專利名稱：N-保護氨基酸的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥品或農藥的中間體有用的N-保護氨基酸的制造方法。
背景技術：
無論天然或非天然氨基酸，均是作為醫(yī)藥品或農藥的原料或者中間體而被廣泛應用的非常有用的化合物。在利用上述氨基酸作為原料或中間體的情況下，為了在將其提供至所希望發(fā)生的反應前，抑制該反應中的副反應，而向其分子內存在的羧基和/或氨基導入保護基。在導入所述保護基對氨基進行保護時，通?？梢栽趬A性條件下，通過使用理論當量 稍過量的保護試劑，快速且?guī)缀醵康氐玫絅-保護氨基酸。(非專利文獻1、專利文獻 1)?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2007-131589公報非專利文獻非專利文獻1 日本化學會編第5版實驗科學講座16、221_2沈頁

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題從得到高光學純度的光學活性氨基酸等理由來考慮，通?？梢酝ㄟ^使用生物催化劑來制造氨基酸。使用生物催化劑來制造氨基酸，通常是在水系中進行，但在水系中進行反應的情況下，出于對與水中溶解性高的氨基酸共存的水溶性無機鹽進行分離、對氨基酸與菌體/蛋白質成分進行分離的復雜操作等是必要的等理由，其分離純化效率低下，較為困難。另外，顯然利用上述分離純化無法回收的氨基酸還會導致成本方面的不利情況。因此， 在以得到氨基酸的保護體為目的的情況下，從生產效率和費用等觀點來看，希望直接使用反應液來進行氨基的保護。然而，通過本發(fā)明人等的研究發(fā)現(xiàn)，使用生物催化劑制造氨基酸的情況下，在現(xiàn)有方法中，僅使用當量 稍過量的保護試劑，存在無法定量制造N-保護氨基酸的情況。特別是，不對得到的氨基酸進行分離純化，直接對該氨基進行保護時，上述趨勢變得更強烈，令人意外的是，即使存在過量的保護試劑，該保護反應也難以進行。在商業(yè)性規(guī)?；a中， 認為上述情況會導致制造效率低下以及成本增加，并阻礙了向市場提供廉價有用的氨基酸保護體。鑒于上述情況，本發(fā)明提供高效率制造高質量的N-保護氨基酸的方法。解決問題的方法本發(fā)明人等對所述技術問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)為了高效地由使用生物催化劑制造的氨基酸來制造N-保護氨基酸，在保護反應前經過酸化處理是非常有效的。
S卩，本發(fā)明涉及N-保護氨基酸的制造方法，所述方法不對使用生物催化劑制造的氨基酸進行分離，而是將含有氨基酸的反應產物進行酸化處理，使其PH為4以下，然后，在堿性條件下進行氨基保護反應。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明涉及的方法，即使在對使用生物催化劑制造的氨基酸直接(不對氨基酸進行分離)實施保護反應的情況下，使用當量 稍過量的保護試劑，也可定量且高效地制造高質量的N-保護氨基酸。
具體實施例方式首先，對本發(fā)明中使用的氨基酸進行說明。對于作為可以在本發(fā)明中使用的氨基酸，沒有特別地限定，具體而言，可以列舉如下，甘氨酸、丙氨酸、3-氯丙氨酸、β -丙氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、苯丙氨酸、高苯丙氨酸、酪氨酸、二碘酪氨酸、蘇氨酸、別蘇氨酸、 絲氨酸、高絲氨酸、異絲氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、3，4-脫氫脯氨酸、色氨酸、甲狀腺素、甲硫氨酸、高甲硫氨酸、胱氨酸、高胱氨酸、α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、α-氨基異丁酸、天冬氨酸、天冬氨酸-β -環(huán)己酯、天冬氨酸-β -甲酯、天冬氨酸-β -異丙酯、 天冬氨酸-β -芐酯、谷氨酸、谷氨酸-Y -環(huán)己酯、谷氨酸-Y -甲酯、谷氨酸-Y -異丙酯、 谷氨酸-Y -芐酯、賴氨酸、羥基賴氨酸、鳥氨酸、羥基鳥氨酸、精氨酸、組氨酸、抗莢膜菌素、 金剛烷基甘氨酸、牛磺酸、Y -甲酰-N-甲基正纈氨酸、Ng-甲苯磺酰精氨酸、0-芐基絲氨酸、0-芐基蘇氨酸、Nin-甲酰色氨酸、2- (2-氨基-4-噻唑基)-2-羥基亞胺乙酸、2- (2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亞胺乙酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-乙醛酸(夕''J才* *酢酸)、2-(2_氨基-4-噻唑基)-2-戊烯酸、3-氨基-2-羥基-4-苯基丁酸、3-氨基-3-苯基丙酸、苯基甘氨酸、4-羥基苯基甘氨酸、4-氯苯基甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、肌酸、亞丙基亞胺-2-羧酸、 Orcylalanine (才> * > 7，二 > )、麥角硫因、羊毛硫氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸寸。