97 :737-45, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006 ；66 :9408-19, Hayama S, et al. , Cancer Res2006 ；66 :10339-48,Kato Τ,et al. ,Clin Cancer Res 2007 ；13 :434-42, Suzuki C,etal. ,Mol Cancer Ther 2007 ；6 :542-51,Yamabuki Τ, et al. , Cancer Res2007 ； 67 :2517-25, Hayama S, et al. , Cancer Res 2007 ；67 :4113-22, Kato Τ, et al. , Cancer Res 2007 ；67 :8544-53,Taniwaki Μ, et al. ,Clin Cancer Res2007 ；13 :6624-31, Ishikawa N，et al., Cancer Res 2007 ；67 :11601-11,Mano Y, etal. , Cancer Sci 2007 ；98 :1902-13, Suda Τ, et al. , Cancer Sci 2007 ；98 :1803-8, Kato Τ, et al. , Clin Cancer Res 2008 ；14 :2363-70 及 Mizukami Y, et al.，Cancer Sci 2008 ；99 :1448-54)。
通過酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)0IP5(opa相互作用蛋白5)與淋病奈瑟氏菌(Neisseria Gonorrhoeae)不透明相關(guān)(Opa)蛋白相互作用(Williams，J. Μ.，et al.，Mol Microbiol 1998 ；27(1) :171-86)。0IP5涉及淋球菌粘附及侵襲人上皮細胞。一項先前的研究證明了人胃癌中升高的 0IP5mRNA 表達(Nakamura Y, et al.，Ann Surg Oncol 2007 ；14 :885-92.)， 而且先前報告說一些蛋白，諸如Rafl，與0IP5相互作用(Yuryev, A. and L. P. ffennogle, Genomics 2003 ；81(2) :112-25)，然而，尚未闡明0IP5在致癌作用中的生物學(xué)作用。 引用表專利文獻W02004/031413 [PTL 2]W02007/013665 [PTL 3]W02007/013671 非專利文獻Shimada H, et al.，Surgery 2003；133 :486-94 [NPL 3]Tarmoto E, et al.，Clin Cancer Res 2004 ；10 :3629-38 [NPL 4]Daigo Y and Nakamura Y,Gen Thorac Cardiovasc Surg2008 ；56 :43-53 [NPL 5]Kikuchi Τ, et al. , Oncogene 2003；22 :2192-205 [NPL 6]Kakiuchi S, et al. ，Mol Cancer Res 2003 ；1 :485-99 [NPL 7]Kakiuchi S, et al.，Hum Mol Genet 2004；13 :3029-43 [NPL 8]Kikuchi Τ, et al.，Int J Oncol 2006；28 :799-805 [NPL 9]Taniwaki Μ, et al. ， Int J Oncol 2006；29 :567-75 [NPL 10] Yamabuki Τ, et al.，Int J Oncol 2006 ；28 :1375-84 [NPL 11]Suzuki C,et al.，Cancer Res 2003 ；63 :7038-41 [NPL 12]Ishikawa N, et al.，Clin Cancer Res 2004；10 :8363-70 [NPL 13]Kato Τ,et al.，Cancer Res 2005；65 :5638-46 [NPL 14]Furukawa C, et al.，Cancer Res 2005；65 :7102-10 [NPL 15]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2005；65 :9176-84 [NPL 16] Suzuki C, et al. , Cancer Res 2005 ；65 :11314-25 [NPL 17]Ishikawa N, et al.，Cancer Sci 2006；97 :737-45 [NPL 18]Takahashi K, et al. Cancer Res 2006 ；66 :9408-19 [NPL 19]Hayama S, et al.，Cancer Res 2006 ；66 :10339-48 [NPL 20]Kato Τ, et al.，Clin Cancer Res 2007 ；13 :434-42 [NPL 21]Suzuki C,et al. ，Mol Cancer Ther 2007 ；6 :542-51 [NPL 22]Yamabuki Τ, et al.，Cancer Res 2007；67 :2517-25 [NPL 23]Hayama S, et al.，Cancer Res 2007；67 :4113-22 [NPL 24]Kato Τ,et al.，Cancer Res 2007；67 :8544-53 [NPL 25]Taniwaki Μ, et al. ，Clin Cancer Res 2007 ；13 :6624-31 [NPL 26]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2007 ；67 :11601-11
[NPL 27]Mano Y, et al.，Cancer Sci 2007 ；98 :1902-13[NPL 28]Suda T,et al.，Cancer Sci 2007；98 :1803-8[NPL 29]Kato T,et al.，Clin Cancer Res 2008；14 :2363-70[NPL 30]Mizukami Y, et al.，Cancer Sci 2008；99 :1448-54[NPL 31]ffilliams, J. Μ. , et al.，Mol Microbiol 1998 ；27(1) :171-86[NPL 32]Yuryev, A. and L. P. ffennogle, Genomics 2003 ；81 (2)[NPL 33]Nakamura Y, et al.，Ann Surg Oncol 2007 ；14 :885-92.發(fā)明概述在本發(fā)明中，公開了 0IP5過表達能促成肺癌和食道癌細胞的惡性性質(zhì)。因此，靶向0IP5分子可能有希望開發(fā)肺癌和食道癌的臨床管理中的新診斷和治療策略。特別地，本發(fā)明源自如下的發(fā)現(xiàn)，即由特定序列(特別是SEQ ID N0:11和12)構(gòu)成的雙鏈分子有效抑制肺癌和/或食道癌細胞的細胞生長。具體地，本發(fā)明提供了靶向0IP5 基因的小干擾RNA(SiRNA)。這些雙鏈分子可以以分離的狀態(tài)利用，或者在載體中編碼并自載體表達。因而，本發(fā)明的一個目的是提供此類雙鏈分子以及表達它們的載體和宿主細胞。在一個方面，本發(fā)明提供了用于抑制細胞生長及治療肺癌和/或食道癌的方法， 其通過將本發(fā)明的雙鏈分子或載體施用于需要它們的受試者來進行。此類方法涵蓋對有此需要的受試者施用由一種或多種本發(fā)明雙鏈分子或載體構(gòu)成的組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的組合物，其含有至少一種本發(fā)明雙鏈分子或載體。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種診斷或確定受試者中對肺癌和/或食道癌的傾向性的方法，其通過測定源自患者的生物樣品中的0IP5表達水平來進行。0IP5基因表達水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示受試者患有或有風(fēng)險形成肺癌和/或食道癌。此外，本發(fā)明涉及如下的發(fā)現(xiàn)，即0IP5的高表達水平與較差存活率相關(guān)。因此，本發(fā)明提供了一種用于評估或確定肺癌和/或食道癌患者的預(yù)后的方法，該方法包括下述步驟檢測0IP5的表達水平，將它與預(yù)確定的參照水平比較并根據(jù)它們之間的差異來確定患者的預(yù)后。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種篩選用于治療和/或預(yù)防肺癌和/或食道癌的化合物的方法。此類化合物可結(jié)合0IP5多肽或降低0IP5多肽的生物學(xué)活性或降低0IP5 基因或替代0IP5基因的報道基因的表達或抑制0IP5多肽與Rafl多肽之間的結(jié)合或抑制 0IP5多肽的磷酸化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的一個或多個方面可以滿足某些目的，而一個或多個其它方面可以滿足某些其它目的。每一個目的可能不在全部方面均同等地適用于本發(fā)明的每一個方面。因此，前述目的可以擇一地適用于本發(fā)明的任何一個方面。在聯(lián)系附圖和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細說明都僅僅提出了優(yōu)選的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實施方案構(gòu)成限制。附圖簡述本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡述和本發(fā)明的詳細描述及其優(yōu)選實施方案后，將更明了本發(fā)明的不同方面和應(yīng)用
圖1，圖1描繪肺癌和食道癌和正常組織中的0IP5表達。在A部分中，描繪了通過半定量RT-PCR分析檢測的正常肺組織和15份臨床肺癌樣品[肺腺癌(ADC)JiSCCdP SCLC ；頂部小圖]和15種肺癌細胞系(底部小圖)中的0IP5表達。在B部分中，描繪了通過半定量RT-PCR分析檢測的正常食道和10份臨床ESCC組織樣品(頂部小圖)和10種 ESCC細胞系(底部小圖)中的0IP5表達。在C部分中，描繪了 SBC-5細胞中內(nèi)源0IP5蛋白的亞細胞定位。0IP5在核和胞質(zhì)中被染色。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。在D 部分中，描繪了 16種正常人組織中0IP5轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析的結(jié)果。在睪丸中觀察到強信號。圖2，圖2描繪了 0IP5蛋白表達及其與NSCLC患者的較差臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)。在A 部分中，描繪了肺癌(鱗狀細胞癌，xlOO)和正常肺(xlOO)中0IP5表達的代表性例子，及放大視圖(x200)。在B部分中，描繪了 NSCLC患者中的腫瘤特異性存活依照0IP5表達水平的Kaplan-Meier分析的結(jié)果(P < 0. 0099 ；時序檢驗)。圖3，圖3描繪了 0IP5對細胞生長的影響。在A部分中，描繪了通過半定量 RT-PCR (頂部小圖)分析的LC319(左邊)和SBC5(右邊)細胞中響應(yīng)si_0IP5 (si_l和-2) 或?qū)φ誷iRNA(LUC和On-Target plus/CNT)的0IP5表達。特別地，通過MTT測定評估的 LC319或SBC-5細胞響應(yīng)si-l、si-2、si_LUC、或si-CNT的存活力(中部小圖)。經(jīng)特異性 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的LC319和SBC-5細胞的集落形成測定(底部小圖)。所有實驗以一式三份測定來進行。在B部分中，描繪了 0IP5對C0S-7細胞生長的影響。特別地，通過 Western印跡分析檢查的，C0S-7細胞中的0IP5表達(左邊頂部小圖)。經(jīng)pCAGGSn3Fc_0IP5 或模擬載體轉(zhuǎn)染的細胞均以一式三份來培養(yǎng)，并通過MTT測定法來評估細胞存活力(右邊小圖)。自經(jīng)0IP5表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞衍生的集落的大小和數(shù)目均大于用模擬載體轉(zhuǎn)染的細胞(左邊底部小圖)。圖4，圖4描繪了內(nèi)源和外源0IP5的磷酸化。特別地，通過用λ -PPase處理，內(nèi)源或外源0ΙΡ5的上部(磷酸化的)條帶減少了。圖5，圖5描繪了肺癌和食道癌及正常組織中的0ΙΡ5表達。在A部分中，通過 Western印跡分析檢查了肺癌細胞系中的0IP5表達。ACTB表達充當(dāng)數(shù)量對照。在B部分中，描繪了 SBC-5細胞中內(nèi)源0IP5蛋白的亞細胞定位。0IP5在核和胞質(zhì)中被染色。DAPI 指4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。圖6，圖6描繪了正常組織及肺癌和食道癌中的0IP5蛋白表達。在A部分中，描繪了 23種正常人組織中0IP5轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析。在睪丸中觀察到強信號。在 B部分中，通過免疫組織化學(xué)染色檢測六種正常人組織以及多種組織學(xué)類型的肺癌和ESCC 中的0IP5表達(放大100倍)。陽性染色主要出現(xiàn)在睪丸細胞和肺癌細胞的核和胞質(zhì)中。圖7，圖7描繪了 0IP5表達與NSCLC和ESCC患者的較差臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)。在 A部分中，描繪了肺癌(鱗狀細胞癌)和正常肺中0IP5表達的代表性例子(頂部XlOO ； 底部X200)。在B部分中，描繪了 NSCLC患者的腫瘤特異性存活依照0IP5表達水平的 Kaplan-Meier分析(P = O. 0053 ；時序檢驗)。在C部分中，描繪了 ESCC和正常食道中0IP5 表達的代表性例子(頂部X100;底部X200)。在D部分中，描繪了 ESCC患者中的腫瘤特異性存活依照0IP5表達水平的Kaplan-Meier分析(P = 0. 0129 ；時序檢驗)。圖8，圖8描繪了 0IP5蛋白經(jīng)由它與Rafl蛋白的相互作用而穩(wěn)定化。在A部分中，描繪了肺癌細胞中外源0IP5與內(nèi)源Rafl蛋白的相互作用。使用M2-Flag瓊脂糖和來自經(jīng)pCAGGSn3FC-0IP5-Flag轉(zhuǎn)染且表達內(nèi)源Rafl的C0S-7細胞的提取物進行免疫沉淀。使用抗Rafl多克隆抗體對免疫沉淀物進行Western印跡分析以檢測內(nèi)源Rafl。IB指免疫印跡；IP指免疫沉淀。在B部分中，描繪了肺癌細胞系中的0IP5和Rafl蛋白表達。0IP5的表達樣式顯示較好地符合Rafl蛋白的表達樣式。在C部分中，描繪了 Rafl表達對0IP5蛋白水平的影響。在左邊小圖中，描繪了 Rafl敲低對0IP5蛋白水平的影響。通過經(jīng)Si-Rafl 轉(zhuǎn)染的SBC-5細胞中的半定量RT-PCR分析和Wfestern印跡分析檢測內(nèi)源Rafl和0IP5轉(zhuǎn)錄物以及它們的編碼蛋白的表達。在右邊小圖中，描繪了 Rafl過表達對0IP5蛋白水平的影響。通過經(jīng)Rafl表達載體轉(zhuǎn)染的SBC-5細胞中的半定量RT-PCR分析和Wfestern印跡分析檢測Rafl和0IP5轉(zhuǎn)錄物和蛋白的表達水平。圖9，圖9描繪了增補圖。在A部分中，描繪了用于檢查抗體對0IP5的特異性的抗原阻斷測定法。將抗0IP5抗體與重組0IP5蛋白一起溫育，之后進行免疫組織化學(xué)染色 (抗0IP5+rh0IP5)。與rh0IP5 —起預(yù)溫育減少了肺癌組織中由抗0IP5抗體獲得的陽性信號(Anti-0IP5)。在B部分中，描繪了 0IP5增強C0S-7的細胞侵襲性。通過^festern印跡分析檢查C0S-7細胞中的0IP5表達(左邊頂部小圖)。Matrigel基質(zhì)中的測定證明了用 pCAGGSn3FC-0IP5-Flag轉(zhuǎn)染后C0S-7細胞的侵襲性質(zhì)。顯示了吉姆薩染色(底部小圖；放大100倍)和遷移穿過基質(zhì)膠包被的濾膜的細胞相對數(shù)目(右邊頂部小圖)。在C部分中， 描繪了 0IP5與Rafl蛋白的直接相互作用。使用抗His抗體和帶His標(biāo)簽的0IP5與GST 融合的重組Rafl蛋白的混合物進行0IP5蛋白的下拉。然后使用針對Rafl的多克隆抗體 (Cell Signaling Technology)進行Western印跡來檢測結(jié)合0IP5的Rafl蛋白。在D部分中，描繪了通過半定量RT-PCR檢測的肺癌細胞系中的Rafl表達。實施方案的描述盡管與本文描述相似或等價的任何方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明實施方式，在此仍描述了優(yōu)選方法、裝置、與材料。然而，在描述本發(fā)明的材料與方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于本文中的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因其可根據(jù)常規(guī)實驗與優(yōu)化而有變化。亦應(yīng)理解本描述所用的命名法僅以描述特定版本或?qū)嵤├秊槟康?，并非意欲限定本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求所限定。通過本文中的述及而具體收錄本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖恼麄€公開內(nèi)容。然而，本文中無一處要解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開。當(dāng)存在沖突時，應(yīng)以本說明書所述為準(zhǔn)，包括定義在內(nèi)。另外，材料、方法、和實施例僅僅是例示性的，而非意圖是限制性的。^X除非另有具體指明，如本文中使用的詞語“一個”、“一種”、和“該”意思是“至少一個”。如本文中使用的，術(shù)語“生物樣品”指整個生物體或其組織、細胞或組成部分(例如體液，包括但不僅限于，血液、血清、血漿、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血 (amniotic cord blood)、尿液、陰道液和精液)的子集(subset)。術(shù)語“生物樣品”進一步指從整個生物體或其細胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿物、裂解物、提取物、細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其級分或部分。最后，“生物樣品”指含有細胞組分(諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸)的培養(yǎng)基，諸如生物體已在其中繁殖的營養(yǎng)湯或凝膠。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互換使用，指核酸殘基的多聚物，而且，除非另有具體指明，用其通常為人接受的單字母代碼進行指代。所述術(shù)語適用于其中一個或更多核酸通過酯鍵連接的核酸(核苷酸)多聚體。所述核酸多聚體可包括DNA、RNA或其組合，而且涵蓋天然出現(xiàn)的和非天然出現(xiàn)的核酸多聚體。術(shù)語“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的多聚體。 這些術(shù)語指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物的氨基酸多聚體，其中一個或多個氨基酸殘基是修飾殘基，或非天然存在的殘基，諸如對應(yīng)天然存在殘基的人工化學(xué)模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼子編碼的氨基酸，以及在細胞內(nèi)翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸)。詞組“氨基酸類似物”是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與一個氫、一個羧基、一個氨基和一個R基團連接)，但具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的骨架的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。詞組“氨基酸模擬物”是指這樣的化合物，其具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)，但具有與一般氨基酸相似的功能。在這里，氨基酸可以用它們公知的三字母符號表示，或者用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號表不。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達0ΙΡ5基因的癌癥。過表達0ΙΡ5的癌癥的例子包括但不限于肺癌和食道癌?；蚧虻鞍妆景l(fā)明的感興趣基因的核酸和多肽序列示于下列數(shù)字，但不限于它們；0ΙΡ5 :SEQ ID NO :13 和 14Rafl :SEQ ID NO 17 和 18另外，序列數(shù)據(jù)亦可通過下述登錄號獲取0IP5 :NM_007280 ；Rafl :NM_002880 ；依照本發(fā)明的一個方面，功能等同物亦被認為是上述“多肽”。在本文中，蛋白的 “功能等同物”為具有與該蛋白等同的生物學(xué)活性的多肽。也就是，任何保留初始參照肽的生物學(xué)能力的肽均可用作本發(fā)明中的此類功能等同物。此類功能等同物包括那些對蛋白的天然存在氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個或多個氨基酸的功能等同物?；蛘撸嚯目砂c相應(yīng)蛋白的序列具有至少約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選與參照序列具有至少約90%至95%同一性，甚至更優(yōu)選96%至99%同一性的氨基酸序列。在其它實施方案中，多肽可以由在嚴(yán)格條件下與基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。本發(fā)明的多肽可在其氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的有無、或形式等方面有變化，這取決于用于產(chǎn)生它的細胞或宿主，或使用的純化方法。無論如何，只要它具有與本發(fā)明的人類蛋白的功能等同的功能，它就在本發(fā)明的范圍內(nèi)。短語“嚴(yán)格(雜交)條件”指這樣的條件，在該條件下，核酸分子會與其靶序列雜交，通常在復(fù)雜的核酸混合物中，而沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴(yán)格條件取決于
