專利名稱：：產(chǎn)生腺病毒載體的方法產(chǎn)生腺病毒載體的方法本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞、用腺病毒感染這些細(xì)胞以及從中產(chǎn)生腺病毒顆粒的改良的方法。
背景技術(shù)：
：近年來在使用重組病毒載體的DNA免疫接種領(lǐng)域中的進(jìn)展產(chǎn)生了大規(guī)模生產(chǎn)臨床級材料的需要。需要能支持欠發(fā)達(dá)和最不發(fā)達(dá)國家足夠量的重組基于腺病毒的疫苗以對抗肺結(jié)核和瘧疾問題的方法。出生組評估示出在2010-2015年在欠發(fā)達(dá)和最不發(fā)達(dá)地區(qū)預(yù)期有150，000，000以上的出生人口?；谶@個出生組，預(yù)計每年需要的疫苗可達(dá)到大約1.5xl019病毒顆粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asp？panel=2)。已經(jīng)描述了一些生產(chǎn)腺病毒的方法。這些方法使用在滾瓶、細(xì)胞工廠(NimclonfromNuncorCellStackfromCorning)或者CellCubes(Corning)中的粘附細(xì)胞培養(yǎng)。粘附細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)過程不能滿足基于腺病毒疫苗的世界范圍需要。因此，用于粘附方法中的細(xì)胞經(jīng)改造適合懸浮培養(yǎng)(例如HEK293和PER.C6細(xì)胞系)。使用懸浮培養(yǎng)可以使生產(chǎn)方法至大規(guī)模生物反應(yīng)器范圍。腺病毒生產(chǎn)的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)通常在3-20L規(guī)模實現(xiàn)，有報道已經(jīng)成功擴大至100L(Kamenetal.，2004)和250L(Xieetal.，2003)。報道了其中預(yù)期擴大至10，000L規(guī)模的實驗(Xieetal.，2003)。然而，擴大至10，000L規(guī)模的主要缺點是高資金總額(CAPEX)，需要設(shè)計和建造10，000L的生物反應(yīng)器設(shè)備。此外，在BSL2條件下建造10，000L設(shè)備的CAPEX投入必須在甚至難以預(yù)料所述產(chǎn)物是否能成功之前實現(xiàn)(IV期及以外)。10，000L生物反應(yīng)器設(shè)備的總投資費用在C225，000，000至e320，000，000之間(Estapeetal.,2006)因此，在較小規(guī)模如在1000L或者更小的生物反應(yīng)器中制備是可取的。使用現(xiàn)有的方法，在1000L規(guī)模必須一年生產(chǎn)超過150批次以達(dá)到1.^dO19VP/年的目標(biāo)。因此，需要改良腺病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，改良腺病毒顆粒的產(chǎn)量，以滿足腺病毒疫苗在世界范圍的需要，優(yōu)選在非過高成本下滿足該需要。腺病毒生產(chǎn)優(yōu)化中遇到的一個問題是所謂的“細(xì)胞密度效應(yīng)”。在分批模式操作中，一些參考文獻(xiàn)提示在腺病毒生產(chǎn)中存在感染時的最佳細(xì)胞密度。最佳密度在0.5-lxlO6個細(xì)胞/mL之間(Marangaetal.，2005；Kamenetal.,2004)在一批攪拌罐生物反應(yīng)器中產(chǎn)生腺病毒(Ac^)示出，直至大約0.虹106個細(xì)胞/mL時，每個細(xì)胞的病毒生產(chǎn)率仍保持恒定，但是在大約IxlO6個細(xì)胞/mL時突然下降(Altarasetal.，2005)。超過hlO6個細(xì)胞/mL時，無感染性病毒顆粒可檢測出。產(chǎn)量隨感染的細(xì)胞密度而下降，與具體產(chǎn)量相關(guān)的斷點(breakpoint)是培養(yǎng)基依賴性的。迄今為止還沒有可商購的培養(yǎng)基示出具有支持病毒顆粒高產(chǎn)量同時保持在IxlO6個細(xì)胞/mL以上的細(xì)胞密度特異性最佳生產(chǎn)的潛力(Kamenetal.，2004)。這種下降的原因還未知，但是可能是由于對于病毒生產(chǎn)的優(yōu)先的養(yǎng)分有效性，或者由于對于病毒生產(chǎn)是抑制性的高代謝物濃度所致。