專利名稱：基于同源重組dna的克隆方法及組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的實施例涉及用于分子克隆的方法及組合物，尤其是將供體DNA在預定位 置克隆至受體載體內(nèi)。
背景技術：
在分子生物學研究和生物技術行業(yè)，始終需要將所需的DNA分子克隆至載體內(nèi)， 尤其是在特定位置。將供體DNA在預定位置克隆至諸如質粒之類的受體載體內(nèi)的傳統(tǒng)方 法通常包括六大步驟(i)利用一或兩種限制性核酸內(nèi)切酶進行受體載體DNA的酶切，純化 線性載體；(ii)在供體DNA分子不在的情況下，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理線性載 體，以使得連接過程中線性載體的自環(huán)化程度最??；(iii)利用PCR引物借助聚合酶鏈反應 (PCR)擴增供體DNA，添加至用于線性化載體DNA的一或兩種限制性核苷酸內(nèi)切酶的擴增供 體DNA限制性酶識別位點的5'端和3'端；(iv)利用線性化載體DNA所用的限制性核苷酸 內(nèi)切酶對擴增供體DNA進行內(nèi)切，接著純化內(nèi)切供體DNA ； (ν)利用DNA連接酶將純化供體 DNA與純化線性載體連接起來；以及(vi)將連接產(chǎn)物轉化為受體細胞，例如大腸桿菌感受 態(tài)細胞，選擇含有所要克隆產(chǎn)物的轉化細胞，其中供體DNA于所需克隆位點插入至載體內(nèi)。 傳統(tǒng)克隆方法繁瑣、費時。克隆效率相對較低。也受限于載體和供體DNA上適當限制性內(nèi) 切酶識別位點的可用性?；谥亟M的方法已被用于加速克隆。例如，Pentao Liu等(Genome Res (2003) 13 476-484)所述的用于生成條件性剔除突變的重組工程方法。該方法使用噬菌體大腸桿菌 同源重組系統(tǒng)，而無需限制性酶或DNA連接酶。特別是，該方法利用經(jīng)λ噬菌體Red蛋白 介導的同源重組，由細菌人工染色體(BAC)通過缺口修復克隆方法將DNA亞克隆至高拷貝 質粒內(nèi)，且與Cre或Flpe重組酶一起，將IoxP或FRT位點引入至亞克隆DNA內(nèi)。在此方法 中使用長于45-55-bp的同源區(qū)域。類似許多其他重組方法，該方法取決于受體載體內(nèi)的特 定序列以及宿主細胞內(nèi)特定噬菌體蛋白的表達，從而限制了只有特定載體和宿主細胞可使 用。重組克隆的另一實例由Clontech Laboratories公司(加州，山景城，94043)開 發(fā)dn-Fusion PCR克隆試劑盒。這種試劑盒旨在在沒有PCR限制性酶切、連接或平端拋 光的情況，使得一步完成任何PCR片段至任何線性載體的克隆。h-Fusion 系統(tǒng)使得PCR 片段頂端融合至線性載體的同遠端。同源3'和5'區(qū)域通過將15bp擴增添加至兩種PCR 引物產(chǎn)生，以便正好與線性載體兩端相匹配。方法包括將線性載體、PCR片段和h-Fusion 酶培養(yǎng)30分鐘，隨后完成大腸桿菌細胞的轉化。^-Fusion 酶是一種將雙鏈擴增添加至 單鏈DNA并將這些區(qū)域融合至線性載體的相應端的專利蛋白。同時h-Fusion 系統(tǒng)可快速定向克隆PCR產(chǎn)物，而無載體和宿主細胞的限制，其取決于專利h-Fusion 酶，因此限制 了只能使用Clontech公司或其分支機構所售的h-FusionTMPCR克隆試劑盒或類似系統(tǒng)。因此，需要一種新型的快速簡單的方法能夠將供體DNA克隆至載體的預定位 置。本發(fā)明申請中描述了這樣一種方法。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法使用酶合劑來替代 In-fusion 酶，其具有所有In-fusion PCR克隆試劑盒的所有優(yōu)勢，同時克隆效率更高。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明實施例涉及一種將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置的方 法，該方法包含以下步驟a)通過將第一序列和第二序列分別添加至供體DNA分子的5'端和3'端來制備 擴展供體DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者獨立地至少具12個核苷酸長，且 與受體載體的第一區(qū)域和第二區(qū)域分別至少有90%相一致；b)提供包含以下物質的反應混合物i)受體載體，ii)擴展供體DNA分子，及iii)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；c)反應混合物經(jīng)培養(yǎng)獲得中間產(chǎn)物；d)利用中間產(chǎn)物進行細胞轉化，獲得轉化細胞；及e)在一定條件下培養(yǎng)該轉化細胞，得到包含位于第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的供體 DNA的重組DNA分子。在本發(fā)明的一個實施例中，擴增供體DNA通過聚合酶鏈反應(PCR)來制備。另一方面，發(fā)明實施例涉及一種用于將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置的 組合物，該組合物包含a)包含內(nèi)切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；以及b)反應緩沖液。