10序列，而且在不同情況中會有所變化。較長的序列在更高的溫度下發(fā)生特異性雜交。對于核酸雜交詳盡指導(dǎo)可見于 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridizaion and the strategy of nucleic acid assays，，(1993)。 一1 ^/eH-^t 件選擇為在限定的離子強度PH下，比特定序列的熱熔點(Tm)低大約5-10°C。1是如下的溫度(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)，在該溫度下，50%的與靶互補的探針在平衡時與靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在Tm，在平衡時50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴(yán)格雜交條件包括如下50%甲酰胺、 5xSSC、和 1% SDS，在 42°C溫育，或 ^cSSCU % SDS、在 65°C溫育，用 0. 2xSSC 和 0. SDS 在 50°C清洗。在本發(fā)明的語境中，用于分離編碼與上述人類蛋白功能等同的多肽的DNA的雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。例如，可用下述步驟進行雜交在68攝氏度用 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)進行30分鐘或更長的預(yù)雜交，添加經(jīng)過標(biāo)記的探針，并在68攝氏度溫育一小時或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴(yán)格度條件中進行。一種例示性的低嚴(yán)格度條件可包括42°C、2xSSC與0. 1 % SDS，優(yōu)選50°C、2xSSC與0. 1 % SDS。經(jīng)常優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。一種例示性的高嚴(yán)格條件可包括在室溫在hSSC、0. SDS中清洗3次各20分鐘，然后在lxSSC、0. 1 % SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘，并在lxSSC、0. 1% SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數(shù)種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴(yán)格度，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的因素以達到所需的嚴(yán)格度。一般地說，蛋白中一個、兩個或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白的功能。事實上，已知突變的或經(jīng)過修飾的蛋白(即由如下氨基酸序列構(gòu)成的肽，其中通過替代、刪除、 插入和/或添加而修飾了一個、兩個或幾個氨基酸殘基)可保留原始的生物學(xué)活性(Mark et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，對氨基酸序列進行改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸的個別添加、刪除、插入、或替代，或者被認為是“保守修飾”的那些修飾，其中蛋白的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的語境中可接受的。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽可具有如下的氨基酸序列，其中添加、插入、刪除、和/或替代參照序列中的一個、兩個或更多個氨基酸。只要保持蛋白的活性，氨基酸突變的數(shù)目不受特別限制。然而，一般優(yōu)選改變氨基酸序列的5%或更少。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數(shù)目一般為30個氨基酸或更少，優(yōu)選20個氨基酸或更少，更優(yōu)選10個氨基酸或更少，更優(yōu)選 5或6個氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選3或4個氨基酸或更少。要突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)榘被醾?cè)鏈特性保持的另一種氨基酸(稱為保守性氨基酸替代的過程)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y， V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S, T)、和具有下列共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基基團的側(cè)鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含有堿的側(cè)鏈(R，K，H)；和含有芳香族的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領(lǐng)域是公知的。例如，下列8個組各種包含彼此構(gòu)成保守性替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且包括非保守性修飾，只要蛋白的至少一種生物學(xué)活性得以保留即可。另外，經(jīng)過修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼的。此外，本發(fā)明的基因涵蓋編碼蛋白的此類功能等同物的多核苷酸。除了雜交之外， 還可以利用基因擴增方法來分離編碼與蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，通過使用基于上述信息的序列合成的引物。分別構(gòu)成人類基因和蛋白的功能等同物的多核苷酸和多肽通常與其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性?！案咄葱浴蓖ǔＶ?0 %或更高的同源性，優(yōu)選60 %或更高，更優(yōu)選80 %或更高，甚至更優(yōu)選90 % 至95%或更高，甚至更優(yōu)選96%至99%或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循 "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 :7洸_30 (1983) ” 中的算法來確定。雙鏈分平本文中使用的術(shù)語“分離的雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，包括，例如，小干擾RNA(siRNA，例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA))與小干擾DNA/ RNA(siD/R-NA,例如DNA與RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA與RNA的小發(fā)夾嵌合體 (shD/R-NA))。本文中使用的術(shù)語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導(dǎo)入細胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA的那些。所述siRNA包括0IP5有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、0IP5反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。所述siRNA可如此構(gòu)建使得單個轉(zhuǎn)錄物具有靶基因的有義核酸序列和與其互補的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術(shù)語“dsRNA”指包含相互互補序列的兩個RNA分子的構(gòu)建體，所述兩個RNA分子通過所述互補序列退火而形成了雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質(zhì)編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因非編碼區(qū)域的核苷酸序列的RNA分子。在本說明書中使用的術(shù)語“shRNA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，其包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個區(qū)的互補程度和方向足以使兩個區(qū)之間發(fā)生堿基配對，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接在一起，而所述環(huán)是因為環(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈(intervening single-strand)”
在本說明書中使用的術(shù)語“siD/R-NA”是指由RNA和DNA 二者組成的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導(dǎo)入細胞的常規(guī)技術(shù)。所述siD/R-NA包括0IP5有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、0IP5反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。siD/R-NA可以這樣構(gòu)建， 使單個轉(zhuǎn)錄物同時具有來自靶基因的有義核酸序列和互補反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術(shù)語“dsD/R-NA”是指這樣兩個分子的構(gòu)建體，所述兩個分子包含彼此互補的序列并且已經(jīng)藉由所述互補序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因的非編碼區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA 的兩個分子中的一個或兩個均由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個分子由RNA 組成而另一個由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術(shù)語“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，其包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是因為在環(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。本說明書中使用的“分離的核酸”是指從本來的環(huán)境(例如，若是天然存在的，則為自然環(huán)境)中被取出，從而與其自然狀態(tài)相比發(fā)生了合成性的改變的核酸。在本發(fā)明的語境中，分離的核酸的實例包括DNA、RNA和它們的衍生物。與靶mRNA雜交的針對0IP5的雙鏈分子通過與正常單鏈mRNA基因轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，干擾其翻譯，抑制蛋白質(zhì)表達，來降低或抑制由0IP5基因編碼的0IP5蛋白的產(chǎn)生。如本文中證明的，在肺癌和/或食道癌細胞系中0IP5的表達被dsRNA抑制(圖3A)。因而，本發(fā)明提供了有能力在導(dǎo)入表達0IP5基因的細胞后抑制該基因表達的分離雙鏈分子。所述雙鏈分子的靶序列可通過siRNA設(shè)計算法來設(shè)計，例如下述的。0IP5靶序列的例子包括例如核苷酸諸如SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO :13 的 557_575nt)本發(fā)明中特別感興趣的是下文所列雙鏈分子[1]至[18][1] 一種分離的雙鏈分子，它當(dāng)被導(dǎo)入細胞后，抑制0IP5的體內(nèi)表達及細胞增殖， 所述分子包含有義鏈以及與之互補的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子；[2] [1]中所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子對mRNA起作用，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 557_575nt)；[3] [2]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈包括對應(yīng)于選自下組的靶序列的序列=SEQ ID NO :11 和 12 ；[4] [3]中所述的雙鏈分子，具有少于約100個核苷酸的長度；
[5] [4]中所述的雙鏈分子，具有少于約75個核苷酸的長度；[6] [5]中所述的雙鏈分子，具有少于約50個核苷酸的長度；[7] [6]中所述的雙鏈分子，具有少于約25個核苷酸的長度；[8] [7]中所述的雙鏈分子，具有約19到約25個核苷酸的長度；[9] [1]中所述的雙鏈分子，其由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的雙鏈分子，其具有通式5' _[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[Α]為包含與選自SEQ ID NO 11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；[11] [1]中所述的雙鏈分子，其由RNA構(gòu)成；[12] [1]中所述的雙鏈分子，其由DNA和RNA構(gòu)成；[13] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[14] [13]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈分別由DNA與RNA構(gòu)成；[15] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子為DNA與RNA的嵌合體；[16] [15]中所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域為RNA，或者有義鏈5’ 端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均為RNA ；[17] [16]中所述的雙鏈分子，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[18] [1]中所述的雙鏈分子，其中所述分子包含3’突出端；本發(fā)明所述的雙鏈分子將在下面更詳細描述。設(shè)計具有抑制細胞內(nèi)靶基因表達能力的雙鏈核酸分子的方法是已知的(見例如， 美國專利No. 6，506，559，本文通過提述并入引用其全部內(nèi)容)。例如，可以從Ambion網(wǎng)站 (http //www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_f inder. html)獲得用于設(shè)計 siRNA 的計
算機程序。該計算機程序可以根據(jù)如下的方案選擇雙鏈核酸分子的靶核苷酸序列。靶點的選擇1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個 AA的出現(xiàn)及其3’側(cè)相鄰的19個核苷酸作為潛在siRNA靶點。Tuschl等不建議針對5’和 3’非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA，因為這些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，而UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾siRNA 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進行比較，將任何與其他編碼序列顯著同源的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST (Altschul SF等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務(wù)器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/o3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評估的基因的長度選擇幾個靶序列。使用上述實驗方案，設(shè)計本發(fā)明中分離雙鏈分子的靶序列為下述對0IP5 基因，SEQ ID NO :11 禾口 12。對以上述靶序列為目標(biāo)的各雙鏈分子，檢查其阻抑表達靶基因的細胞的生長的能力。因此，本發(fā)明提供以選自下組的任何序列為靶標(biāo)的雙鏈分子對于0IP5 基因，SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO :13 的 79_97nt)和 12(位于 SEQ ID NO 13 的 557-575nt)。本發(fā)明的雙鏈分子可以靶向單個0IP5基因序列，或可以靶向多個0IP5基因。以上述靶序列0IP5基因為靶標(biāo)的本發(fā)明的雙鏈分子包括含有靶序列和/或與靶序列互補的序列的任何核酸序列的分離多核苷酸。以0IP5基因為靶的多核苷酸例子包括那些含有序列SEQ ID NO :11或12和/或這些核苷酸的互補序列的多核苷酸；然而，本發(fā)明并不僅限于這些例子，上述核酸序列中的次要修飾是可以接受的，只要所述經(jīng)修飾分子保留阻抑0IP5基因表達的能力。本文中，短語“次要修飾”當(dāng)用于和核酸序列時表示對所述序列替換、缺失、添加或插入一個、兩個或幾個核酸。在本發(fā)明的語境下，術(shù)語“幾個”當(dāng)用于核酸替換、缺失、添加和/或插入時可意指 3-7個，優(yōu)選3-5個，較優(yōu)選3-4個，最優(yōu)選是3個核苷酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的雙鏈分子可用實施例中使用的方法檢測其能力。在后述的實施例中，依照標(biāo)準(zhǔn)方法在體外對包含0IP5基因的mRNA不同部分的有義鏈或其互補的反義鏈的雙鏈分子測驗其在肺癌和/或食道癌細胞系中降低0IP5基因產(chǎn)物產(chǎn)生的能力。進一步，例如，與在缺乏候選分子情況下培養(yǎng)的細胞相比在與候選雙鏈分子接觸的細胞中0IP5 基因產(chǎn)物的減少，可通過例如使用在實施例1 “半定量RT-PCR”項下提到的針對0IP5 mRNA 的引物進行RT-PCR來檢測。然后可對在體外基于細胞的分析中減少0IP5基因產(chǎn)物的序列檢測其針對細胞生長的抑制作用。然后對在體外基于細胞的分析中抑制細胞生長的序列使用患癌癥動物檢測其體內(nèi)的相應(yīng)能力，以證實0IP5基因產(chǎn)物的產(chǎn)生降低與癌細胞生長降低，所述動物的例子包括裸鼠異種移植模型。當(dāng)所述分離多核苷酸是RNA及其衍生物時，核苷酸序列中的“t”應(yīng)替換為“U”。本文中使用的術(shù)語“互補”指多核苷酸中核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，且術(shù)語結(jié)合意指兩個多核苷酸間物理的或化學(xué)的相互作用。當(dāng)所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯酶連結(jié)時，這些多核苷酸亦可以同樣地發(fā)生相互結(jié)合。一般而言，互補多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯配的穩(wěn)定雙鏈體。進一步，本發(fā)明中所述分離多核苷酸的有義鏈與反義鏈可通過雜交形成雙鏈分子或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實施方案中，上述雙鏈體在每10個匹配中包含不超過一個錯配。在特別優(yōu)選的實施方案中，其雙鏈體的鏈完全互補，該雙鏈體不包含錯配。對0IP5所述多核苷酸長度優(yōu)選少于1249個核苷酸。舉例而言，對所述的所有基因，多核苷酸長度小于500、200、100、75、50或25個核苷酸。本發(fā)明中所述的分離多核苷酸可用于形成針對0IP5基因的雙鏈分子，或制備編碼雙鏈分子的模板DNA。當(dāng)所述多核苷酸用于形成雙鏈分子時，所述多核苷酸可長于19個核苷酸，優(yōu)選長于21個核苷酸，且更加優(yōu)選長度在約19與25個核苷酸之間。因而，本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包括與靶序列對應(yīng)的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為 19至25個核苷酸對的雙鏈分子。本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個或更多修飾核苷酸和/或非磷酸二酯聯(lián)接。本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾具有增加所述雙鏈分子穩(wěn)定性、可用性和/或細胞攝入
15的能力。一般技術(shù)人員知道本發(fā)明分子可以包含的其它類型的化學(xué)修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個實施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。 上述修飾的例子包括但不僅限于，硫代磷酸酯聯(lián)接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特別在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉(zhuǎn)脫氧脫堿基(deoxykisic)殘基的摻入(US20060122137)。另一個實施方案中，可以使用修飾來增強雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加尋靶效率。這樣的修飾的例子包括但不限于雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學(xué)交聯(lián)、雙鏈分子一條鏈的3’ 或5’末端的化學(xué)修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和 2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/(^92U)。在另一個實施方案中，修飾可以用于增加或減少針對靶mRNA中和/或互補雙鏈分子鏈中的互補核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl) 嘧啶取代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個實施方案中，當(dāng)雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈核酸分子時，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM等，Genes Dev 2001 Jan 15,15(2) 188-200)。關(guān)于進一步的細節(jié)，可以利用公開文獻如US20060234970。本發(fā)明不限于這些實例，可以將任何已知化學(xué)修飾應(yīng)用于本發(fā)明的雙鏈核酸分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表達的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈核酸分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/ R-NA。具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性?？梢孕纬蒁NA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸)組成的雜合型雙鏈核酸分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸) 上同時包含DNA和RNA的嵌合型雙鏈核酸分子，諸如此類，來增強所述雙鏈核酸分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的雜合體，其中有義鏈?zhǔn)荄NA而反義鏈?zhǔn)?RNA,或者相反，只要它在導(dǎo)入表達靶基因的細胞中后能夠抑制靶基因表達。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈核酸分子可以是其中的有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要所述雙鏈核酸分子在導(dǎo)入表達靶基因的細胞中時具有抑制該基因表達的活性即可。為了提高雙鏈核酸分子的穩(wěn)定性，分子中優(yōu)選包含盡可能多的DNA ；而為了誘導(dǎo)靶基因的表達抑制， 要求分子在一定范圍內(nèi)是RNA，以充分地誘導(dǎo)表達抑制。作為嵌合體雙鏈核酸分子的一個優(yōu)選實例，雙鏈核酸分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補序列之側(cè)翼的區(qū)域)為RNA。優(yōu)選地，所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)?；蛘撸Q有義鏈的5’ -端或反義鏈的3’ -端側(cè)翼的區(qū)域為上游部分區(qū)域。就是說，在優(yōu)選實施方案中，反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域均由 RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈核酸分子包含以下組合。有義鏈5，-[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，和有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，_(-—RNA-—)_5，反義鏈。