補料分批運行如添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸使得可以在直至&106個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度感染。然而，在高細(xì)胞密度實現(xiàn)的生產(chǎn)率低于在IxlO6個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度進(jìn)行感染獲得的那些生產(chǎn)率(Kamenetal.，2004)。在灌注方法中，細(xì)胞通過中空纖維、旋轉(zhuǎn)過濾器(spinfilter)或者聲波分離器(acousticseparators)被保留在生物反應(yīng)器中，而培養(yǎng)基灌注在生物反應(yīng)器中。在這些方法中，有時可達(dá)到>IOOxlO6個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度(例如^llopetal.，2005)。感染的灌注細(xì)胞示出在用中空纖維系統(tǒng)灌注期間不成熟細(xì)胞喪失。這也許與病毒感染所致其較高的剪切靈敏性相關(guān)(Cortinetal.，2004)。在管狀材料、中空纖維中產(chǎn)生的水壓或者對更脆弱的感染的細(xì)胞的蠕動泵是導(dǎo)致這種現(xiàn)象的最可能的因素。由于感染的細(xì)胞更脆弱，如果在整個感染期間要保持灌注，已經(jīng)特別提議聲波分離器(Henryetal.,2004)是可取的。然而，以灌注模式進(jìn)行的感染僅可以維持細(xì)胞密度最多為3xl06個細(xì)胞/mL,灌注速度為2vol/天。在6xl06個細(xì)胞/mL細(xì)胞密度感染導(dǎo)致單位生產(chǎn)率降低5倍(Henryetal.，2004)。盡管其它研究人員報道了細(xì)胞密度的作用，但是有一篇報道(Yuketal,2004)描述了人腫瘤細(xì)胞的成功灌注培養(yǎng)，作為溶癌腺病毒載體的生產(chǎn)平臺。該報道描述了使用交替切向流(ATF)技術(shù)的高細(xì)胞密度灌注方法。觀測到在^d06HeLaS3個細(xì)胞/mL感染的平均存活細(xì)胞密度及大約^IO11VPAiL的平均病毒效價。該報道中使用的腫瘤細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞是不優(yōu)選的，因為當(dāng)產(chǎn)生的腺病毒顆粒給予人體時使用腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)安全危險。該報道中的重組腺病毒基于Ad5。這種腺病毒用作疫苗的可能性有限，因為大部分人群含有先存在的Ad5中和抗體，來自其它血清型的重組腺病毒因此更適合用作疫苗(見例如WO00/70071)。具體地，來自亞組B的重組腺病毒如Ad35特別有利于用作疫苗(W000/70071)。有限的信息(如果存在的話)可用于從除了Ad5之外的其它血清型中大規(guī)模生產(chǎn)重組腺病毒，特別是有益的血清型35。Ad35與Ad5之間的一些差異已經(jīng)關(guān)于使用陰離子交換對其純化進(jìn)行了描述(例如WO2005/080556)。不同血清型的重組腺病毒的一些不同的物理性質(zhì)在生產(chǎn)過程或者在某些條件下可以導(dǎo)致差異的出現(xiàn)。這種潛在的差異在工業(yè)規(guī)模尤為重要，其中甚至表面上看在小規(guī)模的較小差異對于每年世界范圍的需求產(chǎn)量的預(yù)測規(guī)模可具有較大的經(jīng)濟后果。例如，目前還未知報道的細(xì)胞密度對于Ad5的作用與對于其它血清型的作用是否相似。因此，為了滿足世界范圍對于rAd35疫苗的需要，需要改良重組腺病毒血清型35(rAd35)的生產(chǎn)系統(tǒng)。發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)在灌注培養(yǎng)中生產(chǎn)細(xì)胞在超過IOxlO6個存活細(xì)胞/mL的密度被感染時，重組腺病毒血清型35(rAd30的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。相反，當(dāng)生產(chǎn)細(xì)胞在20xl06或者30xl06個存活細(xì)胞/mL被感染時與在IOxIO6個存活細(xì)胞/mL被感染時相比時，重組腺病毒血清型5(rAd5)的產(chǎn)量較低。