本發(fā)明的一個實施例也涉及一種用于將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置 的試劑盒。這種試劑盒包含本發(fā)明實施例的組合物以及克隆中使用試劑盒的說明書。另一方面，發(fā)明實施例涉及一種用于將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置的 系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含a)受體載體，b)在供體DNA分子的5'端和3'端分別包含第一序列和第二序列的擴展供體 DNA分子，其中第一序列與第二序列中的任一者獨自地至少具12個核苷酸長，且分別于受 體載體的第一區(qū)域與第二區(qū)域至少90%—致；c)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑，以及d)細胞隨包含(a)、(b)和(C)的反應混合物培養(yǎng)后形成的中間產(chǎn)物發(fā)生轉化，借 此轉化細胞產(chǎn)生了包含位于第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的供體DNA的重組DNA分子。本發(fā)明的其他方面、特性和優(yōu)點將通過以下公開為大家所知，包括本發(fā)明的詳細 描述及其優(yōu)選實施例和所附權利要求書。


結合附圖可更好地理解上述發(fā)明內(nèi)容及以下發(fā)明詳細說明。出于說明本發(fā)明的目 的，在圖中描述目前優(yōu)選的實施例。但應理解的是，本發(fā)明不限于所示的確切配置和工具。圖中圖1為本發(fā)明實施例方法的示意圖。
具體實施例方式除非另有規(guī)定，本文中所用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所涉及的行業(yè)普通 技術人員所普遍理解的相同含義。另外，本文所用的某些術語具有發(fā)明說明所設定的含義。 本文所引用的所有專利、公開的專利申請及出版物均并入本發(fā)明中作為參考。應注意的是， 除非本文另有明確規(guī)定，本文及所附權利要求書中的所用的單數(shù)形式“一”和“這一”包括 其復數(shù)參考形式。本文中所用的“序列”是指單體在聚合物中發(fā)生的線性順序，例如多肽中氨基酸的 順序或多核苷酸中的核苷酸順序。本文中所用的術語“核苷酸序列”、“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物中脫氧核苷 酸或核苷酸以單鏈或雙鏈形式的排列組合。核酸序列由以下堿基的天然核苷酸組成T、A、 C、G、U和/或天然核苷酸的合成類似物。在本發(fā)明中，腺苷縮寫為“A”，胞苷縮寫為“C”，鳥 苷縮寫為“G”，胸苷縮寫為“T”，尿苷縮寫為“U”。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈核苷酸。除非 另外說明，多核苷酸沒有規(guī)定長度，因此其包括大型核酸以及較短的核酸，例如寡核苷酸。本文中使用傳統(tǒng)符號來描述多核苷酸序列。單鏈核苷酸序列的左端為5'-端。 雙鏈多核苷酸序列的左端為正鏈的5'-端，被看作是雙鏈的上游鏈。雙鏈多核苷酸序列的 右端為負鏈的5'-端，被看作是雙鏈的下鏈。自5'向3'添加核苷酸至新生RNA轉錄的 方向被稱為轉錄方向。作為mRNA的具相同序列額DNA鏈被稱為“編碼鏈”。自5'端向DNA 上參照點的DNA鏈序列被稱為“上游序列”，而自3'端向DNA上參照點的DNA鏈序列被稱 為“下游序列”。本文中所用的“核苷酸補體”為與核苷酸完全互補的一種核酸序列。如本行業(yè)中所熟知的“序列同源性”為兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以 上多核苷酸序列之間的關系，通過比較序列來確定。在兩個或兩個以上多肽序列或兩個或 兩個以上多核苷酸序列之間的關系中，本文所用的“同源性”是指當最佳對齊和分析這些序 列時，核苷酸或氨基酸殘基的百分比分別相同。計算同源性以及對齊區(qū)域上兩個序列之間 同源性匹配的百分比，包括長度上的缺口。進行手動分析或使用序列比較算法。為了比較 序列，通常將一個序列用作參考序列，與查詢序列進行比較。當使用序列比較算法時，將測 試和參考序列輸入電腦，指定子序列的位置，必要時，指定序列算法程序參數(shù)。通過本行業(yè)熟知的方法進行序列優(yōu)化比對，例如Needleman & mmsch(J. Mol. Biol. 48 :443(1970))> Smith & Waterman(Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)) Pearson & Lipman (Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 85 :2444 (1988))的同源算法，通過這些算法的計算 機實現(xiàn)(Wisconsin 基因軟件包內(nèi)的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group公司，地址575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通過外觀檢查。適用于確定序列同源 性百分比和序列相似性的算法的一個實例為BLAST算法(Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990))。