上游部分區(qū)優(yōu)選是由9-13個核苷酸組成的域，從雙鏈核酸分子的有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實例包括這樣的實例鏈長為19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半?yún)^(qū)(對于有義鏈為5’側(cè)區(qū)域而對于反義鏈為3’側(cè)區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達的效果比反義鏈整體為RNA時強得多(US20050004064)。在本發(fā)明的語境中，雙鏈核酸分子可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如短發(fā)夾RNA(ShRNA)以及由DNA與RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA或RNA和DNA的混合序列，其形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA 在單一鏈上包含有義靶標(biāo)序列和反義靶標(biāo)序列，其中所述序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細胞機制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進一步與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合。這種復(fù)合物結(jié)合并切割與所述 dsRNA或dsD/R-NA的靶標(biāo)序列匹配的mRNA。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間設(shè)置由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的雙鏈核酸分子。式中， [A]為有義鏈，包含與靶序列對應(yīng)的序列；[B]為間插單鏈；[A']為反義鏈，包含[A]的互補序列。對0IP5基因，靶序列例如可以選自以下的組SEQ ID N0:11和12。本發(fā)明不限于這些實例，在雙鏈核酸分子保持抑制作為靶標(biāo)的0IP5基因的表達的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在這些實例的基礎(chǔ)上修飾而得到的序列。區(qū)域[A] 與[A']雜交而形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]、即環(huán)序列，長度優(yōu)選可以為 3 23個核苷酸。例如，環(huán)序列可以選自由以下的序列組成的組(http //www. ambion. com/ techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23個核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al·，Nature 2002Jul 25,418(6896) :435-8，Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，Epub 2002 Jun 26 ；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May,20(5) :500-5 ；Fruscoloni Pet al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) 1639-44，Epub 2003 FeblO ；UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun,4(6) 457-67。優(yōu)選的具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸分子實例如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組；但本發(fā)明不限于此CGGCAUCGCUCACGUU⑶G - [B]-CACAAC⑶GAGCGAUGCCG (對靶序列 SEQ ID NO 11)；GUGACAAAAUG⑶⑶GCUA - [B]-UAGCACACCAUUUU⑶CAC (對靶序列 SEQ ID NO 12)；此外，為了增強雙鏈核酸分子的抑制活性，可以將數(shù)個核苷酸添加到靶序列的有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。添加的核苷酸的數(shù)目為至少2個，通常為 2-10個，優(yōu)選為2-5個。添加的核苷酸在雙鏈分子的有義鏈和/或反義鏈的3’末端形成單鏈。要添加的核苷酸的優(yōu)選例子包括但不限于“t”和“U”。在雙鏈分子由單一多核苷酸組成以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的場合，可將3'突出序列添加至該單一多核苷酸的3'端。對于雙鏈核酸分子的制備方法沒有特殊限制，但優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法。根據(jù)化學(xué)合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾鼈兺嘶鸬揭黄?，來獲得雙鏈分子。退火的具體例子包括將合成的單鏈多核苷酸以優(yōu)選至少約3 7、更優(yōu)選約4 6、最優(yōu)選基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈核酸分子解離的溫度，再緩慢冷卻。經(jīng)退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當(dāng)?shù)拿高M行降解)的方法。所述位于0IP5序列側(cè)翼的各調(diào)控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達能夠獨立地，或者以時間性或空間性方式被調(diào)控。所述雙鏈分子可通過將0IP5基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III轉(zhuǎn)錄單元或人類HlRNA啟動子的載體)以在胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄。含有本發(fā)明雙鏈分子的載體本發(fā)明還包括含有一種或多種本文所述的雙鏈核酸分子的載體、以及包含該載體的細胞。本發(fā)明特別感興趣的是下文所列載體[1]至[10]。[1] 一種載體，它編碼當(dāng)被導(dǎo)入細胞后抑制0IP5的體內(nèi)表達及細胞增殖的雙鏈分子，所述分子包含有義鏈以及與之互補的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子。[2] [1]中所述的載體，它編碼對mRNA起作用的雙鏈分子，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 557-575nt)；
[3][1]中所述的載體，其中有義鏈包含對應(yīng)于選自下組的靶序列的序列SEQ ID NO 11 禾口 12 ；[4] [3]中所述的載體，它編碼長度小于約100個核苷酸的雙鏈分子；[5] [4]中所述的載體，它編碼長度小于約75個核苷酸的雙鏈分子；[6] [5]中所述的載體，它編碼長度小于約50個核苷酸的雙鏈分子；[7] [6]中所述的載體，它編碼長度小于約25個核苷酸的雙鏈分子；[8] [7]中所述的載體，它編碼長度為約19個至約25個核苷酸的雙鏈分子；[9] [1]中所述的載體，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸具有通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的載體，它編碼具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'的雙鏈分子，其中，[A]為包含與選自SEQ ID NO 11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；本發(fā)明的載體優(yōu)選編碼處于可表達的形式的本發(fā)明的雙鏈分子。在本說明書中， 術(shù)語“處于可表達的形式”，是指該載體當(dāng)被導(dǎo)入細胞中時，將表達該分子。在優(yōu)選的實施方案中，載體包含雙鏈核酸分子表達所必需的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的這種載體可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分。本發(fā)明的載體可通過下述方法生成例如，將0IP5序列克隆入表達載體中，使調(diào)控序列可操作性地連接于0IP5序列，以允許兩條鏈的表達(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)(Lee NS et al. , Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，與 mRNA 反義的 RNA 分子由第一啟動子(例如位于被克隆DNA的3’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，對mRNA而言為有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如位于被克隆DNA的5’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。有義和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默該基因的雙鏈分子構(gòu)建體?；蛘?，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個載體構(gòu)建體來分別表達有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構(gòu)建體。而且，被克隆的序列可編碼具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，即，載體的單一轉(zhuǎn)錄物同時包含靶基因的有義序列和互補反義序列二者。本發(fā)明涉及這樣的載體，其包括含有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個或二者，其中所述反義鏈包含與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述載體在被引入到表達 0IP5基因的細胞內(nèi)時抑制所述基因表達。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實現(xiàn)在靶細胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關(guān)于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR & Capecchi MR5Cell 1987,51 :503-12)。可以參考例如Wolff 降，Science 1990,247 :1465-8 ；美國專利第 5，580，859 號、第 5，589，466 號、 第 5，804，566 號、第 5，739，118 號、第 5，736，524 號、第 5，679，647 號和 WO 98/04720?；贒NA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)型)輸送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合體、和粒子介導(dǎo)型投遞(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號)。本發(fā)明的載體包括，例如，病毒性載體或細菌性載體。表達載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國專利第4，722，848號)。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導(dǎo)入表達靶基因的細胞時即表達該分子并由此抑制細胞的增殖?？墒褂玫妮d體的另一個例子包括卡介苗(BCG)。BCG 載體在Mover等，Naturel991，351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈核酸分子的治療性施用與生產(chǎn)，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等?？梢詤⒄绽鏢iata等， Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock 等，J Leukoc Biol2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571_85。#用本發(fā)日月雙鏈分子抑泡丨或降低癌細朐,牛長的方法某些siRNA抑制NSCLC的能力之前已描述于W02005/89735，以引用的方式將其包含于本文中。在本發(fā)明中，測試了針對0IP5的兩種不同的dsRNA抑制細胞生長的能力。所述兩種針對0IP5的dsRNA(圖3A)有效地敲低(knockdown) 了肺癌和食道癌細胞系中基因的表達，同時亦發(fā)生了細胞增殖的阻抑。
因而，本發(fā)明提供了通過經(jīng)抑制0IP5的表達來誘導(dǎo)0IP5基因的功能障礙以抑制細胞生長，即肺癌和/或食道癌細胞生長的方法。0IP5基因表達可通過任何特異性地靶定 0IP5基因的前述本發(fā)明雙鏈分子或可表達任何所述雙鏈分子的本發(fā)明載體來抑制。上述本發(fā)明雙鏈分子及載體抑制癌細胞細胞生長的能力提示其可用于治療癌癥的方法。因此，本發(fā)明提供通過施用針對0IP5基因的雙鏈分子或表達所述分子的載體無不良作用的治療罹患癌癥患者的方法，因為所述基因在正常器官中幾乎檢測不到(圖1A、B和 D，圖6)，其中所述癌癥是肺癌和/或食道癌。本發(fā)明特別感興趣的是下文所列[1]至[36]的方法[1] 一種用于抑制癌細胞生長和治療癌癥的方法，其中所述癌細胞或所述癌癥表達0IP5基因，該方法包括施用至少一種在過表達0IP5基因的癌細胞中抑制該基因表達及細胞增殖的分離的雙鏈分子的步驟，其中所述雙鏈分子包含有義鏈和與其互補的反義鏈， 所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中有義鏈包含與來自SEQ ID NO :13的連續(xù)序列對應(yīng)的核苷酸序列；[2] [1]的方法，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)禾口 SEQ IDNO 12 (位于 SEQ ID NO: 13 的 557-575nt)；[3] [2]的方法，其中有義鏈包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列對應(yīng)的序列；[4] [1]的方法，其中要治療的癌癥是肺癌和/或食道癌；[5] [4]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[6] [1]的方法，其中施用多種雙鏈分子；[7] [3]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸；[8] [7]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[9] [8]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[10] [9]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[11] [10]的方法，其中所述雙鏈分子長度在大約19個與大約25個核苷酸之間；[12] [1]的方法，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[13] [12]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；[14] [1]的方法，其中所述雙鏈分子是RNA ；[15] [1]的方法，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[16] [15]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[17] [16]的方法，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構(gòu)成；[18] [15]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[19] [18]的方法，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域為RNA，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均為RNA ；[20] [19]的方法，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；
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[21] [1]的方法，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[22] [1]的方法，其中所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強劑和藥學(xué)上可接受的載體。[23] [1]的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[24] [23]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA 與選自下組的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于SEQ ID NO 13的79_97nt)和SEQ ID NO 12 (位于 SEQ ID NO :13 的 557-575nt)；[25] [24]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自SEQ ID NO :11和12的靶序列對應(yīng)的序列；[26] [23]的方法，其中治療的癌癥是肺癌和/或食道癌；[27] [26]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[28] [23]的方法，其中施用多種雙鏈分子；[29] [25]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸；[30] [29]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[31] [30]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[32] [31]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[33] [32]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度在大約19個與大約 25個核苷酸之間；[34] [23]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[35] [34]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中，[A]為包含與選自SEQ ID NO :11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；和[36] [23]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細的加以描述?？赏ㄟ^將細胞與針對0IP5基因的雙鏈分子、表達該分子的載體或包含所述分子的組合物接觸來抑制表達0IP5基因的細胞的生長?？蛇M一步將所述細胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染劑在本領(lǐng)域是已知的。短語“抑制細胞生長”表示所述細胞較之未暴露于所述分子的細胞，以較低速率增殖或具有降低的存活率。細胞生長可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)測定，例如使用MTT細胞增殖分析。任何細胞的生長均可根據(jù)本方法進行阻抑，只要所述細胞表達或過表達本發(fā)明所述雙鏈分子的靶基因?？勺鳛槔拥募毎ǚ伟┖?或食道癌細胞，特別是NSCLC、SCLC 禾口 ESCC0于正罹患或有危險患上涉及0IP5的疾病的患者，可通過施用至少一種本發(fā)明雙鏈分子、表達至少一種所述分子的載體或包含至少一種所述分子的組合物進行治療。舉例而言，罹患肺癌和/或食道癌的患者可根據(jù)本發(fā)明的方法進行治療。癌癥類型可通過根據(jù)所診斷的特定類型腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法進行鑒定。肺癌和/或食道癌可通過，例如，癌胚抗原(CEA)、CYFRA、pro-GRP等等作為肺癌和/或食道癌標(biāo)志，或通過胸部X光和/或痰細胞學(xué)進行診斷。更優(yōu)選地，用本發(fā)明所述方法治療的患者是用這樣的方法選出的在來自患者的活檢物中通過RT-PCR或免疫測定法檢測0IP5的表達。優(yōu)選地，在本發(fā)明的治療之前， 對于來自患者的所述活檢樣通過本領(lǐng)域所知的方法，例如，免疫組織化學(xué)分析或RT-PCR，證實0IP5基因過表達。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過施用多種所述雙鏈分子(或表達同樣分子的載體或含有同樣分子的組合物)來抑制癌細胞生長并治療癌癥，每個所述分子可具有不同結(jié)構(gòu)，但作用于與0IP5的相同靶序列匹配的mRNA?；蛘?，多種雙鏈分子可作用于與相同基因內(nèi)的不同靶序列匹配的mRNA。舉例而言，所述方法可使用針對0IP5的雙鏈分子。為抑制細胞生長，本發(fā)明的雙鏈分子可直接以可實現(xiàn)該分子與對應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式導(dǎo)入細胞。或者，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導(dǎo)入細胞。為將雙鏈分子和載體導(dǎo)入細胞，可使用轉(zhuǎn)染增強劑，例如FuGENE(Roche diagnostics)、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)與 Nucleofector (Wako pure Chemical)。當(dāng)治療導(dǎo)致臨床效益，諸如受試者中0IP5基因表達的減少、癌癥的尺寸、患病率 (prevalence)、轉(zhuǎn)移潛力的降低等，可以判定該治療是“有效”的。當(dāng)預(yù)防性地適用治療時， “有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預(yù)防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。就本發(fā)明的方法和組合物用于“預(yù)防”和“防范”的語境而言，這些術(shù)語在本文中可互換使用，指降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減少疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動。或者，預(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的廣泛的預(yù)防性治療。治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。應(yīng)理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子降解亞化學(xué)計量的0IP5mRNA。雖不愿拘于任何理論，認為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，本發(fā)明為發(fā)揮治療效應(yīng)而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎(chǔ)上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈核酸分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞內(nèi)濃度為大約1納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，優(yōu)選大約2nM到大約50nM，更優(yōu)選大約2. 