因此，在應(yīng)用的條件下rAd35與rAd5在生產(chǎn)細(xì)胞中的增殖不同。此外，我們再次觀測到另一血清型的不同表現(xiàn)，提示對于具體的腺病毒血清型的處理可以針對每個血清型進(jìn)行調(diào)整，以獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明提供了在如下方面優(yōu)化的rAd35生產(chǎn)系統(tǒng)產(chǎn)量、獲得的rAd35的質(zhì)量以及收獲物下游處理的便利性。本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組腺病毒血清型35(rAd30的方法，所述方包括a)用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為大約IOxlO6個存活細(xì)胞/mL至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞，以使所述rAd35增殖；以及d)收獲所述rAd35。在某些實施方案中，用rAd35感染其密度為大約IOxlO6至HxlO6個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，步驟c)中所述灌注系統(tǒng)是交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)。在其它優(yōu)選的實施方案中，步驟a)中所述灌注系統(tǒng)是交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)。在一優(yōu)選的實施方案中，步驟a)和c)中所述灌注系統(tǒng)是交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括e)純化所述rAd35。在進(jìn)一步的實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括f)制備含有純化的rAd35的藥物組合物。在某些實施方案中，所述重組腺病毒缺少至少一部分El區(qū)域，及包含異源核酸。在優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生的rAd35的物理顆粒(physicalparticle)與感染性顆粒(VP/IU)比率低于301，優(yōu)選低于201。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生至少lX1012rAd35病毒顆粒(VP)/mL的方法，所述方法包括a)用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為大約IOxlO6個存活細(xì)胞/mL至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞，以使所述rAd35增殖，從而rAd35病毒顆粒的濃度達(dá)到至少lxl012VP/mL；以及d)收獲所述rAd350本發(fā)明還提供了工作體積在2L-1000L之間的生物反應(yīng)器，其包含培養(yǎng)基、生產(chǎn)細(xì)胞以及至少lxl012rAd35病毒顆粒(VP)/mL。在某些實施方案中，所述生物反應(yīng)器的工作體積在50L-500L之間。在優(yōu)選的實施方案中，所述生物反應(yīng)器與ATF灌注系統(tǒng)連接。附圖簡述圖1在搖瓶中在高細(xì)胞密度下用rAd5感染。圖2在搖瓶和2L生物反應(yīng)器中在高細(xì)胞密度下用rAd35.TB-S感染。圖3在搖瓶中在高細(xì)胞密度下用rAd35.eGFP感染。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了生產(chǎn)大量重組腺病毒35的新方法。這個優(yōu)化的方法依賴于在高細(xì)胞密度感染培養(yǎng)物以及保持高病毒生產(chǎn)率/細(xì)胞的能力。本發(fā)明提供管理在一個生物反應(yīng)器中獲得具有高病毒濃度的收獲的病毒溶液的方法。現(xiàn)有方法的rAd35的典型產(chǎn)量是大約2-3xl0nVP/mLo事實上，確信使用本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生大批量的rAd35顆粒，例如至少大約^dO11VPAiL,優(yōu)選至少大約6、7、8或者^dO11VPAiL優(yōu)選地，產(chǎn)生至少lxl012VP/mL的rAd35,更優(yōu)選至少1.5xl012VP/mL,更優(yōu)選至少hl012VP/mL，例如在大約IxlO12至^lO12VP/mL之間。