進行BLAST分析的軟件可自美國國立生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站獲得。本文中所用的“重組”是指由多核苷酸、細胞、病毒粒子或有機體編碼而成的多核 苷酸、多肽，可使用分子生物學技術進行對其進行部分修改，但不修改其天然狀態(tài)。本文中所用的“重組DNA分子”是指不作為天然產(chǎn)物存在的DNA分子，而是利用分 子生物學技術制備的。本文中所用的“轉化細胞”、“轉染細胞”、“轉化”和“重組細胞”都是指引入重組多 核苷酸序列的細胞。例如，轉化細胞可含有至少一個天然細胞(非轉化)形式中不存在的核 苷酸序列，或可以表達那些異常表達、低表達或表達不完全的天然基因。轉化細胞也可含有 天然形式細胞中所發(fā)現(xiàn)的基因，其中基因可通過人工方法進行修改并重新引入細胞內(nèi)。這 個詞強調細胞在載體上含有重組多核苷酸序列或已整合至細胞染色體內(nèi)?？墒褂靡韵氯魏芜m當方法將重組DNA序列引入宿主細胞內(nèi)，例如電穿孔、磷酸鈣 沉淀法、顯微注射、轉化、基因槍法和病毒感染。重組DNA可能會或可能不會被整合到(共 價鍵連接)構成細胞基因組的染色體DNA內(nèi)。例如，重組DNA可始終位于附著性元素上，例 如質粒。另外，對于穩(wěn)定轉化或轉染的細胞而言，重組DNA可融入染色體內(nèi)，以便通過染色 體復制借由子細胞進行遺傳。其穩(wěn)定性借助穩(wěn)定轉化或轉染細胞的能力來描述，以便建立 由含有外源DNA的眾多子細胞組成的細胞系或細胞克隆。應進一步了解的是，術語“轉化細 胞”不僅是指特定受試細胞，同時也指這一細胞的后代或潛在的后代。由于突變或環(huán)境影 響，某些修改可能發(fā)生在后續(xù)代，在這種情況下，事實上這些后代可能與母細胞不一致，但 這仍然包括在本文所用的術語范圍內(nèi)。本文中所用的術語“載體”是指能夠將另一核酸運送至它所連接的另一核酸的核 酸分子。一種載體為質粒，是指可插入額外的DNA片段內(nèi)的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。其他類型的 載體包括但不限于細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和噬菌體。某些載體能 夠在宿主細胞內(nèi)完成自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附著性哺乳動物載 體)。當引入宿主細胞時，其他載體(例如非附著性哺乳動物載體)可整合至宿主細胞的基 因組內(nèi)，因此隨著宿主基因組進行復制。此外，某些載體(表達載體)能夠將基因表達指向 其切實可連接的基因。一般來說，重組DNA技術中所用的載體通常以質粒形式存在。這些 質?？梢允菃慰截悺⒌涂截?、中拷貝或高拷貝質粒。例如，借助Sambrook等人(Molecular Cloning, Laboratory Manual，第二版(1989)，冷泉港實驗室出版社)與Ioannou等人 (Nature Genet. 6 (1994),84-89)或本文所引用的參考文獻描述這些載體的實例。然而，本 發(fā)明意欲也包括載體的其他形式，諸如病毒載體(例如復制缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺 體相關病毒)、BAC、YAC和質粒，這些載體均具有同樣效果。特殊設計的載體使得不同宿主之間的DNA克隆或宿主之間的DNA穿梭得以進行， 例如細菌-酵母或細菌-動物細胞或細菌-真菌細胞或細菌-無脊椎動物細胞。本領域普 通技術人員均知道這眾多載體，且適當載體的選擇是一個選擇的問題。對于其他用于原核 和真核細胞的適當表達系統(tǒng)而言，參見上文中Sambrook等人著作的第16和第17章。本發(fā)明實施例涉及一種DNA快速克隆方法，它在傳統(tǒng)DNA克隆技術以及其他重組 克隆方法上作出了明顯改善。根據(jù)本發(fā)明的實施例，幾乎所有供體DNA分子利用一種方法 均可克隆至任何載體的預定位置，該方法不再需要傳統(tǒng)DNA克隆方法中的眾多步驟，例如PCR擴增供體DNA的限制性酶切、利用堿性磷酸酶進行限制性酶切受體載體的脫磷酸作用、 使用DNA連接酶進行供體DNA與受體DNA之間的連接等。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法可大幅 度地降低克隆時間和成本，同時為克隆中所用的載體和宿主細胞提供更好地使用適應性。 根據(jù)本發(fā)明實施例的克隆方法利用供體DNA分子與受體載體之間同源重組。在本發(fā)明的一方面，使用包含以下步驟的方法，將供體DNA分子克隆至受體載體 預定位置內(nèi)a)通過將第一序列和第二序列分別添加至供體DNA分子的5'端和3'端來制備 擴展供體DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者獨立地至少具12個核苷酸長，且 與受體載體的第一區(qū)域和第二區(qū)域分別至少有90%相一致；b)提供包含以下物質的反應混合物i)受體載體，ii)擴展供體DNA分子，及iii)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；c)反應混合物經(jīng)培養(yǎng)獲得中間產(chǎn)物；d)利用中間產(chǎn)物進行細胞轉化，獲得轉化細胞；及e)在一定條件下培養(yǎng)該轉化細胞，得到包含位于第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的供體 DNA的重組DNA分子。