5nM到大約 ΙΟηΜ?？紤]可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可方便地及常規(guī)地確定特定情況下所需的確切劑量。 本發(fā)明的方法可用于抑制表達至少一種0IP5的癌癥，例如肺癌和/或食道癌，尤其是NSCLC、SCLC或ESCC，的生長或轉(zhuǎn)移。具體而言，含有0IP5 (即SEQ ID NO :11或12) 靶序列的雙鏈分子特別優(yōu)選用來治療肺癌和/或食道癌。 為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈核酸分子與不同于所述雙鏈核酸分子的藥劑組合來施用于受試者。或者，本發(fā)明的雙鏈核酸分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于患者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現(xiàn)在用于治療癌癥或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法(例如，放射療法，外科手術(shù)，以及使用化療劑，如順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治療) 組合施用。在本發(fā)明的方法中，雙鏈分子可以以與投遞試劑相組合的裸雙鏈核酸分子的形式，或者以表達雙鏈分子的重組質(zhì)?；蛘卟《据d體的形式施用于受試者。用于與本發(fā)明的雙鏈核酸分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus Transit TKO脂溶性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、 或脂質(zhì)體。一種優(yōu)選的投遞試劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠幫助將雙鏈核酸分子投遞至特定的組織如肺和/或食道腫瘤組織中， 還能夠增加雙鏈核酸分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明的語境中使用的脂質(zhì)體可以是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì)(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂質(zhì)通常包括中性或帶負電荷的磷脂，以及留醇，諸如膽固醇。對一些因素的考慮通?？梢詾橹|(zhì)的選擇提供指導(dǎo)，如期望的脂質(zhì)體大小以及在血流中的脂質(zhì)體的半衰期等。有多種制備脂質(zhì)體的方法是公知的，例如 Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ；美國專利第 4，235，871 號; 第4，501，728號；第4，837，028號；第5，019，369號；它們?nèi)吭⑷氡菊f明書。優(yōu)選地，包被本發(fā)明的雙鏈核酸分子的脂質(zhì)體包含能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送至癌癥部位的配體分子。優(yōu)選的配體是與腫瘤或血管內(nèi)皮細胞中常見的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體特別優(yōu)選地，包被本發(fā)明的雙鏈核酸分子的脂質(zhì)體經(jīng)過了修飾以免被單核巨噬細胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如，其結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào)理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時包括調(diào)理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，當(dāng)調(diào)理作用抑制部分化學(xué)地或物理地搭接在膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質(zhì)的活性基團直接結(jié)合，則調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，其顯著地減少單核巨噬細胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(”RES”)對脂質(zhì)體的攝入； 在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說明書。 因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質(zhì)體有時也被稱為“隱形”(stealth)脂質(zhì)體。
已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質(zhì)體會高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的攝入的減少可防止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優(yōu)選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohol)，諸如化學(xué)結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、 聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應(yīng)而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類或寡糖。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時稱為“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié)合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。上文討論了表達本發(fā)明的雙鏈核酸分子的載體。這樣的表達至少一種本發(fā)明的雙鏈核酸分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子 (例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內(nèi)施用途徑來施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口腔、直腸、與鼻內(nèi)遞送。合適的非消化道施用途徑包括膀胱內(nèi)或血管內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動脈內(nèi)推注、動脈內(nèi)輸注和針對血管網(wǎng)絡(luò)的導(dǎo)管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或附近的區(qū)域，例如借助導(dǎo)管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。
本發(fā)明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時，輸注可以是單個持續(xù)劑量，或者通過多次輸注來施用。優(yōu)選的是將藥劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將藥劑多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。為了對給定受試者施用本發(fā)明的雙鏈分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定合適的劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近。或者，雙鏈分子可以在約3 約觀日、更優(yōu)選約7 約10日的期間內(nèi)每日一次或二次地施用給受試者。在優(yōu)選的劑量方案中，雙鏈分子在7日期間內(nèi)一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當(dāng)劑量方案包括多次施用時，應(yīng)該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。包含本發(fā)明雙鏈分子的組合物除上述外，本發(fā)明亦提供了包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼該分子載體的藥物組合物。本發(fā)明特別感興趣的是下述[1]至[36]的組合物[1] 一種用于抑制癌細胞生長并治療癌癥的組合物，其中所述癌癥與癌細胞表達至少一種0IP5基因，所述組合物包括至少一種分離的抑制0IP5表達以及細胞增殖的雙鏈分子，且其中該分子包括有義鏈和與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈分子；[2][1]中的組合物，其中所述雙鏈分子作用于mRNA，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO 13 的 79_97nt)和 SEQID NO :12(位于 SEQ ID NO: 13 的 557-575nt)；[3] [2]的組合物，其中所述雙鏈分子，其有義鏈包含與選自下組的靶序列相應(yīng)的序列SEQ ID NO :11 和 12 ；[4] [1]的組合物，其中需治療的癌癥是肺癌和/或食道癌；[5] [4]的組合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[6] [1]的組合物，其中所述組合物包含多種所述雙鏈分子；[7] [3]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸；[8] [7]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[9] [8]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[10] [9]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[11] [10]的組合物，其中所述雙鏈分子長度在大約19個與大約25個核苷酸之間；[12] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[13] [12]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈序列，[B]為由3 個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；[14] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子是RNA ；[15] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA和/或RNA ；[16] [15]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；
25
[17] [16]的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸與反義鏈多核苷酸分別由DNA與 RNA組成；[18] [15]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[19] [18]的組合物，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA組成；[20] [19]的組合物，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[21] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[22] [1]的組合物，其中所述組合物包括轉(zhuǎn)染增強劑和藥學(xué)上可接受的載體。[23] [1]的組合物，其中所述雙鏈分子由載體編碼并包含于組合物中；[24] [23]中的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子作用于mRNA，所述 mRNA與選自下組的靶序列匹配=SEQ ID NO :11(位于SEQ IDNO 13的79_97nt)和SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO :13 的 557_575nt)；[25] [24]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自下組的靶序列相應(yīng)的序列=SEQ ID NO :11和12 ；[26] [23]的組合物，其中需治療的癌癥是肺癌和/或食道癌；[27] [26]的組合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC，而食道癌是ESCC ；[28] [23]的組合物，其中施用多種所述雙鏈分子；[29] [25]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約100個核
苷酸；[30] [29]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[31] [30]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約50個核
苷酸；[32] [31]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[33] [32]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度在大約19個與大約25個核苷酸之間；[34] [23]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成， 所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者；[35] [23]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :11和12中的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈；知[36] [23]的組合物，其中所述組合物包括轉(zhuǎn)染增強劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明合適的組合物將在下面更加詳述地加以描述。本發(fā)明的所述雙鏈分子優(yōu)選在施用于患者之前根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物配制劑”包括適用于人類與動物的配制劑。制備本發(fā)明藥物配制劑的方法屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)，例如，描述于Remington' sPharmaceutical Science, 17th ed. ,Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內(nèi)容通過引用包含于本文中。
本發(fā)明的藥物配制劑包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它們的載體(例如， 以重量計為0. 到90% )，或所述分子的生理學(xué)上可接受的鹽，與生理上可接受的載體介質(zhì)混合。生理學(xué)上可接受的載體介質(zhì)優(yōu)選水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、 透明質(zhì)酸及類似物。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，其中每一個均可針對0IP5的相同或不同的靶序列。舉例而言，所述組合物可包含針對0IP5的雙鏈分子。或者，例如，所述組合物可包含針對選自0IP5的一種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。而且，本組合物可以包含編碼1個或多個雙鏈核酸分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種、2種或數(shù)種本雙鏈核酸分子?；蛘?，本組合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈核酸分子。而且，本雙鏈核酸分子可以作為脂質(zhì)體的形式包含在本組合物中。脂質(zhì)體的具體情況可以參照“使用雙鏈分子治療癌癥的方法”項。此外，本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含常規(guī)的藥用賦形劑和/或添加劑。合適的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理學(xué)生物相容性的緩沖液(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補加螯合劑(例如DTPA或 DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復(fù)合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地， 補加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以進行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固態(tài)載體。例如，藥物級的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，優(yōu)選25-75%的一種或多種本發(fā)明的雙鏈核酸分子。用于氣霧劑(吸入) 施用的藥物組合物可以包含0. 01-20重量％、優(yōu)選1-10重量％的包被于上述脂質(zhì)體中的一種或多種本發(fā)明的雙鏈核酸分子，以及推進劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如用于鼻內(nèi)投遞的卵磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學(xué)活性成分，只要它們不抑制本發(fā)明雙鏈核酸分子的體內(nèi)功能。例如，上述組合物中可以包含常規(guī)用于癌癥治療的化療藥物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療以表達 0IP5為特征的肺癌和/或食道癌的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療表達0IP5的肺癌和/或食道癌的藥物組合物中的用途該分子在細胞內(nèi)抑制0IP5基因的表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以選自SEQ ID NO 11和12的序列為靶標(biāo)。本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療以表達0IP5為特征的肺癌和/或食道癌的藥物組合物的方法或工藝。該方法或工藝包括將藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起配制的步驟其在過表達0IP5的細胞中抑制所述基因的表達，該分子包含有義鏈與與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以選自SEQ ID NO 11和12的序列為靶標(biāo)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)用于治療以表達0IP5為特征的肺癌和/ 或食道癌的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過表達 0IP5的細胞中抑制所述基因的表達，該分子包含有義鏈與與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以選自SEQ ID NO 11和12的序列為靶標(biāo)。診斷肺癌和/或食道癌的方法發(fā)現(xiàn)0IP5的表達在肺癌和/或食道癌細胞中特異性的提高(圖IA和B)。因而， 本文鑒定出的基因及其轉(zhuǎn)錄與翻譯產(chǎn)物可以作為肺癌和/或食道癌標(biāo)志用于診斷，且通過測量細胞樣品中0IP5的表達可診斷肺癌和/或食道癌。具體而言，本發(fā)明提供了通過確定受試者中0IP5表達水平檢測、診斷和/或確定肺癌和/或食道癌的存在或其形成傾向性的方法?？捎帽痉椒ㄔ\斷的肺癌和/或食道癌包括NSCLC、SCLC與ESCC。進一步地，NSCLC, 包括肺和/或食道腺癌與肺和/或食道鱗狀細胞癌(SCC)，亦可通過本發(fā)明診斷或檢測出來。根據(jù)本發(fā)明，可提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。所述中間結(jié)果可與其它信息結(jié)合起來以協(xié)助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員確定患者罹患所述疾病。就是說，本發(fā)明提供用于檢查癌癥的診斷標(biāo)志0IP5?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于檢測或鑒定源自受試者的肺或食道組織樣品中癌細胞的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物樣品中0IP5基因表達水平的步驟，其中所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示組織中存在或懷疑存在癌細胞。此類結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護士、或其它保健從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。例如，依照本發(fā)明，當(dāng)關(guān)于自受試者獲得的組織中癌細胞的存在有疑問時，通過考慮0IP5基因的表達水平，加上疾病的不同方面，包括組織病理學(xué)、血液中的已知腫瘤標(biāo)志物的水平、和受試者的臨床過程等，能做出臨床決策。例如，一些公知的血液中的診斷性肺腫瘤標(biāo)志物為IAP， ACT, BFP，CA19-9，CA50, CA72-4，CA130，CEA，KMO-1，NSE，SCC，SPl，Span-I，TPA，CSLEX，SLX， STN和CYFRA。或者，血液中的診斷性食道腫瘤標(biāo)志物諸如CEA，DUPAN-2, IAP, NSE, SCC, SLX 和Span-I也是公知的。就是說，在本發(fā)明的這個具體實施方案中，基因表達分析的結(jié)果作為中間結(jié)果，用于進一步診斷受試者的疾病狀態(tài)。本發(fā)明特別感興趣的是下述[1]到[10]的方法[1] 一種診斷肺癌和/或食道癌的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測生物樣品中編碼0IP5的氨基酸序列的基因的表達水平；(b)將檢測出的表達水平較之基因通常正照水平的提高與疾病的存在相關(guān)聯(lián)。[2] [1]的方法，其中所述表達水平比正常對照水平高至少10%。[3] [1]的方法，其中所述表達水平通過選自下組的方法檢測。(a)檢測包含0IP5的序列的mRNA ；(b)檢測包含0IP5的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c)檢測包含0IP5的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的活性。[4] [1]的方法，其中所述肺癌為NSCLC或SCLC，而所述食道癌為ESCC。[5] [3]的方法，其中所述表達水平是通過檢測探針與基因的基因轉(zhuǎn)錄物的雜交而確定的。[6] [3]的方法，其中確定所述表達水平是通過檢測抗體與基因編碼的蛋白的結(jié)合