典型地，所述方法產(chǎn)生不超過大約lxl013VP/mL的rAd35。使用本發(fā)明的方法可獲得的產(chǎn)量可能足以制備世界范圍需要量的某些基于rAd35的疫苗，而不需要工作體積超過1000L的生物反應(yīng)器設(shè)備。本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組腺病毒血清型35(rAd30的方法，所述方法包括a)使用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為至少IOxlO6個存活細(xì)胞/mL的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞以使所述rAd35增殖；及d)收獲所述rAd35。在某些實施方案中，用rAd35感染其密度為大約IOxlO6至50xl06個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，用rAd35感染其密度為大約IOxlO6至20xl06個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，用rAd35感染其密度為大約IOxlO6至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞，例如大約10、11、12、13、14或者15xl06個存活細(xì)胞/mL。在其它實施方案中，用rAd35感染其密度為大約20xl06至50xl06個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞和重組腺病毒本發(fā)明的生產(chǎn)細(xì)胞(在本領(lǐng)域及本文有時也稱作“包裝細(xì)胞”或者“互補細(xì)胞”或者“宿主細(xì)胞”)可以是任何生產(chǎn)細(xì)胞，其中希望的腺病毒可以被增殖。例如，重組腺病毒載體的增殖在互補腺病毒缺陷的生產(chǎn)細(xì)胞中進(jìn)行。這種生產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)選在其基因組中具有至少一個腺病毒El序列，從而能互補重組腺病毒El區(qū)中的缺失。此外，腺病毒可具有E3區(qū)缺失，其可以從Ad基因組中缺失，并因此這種缺失不必互補。任何El互補的生產(chǎn)細(xì)胞均可以使用，如通過El永生化的人視網(wǎng)膜細(xì)胞，例如911或者PER.C6細(xì)胞(見美國專利5，994，128)、E1-轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞(見歐洲專利1230354)、E1_轉(zhuǎn)化的A549細(xì)胞(見例如WO98/39411、美國專利5，891，690)、GH3^:HeLa(Gaoetal，2000，HumanGeneTherapy11213-219)、293等等。在某些實施方案中，所述生產(chǎn)細(xì)胞是例如HEK293細(xì)胞，或者PER.C6細(xì)胞，或者911細(xì)胞，或者ID93SF細(xì)胞等等。優(yōu)選地，PER.C6細(xì)胞(ECACC保藏號9602^40；見美國專利5，994，128)或者衍生自其中的細(xì)胞用作生產(chǎn)細(xì)胞。本文示出重組腺病毒35(rAd3Q在應(yīng)用高細(xì)胞密度感染的方法中具有與rAd5相比未知的有利的性質(zhì)。我們現(xiàn)已知另一血清型在相似方法中具有不同表現(xiàn)，提示對于不同血清型必須確立重組腺病毒的大規(guī)模生產(chǎn)的最佳條件。因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的腺病毒是rAd35。優(yōu)選地，所述腺病毒載體在腺病毒基因組El區(qū)的至少一個必需基因功能中是缺陷的，例如為病毒復(fù)制必需的腺病毒基因組的El區(qū)的至少一個必需基因功能，例如Ela區(qū)和/或Elb區(qū)。在某些實施方案中，所述載體缺失El區(qū)及至少一部分非必需E3區(qū)的至少一個必需基因功能。腺病毒載體可以是“多重缺陷的”，是指所述腺病毒載體在腺病毒基因組的兩或多個區(qū)域的每一個區(qū)域中缺失一或多個基本的基因功能。例如，前述El缺失的或者El、E3缺陷的腺病毒載體可進(jìn)一步缺失E4區(qū)的至少一個必需基因和/或E2區(qū)的至少一個必需基因(例如E2A區(qū)和/或E2B區(qū))。