在除了甘氨酸以外的氨基酸中，存在光學異構體、立體異構體，因此本發(fā)明可以使用其立體異構體，也可以使用其混合物或消旋體。此外，可以將上述氨基酸的羧基轉換為其他官能團，具體而言，可以轉換為適于使用的酰胺體或酯體。就通過使用本發(fā)明中所使用的生物催化劑制造氨基酸而言，例如可以按照以下方法來制造，但并不限定于這些方法。1)使氨基酸脫氫酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于相應的酮酸，選擇性地對D構型體或L構型體進行氨基化。作為本反應中使用的氨基酸脫氫酶，可以列舉如下，例如，亮氨酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、苯丙氨酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、纈氨酸脫氫酶、 賴氨酸脫氫酶、天冬氨酸脫氫酶等。2)使轉氨酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于相應的酮酸，選擇性地對D構型體或L構型體進行氨基化。3)使酯酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于DL-氨基酸烷基酯，選擇性地對D構型體或L構型體進行水解。4)使?；D移酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于L-N-酰基氨基酸，選擇性地對D構型體或L構型體進行水解。5)使酰胺酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于DL-氨基酸酰胺，選擇性地對D構型體或L構型體進行水解。6)使乙內酰脲酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物或其處理物作用于5-取代乙內酰脲，選擇性地對D構型體或L構型體進行水解。7)使腈水解酶或具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于α -氨基硝基化合物，選擇性地對D構型體或L構型體進行水解。8)使選擇性分解D構型體或L構型體的微生物培養(yǎng)物作用于DL-氨基酸，對氨基酸的一種立體異構體進行水解。9)使D或L-氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶、以及具有輔酶再生能力的酶、或者具有生產該酶能力的微生物的培養(yǎng)物作用于DL-氨基酸，以100%的理論收率，使DL-氨基酸轉換為D構型體或L構型體的氨基酸。此外，本發(fā)明中所述的“生物催化劑”，是指在制造氨基酸時利用的上述氨基酸脫氫酶等酶，或者具有產生該酶的能力的微生物的培養(yǎng)物或其處理物。在此，“微生物的培養(yǎng)物”是指，含有菌體的培養(yǎng)液或培養(yǎng)菌體，“其處理物”是指，通過物理方法、酶等破碎得到的菌體破碎物、通過離心分離等除去破碎物中的不溶成分從而得到的粗提取液、冷凍干燥菌體、丙酮干燥菌體等。作為“制造氨基酸時利用的酶”，可以列舉如下，例如，氨基酸脫氫酶、轉氨酶、酯酶、酰基轉移酶、酰胺酶、乙內酰脲酶、腈水解酶。作為氨基酸脫氫酶，可以列舉如下，例如，亮氨酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、苯丙氨酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、纈氨酸脫氫酶、賴氨酸脫氫酶、天冬氨酸脫氫酶。具體而言，在制造的氨基酸為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸或叔亮氨酸等脂肪族氨基酸的情況下，作為氨基酸脫氫酶，優(yōu)選亮氨酸脫氫酶、纈氨酸脫氫酶。 在制造的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、金剛烷基甘氨酸等芳香族氨基酸的情況下，作為所使用的氨基酸脫氫酶，優(yōu)選苯丙氨酸脫氫酶。在制造的氨基酸為谷氨酸、6-羥基正亮氨酸等的情況下，優(yōu)選谷氨酸脫氫酶。