警體載體根據(jù)本發(fā)明所述內(nèi)容，本領域普通技術人員均可簡單地理解本發(fā)明中受體載體的 選擇和使用。受體載體可以是本領域所熟知的任何載體，例如質粒、細菌人工染色體(BAC)、 酵母人工染色體(YAC)、病毒或噬菌體。在本發(fā)明的一個實施例中，受體載體具有一復制序列的起點，其使得轉化原核或 真核宿主細胞內(nèi)的構建重組DNA的自生復制得以實現(xiàn)。例如，受體載體可具有大腸桿菌宿 主細胞內(nèi)構建重組DNA的自主復制的ColEl復制起點，2 μ酵母宿主細胞的復制起點或病毒 復制起點用于含有適當復制因子的宿主細胞以供病毒復制，例如SV40復制起點。在本發(fā)明的另一實施例中，受體載體具有能促進所構建重組DNA的整合或并入轉 化細胞基因組內(nèi)的序列。在本發(fā)明的實施例中，受體載體含有一序列，其使得構建重組DNA表達受體載體 不表達的標記基因產(chǎn)品，從而借助標記基因產(chǎn)品的存在的選擇或篩選，完成含有重組DNA 的轉化細胞的選擇或篩選。這可以通過重組DNA的設計來完成，例如，借助供體DNA的插入， 提供標記基因的缺少元素。在本發(fā)明的另一實施例中，受體載體含有一序列，其使得所構建的重組DNA不表 達受體載體所表達的標記基因產(chǎn)品，從而借助標記基因產(chǎn)品的缺失的選擇或篩選，完成含 有重組DNA的轉化細胞的選擇或篩選。這可以通過重組DNA的設計來完成，例如，借助供體 DNA的插入使得標記基因無效。標記基因可以是選擇性標記基因，該基因的表達可進行選擇性介質上轉化細胞的 選擇。選擇性標記基因的實例包括但不限于，那些賦予抗藥性的編碼蛋白，例如抗生素、 G418、潮霉素和甲氨蝶呤；以及那些在缺乏必須營養(yǎng)素的介質上賦予生長能力的編碼蛋白。標記基因也可以是報告基因，報告基因的表達可使用常規(guī)實驗室技術進行轉化細胞的簡單篩選。報告基因的實例包括但不限于，那些編碼綠色熒光蛋白(GFP)、β-半乳糖 苷酶、熒光素酶、氯霉素乙酰轉移酶、β -葡萄糖醛酸酶、新霉素磷酸轉移酶、黃嘌呤鳥嘌呤 磷酸轉移酶等。受體載體內(nèi)差異表達的標記基因及構建重組DNA，可自僅含有受體載體的那些轉 化細胞中，完成含有重組DNA的轉化細胞的簡單選擇或篩選。然而，由于本發(fā)明方法所提供 的高克隆效率，這樣一個特性對于本發(fā)明方法而言，可能存在，但不必須。根據(jù)本發(fā)明所述 內(nèi)容，利用本領域所熟知的方法，可通過PCR篩選方法很容易地確認含有重組DNA的轉化子。供體DNA可克隆至受體載體的任意預定位置。根據(jù)試驗需求選擇克隆位置。供體 DNA可在替代或切除一部分載體的情況下，或沒有替代或切除一部分載體的情況下插入受 體載體。如果由于同源重組，切除掉一部分自動復制的受體載體，要采取審慎態(tài)度確保載體 復制起點仍然位于構建重組DNA中。一旦選擇好插入供體DNA分子的位置，應很容易地分辨受體載體上所選位置兩側 區(qū)域的序列，例如，通過載體原有序列或通過區(qū)域的順序。本文中所用的“第一區(qū)域”是指位于預定插入位置的5'端上游的序列。當需要將 供體DNA準確插入插入位置的5'端時，第一區(qū)域與預定插入位置的第一或5'端最大額核 苷酸相連。本文中所用的“第二區(qū)域”是指位于預定插入位置的3'端下游的序列。當需要將 供體DNA準確插入插入位置的3'端時，第二區(qū)域與預定插入位置的最后一個或3'端最大 的核苷酸相連。在本發(fā)明的實施例中，受體載體為質粒，用于插入供體DNA的預定位置位于限制 性內(nèi)切酶切割位點，或位于兩個限制性內(nèi)切酶切割位點之間。質粒通過一或兩種限制性內(nèi) 切酶進行消化。限制性酶消化后，這一伙兩種限制性酶經(jīng)熱滅活，且線性質粒經(jīng)凝膠純化或 柱純化法進行純化。第一區(qū)域和第二區(qū)域分別是位于線性質粒兩端的序列。在本發(fā)明的另一實施例中，受體載體是環(huán)形、未經(jīng)任何限制性酶消化或切割的。根 據(jù)本發(fā)明實施例，可在反應混合物中直接使用未切割質粒用于同源重組。擴展供體DNA分子的制備任何供體DNA都可利用本發(fā)明克隆至載體。供體DNA分子的實例包括但不限于 cDNA或基因組DNA片段。供體DNA分子可以是所需要的基因編碼蛋白。也可以是所需要的 攜帶基因突變或基因病變的序列，用于快速形成DNA突變。基因突變或基因病變包括但不 限于1)切除目標DNA的一或多個核苷酸；2)向目標DNA添加一或多個核苷酸；3)取代目 標DNA的一或多個核苷酸；等。DNA突變形成，例如引入包括點突變、增刪在內(nèi)的DNA突變， 如使用常規(guī)方法進行DNA克隆，傳統(tǒng)上以相同方式進行。本發(fā)明方法也可用于DNA突變快 速形成，從而顯著降低DNA突變形成的時間和相關費用。在本發(fā)明實施例中，通過向供體DNA兩端添加第一序列或第二序列進行擴增，其 中第一序列或第二序列與上文所述的受體載體的第一區(qū)域或第二區(qū)域具有足夠的同源性， 因此高效同源組合物恰恰分別發(fā)生在第一序列與第一區(qū)域之間，以及第二序列與第二區(qū)域 之間。在本發(fā)明的另一實施例中，第一序列和第二序列各具12個核苷酸長，且與第一和第二區(qū)域分別具有至少約90%的序列同源性。例如，第一序列和第二序列各具12、15、20、 25、30、35、40、45、50個核苷酸長，且與第一和第二區(qū)域分別具有約90%、95%或100%的序 列同源性。