28作為所述基因的表達水平而確定的。[7] [1]的方法，其中所述生物樣品包括活檢物、痰或血液。[8] [1]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含上皮細胞。[9] [1]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌細胞。[10] [1]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌性上皮細胞。診斷肺癌和/或食道癌的方法將在下面更加詳細的加以敘述。用本方法診斷的受試者優(yōu)選為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如， 人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。為實施診斷，優(yōu)選從要診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學(xué)材料均可作為生物樣品用于測定，只要其包括目標(biāo)的0IP5轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。所述生物樣品包括，但不僅限于，想要診斷或懷疑患有癌癥的身體組織與體液，例如活檢物，血液，痰，胸腔積液與尿液。 生物樣品優(yōu)選含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，更優(yōu)選癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，并將其用為生物樣品。根據(jù)本發(fā)明，測定在所述源自患者的生物樣品中0IP5的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核酸)水平確定，使用本領(lǐng)域熟知的方法。舉例而言，0IP5的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈嵤┧鰴z測。對檢測多個基因(例如，多種癌癥特異性基因)，包括0IP5，的表達水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用0IP5(SEQ ID NO 13 ；GenBank登錄號匪_007觀0)的序列信息制備上述探針。舉例而言，0IP5的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)志物來標(biāo)記物， 例如染料、熒光和同位素，且所述基因的表達水平可以作為發(fā)生雜交的標(biāo)記物的強度來加以檢測。進一步，0IP5的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過基于擴增的檢測技術(shù)(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實施例的引物對 (SEQ ID NO :1和2，或者5和6)可用于通過RT-PCR或Northern印跡的檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件與低嚴(yán)格條件下與0IP5的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的， 在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地， 嚴(yán)格條件的溫度應(yīng)選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熔點(Tm)低大約5°C。Tm 是(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約0. 01-1. OM鈉離子 (或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約 30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)?；蛘?，本發(fā)明的診斷可以通過檢測翻譯產(chǎn)物來進行。例如，可以測定0IP5蛋白的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、 scFv,Fab,F(ab' ) 2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留對0IP5蛋白的結(jié)合能力即可。 制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于0IP5的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的方法，可利用針對0IP5蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析觀察其染色的強度。即，觀察到強染色表明所述蛋白質(zhì)的存在增加，且同時表明0IP5的高表達水平。另外，除0IP5基因的表達水平外，亦可確定其它癌相關(guān)基因，例如已知在肺癌和/ 或食道癌中有差異表達的基因的表達水平，以提高所述診斷的準(zhǔn)確性。對于包括0IP5基因在內(nèi)的癌癥標(biāo)志基因而言，如果其較之相應(yīng)的癌癥標(biāo)志基因的對照水平增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0 倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可認為其在生物樣品中的表達水平是增加的。對照水平可以與測試生物樣品同時確定，通過使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的0IP5基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。 進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中0IP5基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中0IP5基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)值。 標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌性對照水平”。當(dāng)0IP5基因的表達水平相比正常表達水平有所提高或與癌性對照水平相似時， 則受試者可診斷為正罹患或有風(fēng)險發(fā)生癌癥。進一步，當(dāng)比較多種癌癥相關(guān)基因的表達水平時，樣品與癌性參照之間的基因表達模式的相似性表明受試者正罹患或有風(fēng)險發(fā)生癌癥。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異，可以相對已知表達水平不會因細胞的癌或非癌狀態(tài)而改變的對照核酸(例如持家基因)的表達水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例的對照基因包括，但不僅限于，β -肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。評價癌癥預(yù)后的方法本發(fā)明涉及下列新發(fā)現(xiàn)，即0ΙΡ5表達與患者的較差預(yù)后顯著相關(guān)。因此，本發(fā)明提供確定或評價罹患癌癥，尤其是肺癌和/或食道癌患者預(yù)后的方法，所述方法在患者生物樣品中檢測0ΙΡ5表達水平；將測得的表達水平與對照水平比較；并確定與對照水平相比升高的表達水平為不良預(yù)后(不良的存活率)的指示。另外，可以根據(jù)本發(fā)明的方法比較0ΙΡ5基因在治療之前和之后的表達水平，以評估治療的效力。具體地，將治療后來自受試者的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療后水平)與來自同一受試者的在治療開始前獲得的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療前水平)進行比較。治療后水平與治療前水平相比降低，表明感興趣的治療是有效的，而治療后水平與治療前水平相比增加或相似則表明臨床結(jié)果或預(yù)后較為不利。如這里所使用的，術(shù)語“有效”是指治療導(dǎo)致受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因的表達降低、病理性下調(diào)的基因的表達增加或者癌的大小、普遍性或轉(zhuǎn)移潛力降低。當(dāng)預(yù)防性地應(yīng)用感興趣的治療時，“有效”是指治療可延緩或防止腫瘤的形成，或者延緩、防止或減輕該疾病的至少一種臨床癥狀。受試者體內(nèi)腫瘤狀況的評估可以用標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)程實施。此外，治療的有效性可以結(jié)合任何已知的用于診斷癌癥的方法加以確定。癌癥可以通過例如鑒定癥狀性異常，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲不振、惡心、嘔吐和全身性不適、虛弱和黃疸，來加以診斷。在此，術(shù)語“預(yù)后“指如病例的性質(zhì)與癥狀所表明的所述疾病的可能結(jié)果以及從疾病恢復(fù)的前景。相應(yīng)的，不利的、負面的、不良的預(yù)后定義為較低的治療后存活期與存活率。 相反，正面的、有利的、或良好的預(yù)后定義為治療后存活期或存活率提高。術(shù)語“評價預(yù)后”指預(yù)測、預(yù)告或?qū)⒔o定檢測或測量與患者癌癥的將來結(jié)果(例如，惡性，治愈癌癥的可能性、存活率等)相聯(lián)系。舉例而言，確定0IP5經(jīng)時的表達水平使預(yù)測患者結(jié)果(例如，惡性的增加或減少，癌癥的等級的增加或減少，治愈癌癥的可能性、 存活率等)成為可能。在本發(fā)明的語境下，短語“評價(或確定)預(yù)后”意欲涵蓋癌癥的預(yù)測與可能性分析、進展、特別是癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性擴散與疾病復(fù)發(fā)。本評價預(yù)后的方法意欲用于臨床以對治療模式作出決定，包括治療介入、診斷標(biāo)準(zhǔn)例如疾病的分期，以及針對腫瘤疾病的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的疾病監(jiān)視和監(jiān)測。本方法所用的源自患者的生物樣品可為任何源自要評價的受試者的樣品，只要 0IP5基因可在樣品中檢測出來。所述生物樣品優(yōu)選肺和/或食道細胞(從肺和/或食道獲得的細胞)。進一步，所述生物樣品可包括體液例如痰、血液、血清或血漿。另外，所述樣品可為從組織純化的細胞。生物樣品可在不同的時點自患者獲取，包括治療前，治療中和/或治療后。根據(jù)本發(fā)明，在源自患者的生物樣品中測得的0IP5基因的表達水平越高，治療后病情緩和、恢復(fù)和/或存活的預(yù)后就越差，且不良臨床后果的可能性就越高。因此，根據(jù)本方法，用作比較的“對照水平”可為，例如，在治療后顯示良好或積極的癌癥預(yù)后的個體或個體組成的群體中任何0IP5基因的表達水平，本文中稱之為“良好預(yù)后對照水平”?；蛘?，所述“對照水平”可為，例如，在治療后顯示不良或消極的癌癥預(yù)后的個體或個體組成的群體中任何0IP5基因的表達水平，本文中稱之為“不良預(yù)后對照水平”。所述“對照水平”是源自單一參照群體的單一表達模式，或者是多種表達模式。因此，所述對照水平可以基于在其疾病狀態(tài)(良好或不良預(yù)后)已知的癌癥患者或癌癥患者群體中，在進行任何種類治療之前的0IP5基因的表達水平來加以確定。癌癥優(yōu)選為肺癌和/或食道癌。在具有已知疾病狀態(tài)的患者集合中優(yōu)先使用0IP5基因的表達水平的標(biāo)準(zhǔn)值。所述標(biāo)準(zhǔn)值可通過任何本領(lǐng)域已知的方法獲得。舉例而言，平均值+/-2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差或平均值+/-3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍可用作標(biāo)準(zhǔn)值。所述對照水平可以與所測試的生物樣品同時確定，這通過使用先前從已知其疾病狀態(tài)(良好或不良預(yù)后)的患者在接受任何種類的治療之前采集并儲藏的樣品來實現(xiàn)。此外，所述對照水平可通過統(tǒng)計學(xué)方法基于通過分析之前確定的來自對照組樣品
31中0IP5表達水平來確定。進一步，所述對照水平可為源自先前測試的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。另外，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中0IP5基因的表達水平與從多種參照樣品確定的多種對照水平進行比較。優(yōu)選使用從與源自患者的生物樣品類似的組織類型所得的參照樣品確定的對照水平。根據(jù)本發(fā)明，0IP5基因的表達水平與良好預(yù)后對照水平的相似性顯示所述患者較理想的預(yù)后，而表達水平相對于良好預(yù)后對照水平的增加顯示較不理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復(fù)、存活和/或臨床后果的預(yù)后。另一方面，0IP5基因表達水平相比于不良預(yù)后對照水平的減少顯示患者較理想的預(yù)后，而與不良預(yù)后對照水平相似的表達水平顯示較不較理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復(fù)、存活和/或臨床后果的預(yù)后。當(dāng)相對對照水平表達水平變化超過1. 0,1. 5,2. 0,5. 0,10. 0或更多倍時，在生物樣品中0IP5基因表達水平可認為是改變了。所試生物樣品與對照水平間表達水平的差異可相對于對照，例如持家基因，加以標(biāo)準(zhǔn)化。舉例而言，已知其表達水平在癌性與非癌性細胞中不變的多核苷酸，包括那些編碼 β -肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶與核糖體蛋白Pl的基因，可用于標(biāo)準(zhǔn)化0ΙΡ5基因表達水平。表達水平可通過在源自患者的生物樣品中利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)錄物來確定。所述通過本方法檢測的基因轉(zhuǎn)錄物既包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也包括翻譯產(chǎn)物，例如 mRNA與蛋白質(zhì)。舉例而言，0IP5基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過使用針對基因轉(zhuǎn)錄物的0IP5基因探針進行雜交，例如Northern印跡雜交分析來加以檢測。所述檢測可在芯片或陣列上進行。對檢測多種基因包括0IP5的表達水平，優(yōu)選使用陣列。作為另一個示例，基于擴增的檢測方法， 例如使用對0IP5基因特異性的引物基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可用于檢測(參見實施例)。0IP5基因特異性探針或引物可使用常規(guī)技術(shù)參照0IP5基因的全序列(SEQ ID NO 13)設(shè)計和制備。舉例而言，在實施例中使用的引物(SEQ ID NO :1和2)可用于通過RT-PCR 檢測，但本方面并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與0IP5的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”指探針或載體會與其靶序列，但非其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件依賴于序列，且在不同情況下不同。觀察到長序列較之短序列在更高溫度下特異性雜交。一般而言，嚴(yán)格條件的溫度選為大約比特定序列在給定離子強度與PH值下的熱熔點(Tm)低大約5攝氏度。所述Tm是50%的互補于靶序列的探針與靶序列在平衡條件下雜交的溫度(在給定離子強度、PH與核酸濃度下)。因為所述靶序列通常過量存在，在Tm下50 %的探針在平衡時被占據(jù)。通常，嚴(yán)格條件是在該條件下鹽濃度低于大約1. OM鈉離子，通常為大約0.01到1.0M鈉離子(或其它鹽)在pH7.0 到8. 3處，且溫度對短探針或引物(例如，10到50核苷酸)為至少30攝氏度，而對較長探針與引物為至少大約60攝氏度。嚴(yán)格條件亦可通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達成。另外，本發(fā)明的評價可通過檢測翻譯產(chǎn)物來進行。舉例而言，可確定0IP5的量。確定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的量的方法包括使用特異性識別0IP5的抗體的免疫測定方法。 所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、SCFV、Fab、F(ab，)2、FV等等)可用于檢測，只要所述片段保留與0IP5蛋白的結(jié)合能力。 制備此類用于檢測蛋白的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，本發(fā)明中可以使用任何方法制備上述抗體及其等價物。作為另一種基于0IP5翻譯產(chǎn)物來檢測其基因的表達水平的方法，可通過免疫組織化學(xué)分析利用針對0IP5蛋白質(zhì)的抗體觀察其染色的強度。即，觀察到強染色表明0IP5 蛋白的存在增加，且同時表明0IP5基因的高表達水平。進一步，已知0IP5蛋白具有細胞增殖活性。因此，0IP5基因的表達水平可使用上述細胞增殖活性作為指標(biāo)確定。舉例而言，在生物樣品存在下制備并培養(yǎng)表達0IP5的細胞，隨后通過檢測增殖速度或評價細胞周期或集落形成能力，可確定所述生物樣品的細胞增殖活性。另外，除0IP5基因的表達水平外，亦可確定其它肺癌和/或食道癌相關(guān)基因，例如已知在肺癌和/或食道癌中有差異表達的基因，的表達水平，以提高所述評價的準(zhǔn)確性。上述其它的肺和/或食道細胞相關(guān)基因的實例包括那些于W02004/031413和W02005/090603 中描述的基因，以引用方式將上述文獻的內(nèi)容納入于本文中。此外，根據(jù)本發(fā)明，還可提供中間結(jié)果，附加其它測試結(jié)果以評價受試者的預(yù)后。 所述中間結(jié)果可協(xié)助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員評價、確定或估計受試者的預(yù)后?？膳c本發(fā)明所得中間結(jié)果結(jié)合考慮的其它信息包括受試者的臨床癥狀和身體狀況。需根據(jù)本方法評價癌癥預(yù)后的患者優(yōu)選為哺乳動物，包括人、非人靈長類、小鼠、 大鼠、犬、貓、馬和牛。腦赫、i平輔觀翩/丨丨赫衍去JM撤式撇本發(fā)明提供了診斷癌癥、評價癌癥預(yù)后、和/或監(jiān)測癌癥療法功效的試劑盒。所述癌癥優(yōu)選肺癌和/或食道癌。具體而言，所述試劑盒包含至少一種在源自患者的生物樣品中檢測0IP5基因表達的試劑，所述試劑可選自下組 (a)檢測0IP5基因的mRNA的試劑；(b)檢測0IP5的蛋白質(zhì)的試劑；和(c)檢測0IP5的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。適于檢測0IP5基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識別0IP5 mRNA的核酸，諸如具有與0IP5 mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對0IP5 mRNA 為特異性的引物與探針。可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸。如果需要，檢測0IP5 mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測 0IP5 mRNA的試劑。另一方面，適于檢測0IP5蛋白質(zhì)的試劑包括針對0IP5蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于檢測，只要所述片段保留與0IP5蛋白的結(jié)合能力。制備此類用于檢測蛋白的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且在本發(fā)明中可使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測0IP5 蛋白質(zhì)的試劑。
進一步，所述生物學(xué)活性可通過，例如，測量所述生物樣品中由于表達的0IP5蛋白而導(dǎo)致的細胞增殖活性來確定。舉例而言，在源自患者的生物樣品的存在下培養(yǎng)所述細胞，然后通過檢測增殖的速度，或測量細胞周期或集落形成能力，可確定所述生物樣品的生物學(xué)活性。如需要，用于檢測0IP5mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測0IP5蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。進一步，所述試劑盒可包括固體基質(zhì)以及用于結(jié)合針對0IP5基因的探針或針對0IP5蛋白的抗體的試劑，用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基與容器，陽性與陰性對照試劑，以及用于檢測針對0IP5蛋白的抗體的第二抗體。舉例而言， 從具有良好預(yù)后或不良預(yù)后的患者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)和用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、針頭、 注射器和帶有使用說明書的裝箱單(例如，書面的、磁帶、⑶-ROM等等)。這些試劑等包含在帶標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料制成，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個實施方案，當(dāng)所述試劑是針對0IP5 mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位點。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位點，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位點。 或者，對照位點可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位點上量較大而在接下來的位點上量較小。在加入樣品之后，顯示可檢測信號的位點的數(shù)量提供了樣品中存在的0IP5 mRNA量的定量指征。所述檢測位點可配置為任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或0IP5標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集0IP5陽性血液樣品，隨后分析其0IP5水平來制備。此外，可將純化的0IP5蛋白或多核苷酸添加到不含0IP5的血清中以形成所述陽性樣品或0IP5標(biāo)準(zhǔn)品。抗癌化合物的篩選在本發(fā)明的語境中，待通過本篩選方法鑒定的治療劑包括任何化合物或包含數(shù)種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細胞或蛋白的測試劑可以是單個化合物或多個化合物的組合。當(dāng)在方法中使用化合物組合時，各化合物可以順次或同時加以接觸。任何測試劑，例如，細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構(gòu)建體， 例如反義RNA、siRNA、核酶以及適體等等)以及天然化合物，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可使用本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來獲得本發(fā)明的測試劑，包括 (1)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要角軍卷禾只(deconvolution)白勺合成文庫法，(4) “一珠一化合物”(“one-bead one-compound")文庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文庫方法的例子可在本領(lǐng)域找到(DeWitt et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 6909-13 ；Erb et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al.