在制造的氨基酸為α -氨基丁酸、α -氨基戊酸、 絲氨酸、甘氨酸、3-氯丙氨酸、3-氟丙氨酸等的情況下，優(yōu)選丙氨酸脫氫酶。其中，作為亮氨酸脫氫酶，只要是具有該酶活性的酶均可任意利用，例如，芽孢桿菌屬(Bacillus)、高溫方文線菌屬(Thermoactinomyces)、梭菌屬(Clostridium) lifM (Corynebacterium)微生物來源的酶，優(yōu)選球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、賭狀芽孢桿菌(Bacillus celeus)、枯草芽 ？包桿菌(Bacillus subtilis)、中間型高溫方文線菌(Thermoactinomyces intermedis)、熱醋酸菌(Clostridium thermoaceticum)來源的酶，進一步優(yōu)選球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) NBRC3341 菌株來源的酶。作為苯丙氨酸脫氫酶，只要是具有該酶活性的酶均可任意利用，例如，芽孢桿菌屬、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、紅球菌屬(Iihodococcus)、高溫放線菌屬、短桿菌屬 (Brevibacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、微桿菌屬(Microbacterium)微生物來源的酶。優(yōu)選栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、球形芽孢桿菌、脲芽孢八疊球菌(Sporosarcina ureae)、海洋紅球菌(Rhodococcus maris)、中間型高溫方文線菌(Thermoactinomyces intermedius)來源的酶，進一步優(yōu)選栗褐芽孢桿菌IAMl 1059菌株來源的酶。關于其他的脫氫酶等，只要是具有該酶活性的酶均可任意利用。需要說明的是，上述各種微生物，可以從專利微生物保藏機構或其他研究機構獲得。例如，按照NBRC編號特定的微生物，可以從獨立行政法人制品評價技術基礎機構生物遺傳資源部門獲得，按照IAM編號特定的微生物，可以從東京大學分子細胞生物學研究所細胞機能信息研究中心獲得。作為上述“具有可以產生在制造氨基酸時所利用的酶的能力的微生物”，可以是野生株或者任意突變株。或者，可以是通過基因操作等遺傳學方法來衍生得到的微生物。作為基因操作得到的微生物，可以列舉如下，例如，使用具有編碼制造上述氨基酸時所利用的酶的DNA的載體進行轉化得到的轉化體。在制造氨基酸所利用的酶是氨基酸脫氫酶的情況下，優(yōu)選具有該酶，并且具有下述能力的微生物，所述能力是指具備產生能夠再生該酶所依賴的輔酶的酶的能力，可以列舉如下，例如，使用下述載體進行轉化得到的轉化體所述載體具有編碼氨基酸脫氫酶的DNA和編碼具備使該酶所依賴輔酶再生的能力的酶的DNA，優(yōu)選的轉化體其具備輔酶再生能力的酶是甲酸脫氫酶或葡糖脫氫酶，進一步優(yōu)選，轉化體的上述甲酸脫氫酶為硫桿菌(Thiobacillus sp.)來源的酶，轉化體的上述葡糖脫氫酶為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源的酶。作為導入載體的宿主，可以列舉細菌、酵母、絲狀菌、植物細胞、動物細胞，從轉化的難易和酶的表達效率的觀點來看，優(yōu)選細菌，特別優(yōu)選大腸桿菌。例如，制造氨基酸所利用的酶是亮氨酸脫氫酶的情況下，作為生物催化劑被使用的微生物，可以列舉如下，如通過具有編碼亮氨酸脫氫酶的DNA的載體轉化得到的轉化體， 優(yōu)選通過具有編碼亮氨酸脫氫酶的DNA和編碼上述甲酸脫氫酶的DNA的載體轉化得到的轉化體，例如，作為亮氨酸脫氫酶，可以列舉使用球形芽孢桿菌NBRC3341菌株來源的酶的 W02007/015511 號記載的大腸桿菌 HBlOl (pFTLB)。上述酶或微生物的培養(yǎng)物作用于酮酸等時，可以按照例如下述方法進行。然而，并不限定于下述方法。在水等適宜的溶劑中，添加相應的酮酸、甲酸銨和硫酸銨等包括甲酸與氨的無機鹽類、NAD+等輔酶、以及具有生產上述氨基酸脫氫酶和甲酸脫氫酶能力的上述微生物的培養(yǎng)液或從培養(yǎng)液中取得的培養(yǎng)菌體，在調節(jié)PH值的條件下，進行攪拌反應。上述反應在10 70°C、優(yōu)選在20 60°C的溫度條件下進行，保持反應液pH為 4 12，優(yōu)選6 10。酮酸以0.1% 60% (w/w)、優(yōu)選以1 % 30% (w/w)的投料濃度添加。