在本發(fā)明的一個實施例中，第一序列和第二序列各具至少12個核苷酸長，且分別 于第一區(qū)域和第二區(qū)域具有約100%序列同源性。根據(jù)本發(fā)明所述內(nèi)容，使用本領域所熟知的任何方法來制備擴展供體DNA分子。 例如，擴展供體DNA可通過化學合成來制備。擴展DNA也可進行重組制備，隨后進行適當?shù)?限制性酶裂解和純化。在優(yōu)選實施例中，擴展供體DNA分子可通過PCR來制備。每一 PCR引物都由兩部 分組成5'插入序列和3'端供體DNA特定序列。一 PCR引物含有第一序列作為5'插入 序列，其他引物含有第二序列的補體。根據(jù)本發(fā)明所述內(nèi)容，可使用本領域所熟知的方法進 行PCR引物中3'端供體DNA特定序列。例如，供體DNA特定序列必須對供體DNA上目標區(qū) 域具有特定意義，可以是10-25個堿基長，具有約35-65%的GC濃度。作為優(yōu)選，兩種PCR 引物具有在范圍內(nèi)的類似融化溫度(Tm)等。根據(jù)本發(fā)明所述內(nèi)容，可使用本領域中所熟知的任何PCR應用。借由大家所熟知 的知識或常規(guī)實驗方法選擇或優(yōu)化PCR條件，例如模板和引物的數(shù)量、Mg2+和dNTP的濃度、 退火和熱循環(huán)條件等。在本發(fā)明的實施例中，可以所需次序在受體載體的預定位置上克隆不止一個供體 DNA分子。擴展供體DNA分子兩端的插入序列經(jīng)設計，以便以預定順序完成供體DNA分子之 間的同源重組，并完成預定位置上供體DNA分子與受體載體之間的同源重組。另外，可首先使用本領域熟知的方法將多個供體DNA分子結合在一起，例如DNA連 接或融合PCR。接著可將含有多個供體DNA分子的聯(lián)產(chǎn)品利用本發(fā)明方法插入受體載體內(nèi)。在本發(fā)明的另一實施例中，一組具有同源序列的供體DNA分子，例如來自于DNA文 庫或cDNA文庫，可在受體載體的預定位置進行克隆。例如，可使用一對通用PCR引物借由 PCR，將第一和第二序列添加至每一供體DNA分子的兩端。接著利用本文所述方法，將擴展 過的同源供體DNA分子借由同源重組克隆至受體載體。酶合劑不同于使用專利融合酶的Clontech公司的h-Fusion 克隆系統(tǒng)，一種通過在兩 端識別15bp重疊，將PCR產(chǎn)生的供體序列融合至線性載體的蛋白。本發(fā)明方法在擴展供體 DNA分子和受體載體體外治療中使用酶合劑，以此啟動和介導同源重組，并通過轉化細胞的 體內(nèi)重組系統(tǒng)來完成。本發(fā)明實施例的酶合劑包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白。每一蛋白可以被本領域 熟知的類似蛋白所替代，這些類似蛋白能夠以大致相同的方法起作用。本文中所使用的術語“外切酶”是指通過在3'或5'端打破磷酸二酯鍵的水解反 應，自多核苷酸鏈一端依次分開核苷酸的酶。“外切酶”可以是3'端向5'端的外切酶，也 可以是5'端向3'端的外切酶。大腸桿菌核酸外切酶I和外切酶III為兩種具有3'-核 酸外切除單鏈降解活性的常用3' -5'端核酸外切酶。大腸桿菌核酸外切酶VII和T7-核 酸外切酶基因6為具有5'-核酸外切除單鏈降解活性的常用5' -3'端核酸外切酶。核酸外切酶起源于原核生物，諸如大腸桿菌核酸外切酶，或真核生物，諸如酵母、線蟲、小鼠或人類核酸外切酶?？捎糜诒景l(fā)明的核酸外切酶實例包括但不限于大腸桿菌核酸外切酶I、大腸桿菌 核酸外切酶III、大腸桿菌核酸外切酶VII、噬菌體λ核酸外切酶及噬菌體Τ7-核酸外切酶 基因6或其組合物。本文中所用的“單鏈DNA結合蛋白”，也稱為SSB或SSBP，是指結合DNA單鏈區(qū)域 的蛋白。“SSB”可源自人體病毒?！癝SB”可以是單體，諸如噬菌體和病毒體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的許多 蛋白，或者也可以是多聚體，諸如四聚體細菌SSB或異源三聚體真核復制蛋白A(RPA)?？捎糜诒景l(fā)明的單鏈DNA結合蛋白實例包括但不限于極端耐熱單鏈DNA結合蛋白 (ET SSB)、RecA(諸如大腸桿菌RecA(任何由大腸桿菌重組表達的RecA)或其衍生物)、Τ4 基因32單鏈結合蛋白、極端嗜熱RecA(Tth RecA)及大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白或其組合 物。根據(jù)本發(fā)明實施例的酶合劑可包含外切酶和SSB的任意組合。這些組合物實例包 括但不限于由以下各物組成的群組大腸桿菌核酸外切酶I與RecA、大腸桿菌核酸外切酶 III與RecA、大腸桿菌核酸外切酶VII與RecA、噬菌體λ核酸外切酶與RecA、噬菌體Τ7-核 酸外切酶基因6111與RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶III 與TthRecA、大腸桿菌核酸外切酶VII與Tth RecA、噬菌體λ核酸外切酶與Tth RecA、噬菌 體T7-核酸外切酶基因6III與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與ET SSB、大腸桿菌核酸 外切酶I與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶I與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核 酸外切酶III與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌 核酸外切酶III與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶 VII與T4基因32單鏈結合蛋白；以及大腸桿菌核酸外切酶VII與大腸桿菌SSB。