，J Med Chem 37 :2678-85,1994；Choet al.，Science 1993,261 :1303-5 ；Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Care 11 et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 2061 ；Gallop et al.，JMed Chem 1994,37 :1233-51)?；衔镂膸炜商峁┯谌芤褐?參見Houghten，Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam,Nature 1991,354 :82-4)、 芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細菌上(美國專利5，223，409)、孢子上(美國專利 5,571,698 ;5，403，484 與 5，223，409)、質(zhì)粒上(Cull et al. , ProcNatl Acad Sci USA 1992,89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Sciencel990, 249 :386-90 ；Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ；美國專利申請 2002103360)。通過本發(fā)明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結(jié)構(gòu)通過添加、刪除、和/或置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的化合物，包括在通過本發(fā)明篩選方法鑒定的藥劑之內(nèi)。此外，當(dāng)所篩選的測試劑是蛋白質(zhì)時，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的 DNA。對所得的DNA確認其在制備治療或預(yù)防癌癥的候選物測試劑中的有用性。對本文描述的篩選有用的測試樣品亦可為特異性結(jié)合0IP5蛋白或其缺乏原蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性的部分肽的抗體。盡管測試劑文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，在下文中還是進一步提供了鑒定測試劑和構(gòu)建用于本篩選方法的這些測試劑的文庫的指導(dǎo)。( )分子建模對具有目標(biāo)性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)?IP5的分子結(jié)構(gòu)的知識為人們構(gòu)建測試劑文庫提供了便利。預(yù)篩選適于進一步評估的受試藥劑的途徑之一是利用對受試藥劑與其靶標(biāo)的相互作用進行計算機建模。計算機建模技術(shù)為選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會與該分子相互作用的新化合物的合理設(shè)計提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于來源于選定分子的χ-射線晶體分析或NMR成像的數(shù)據(jù)。分子動力學(xué)需要力場數(shù)據(jù)。計算機圖形系統(tǒng)為預(yù)測新化合物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以完善結(jié)合特異性提供了可能。為了預(yù)測當(dāng)分子和化合物之一或二者都發(fā)生細小改變時分子-化合物相互作用是什么樣的，需要分子力學(xué)軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯(lián)著分子設(shè)計程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個實例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構(gòu)建、修飾、可視化和分析。關(guān)于與特異蛋白相互作用的藥物的計算機建模已經(jīng)發(fā)表了多篇文獻，例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka,New Scientist 1988,54-8 ；McKinlay & Rossmann，Annu Rev Pharmacol Toxicioll989，29 :111-22 ；Perry & Davies，Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ;Lewis& Dean，Proc R Soc Lond 1989, 236 :125-40,141-62 ；以及關(guān)于核酸組分模型受體的 Askew et al. , JAm Chem Soc 1989，111 :1082-90。其它可篩選并圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計算機程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如 DesJarlais et al.，J Med Cheml988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993,259 1445-50 一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學(xué)技術(shù)基于鑒定出的推定抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)建任何數(shù)量的變體，如下所述。所得的推定抑制劑，或“測試劑”文庫可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定適合于治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防癌癥術(shù)后復(fù)發(fā)的測試劑，其中所述癌癥特別是肺癌和/或食道癌。(ii)組合化學(xué)合成測試劑的組合文庫可以作為合理藥物設(shè)計程序的一部分來制備，合理藥物設(shè)計程序涉及有關(guān)已知化合物中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識。這種策略使得文庫可以保持合理的規(guī)模，便于進行高通量篩選?；蛘?，可通過簡單地合成構(gòu)成文庫的分子家族的所有排列，構(gòu)建簡單的、特別短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個實例是由所有長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有6氨基酸序列排列。這種類型的文庫稱作線性組合化學(xué)文庫。組合化學(xué)文庫的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以通過化學(xué)或生物合成來產(chǎn)生。組合化學(xué)文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的化學(xué)。這些化學(xué)包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國專利5，觀8，514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、 苯并二氮卓和二肽(DeWittet al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :9217-8)，小化合物文庫的模擬有機合成(analogous organic synthese) (Chen etal.，J. Amer Chem Soc 1994,116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al.，Sciencel993, 261 :1303)，和 / 或Jft酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al.，JOrg Chem 1994，59 :658)，核酸文庫(見 Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995 supplement ；Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA)，肽核酸文庫(見例如美國專利 5，539，083)， 抗體文庫(見例如 Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996，14(3) :309-14 禾口 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如 Liang et al.，Science 1996,274 :1520-22 ； 美國專利5，593，853)，和有機小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Decl ；6 (6) :624-31 ；類異戊二烯(isoprenoids)，美國專利 5，569，588 ； 噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫雜氮雜環(huán)己烷(metathiazanone)，美國專利 5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美國專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美國專利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。
用于制備組合文庫的設(shè)備是可商購的(見例如357MPS，390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業(yè)可得的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。(iii)其它候詵另一種手段是使用重組細菌噬菌體來產(chǎn)生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott & Smith, Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad SciUSA 1990,87 6378-82 ；Devlin et al.，Science 1990，249 :404-6)，可以構(gòu)建非常大的文庫(例如 106-108個化學(xué)實體)。再一種手段主要使用化學(xué)方法，其實例包括Geysen方法(Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251 :767-73)。Furka 等(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ；Furka, Int J Peptide Protein Resl991，37 :487-93)，Houghten (美國專利 4，631，211)和 Rutter 等(美國專利5，010，175)記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。適體是由緊密結(jié)合特定分子靶的核酸構(gòu)成的大分子。Tuerk和GolcKScience. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通過指數(shù)式富集進行的配體系統(tǒng)性進化)方法來選擇適體。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫(例如IO15種不同分子)可用于篩選。0IP5結(jié)合化合物的篩選在本發(fā)明的語境中，在肺癌和/或食道癌中檢測出0IP5的過表達，雖然在正常器官中無表達(圖1A、B、D與2A)。因而，本發(fā)明提供了使用0IP5基因、所述基因編碼的蛋白篩選結(jié)合0IP5化合物的方法。由于肺癌和/或食道癌中0IP5的表達，與0IP5結(jié)合的化合物期待可阻抑癌細胞的增殖，并因此對治療或預(yù)防癌癥是有用的，其中所述癌癥是肺癌和/ 或食道癌。因此，本發(fā)明亦提供了使用0IP5多肽篩選阻抑癌細胞增殖和/或細胞侵襲的化合物的方法，以及篩選治療或預(yù)防癌癥的化合物的方法，其中所述癌癥特別是肺和/或食道癌。該篩選方法的一個實施方案包括以下步驟(a)將測試化合物與0IP5的多核苷酸所編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽與所述測試化合物之間的結(jié)合活性；和(c)選擇結(jié)合所述多肽的測試化合物。在本發(fā)明的語境中，治療效果可以與測試劑或化合物同0IP5蛋白的結(jié)合水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)某種測試劑或化合物結(jié)合0IP5蛋白時，可將所述測試劑或化合物鑒定或選擇為具有所需治療效果的候選劑或化合物?；蛘撸?dāng)某種測試劑或化合物不結(jié)合0IP5蛋白時，可將所述測試劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細地加以描述。用于篩選的0IP5多肽可為重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質(zhì)，或其部分肽。 與測試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為使用0IP5多肽來篩選蛋白質(zhì)，例如與0IP5多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多方法。上述篩選可通過，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式進行。在宿主(例如，動物)細胞等中通過將表達編碼0IP5多肽的基因插入外源基因表達載體，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. 1、pCAGGS與pCD8，來表達編碼0IP5多肽的基因。為此表達所用的啟動子可為任何通常使用的啟動子，包括，例如，SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed. ), Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 83-141 (1982))、EF-alpha啟動子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG啟動子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 啟動子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期啟動子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))、SV40 晚期啟動子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期啟動子 (Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989))、HSV TK 啟動子等等。將所述導(dǎo)入宿主細胞以表達外源基因可根據(jù)任何方法來實施，所述方法例如電穿孔方法((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15 131H6 (1987))、磷酸鈣方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987))、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984) ；Sussman and MiIman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984))、 Lipofectin 方法(Deri jard B. , Cell 76 1025-37 (1994) ；Lamb et al. , Nature Genetics 5 :22-30(1993) =Rabindran et al.，Science259 :230-4(1993))等等。對于由0IP5基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(表位)導(dǎo)入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達為包含該表位的融合蛋白?？梢允褂蒙唐坊谋砦?抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能夠利用其多克隆位點表達與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP) 形成的融合蛋白的載體是可以商購的。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通過導(dǎo)入僅由數(shù)個到十二個(adozen)氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備，使融合不會改變0IP5多肽的性質(zhì)?？梢允褂美缍嘟M氨酸(His-標(biāo)簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(Τ7-標(biāo)簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、Ε_標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等表位，以及識別它們的單克隆抗體作為篩選與0ΙΡ5多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90(1995))在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細胞裂解物內(nèi)形成免疫復(fù)合體。免疫復(fù)合體由0IP5多肽、具有與該多肽結(jié)合能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對上述表位的抗體之外，還可以使用針對0IP5多肽的抗體進行免疫沉淀，這樣的抗體可以如下文所述那樣制備。免疫復(fù)合體可以被沉淀，例如當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過蛋白A s印harose或蛋白Gs印harose將其沉淀。如果將由0IP5基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-S印har0Se4B，按照與使用針對0IP5的抗體的相同的方式來形成免疫復(fù)合體?？勺裱蚋鶕?jù)，例如，文獻中的方法來實施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結(jié)合蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與0IP5多肽結(jié)合的蛋白難以通過考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或mS-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標(biāo)記細胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列?？梢允褂肳est-Western 印跡分析法(Skolnik et al. ,Cell 65 :83-90(1991))作為利用0IP5多肽來篩選結(jié)合所述多肽的蛋白的方法。特別地，與0IP5多肽結(jié)合的蛋白可以通過如下方法獲得，從預(yù)期表達與0IP5多肽結(jié)合的蛋白的培養(yǎng)細胞利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達蛋白，將表達出的蛋白固定在濾膜上，使純化并且標(biāo)記的0IP5多肽與上述濾膜反應(yīng)，并依照標(biāo)記物來檢測表達與0IP5多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合0IP5 多肽或與0IP5多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體，來進行標(biāo)記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘撸诒景l(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻見“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，使本發(fā)明多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。從預(yù)期表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細胞制備cDNA文庫，使該文庫在被表達時與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將該cDNA文庫導(dǎo)入到上述酵母細胞中，并從檢測到的陽性克隆(當(dāng)酵母細胞表達可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時，兩者的結(jié)合可激活報告基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導(dǎo)入到大腸桿菌中并表達該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報告基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與0IP5基因編碼的多肽結(jié)合的化合物。例如，可以把本發(fā)明多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白的測試化合物施加到該柱上。這里的測試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在加載測試化合物之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結(jié)合于本發(fā)明多肽的化合物。當(dāng)測試化合物是蛋白質(zhì)時， 對所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選 cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測或定量結(jié)合化合物的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器時，可以僅使用微量并且沒有標(biāo)記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號的形式對本發(fā)明多肽與測試化合物間的相互作用進行實時的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，就有可能評估本發(fā)明多肽與測試化合物之間的結(jié)合。用于篩選當(dāng)固定的0IP5多肽暴露于合成化學(xué)化合物或天然物質(zhì)文庫或隨機噬菌體肽展示文庫時發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選方法(ffrighton et al.，Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan，Nature 384 :17-9 (1996))，不僅分離與0IP5蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分離與0IP5蛋