此外，酮酸可以一次添加，也可以分批添加。通常以水溶液的形態(tài)獲得按照上述制造的含氨基酸的反應產物，但可以共存有機溶劑，進一步地，也可以共存有無機鹽。此外，在本發(fā)明涉及的方法中，不對得到的氨基酸進行分離，可以以含氨基酸的溶液或漿料的形態(tài)進行保護反應，也可以不直接實施保護反應， 而是經過以純化為目的的過濾不溶物等操作。具體而言，作為可能經過的操作，可以列舉如下，例如過濾蛋白質等不溶物、蒸餾除去溶劑、使用活性炭處理、通過離心沉降分離菌體、通過離子交換樹脂除去無機鹽類等。此外，上述操作未必一定要在酸化處理前進行，也可以在酸化處理后適當?shù)貙嵤M一步地，也可以組合使用多種處理。接下來對酸化處理進行說明。根據(jù)該處理，可以提高N-保護氨基酸的制造效率。對于作為可以在酸化處理中使用的酸，沒有特別地限定，通常可以使用例如鹽酸、 硫酸、硝酸等無機酸；甲磺酸、乙磺酸等有機酸。上述酸可以單獨使用，也可以混合使用。對于酸的添加形態(tài)，沒有特殊地限定，可以僅添加酸，也可以使用水和/或有機溶劑將酸稀釋后使用。用有機溶劑對酸進行稀釋并使用時，該有機溶劑只要不與酸發(fā)生反應即可，沒有特殊限定。具體而言，可以列舉甲醇、乙醇、2-丙醇、甲苯等可以使用的有機溶劑。需要說明的是，優(yōu)選通過注意攪拌等對上述酸進行混合，以避免局部的強酸性。在本發(fā)明中，通過添加上述酸調節(jié)溶液的pH為4以下，優(yōu)選3以下，進一步優(yōu)選2 以下。如上所述，即使使用理論當量 稍過量的保護試劑，也可以高效地制得N-保護氨基酸。保持溶液pH的時間優(yōu)選5分鐘以上，更優(yōu)選30分鐘以上。長時間保持勢必損害制造效率，因此，可以通過容易的實驗，設定最適保持時間。對于一系列的操作溫度沒有特殊規(guī)定，為了得到簡便的操作性，通常設定為0 50°C的范圍。經過上述酸化處理的氨基酸，通過使用理論當量 稍過量的保護試劑，即可快速且?guī)缀醵康貙嵤┌被Ｗo。對于作為用于保護氨基的保護試劑，沒有特別限定，可以使用公知的試劑，例如可以使用N-烷氧基羰基化劑、N-氨基甲酰化劑和N-?；瘎?。更具體來說，優(yōu)選使用鹵代甲酸烷基酯、焦碳酸二烷基酯、烷基異氰酸酯、羧酸酐、烷基碳酰鹵化物(7 > # >力> # 二 ^ ^ 7 K )，其中從通用性的觀點來看，特別優(yōu)選使用氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸芐酯、焦碳酸二甲酯、焦碳酸二乙酯、焦碳酸二叔丁酯、異氰酸叔丁酯、異氰酸異丙酯、異氰酸苯酯、苯甲酰氯、乙酰氯、乙酸酐。保護反應條件可以采用公知的條件。由于氨基酸與所使用的保護試劑的不同組合，最適條件會有所不同，因此無法統(tǒng)一規(guī)定，通常是在堿性條件下進行，反應PH為8 14， 優(yōu)選9 14，反應溫度為-5 90°C，優(yōu)選0 50°C。此外，保護試劑通常設定為0.95當量以上1.20當量以下，優(yōu)選0.98當量以上 1. 10當量以下，更優(yōu)選0. 99當量以上1.05當量以下。按照上述，可以從使用生物催化劑制造的氨基酸來高效地制造N-保護氨基酸。需要說明的是，通過上述保護反應制造的N-保護氨基酸，可以通過后續(xù)的結晶析出、分級蒸餾、柱色譜等常規(guī)方法進行純化、分離。實施例下面記載了本發(fā)明的實施例，然而本發(fā)明并不限定于這些實施例。(參考例1)使用具有亮氨酸脫氫酶活性的微生物的培養(yǎng)菌體制造L-叔亮氨酸將由Bacto 胰蛋白胨 1. 6% (w/v)、Bacto 酵母提取物 1. 0% (w/v)、NaC10. 5% (w/ ν)組成的2XYT培養(yǎng)基(pH7)50ml分別注入容積為500ml振蕩燒瓶(坂口 7，^ 二)中， 于120°C蒸汽殺菌20分鐘。植菌根據(jù)W02007/015511號中記載的方法得到的具有亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶活性的轉化體大腸桿菌HBlOl (pFTLB)，然后于37°C振蕩30小時，進行需氧培養(yǎng)，得到具有亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶活性的微生物的培養(yǎng)液。對培養(yǎng)液進行離心分離、收集菌體、 并懸浮到培養(yǎng)液上清液中從而調節(jié)菌體濃度為培養(yǎng)液的20倍。在容積為IL的可拆式燒瓶中，加入3，3- 二甲基-2-氧代-丁酸(DMOB) 40g,用30重量％氫氧化鈉水溶液將pH調節(jié)為7. 3，然后添加甲酸銨19. 4g、硫酸銨8. 