體外治療根據(jù)本發(fā)明實施例，通過在反應混合物中將DNA分子和酶合劑進行體外培養(yǎng)，以 此開始、介導或促進擴展供體DNA與受體載體之間的同源重組。反應混合物包含受體載體、擴展供體分子、酶合劑和反應緩沖液。反應緩沖液包含緩沖劑、鹽和腺苷-5'-三磷酸(ATP)，其pH為約5. 0至約9. 0。 在本發(fā)明實施例中，反應緩沖液包含三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、NaCl、EDTA、MgCl2、甘 油、牛血清白蛋白(BSA)、ATP和二硫蘇糖醇(DTT)，pH約為6. 8至7. 4。這些試劑中的每一 種都可由本領域中熟知的在溶液中以類似方式起作用的類似試劑所替代。例如，BSA可由 本領域中熟知的酪蛋白和/或其他試劑替代。NaCl也可由KCl替代。另一方面，本發(fā)明實施例涉及一種用于將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置 的組合物。該組合物包含a)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑，以及b)反應緩沖 液。酶合劑與反應緩沖液可由試劑盒提供，用于將供體DNA分子克隆至受體載體預定 位置，試劑盒也包括克隆中使用酶合劑和反應緩沖液的說明書。試劑盒可能進一步含有用 于克隆中轉化的感受態(tài)細胞。試劑盒也可包括用于克隆的對照載體或DNA分子。酶合劑和反應緩沖液能夠以適用于其應用的多種形式提供。例如，酶合劑能以濃 縮液形式或凍干形式提供，附帶或沒有附帶稀釋或重組緩沖液。反應緩沖液以濃縮或凍干 形式于一個容器中提供。此外，以獨立容器提供的反應緩沖液的一或多種成分可在使用時組合在一起。在本發(fā)明的一個實施例中，反應混合物包含約0. 5至IOng/μ 1受體載體。例如， 反應混合物可含有約0. 5、1、5或IOng/μ 1受體載體。在本發(fā)明的一個實施例中，反應混合物含有約1至約30ng/ μ 1擴展DNA分子。例 如，反應混合物可含有約1、5、10、15、20、25或30ng/μ 1擴展DNA分子。在本發(fā)明的一個實施例中，反應混合物含有約1至約lOOng/μ 1單鏈DNA結合蛋 白。例如，反應混合物可含有約1、5、15、25、35、45、55、65、75、85、95或100mg/l單鏈DNA結
合蛋白ο在本發(fā)明的一個實施例中，反應混合物含有約1至約IOOng/ μ 1外切酶。例如，反 應混合物可含有約 1、5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 或 100mg/l 外切酶。在本發(fā)明的一個實施例中，IL反應混合物含有約Ig至IOg Tris (例如約5g Tris)；約 0. Ig 至 IOg NaCl (例如約 5g)；約 0. Ig 至 IOg EDTA (例如約 2g)；約 0. Ig 至約 IOg MgCl2 (例如約Ig)；約IOg至約200g甘油(例如約50g)；約IOg至50g BSA (例如約 20g)；約0. Ig至約IOg ATP (例如約Ig)；約0. Ig至約IOg DDT (例如約Ig)；約Img至約 IOOmgRecA (例如75mg)(例如，大腸桿菌RecA，任何經(jīng)大腸桿菌重組表達的RecA或其衍生 物)；約Img至約IOOmg大腸桿菌核酸外切酶VII (例如約35mg)。反應混合物進一步包含 約0. 5ng/ μ 1至約IOng/ μ 1線性載體(例如5ng/ μ 1)以及約lng/ μ 1至約30ng/ μ 1擴展 供體DNA (諸如約5至約15ng/ μ 1)。反應混合物的ρΗ可以為約5. 0至約9. 0，例如約6. 8 至7. 4左右或約7. 6。在本發(fā)明實施例中，反應混合物在約10至38°C溫度下培養(yǎng)10至60分鐘。在本發(fā)明的另一實施例中，反應混合物在室溫下培養(yǎng)約30分鐘。應注意的是，本發(fā)明不限于本文中所述的濃度、成分或實驗條件。也可使用等效濃 度、成分或實驗條件。細胞轉化反應混合物體外培養(yǎng)后形成中間產(chǎn)物。由本發(fā)明內(nèi)容可知，使用本行業(yè)熟知的方 法可將中間產(chǎn)物轉化至宿主細胞內(nèi)。中間產(chǎn)物可通過傳統(tǒng)轉化或轉染技術引入原核或真核細胞內(nèi)，這些技術包括但不 限于磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導轉染、脂質轉染、原生質體融合及 病毒感染。轉化或轉染宿主細胞的適當方法可見Sambrook等人(supra)的著作及其他實