39白結(jié)合化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。阻抑0IP5牛物學(xué)活件的化合物的篩詵在本發(fā)明的語境中，0IP5蛋白特征在于具有促進肺癌和/或食道癌細胞的細胞增殖(圖3B)和細胞侵襲活性(圖9B)的活性。使用這種生物學(xué)活性作為指標(biāo)，本發(fā)明提供了篩選可阻抑癌細胞增殖和/或細胞侵襲的化合物的方法，以及篩選用于治療或預(yù)防癌癥的化合物的方法，其中所述癌癥特別是肺和/或食道癌。因此，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因相關(guān)的癌癥的化合物的方法，其包括下列步驟(a)將測試化合物與由0IP5的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測(a)所述多肽的生物學(xué)活性；(c)選擇與沒有測試化合物存在下測得的所述多肽的生物學(xué)活性相比，阻抑由 0IP5基因編碼的多肽的生物學(xué)活性的測試化合物。依照本發(fā)明，可評估測試化合物阻抑促進細胞增殖的活性的治療效果，或者候選化合物治療或預(yù)防與0IP5相關(guān)的癌癥(例如肺癌和/或食道癌)的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于阻抑細胞增殖的候選化合物或者用于治療或預(yù)防與0IP5相關(guān)的癌癥的候選化合物的方法，其使用0IP5多肽或其片段，包括以下步驟(a)將測試化合物與0IP5多肽或其功能性片段接觸；并(b)檢測步驟a)的所述多肽或片段的生物學(xué)活性；并(c)將(b)的生物學(xué)活性與所述測試劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明的語境中，治療效果可以與0IP5多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比，該測試劑或化合物抑制0IP5多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時，可將所述測試劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選劑或化合物?；蛘?，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比，該測試劑或化合物不阻抑或抑制0IP5多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時，可將所述測試劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明所述方法將在下面更加詳細的加以描述。任何多肽均可用于篩選，只要它們阻抑0IP5蛋白的生物學(xué)活性即可。這樣的生物學(xué)活性包括0IP5蛋白的細胞增殖活性。舉例而言，可使用0IP5蛋白，亦可使用與這些蛋白功能上等價的多肽。上述多肽可由細胞內(nèi)源或外源地表達。通過本篩選分離的化合物是0IP5基因編碼多肽的拮抗劑的候選物。術(shù)語“拮抗劑”是指可以通過結(jié)合多肽而抑制多肽功能的分子。此術(shù)語還指可降低或抑制編碼0IP5的基因的表達的分子。而且，通過本篩選分離的化合物是如下化合物的候選物，所述化合物抑制0IP5多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內(nèi)相互作用。當(dāng)本方法中要檢測的生物學(xué)活性是細胞增殖時，可以通過例如如下方法進行檢測制備表達0IP5多肽的細胞，在測試化合物的存在下培養(yǎng)細胞，確定細胞增殖速度，測量細胞周期等，以及通過測量存活細胞或集落形成活性，例如圖3所示。選擇降低表達0IP5 的細胞的增殖速度的化合物作為治療或預(yù)防肺癌和/或食道癌的候選化合物。更具體而言，該方法包括以下步驟(a)使測試化合物與表達0IP5的細胞接觸；(b)測量細胞增殖活性；并
(c)選擇與沒有測試化合物存在下的細胞增殖活性相比降低細胞增殖活性的測試化合物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可進一步包括以下步驟(d)選擇對不或很少表達0IP5的細胞沒有影響的測試化合物。短語“阻抑生物學(xué)活性”在此定義為較之不存在所述化合物時，對0IP5的生物學(xué)活性優(yōu)選至少10 %的阻抑，較優(yōu)選至少25 %、50 %或75 %的阻抑，且最優(yōu)選至少90 %的阻抑。改變0IP5表汰的化合物的篩詵在本發(fā)明中，SiRNA減少0IP5表達導(dǎo)致癌細胞增殖的抑制(圖3A)，而且OIP過表達的升高導(dǎo)致促進細胞侵襲。因而，本發(fā)明提供了篩選抑制0IP5表達的化合物的方法。抑制0IP5表達的化合物可望能夠阻抑癌細胞增殖和/或細胞侵襲，并由此可用于治療或預(yù)防與0IP5相關(guān)的癌癥，其中所述癌癥特別是肺和/或食道癌。因此，本發(fā)明亦提供了篩選阻抑癌細胞增殖的化合物的方法，以及篩選治療或預(yù)防與0IP5相關(guān)的癌癥的化合物的方法， 其中所述癌癥是肺和/或食道癌。在本發(fā)明的語境下，上述篩選可包括，例如，下列步驟(a)將候選化合物與表達0IP5的細胞接觸；并(b)選擇與對照相比減少0IP5表達水平的候選化合物。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細的加以描述。表達0IP5的細胞包括，例如，自肺癌和/或食道癌建立的細胞系或經(jīng)0IP5表達載體轉(zhuǎn)染的細胞系；任何這樣的細胞可用于上述本發(fā)明的篩選?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如，RT-PCR、Northern印跡分析、Western印跡分析、免疫染色與流式細胞分析來估計表達水平。在此定義的“降低表達水平”優(yōu)選為較之在所述化合物不存在時的表達水平，至少使0IP5表達降低至少10%，更優(yōu)選降低至少25%、50%或75%，最優(yōu)選降低至少 95%的水平。在此的化合物包括化學(xué)化合物、雙鏈核苷酸等等。在前面描述了雙鏈核苷酸的制備。在篩選方法中，可選擇降低0IP5表達水平的化合物作為治療或預(yù)防肺癌和/或食道癌的候選化合物。或者，本發(fā)明的所述篩選方法可包括下列步驟(a)將候選化合物與導(dǎo)入了包含0IP5轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域控制下表達的報道基因的載體的細胞接觸；(b)測量所述報道基因的表達或活性；并(c)選擇降低所述報道基因表達或活性的候選化合物。依照本發(fā)明，可評估測試劑或化合物抑制細胞生長或者候選劑或化合物治療或預(yù)防0IP5相關(guān)疾病的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于阻抑癌細胞增殖的候選劑或化合物的方法和篩選用于治療或預(yù)防0IP5相關(guān)疾病的候選劑或化合物的方法。在本發(fā)明的語境中，此類篩選包括例如以下步驟a)使測試劑或化合物與其中導(dǎo)入了載體的細胞接觸，該載體包含0IP5基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報道基因b)檢測所述報道基因的表達或活性；并c)將b)的表達水平與所述測試劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明的語境中，治療效果可以與所述報道基因的表達或活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比該測試劑或化合物降低所述報道基因的表達或活性時，所述測試劑或化合物可鑒定或選擇為具有治療效果的候選劑或化合物?；蛘?，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比該測試劑或化合物不降低所述報道基因的表達或活性時，所述測試劑或化合物可鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。合適的報道基因和宿主細胞在本領(lǐng)域是眾所周知的。例示性的報道基因包括但不限于螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)紅色熒光蛋白(DsRed)、 氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、Laz與beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主細胞為C0S7、 HEK293、HeLa等。所述篩選所需的報道構(gòu)建體可通過將報道基因序列與0IP5轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。本文所述的0IP5轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域包括從轉(zhuǎn)錄起始位點開始至少500bp上游的區(qū)域，優(yōu)選lOOObp，較優(yōu)選5000或IOOOObp上游。含有所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的核苷酸片段可從基因組文庫中分離出來，或可通過PCR擴增。所述篩選所需的報道構(gòu)建體可通過將報道基因序列與這些基因中任一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。識別轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的方法，以及其測定法規(guī)程都是眾所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。用含有所述報道構(gòu)建體的載體感染宿主細胞，且用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測報道基因的表達或活性(例如，使用照度計(luminometer)、吸收光譜儀、流式細胞儀等等)。 在此定義的“降低表達或活性”優(yōu)選為較之在所述化合物不存在時，報道基因的表達或活性被降低至少10 %，更優(yōu)選地，至少降低25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地，降低至少95 %。使用0IP5和Rafl的結(jié)合作為指標(biāo)的篩選在本發(fā)明中，通過下拉測定法(圖9C)顯示了 0IP5與Rafl蛋白的直接相互作用。 0IP5蛋白的下拉是使用抗His抗體和經(jīng)溫育的帶His標(biāo)簽的0IP5與GST融合的重組Rafa 蛋白的混合物進行的。結(jié)合0IP5的Rafl蛋白通過后續(xù)的使用針對Rafl的多克隆抗體的 Western印跡來檢測(圖9C)。因而，本發(fā)明提供了篩選抑制0IP5與Rafl之間結(jié)合的化合物的方法。抑制0IP5蛋白與Rafl蛋白之間結(jié)合的化合物可通過檢測0IP5蛋白與Rafl蛋白之間的結(jié)合水平作為指標(biāo)來篩選。因此，本發(fā)明提供了使用0IP5蛋白與Rafl蛋白之間結(jié)合水平作為指標(biāo)，篩選用于抑制0IP5蛋白與Rafl蛋白之間結(jié)合的化合物的方法。抑制0IP5 蛋白與Rafl蛋白之間結(jié)合的化合物預(yù)期通過使0IP5蛋白失穩(wěn)來阻抑癌細胞增殖和/或細胞侵襲。因而，本發(fā)明亦提供篩選用于抑制或降低表達0IP5基因的癌細胞(例如肺癌細胞和/或食道癌細胞)生長的候選化合物和因此用于治療或預(yù)防癌癥(例如肺癌和/或食道癌)的候選化合物的方法。另外，通過本篩選方法獲得的化合物亦可用于抑制細胞侵襲。本發(fā)明特別感興趣的是下述[1]到[5]的方法[1] 一種篩選破壞0IP5多肽與Rafl多肽之間結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)使0IP5多肽或其功能性等同物與Rafl多肽或其功能性等同物在測試化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合水平；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在沒有測試化合物存在下檢測到的結(jié)合水平；并(d)選擇降低所述結(jié)合水平的測試化合物。[2] 一種篩選可用于治療或預(yù)防癌癥，或者抑制癌細胞生長和/或細胞侵襲的藥劑或化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)使0IP5多肽或其功能性等同物與Rafl多肽或其功能性等同物在測試化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合水平；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在沒有測試化合物存在下檢測到的結(jié)合水平；并(d)選擇降低所述結(jié)合水平的測試化合物。[3] [1]或[2]的方法，其中0IP5的功能性等同物包括Rafl結(jié)合域。[4] [1]或[2]的方法，其中Rafl的功能性等同物包括0IP5結(jié)合域。[5] [1]的方法，其中所述癌癥選自下組肺癌和食道癌。在本發(fā)明的語境中，0IP5和Rafl多肽的功能性等同物分別為具有與0IP5多肽 (SEQ ID NO 14) ,Rafl多肽(SEQ ID NO 18)等同的生物學(xué)活性的多肽。特別地，0IP5的功能性等同物為含有針對Rafl的結(jié)合域的多肽片段，諸如SEQ ID NO :14的氨基酸序列。類似地，Rafl的功能性等同物為SEQ ID NO 17的包括0IP5結(jié)合域的多肽片段。作為篩選抑制0IP5與Rafl結(jié)合的化合物的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法。用于篩選的多肽可為重組多肽，或者是來自自然來源的蛋白質(zhì)，或其部分肽。上述任何測試化合物可用于篩選。作為檢測0IP5蛋白與Rafl蛋白之間結(jié)合的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法。此類檢測可使用例如免疫沉淀、Wiest-Western印跡分析(Skolnik et al.，Cell 65 :83-90 (1991))、利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system"，" Mammalian MATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit"，" MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ； " HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene)；參考文 KB" Dalton and Treisman, Cell 68 :597-612(1992) “ ， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)")、親和層析，以及利用表面等離振子共振現(xiàn)象的生物傳感器來進行。在一些實施方案中，本篩選方法可以使用表達0IP5多肽和Rafl多肽二者的細胞以基于細胞的測定法進行。表達0IP5蛋白和Rafl蛋白的細胞包括例如自癌癥(例如肺癌和/或食道癌)建立的細胞系?；蛘?，所述細胞可以通過用編碼0IP5和Rafl蛋白的核苷酸轉(zhuǎn)化細胞來制備。此類轉(zhuǎn)化可使用編碼0IP5和Rafl 二者的表達載體，或者編碼0IP5或 Rafl任一的表達載體來進行。本篩選方法可通過在測試化合物存在下溫育此類細胞來進行。0IP5蛋白與Rafl蛋白的結(jié)合可使用抗0IP5抗體或抗Rafl抗體通過免疫沉淀測定法來檢測。依照本發(fā)明，可評估測試劑或化合物抑制細胞生長或者候選劑或化合物治療或預(yù)防與0IP5相關(guān)的癌癥(例如肺癌和食道癌)的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于阻抑細胞增殖的候選劑或化合物或者用于治療或預(yù)防癌癥(例如肺癌和食道癌)的候選劑
43或化合物的方法，所述方法使用0IP5多肽或其功能性等同物，包括以下步驟(a)使0IP5多肽或其功能性等同物與Rafl多肽或其功能性等同物在測試劑或化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合水平；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與沒有測試劑或化合物存在下檢測到的結(jié)合水平；并(d)將(C)的結(jié)合水平與測試劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與0IP5蛋白與Rafl蛋白之間的結(jié)合水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比，該測試劑或化合物阻抑所述多肽之間的結(jié)合水平時，可將所述測試劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選劑或化合物?；蛘?，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比，該測試劑或化合物不阻抑或抑制所述多肽之間的結(jié)合水平時，可將所述測試劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。阻抑0IP5磷酸化的化合物的篩詵在本發(fā)明中，證明了 Rafl蛋白對0IP5蛋白的磷酸化可促成0IP5多肽的穩(wěn)定化 (圖8C)，而且因此它可能在癌細胞生長中具有至關(guān)重要的作用。因而，預(yù)期可抑制Rafl蛋白對0IP5蛋白的磷酸化的化合物對于抑制癌細胞生長和/或細胞侵襲是有用的，而且因此可以是用于治療或預(yù)防涉及0IP5過表達的癌癥(例如肺癌或食道癌)的候選化合物。因此，本發(fā)明還提供使用0IP5磷酸化水平作為指標(biāo)，篩選用于阻抑細胞增殖和/ 或細胞侵襲的候選化合物或者用于治療或預(yù)防涉及0IP5過表達的癌癥候選化合物的方法。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如下列步驟(a)使0IP5多肽或其功能性等同物與Rafl多肽或其功能性等同物在測試化合物存在下在適合于0IP5多肽磷酸化的條件下接觸；(b)檢測0IP5多肽的磷酸化水平；(c)比較步驟(b)中的磷酸化水平與在沒有測試化合物存在下檢測到的磷酸化水平；并(d)選擇降低0IP5多肽磷酸化水平的測試化合物。依照本發(fā)明，可評估測試劑或化合物抑制細胞生長或者候選劑或化合物治療或預(yù)防0IP5相關(guān)疾病(例如肺癌和食道癌)的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供篩選阻抑乳腺癌細胞增殖的候選劑或化合物的方法和篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的候選劑或化合物的方法。更具體而言，該方法包括以下步驟(a)使0IP5蛋白與Rafl蛋白在測試劑或化合物存在下接觸；(b)檢測0IP5蛋白的磷酸化水平；(c)比較0IP5蛋白的磷酸化水平與沒有測試劑或化合物存在下檢測到的磷酸化水平；并(d)將C)的磷酸化水平與測試劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與0IP5蛋白的磷酸化水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比該測試劑或化合物降低0IP5蛋白的磷酸化水平時，可將所述測試劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選劑或化合物?；蛘?，當(dāng)與沒有某種測試劑或化合物存在下檢測到的水平相比該測試劑或化合物不降低0IP5蛋白的磷酸化水平時，可將所述測試劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。在本發(fā)明的語境中，0IP5或Rafl多肽的功能性等同物分別為具有與0IP5多肽 (SEQ ID NO 14)或Raf 1多肽(SEQ ID NO 18)等同的生物學(xué)活性的多肽。如本文中使用的，短語“功能性等同物”與“基因或蛋白”項中描述的含義相同。作為篩選抑制Rafl多肽對0IP5多肽的磷酸化的化合物的方法，可使用本領(lǐng)域已知的任何方法。在本發(fā)明的語境中，適合于0IP5多肽磷酸化的條件可通過在磷酸供體(例如ATP)存在下溫育分離的0IP5多肽與分離的Rafl多肽來提供。適合于Rafl對0IP5的磷酸化的條件還包括培養(yǎng)表達0IP5多肽和fefl多肽二者的細胞。例如，此類細胞可以是內(nèi)源表達0IP5和Rafl的細胞，諸如癌細胞(例如肺癌細胞、食道癌細胞)，或攜帶包含編碼 0IP5多肽和/或Rafl多肽的多核苷酸的表達載體的轉(zhuǎn)染細胞。在測試化合物存在下溫育分離的多肽或表達多肽的細胞之后，可使用試劑，諸如識別磷酸化0IP5的抗體，來檢測0IP5多肽的磷酸化水平。例如，可應(yīng)用免疫測定法或 Western印跡測定法來檢測0IP5多肽的磷酸化狀態(tài)。在檢測磷酸化的0IP5之前，可將0IP5多肽與其它成分分開。例如，凝膠電泳可用于將0IP5多肽與其余組分分開?；蛘撸赏ㄟ^具有抗LGN/GPSM2抗體的載體來捕捉0IP5多肽。或者，可如下檢測0IP5多肽的磷酸化水平，即溫育分離的0IP5多肽和Rafl多肽或者表達這些多肽的細胞與經(jīng)過標(biāo)記的磷酸供體，然后對標(biāo)記物示蹤。例如，當(dāng)使用放射性標(biāo)記的ATP (例如32P-ATP)作為磷酸供體時，將分出的0IP5多肽的放射性與0IP5多肽的磷酸化水平關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明的背景中，可鑒定出具有治療或預(yù)防癌癥的潛力的候選化合物。這些候選化合物的治療潛力可通過二次和/或更進一步篩選來評估以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當(dāng)結(jié)合0IP5蛋白的化合物抑制癌癥的上文所述活性時，可得出結(jié)論此類化合物具有 0IP5特異性治療效果。本發(fā)明的樣態(tài)在下述實施例中加以描述，它們并無意對權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進行限定。除非另行定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的意義相同。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實踐或測試本發(fā)明。