2g、硫酸鋅七水合物40mg、NAD 61mg、離子交換水 256g和相當于3200u的甲酸脫氫酶活性的上述菌體懸浮液，在攪拌條件下，一邊使用55重量％硫酸控制PH為7. 3，一邊于33°C進行反應19小時。通過高效液相色譜(HPLC)分析生成的L-叔亮氨酸的光學純度和含量，結果顯示得到了含有光學純度100% e. e.的L-叔亮氨酸38. Sg的菌體反應液。進一步地，通過離心分離除去得到的一部分菌體反應液中的菌體，得到含有L-叔亮氨酸的水溶液。作為參考，蛋白質的含量為0. 0 1. lmg/L。作為HPLC分析中的色譜柱，使用SUMICHIRAL 0A-5000 (4. 6 X 150mm，住化分析中心公司制造)，作為流動相，使用2mM硫酸銅水溶液與甲醇以容量比95 5混合的溶液，流速為1. OmL/min，柱溫為40°C，檢測波長為210nm進行分析。(實施例1)使用濃鹽酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸2. 48g (18. 4mmol)的菌體反應液的PH調節(jié)為4. O。攪拌2小時后，通過30重量％氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為7. 0，并通過離心沉降將菌體成分分離。然后，使用30重量％氫氧化鈉水溶液，調節(jié)制得的上清液的pH為10. 6。隨后一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至30. lg。在冰冷卻攪拌下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸甲酯1.78g(18. 8mmolU.02當量)。此時，添加氯甲酸甲酯會降低pH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的PH為9. 5 10. 5。添加氯甲酸甲酯結束后，攪拌1小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為98%。需要說明的是，轉化率通過以下計算式計算。轉化率(<%)=(生成的N-保護-氨基酸的峰面積值)/ (氨基酸的峰面積值+生成的N-保護-氨基酸的峰面積值)X 100作為HPLC分析中的色譜柱，使用CAPCELLPAKSCXQ50X4. 6mm i. d.)，作為流動相，使用磷酸緩沖液(PH= 3. 3)和乙腈以容量比95 5混合的溶液，流速為1. OmL/min，柱溫為35°C，使用差示折射計作為檢測器進行分析。以下的實施例中也進行相同的計算。(實施例2)使用濃鹽酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸3. 01g(23. Ommol)的水溶液的pH 調節(jié)為2.0后，保持2小時。然后，通過30重量％氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為10.6以后，一邊保持在40°C以下一邊減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至29. 7g。在冰冷卻攪拌下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸甲酯2. 19g(23. ImmolU.Ol當量)。此時，添加氯甲酸甲酯會降低pH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的pH為9. 8 12. 9。添加氯甲酸甲酯結束后，攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為99%。(實施例3)使用濃鹽酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸1. 96g (14. 9mmol)的菌體反應液的PH調節(jié)為4. 0。攪拌1小時后，通過離心沉降將菌體成分分離。然后，使用30重量％氫氧化鈉水溶液，調節(jié)制得的上清液的pH為10. 6。隨后一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至20. lg。在冰冷卻攪拌下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸乙酯1.63g(15.0mmOl、1.01當量)。此時，添加氯甲酸乙酯會降低PH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的pH為8. 9 12. 8。