驗室手冊。對于穩(wěn)定轉染哺乳動物細胞而言，可知只有一小部分細胞可將外源DNA集成到其 基因組內(nèi)，這取決于所用的表達載體和轉染技術而定。為了識別和選擇這些整合體，通常將 編碼選擇性標記(例如，抗生素抗性)的基因隨基因興趣引入宿主細胞。優(yōu)選考慮的選擇 性標記包括賦予抗藥性的標記，例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤藥物。經(jīng)引入核酸穩(wěn)定轉染的 細胞可通過藥物選擇進行識別(例如，亦并入選擇性標記基因的細胞才能生存，而其他細 胞則死亡)。適用于本發(fā)明轉化的細胞包括但不限于細菌細胞(例如革蘭氏陰性細菌細胞或 革蘭氏陽性細菌細胞)、酵母細胞、哺乳動物細胞等。在本發(fā)明的一個實施例中，用于轉化的細胞為感受態(tài)大腸桿菌細胞。例如，約2-10 μ 1反應混合物經(jīng)培養(yǎng)根據(jù)標準轉化程序用于轉化50 μ 1感受態(tài)細胞。已轉化的細胞可在選擇介質上進行選擇。含有重組DNA的細胞包含在受體載體預 定位置插入的供體DNA，使用PCR篩選方法可進行篩選。不希望被理論束縛，大家相信在本發(fā)明實施例的方法中，同源重組是在受體載體 和供體DNA的體外治療過程中發(fā)生和介導的，且在轉化細胞體內(nèi)完成。大家相信在體外治 療中，外切酶作用于線性擴展供體DNA分子的兩端，得到兩端單鏈DNA(ssDNA)突出部分。單 鏈結合蛋白(SSB)結合至ssDNA突出部分，以便防止其降解，特別是引入宿主細胞，例如大 腸桿菌。人們相信體外治療后形成的中間產(chǎn)物中，ssDNA突出部分與受體載體的第一或第 二區(qū)域中互補序列形成堿基對相互作用。當中間產(chǎn)物引入宿主細胞時，同源重組分別在第 一區(qū)域和第一序列及第二區(qū)域和第二序列之間發(fā)生，從而得到宿主細胞的重組功能。不考慮其實際機制，發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明方法，可將不同大小的供體DNA分子高效克 隆至載體預定位置。表1總結了 1千堿、2千堿和3千堿大小的供體DAN分子至UC57載體的克隆結果。表權利要求
1.一種將供體DNA分子克隆至受體載體預定位置的方法，該方法包含以下步驟a)通過將第一序列和第二序列分別添加至供體DNA分子的5'端和3'端來制備擴展 供體DNA分子，其中，第一序列和第二序列中的任一者獨立地至少具12個核苷酸長，且與受 體載體的第一區(qū)域和第二區(qū)域分別至少有90%相一致；b)提供包含以下物質的反應混合物i)受體載體， )擴展供體DNA分子，及iii)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；c)反應混合物經(jīng)培養(yǎng)獲得中間產(chǎn)物；d)利用中間產(chǎn)物進行細胞轉化，獲得轉化細胞；及e)在一定條件下培養(yǎng)該轉化細胞，得到包含位于第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的供體DNA 的重組DNA分子。
2.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中該受體載體為環(huán)形載體或線性載體。
3.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中該第一區(qū)域與該第二區(qū)域分別位于線性載體的 3'端和5'端。
4.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中第一序列與第二序列分別于第一區(qū)域與第二區(qū)域完全一致。
5.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中利用包含第一序列的第一聚合酶鏈反應(PCR) 引物和包含第二序列補體的第二 PCR引物，通過聚合物酶鏈反應制備擴展供體DNA分子。
6.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中外切酶選自由以下各物組成的群組大腸桿菌 核酸外切酶I、大腸桿菌核酸外切酶III、大腸桿菌核酸外切酶VII、噬菌體λ核酸外切酶、 噬菌體Τ7-核酸外切酶基因及其組合物。
7.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中單鏈DNA結合蛋白選自由以下各物組成的群組 極端耐熱單鏈DNA結合蛋白(ET SSB)、RecA、T4基因32單鏈結合蛋白、嗜熱棲熱菌RecA (Tth RecA)及大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白(SSB)及其組合物。
8.根據(jù)權利要求項7所述的方法，其中酶合劑包含由以下酶組合物組成的群組大腸 桿菌核酸外切酶I與RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與RecA、大腸桿菌核酸外切酶VII與 RecA、噬菌體λ核酸外切酶與RecA、噬菌體Τ7-核酸外切酶基因6ΙΙΙ與RecA、大腸桿菌核 酸外切酶I與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶VII 與Tth RecA、噬菌體λ核酸外切酶與Tth RecA、噬菌體Τ7-核酸外切酶基因6ΙΙΙ與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶I與T4基因32單鏈結合蛋 白、大腸桿菌核酸外切酶I與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與ET SSB、大腸桿菌 核酸外切酶III與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶III與大腸桿菌SSB、大 腸桿菌核酸外切酶VII與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與T4基因32單鏈結合蛋白； 以及大腸桿菌核酸外切酶VII與大腸桿菌SSB。