實施例本發(fā)明將于下列實施例中進一步加以描述，其并不對權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍構(gòu)成限定。材料和方法細胞系與組織樣品此研究中使用的15種人肺癌細胞系包括5種腺癌(ADC) (A549, LC319，PC-14， NCI-H1373，和 NCI-H1781)、5 種鱗狀細胞癌(SCC) (SK-MES-1，LU61, NCI-H520，NCI-H1703，和 NCI-H2170)、1 種大細胞癌(LCC) (LXl)、和 4 種小細胞肺癌(SCLC) (DMS114，DMS273， SBCUP SBC-5)。此研究中使用的人食道癌細胞系如下9種SCC細胞系(TEl，TE2，TE3， TE4，TE5，TE6，TE8，TE9JPTE10)和 1 種 ADC 細胞系(TE7) (Nishihira T，et al.，J Cancer Res Clin 0ncoll993 ;119 :441-9)。所有的細胞均于合適的補充有10%胎牛血清(FCS) 的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)，且保持在37攝氏度下含5% CO2的濕潤空氣中。用作正常對照的人類小氣道上皮細胞(SAEC)在經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基(SAGM) (Cambrex Bio Science he.)中培養(yǎng)。原代肺癌和ESCC樣品是先前獲取的。此研究和所述所有臨床材料的使用已經(jīng)得到了相關(guān)機構(gòu)倫理委員會的批準(zhǔn)。臨床分期根據(jù)UICC Μ分級法(Sobin L and Wittekind Ch. 6th ed. New York =Wiley-Liss ；2002)來判斷。用于組織微陣列免疫染色的經(jīng)福爾馬林固定的原代肺腫瘤以及鄰近的正常肺組織樣品已從在Hokkaido University (Sapporo, Japan)接受了根治性手術(shù)的279名患者(161名ADC,96名SCCU8名LCC,4名ASC ；96名女性和183名男性患者；中值年齡63. 3，范圍26-84歲)獲取?？偣?80份經(jīng)福爾馬林固定的原代ESCC(27份女性和253份男性患者；中值年齡61. 5，范圍38-82歲)以及鄰近的正常食道組織樣品亦已從在Keiyukai Sapporo Hospital (Sapporo, Japan)接受了根治性手術(shù)的患者獲取。另外，用于組織微陣列免疫染色的總共336例NSCLCd-IIIA期；201例 ADCUOl例SCC,23例LCCUl例ASC ；103名女性禾口 233名男性患者；中值年齡66. 0歲，范圍四-85歲)和正常肺組織樣品亦已從Saitama Cancer Center (Saitama, Japan)獲取。 這些患者接受了他們的原發(fā)癌切除，而且他們之中只有具有陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者在他們的手術(shù)后接受了基于鉬的輔助化療治療。經(jīng)福爾馬林固定的原代221份ESCCd-IVA期；21 名女性和200名男性患者；中值年齡62歲，范圍44-79歲)以及鄰近的正常食道組織樣品已從在Keiyukai Sapporo Hospital (Sapporo, Japan)接受了根治性手術(shù)的患者獲取。76 份ESCCd-IVB期；13名女性和63名男性患者；中值年齡63，范圍38-84歲)以及鄰近的正常食道組織樣品亦已從在Hokkaido University及其附屬醫(yī)院(Sapporo，Japan)接受了根治性手術(shù)的患者獲取。此研究和所有臨床材料的使用已經(jīng)各機構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)。半定量RT-PCR使用Trizol 試劑(Life Technologies, Inc.，Gaithersburg, MD)依照制造商的方案從培養(yǎng)細胞與臨床組織中抽提總RNA。用DNase I (Nippon Gene, Tokyo, Japan)處理抽提的RNA與正常人類組織多聚(A)RNA，并使用寡聚(dT)引物與SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad, CA)進行逆轉(zhuǎn)錄。半定量RT-PCR實驗通過下列組針對0IP5特異性的引物或作為內(nèi)部對照的ACTB特異性引物加以實施。0IP5 5' -CTTCAAGAATGGAGGGGAAA-3‘ (SEQ ID NO :1)與5' -GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3‘ (SEQ ID NO 2)；ACTB 5' -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3‘ (SEQ ID NO 3)與5' -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3‘ (SEQ ID NO :4)。優(yōu)化PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)以保證產(chǎn)物的強度在擴增的對數(shù)期內(nèi)。Northern 印跡分析將人類多組織印跡(BDBiosciences Clontech, Palo Alto，CA)與標(biāo)記的 0IP5PCR產(chǎn)物雜交。0IP5的cDNA探針通過RT-PCR用下述引物制備5' -CCAGTGACAAAATGGTGTGC-3‘ (SEQ ID NO :5)，與
5' -GTATTCATAACAACTGCTCCATGC-3‘ (SEQ ID NO :6)。預(yù)雜交、雜交與漂洗遵循生產(chǎn)商的推薦進行。所述印跡在-80°C用增感屏放射自顯影1周°Western 印跡腫瘤組織或細胞在裂解緩沖液50mMTris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl,0. 5% NP40，0. 5%脫氧膽酸鈉，和蛋白酶抑制劑混合物集III(Calbi0Chem)中裂解。如先前所述 (Kato T, et al.，Cancer Res 2005 ;65 :5638-46)，使用增強型化學(xué)發(fā)光 Western 印跡分析系統(tǒng)(GE Healthcare Biosciences) 0使用肺癌和食道癌細胞系以及正常氣道上皮細胞的溶胞物通過Western印跡分析確認了商品化的針對人0IP5的家兔多克隆抗體(目錄號 12142-1-AP, Proteintech group. Inc.)是對內(nèi)源 0IP5 蛋白特異性的。免疫細胞化學(xué)將培養(yǎng)的細胞用4%多聚甲醛固定，并用含有0. I^Triton X-100的PBS于室溫透化3分鐘。于室溫用CASBLOCK(ZYMED)覆蓋細胞10分鐘以封閉非特異性結(jié)合。然后將細胞與在含有BSA的PBS中稀釋的一抗一起于室溫溫育60分鐘。用PBS清洗后，將免疫偶聯(lián)物用綴合有Alexa 488的山羊抗家兔二抗(Invitrogen)染色。每份標(biāo)本用含有4'， 6' -二脈基-2'-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的 Vectashield(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)封固，并用 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2A0B S :Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)顯現(xiàn)。 免疫組織化學(xué)和組織微陣列分析如先前公開的，使用福爾馬林固定的NSCLC構(gòu)建腫瘤組織微陣列(ChinSF，et al.，Mol Pathol 2003 ；56 :275-9,Callagy G, et al.，Diagn Mol Pathol2003 ；12 :27-34, Callagy G，et al. J Pathol 2005;205:388-96)?；谂c在載玻片上對應(yīng)的H&E染色切片目視對準(zhǔn)，選取用于取樣的組織區(qū)域。將三個、四個或五個取自供體腫瘤塊的組織芯(直徑0. 6mm ；高度，3-4mm)用微陣列點樣器(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)置入受體石蠟塊中。從每個病例中打孔取出正常組織芯。將所得微陣列塊的5微米切片用于免疫組織化學(xué)分析。三個獨立的調(diào)查者在事先不知曉臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的情況下半定量地評估了 0IP5陽性。只有在評議者都斷定為陽性時才可以判定肺癌為陽性。為了調(diào)查0IP5過表達在臨床NSCLC中的顯著性/意義，將組織切片使用 ENVISION+試劑盒 / 辣根過氧化物酶(HRP ;DakoCytomation，Glostrup，Denmark)染色。在封閉內(nèi)源過氧化物酶和蛋白之后添加0IP5抗體(Proteintech group. Inc.)，并將每個切片與HRP標(biāo)記的抗家兔IgG(作為二抗)一起溫育。添加底物-色原體，并將標(biāo)本用蘇木精復(fù)染色。統(tǒng)計分析使用列聯(lián)表來分析NSCLC患者中0IP5表達與臨床病理變量之間的相關(guān)性。計算從手術(shù)之日到NSCLC相關(guān)的死亡之時，或到最后-次隨訪之時的腫瘤特異生存曲線。對每個相關(guān)變量及0IP5表達計算Kaplan-Meier曲線。病人亞組之間存活時間的差異用時序檢驗(log rank test)進行分析。用Cox相對風(fēng)險回歸模型進行單變量和多變量分析以確定臨床病理學(xué)變量與癌癥相關(guān)死亡率之間的聯(lián)系。首先，分析死亡與可能的預(yù)后因素，包括年齡、性別、組織學(xué)類型、PT分類以及pN分類之間的關(guān)系，每次考慮一個因素。其次，將多變量Cox分析應(yīng)用于反向(分步的)過程，其中總是將0IP5表達，以及任何及所有滿足P值小于0. 05準(zhǔn)入水平的變量強制引入該模型。當(dāng)所述模型繼續(xù)增加因素時，獨立因素未超過 P < 0. 05的退出水平。RNA干擾測定使用30 微升 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，Carlsbad，CA)依照制造商的方案將小干擾 RNA(siRNA)雙鏈體(Dharmacon, Inc.，Lafayette, CO) (IOOnM)轉(zhuǎn)染到 NSCLC細胞系A(chǔ)549中。將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)7日；通過吉姆薩染色對集落數(shù)目計數(shù)；并在處理后7天用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯四唑溴化物(MTT)測定(細胞計數(shù)試劑盒-8溶液；Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)評價細胞的存活力。為驗證0IP5mRNA表達的阻抑，用上述的對0IP5具有特異性的合成引物進行半定量RT-PCR 實驗。用于RNA干擾的合成寡核苷酸的靶序列如下對照1(螢光素酶/LUC 螢火蟲 (Photinus pyralis)螢光素酶基因)5 ‘ -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3 ‘ (SEQ ID NO 7)； 對照 2 (On-Target plus/CNT ；Dharmacon Inc.) 5 ‘ -UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘ (SEQ ID NO 8) ；siRNA-0IP5-l 5 ‘ -CGGCAUCGCUCACGUUGUGUU-3 ‘ (SEQ ID N0: 9) ；siRNA-0IP5-2 5 ‘ -GUGACAAAAUGGUGUGCUAUU-3 ‘ (SEQ ID NO 10)； siRNA-Rafl-1 5 ‘ -GCAAAGAACAUCAUCCAUA—3 ‘ (SEQID N0 15)；禾Π siRNA-Rafl-2 5' -GACAUGAAAUCCAACAAUA-3‘ (SEQ IDNO 16)。細胞生長測定將經(jīng)設(shè)計成表達0IP5的質(zhì)粒(pcAGGSn3FC-0IP5-Flag)或模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 C0S-7細胞以IxlO6個細胞/IOOmm皿的密度鋪板。將細胞在含有0. 4mg/ml遺傳霉素 (Invitrogen)的培養(yǎng)基中選擇7天，并通過MTT測定法(細胞計數(shù)試劑盒_8溶液；Dojindo Laboratories)評估細胞數(shù)目?；|(zhì)膠(Matrigel)侵襲測定用表達0IP5的p3XFLAG-標(biāo)簽質(zhì)粒(pcAGGSn3FC-0IP5_Flag)或用模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C0S-7細胞在含10% FCS的DMEM中生長至接近匯合。通過胰蛋白酶消化收集細胞，用未添加血清或蛋白酶抑制劑的DMEM清洗，并以IxlO5細胞/ml的濃度懸浮在DMEM中。在制備細胞懸液之前，將基質(zhì)膠基質(zhì)(Becton Dickinson Labware)的干燥層用DMEM在室溫下復(fù)水2小時。向M孔基質(zhì)膠侵襲室的每個下部小室中添加含有10% FCS的DMEM(0. 75ml)， 并向每個上部小室插入物中添加0.5ml (5X104細胞/ml)細胞懸液。將插片的板于37°C溫育對小時。溫育后，處理室；如供應(yīng)商(Becton Dickinson Labware)所指導(dǎo)地固定侵襲通過基質(zhì)膠的細胞，并用吉姆薩染色。MM肺癌和食道癌及正常組織中的0IP5表達。為了為肺癌和食道癌鑒定開發(fā)新治療劑的靶分子和/或生物標(biāo)志物，使用cDNA微陣列實施了肺癌和ESCC的基因組范圍表達序型分析(Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53, Kikuchi T, et al. ， Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, et al. ， Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, et al. ， Hum Mol Genet2004 ；13 :3029-43, Kikuchi Τ, et al.， Int J Oncol 2006 ；28 :799-805, Taniwaki M, etal. ， Int J Oncol 2006 ；29 :567-75, YamabukiT, et al.，Int J 0ncol2006 ;28 1375-84)。在所篩選的 27，648 種基因中，在絕
48大多數(shù)所檢查的肺癌和食道癌樣品中鑒定到0IP5轉(zhuǎn)錄物的升高的表達(3倍或更高)。它的過表達通過半定量RT-PCR實驗在15個肺癌組織中的9個、15個肺癌細胞系中的15個、 10種ESCC組織中的6個、及10個ESCC細胞系中的9個中得到證實(圖IA和1B)。肺癌和食道癌細胞系中高水平的0IP5表達使用抗0IP5抗體通過Wfestern印跡分析得到了進一步證實(圖5A)。0IP5蛋白通過Western印跡作為雙帶被檢測出，指示0IP5蛋白的可能修飾。因此，將來自過表達內(nèi)源0IP5的SBC-5細胞和經(jīng)0IP5表達質(zhì)粒(pcAGGSn3FC-0IP5-Flag)轉(zhuǎn)染的C0S-7細胞的提取物在蛋白磷酸酶(New England Biolabs)存在或不存在下溫育，并通過Wfestern印跡分析來分析0IP5蛋白的分子量。經(jīng)磷酸酶處理的提取物中內(nèi)源和外源0IP5蛋白二者大部分的測量分子量比未處理細胞中的要小。數(shù)據(jù)指示0IP5可能在細胞中被磷酸化(圖4)。進行了免疫熒光分析來檢查內(nèi)源0IP5 在肺癌細胞系SBC-5中的亞細胞定位，而且發(fā)現(xiàn)0IP5位于核和胞質(zhì)中(圖1C、圖5B)。使用0IP5cDNA作為探針的Northern印跡分析只在所檢查的16種組織(圖1D)或23種組織 (圖6A)中的睪丸中鑒定出與1.5-1Λ轉(zhuǎn)錄物對應(yīng)的強信號。另外，使用抗OIP多克隆抗體通過免疫組織化學(xué)將六種正常組織(肝、心、腎、肺、食道和睪丸)中的0IP5蛋白表達與肺癌和食道癌中的比較。在睪丸細胞及肺癌和食道癌細胞的核和胞質(zhì)中檢測到豐富的0IP5 ； 然而，它的表達在其余五種正常組織中幾乎檢測不到(圖6B)。在肺癌組織中獲得的抗0IP5 抗體陽性信號因抗體與重組人0IP5 —起預(yù)溫育而減弱，指示它對0IP5蛋白的高度特異性 (圖 9A)。NSCLC患者和ESCC中0IP5表達與差預(yù)后的關(guān)聯(lián)然后檢查手術(shù)切除的NSCLC中的0IP5表達與多種臨床病理變量的關(guān)聯(lián)。為了檢驗0IP5的臨床病理意義，另外借助含有來自419名接受了根治性手術(shù)切除的患者的肺癌組織的組織微陣列來檢查0IP5蛋白的表達。在262份ADC腫瘤中的163份(62. 2% )和157 份非ADC腫瘤中的139份(88.5%)中找到了陽性染色(圖2A)。然后檢查0IP5表達(陽性對陰性)與多種臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)了它與組織學(xué)的顯著關(guān)聯(lián)(在非腺癌中較高；P < 0. 0001，卡方檢驗；表1)。Kaplan-Meier法指示NSCLC中的0IP5狀態(tài)(陽性對陰性)與腫瘤特異性存活率之間的顯著關(guān)聯(lián)(0IP5陽性病例中的存活期較短；P = O. 0099，時序檢驗；圖2B)。通過單變量分析，組織學(xué)(腺癌對非腺癌)、腫瘤大小(pTl對pT2-4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pNO對pNl-3)、年齡(< 65歲對z65歲)、性別(女性對男性)、和0IP5陽性(陰性對陽性)都與NSCLC患者的腫瘤特異性存活顯著相關(guān)(表幻。另外，使用Cox比例風(fēng)險模型進行的多變量分析指示PT階段、pN階段、年齡、和陽性0IP5染色是NSCLC的獨立預(yù)后因素(表2)。表 1NSCLC組織中的0IP5陽性與患者的特征之間的關(guān)聯(lián)(n = 419)
權(quán)利要求
1.一種用于診斷肺癌和/或食道癌的方法，所述方法包括下列步驟(a)通過選自下組的任一方法測定源自受試者的生物樣品中0IP5基因的表達水平； ⑴檢測0IP5基因的mRNA，(ii)檢測由0IP5基因編碼的蛋白，和(iii)檢測由0IP5基因編碼的蛋白的生物學(xué)活性；并(b)將步驟(a)中測得的表達水平與基因的正常對照水平相比的升高與肺癌和/或食道癌的存在關(guān)聯(lián)起來。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)中測得的表達水平比正常對照水平高至少10%。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)測得的表達水平是通過檢測針對0IP5蛋白的抗體的結(jié)合來測定的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中源自受試者的生物樣品包括活檢物。
5.一種用于評估或確定患有肺癌和/或食道癌的患者的預(yù)后的方法，該方法包括下列步驟(a)檢測源自患者的生物樣品中0IP5基因的表達水平；(b)將檢測得到的表達水平與對照水平比較；并(c)基于(b)的比較來確定患者的預(yù)后。
6.權(quán)利要求5的方法，其中對照水平為良好的預(yù)后對照水平，且表達水平與對照水平相比的升高確定為不良的預(yù)后。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述升高是比對照水平高至少10%。
8.權(quán)利要求5的方法，其中表達水平是通過選自下組的任一方法測定的(a)檢測0IP5基因的mRNA；(b)檢測由0IP5基因編碼的蛋白；和(c)檢測由0IP5基因編碼的蛋白的生物學(xué)活性。
9.權(quán)利要求5的方法，其中源自患者的生物樣品包括活檢。
10.一種用于診斷肺癌和/或食道癌或評估或確定患有肺癌和/或食道癌的患者的預(yù)后的試劑盒，其包括選自下組的試劑(a)用于檢測0IP5基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測由0IP5基因編碼的蛋白的試劑；和(c)用于檢測由0IP5基因編碼的蛋白的生物學(xué)活性的試劑。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述試劑是針對所述基因的基因轉(zhuǎn)錄物的探針。
12.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述試劑是針對由所述基因編碼的蛋白的抗體。
13.—種在導(dǎo)入細胞中時抑制0IP5基因體內(nèi)表達以及細胞增殖的分離的雙鏈分子，所述分子包含有義鏈和與其互補的反義鏈，所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中有義鏈包含與來自SEQ ID NO 13的連續(xù)序列對應(yīng)的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其中有義鏈包含與選自下組的靶序列對應(yīng)的序列SEQ ID NO :11 和 12。
15.權(quán)利要求14的雙鏈分子，其中雙鏈分子是長度為約19個至約25個核苷酸的寡核苷酸。
16.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其由包含通過居間單鏈連接的有義及反義鏈二者的單一多核苷酸組成。
17.權(quán)利要求16的雙鏈分子，其具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]_3'，其中[Α]為包含與選自SEQ ID NO 11和12的靶序列對應(yīng)的序列的有義鏈，M為由3至23個核苷酸組成的居間單鏈，而[A']為包含[A]的互補序列的反義鏈。
18.—種編碼權(quán)利要求13至17的雙鏈分子的載體。
19.一種用于治療或預(yù)防表達0IP5基因的癌癥的方法，其中該方法包括施用至少一種權(quán)利要求13-17的分離的雙鏈分子或權(quán)利要求18的載體的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中要治療的癌癥是肺癌和/或食道癌。
21.一種用于治療或預(yù)防表達0IP5基因的癌癥的組合物，其中組合物包含至少一種權(quán)利要求13-17的分離的雙鏈分子或權(quán)利要求18的載體。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中要治療的癌癥是肺癌和/或食道癌。
23.一種篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試化合物與由0IP5基因的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽與測試化合物之間的結(jié)合活性；并(c)選擇結(jié)合所述多肽的測試化合物。
24.一種篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試化合物與由0IP5基因的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物學(xué)活性；并(c)選擇與在沒有該測試化合物存在下檢測得到的由0IP5基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學(xué)活性相比，遏制所述多肽的生物學(xué)活性的測試化合物。
25.權(quán)利要求對的方法，其中所述生物學(xué)活性為促進細胞增殖。
26.一種篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使候選化合物與表達0IP5基因的細胞接觸；并(b)選擇與在沒有該測試化合物存在下檢測到的0IP5基因表達水平相比降低該基因的表達水平的測試化合物。
27.一種篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試化合物與其中導(dǎo)入了載體的細胞接觸，該載體包含0IP5基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報道基因；(b)測量所述報道基因的表達或活性；并(c)選擇與對照相比降低所述報道基因的表達或活性水平的測試化合物。
28.一種篩選用于治療或預(yù)防與0IP5基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌癥細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使0IP5多肽或其功能等同物與Rafl多肽或其功能等同物在測試化合物存在下接觸；(b)檢測多肽間的結(jié)合水平；(C)比較在步驟(b)檢測得到的結(jié)合水平與在沒有所述測試化合物存在下檢測得到的結(jié)合水平；并(d)選擇與步驟(C)中在沒有該測試化合物存在下檢測到的結(jié)合水平相比降低結(jié)合水平的測試化合物。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述0IP5的功能等同物包含Rafl結(jié)合域。
30.一種篩選用于治療或預(yù)防與OIP基因過表達有關(guān)的癌癥或抑制所述癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使0IP5多肽或其功能等同物與Rafl多肽或其功能等同物在測試化合物存在下在磷酸化的合適條件下接觸；(b)檢測0IP5多肽的磷酸化水平；并(c)選擇與在沒有該測試化合物存在下檢測到的0IP5多肽的磷酸化水平相比，降低該多肽的磷酸化水平的測試化合物。
31.權(quán)利要求23、24、沈、27、觀或四任一項的方法，其中癌癥選自肺癌和食道癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及OIP5基因在肺癌和/或食道癌致癌作用中發(fā)揮的作用，提供了一種通過施用針對OIP5基因的雙鏈分子或含有此類雙鏈分子的組合物、載體或細胞和抗體來治療和/或預(yù)防肺癌和/或食道癌的方法。本發(fā)明特征還在于通過檢測OIP5來檢測和/或診斷肺癌和/或食道癌或評估/確定具有肺癌和/或食道癌的患者的預(yù)后，和/或監(jiān)測癌癥療法在肺癌和/或食道癌的患者中的功效的方法。還公開了鑒定用于治療和預(yù)防涉及OIP5的癌癥的化合物的方法。
文檔編號C12N15/09GK102197134SQ20098014288
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者中村佑輔, 富樫亮, 醍醐彌太郎 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司