添加氯甲酸乙酯結束后，攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為96%。(實施例4)使用濃硫酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸2. 05g(15. 6mmol)的水溶液的pH 調節(jié)為2.0后，保持30分鐘。然后，通過30重量％氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為10.7以后， 一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至19. Sg。邊攪拌以及保持25 °C以下的條件下，邊向上述溶液中緩慢加入氯甲酸芐酯
2.70g(15. 8mmol, 1. 00當量)。此時，添加氯甲酸芐酯會降低pH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的pH為9. 9 12. 5。添加氯甲酸芐酯結束后，攪拌2小時， 然后通過HPLC分析的結果為轉化率為97%。(實施例5)使用濃硫酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸2. 03g(15. 5mmol)的水溶液的pH 調節(jié)為2.0后，保持30分鐘。然后，通過30重量％氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為10.7以后， 一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至19. 6g。在攪拌以及室溫條件下，向上述溶液中緩慢加入焦碳酸二叔丁酯
3.41g(15. 6mmol, 1. 00當量)。此時，添加焦碳酸二叔丁酯會降低pH值，但通過同時加入30 重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的pH為9. 5 10. 5。添加焦碳酸二叔丁酯結束后，攪拌
2.5小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為99%。(比較例1)使用30重量％氫氧化鈉水溶液，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸
3.01g(23. Ommol)的水溶液的pH調節(jié)為10. 6以后，一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至30. 3g。在冰冷卻攪拌條件下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸甲酯2. 20g(23. 3mmolU. 01 當量)。此時，添加氯甲酸甲酯會降低pH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的PH為10.0 13.0。添加氯甲酸甲酯結束后，攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為86%。(比較例2)使用30重量％氫氧化鈉水溶液，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸 3. 01g(23. Ommol)的水溶液的pH調節(jié)為10. 6以后，一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至30. 3g。在冰冷卻攪拌下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸甲酯2. 20g(23. 3mmOl，1.01當量)。此時，氯甲酸甲酯會降低PH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的PH為10. 0 13. 0。添加氯甲酸甲酯結束后，攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為86%。