9.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中反應混合物包含約1至約100mg/l的外切酶以 及約1至約100mg/l的單鏈DNA結合蛋白。
10.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中反應混合物進一步包含約1至約10mg/l三 (羥甲基)氨基甲烷(Tris)、約1至約10mg/l的NaCl、約0. 1至約10mg/l對乙二胺四乙酸(EDTA)、約0. 1至約10mg/l氯化鎂、約10至約200g/l的甘油、約10至50mg/l的牛血 清白蛋白(BSA)、約0. 1至約10mg/l腺苷-5'-三磷酸(ATP)、0. 1至約10g/l 二硫蘇糖醇 (DTT)，且其中反應混合物的pH為約5. 0至約9. 0。
11.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中步驟(c)中，在約10°C至約38°C的溫度下培養(yǎng) 約15分鐘至約60分鐘。
12.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中細胞為大腸桿菌細胞，且受體載體為包含復制 起點的質粒，其在大腸桿菌細胞中指揮質粒的復制。
13.根據(jù)權利要求項1所述的方法，其中轉化細胞表達了來自重組DNA的標記基因，該 標記基因使得轉化細胞的選擇或篩選得以完成。
14.一種用于將供體DNA分子在預定位置克隆至受體載體內(nèi)的組合物，其包含a)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑；以及b)反應緩沖液。
15.根據(jù)權利要求項14所述的組合物，其中外切酶選自由以下各酶組成的群組大腸 桿菌核酸外切酶I、大腸桿菌核酸外切酶III、大腸桿菌核酸外切酶VII、噬菌體λ核酸外切 酶及噬菌體Τ7-核酸外切酶基因6。
16.根據(jù)權利要求項14所述的組合物，其中單鏈DNA結合蛋白選自由以下蛋白組成的 群組極端耐熱單鏈DNA結合蛋白、RecA、T4基因32單鏈結合蛋白、嗜熱棲熱菌RecA(Tth RecA)及大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白。
17.根據(jù)權利要求項16所述的組合物，其中包含酶組合物的酶合劑選自由以下各物組 成的群組大腸桿菌核酸外切酶I與RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與RecA、大腸桿菌核 酸外切酶VII與RecA、噬菌體λ核酸外切酶與RecA、噬菌體T7-核酸外切酶基因6111與 RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶III與Tth RecA、大腸桿菌 核酸外切酶VII與Tth RecA、噬菌體λ核酸外切酶與Tth RecA、噬菌體Τ7-核酸外切酶基 因6III與Tth RecA、大腸桿菌核酸外切酶I與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶I與T4基因 32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶I與大腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶III與T4基因32單鏈結合蛋白、大腸桿菌核酸外切酶III與大 腸桿菌SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與ET SSB、大腸桿菌核酸外切酶VII與T4基因32單 鏈結合蛋白；以及大腸桿菌核酸外切酶VII與大腸桿菌SSB。
18.一種用于在預定位置將供體DNA分子克隆至受體載體內(nèi)的試劑盒，該試劑盒包含a)權利要求14項的組合物；以及b)在克隆中使用這些組合物的說明書。
19.根據(jù)權利要求項18所述的試劑盒，其進一步包含用于克隆的感受態(tài)細胞。
20.一種用于將供體DNA分子在預定位置克隆至受體載體內(nèi)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含a)受體載體，b)在供體DNA分子的5'端和3'端分別包含第一序列和第二序列的擴展供體DNA分 子，其中第一序列與第二序列中的任一者獨自地至少具12個核苷酸長，且分別于受體載體 的第一區(qū)域與第二區(qū)域至少90%—致；c)包含外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑，以及d)細胞隨包含(a)、(b)和(c)的反應混合物培養(yǎng)后形成的中間產(chǎn)物發(fā)生轉化，借此轉化細胞產(chǎn)生了包含位于第一區(qū)域與第二區(qū)域之間的供體DNA的重組DNA分子c
全文摘要
本發(fā)明涉及將供體DNA分子在預定位置克隆至受體載體內(nèi)的方法和組合物。這些方法基于供體DNA、受體載體以及含有外切酶和單鏈DNA結合蛋白的酶合劑的體外治療介導的同源重組。
文檔編號C12N15/74GK102124112SQ200980143524
公開日2011年7月13日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權日2008年9月10日
發(fā)明者楊平, 柳偉強, 王濤, 王珠銀, 章方良, 陳文柱 申請人:金斯瑞公司