一邊同時添加30重量％氫氧化鈉水溶液，保持上述反應液的pH為10. 0 13. 0， 一邊進一步追加氯甲酸甲酯0. 59g(總用量2. 79g，總計29. 5mmol, 1. 28當量)。添加結束后攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為90%。進一步同樣地，追加氯甲酸甲酯1.觀8(總用量4.078，總計43. Immol, 1.87當量)。添加結束后攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為94%。由上述結果可知，在未經過酸化處理的情況下，即使存在過量的保護試劑，也無法充分進行保護反應。(比較例3)使用濃硫酸，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸2. 05g(15. 6mmol)的水溶液的pH 調節(jié)為5. 1后，保持30分鐘。然后，通過30重量％氫氧化鈉水溶液調節(jié)pH為10. 6以后， 一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至19. 5g。在冰冷卻攪拌條件下，向上述溶液中緩慢加入氯甲酸甲酯1.49g(15.8mmOl，1.01 當量)。此時，添加氯甲酸甲酯會降低PH值，但通過同時加入30重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的PH為9. 9 11. 4。添加氯甲酸甲酯結束后，攪拌2小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為89%。(比較例4)使用30重量％氫氧化鈉水溶液，將根據(jù)參考例制得的含L-叔亮氨酸 1.52g(11.6mmol)的水溶液的pH調節(jié)為10. 6以后，一邊保持在40°C以下一邊進行減壓濃縮，并調節(jié)溶液量至15. 7g。在攪拌以及室溫條件下，向上述溶液中緩慢加入焦碳酸二叔丁酯 2. 63g(12. lmmol、1.04當量)。此時，添加焦碳酸二叔丁酯會降低pH值，但通過同時加入30 重量％氫氧化鈉水溶液，保持溶液的pH為9. 6 10. 5。添加焦碳酸二叔丁酯結束后，攪拌 2. 5小時，然后通過HPLC分析的結果為轉化率為92%。
權利要求
1.N-保護氨基酸的制造方法，其中，對使用生物催化劑制造的氨基酸不進行分離，而是將含有氨基酸的反應產物進行酸化處理，使其PH為4以下，然后，在堿性條件下進行氨基保護反應。
2.根據(jù)權利要求1所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，氨基酸是叔亮氨酸。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，氨基保護所使用的保護試劑是N-烷氧基羰基化劑、N-氨基甲?；瘎┗騈-?；瘎?。
4.根據(jù)權利要求3所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，氨基保護所使用的保護試劑是氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸芐酯、焦碳酸二叔丁酯中的任意試劑。
5.根據(jù)權利要求1 4中任一項所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，生物催化劑是氨基酸脫氫酶、轉氨酶、酯酶、酰基轉移酶、酰胺酶、乙內酰脲酶、腈水解酶或具有生產該酶的能力的微生物的培養(yǎng)物。
6.根據(jù)權利要求5所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，生物催化劑是氨基酸脫氫酶或具有生產該酶的能力的微生物的培養(yǎng)物。
7.根據(jù)權利要求6所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，氨基酸脫氫酶是亮氨酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、苯丙氨酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、纈氨酸脫氫酶、賴氨酸脫氫酶或天冬氨酸脫氫酶。
8.根據(jù)權利要求7所述的N-保護氨基酸的制造方法，其中，氨基酸脫氫酶來源于球形芽 包木干胃(Bacillus sphaericus) 0
全文摘要
在本申請中，不對使用微生物菌體或催化劑等生物催化劑制造的氨基酸進行分離，而是將含有氨基酸的反應產物進行酸化處理，使其pH為4以下，然后，在堿性條件下進行氨基保護反應得到N-保護氨基酸。按照上述方法，即使是對使用生物催化劑制造的氨基酸直接(不對氨基酸進行分離)實施保護反應的情況下，通過使用當量～稍過量的保護試劑，即可定量且高效地制造高質量的N-保護氨基酸。
文檔編號C12P13/06GK102203269SQ20098014317
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權日2008年10月31日
發(fā)明者前原克治, 巖崎晃, 平井義則, 諸島忠, 金丸博幸 申請人:株式會社鐘化