缺失全部E4區(qū)的腺病毒載體可激發(fā)較低的宿主免疫應(yīng)答。舉例的合適的腺病毒載體包括這樣的腺病毒載體，其缺少(a)所有或者一部分El區(qū)及所有或者一部分E2區(qū)，(b)所有或者一部分El區(qū)，所有或一部分E2區(qū)，以及所有或一部分E3區(qū)，(c)所有或一部分El區(qū)，所有或一部分E2區(qū)，所有或一部分E3區(qū)，以及所有或一部分E4區(qū)，(d)至少一部分Ela區(qū)，至少一部分Elb區(qū)，至少一部分E2a區(qū)，以及至少一部分E3區(qū)，(e)至少一部分El區(qū)，至少一部分E3區(qū)，以及至少一部分E4區(qū)，以及(f)所有必需的腺病毒基因產(chǎn)物(例如包含ITR的腺病毒復(fù)制子以及僅包裝信號)。如技術(shù)人員已知，在缺失腺病毒基因組必需區(qū)域的情況中，由這些區(qū)域編碼的功能必須反式(intrans)提供，優(yōu)選由生產(chǎn)細(xì)胞提供，即當(dāng)腺病毒中缺失一部分或者全部E1、E2和/或E4區(qū)時，這些區(qū)域必須存在于生產(chǎn)細(xì)胞中，例如整合進(jìn)基因組中，或者以所謂的輔助腺病毒或者輔助質(zhì)粒形式存在。復(fù)制缺陷的腺病毒載體可以通過使用腺病毒的任何種、株系、亞型或者種、株系或亞型混合物或者嵌合的腺病毒作為載體DNA來源(見例如WO96/26281,WO00/030所述)，例如可提供具有感染某些所希望細(xì)胞類型的能力的腺病毒載體。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，rAd35用作腺病毒。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的腺病毒缺少至少一部分El區(qū)，例如ElA和/或ElB編碼序列，且進(jìn)一步包含異源核酸。合適的異源核酸為技術(shù)人員熟知，例如可包括轉(zhuǎn)基因開放讀框，編碼當(dāng)rAd載體用于免疫接種目的時預(yù)期對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的多肽的開放讀框，例如適于產(chǎn)生抗瘧疾(見例如WO2004/055187)、HIV、肺結(jié)核(見例如WO2006/053871)、某些病毒等的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因，所有這些均為技術(shù)人員熟知。事實上，異源核酸的性質(zhì)對于本發(fā)明不是關(guān)鍵因素，可以是任何異源核酸，因此在此不需要進(jìn)一步詳述。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到在特定的宿主細(xì)胞上使不同血清型的腺病毒載體增殖的可能性，使用如美國專利6，492，169或者WO03/104467及其中的參考文獻(xiàn)中揭示的方法進(jìn)行。例如，為了增殖El-缺陷的rAd35，可以構(gòu)建表達(dá)Ad35的E1B_5^(的具體生產(chǎn)細(xì)胞，例如基于表達(dá)Ad5的ElA和ElB的現(xiàn)有生產(chǎn)細(xì)胞構(gòu)建，如PER.C6或者HEK293細(xì)胞(見例如US6，492，169)，這些為技術(shù)人員已知?；蛘呋騼?yōu)選地，可以使用現(xiàn)有的(Ad5_)互補細(xì)胞系如PER.C6或者HEK293，不用修飾所述細(xì)胞以增殖El-缺陷的rAd35，通過在rAd35載體中包含Ad5的E4-orf6編碼序列，如WO03/104467揭示，所述專利以其全部內(nèi)容并入本文作參考。因此，可以在生產(chǎn)細(xì)胞上進(jìn)行任何血清型的腺病毒載體的增殖，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式和方法進(jìn)行。腺病毒載體、構(gòu)建其的方法以及增殖其的方法為本領(lǐng)域熟知，在例如美國專利No.5，559，099,5,837，511,5,846，782,5,851，806,5,994，106、5，994，128、5，965，541、5，981，225、6，040，174、6，020，191和6，113，913以及ThomasShenk,“AdenoviridaeandtheirReplication",Μ.S.Horwitz,"Adenoviruses“,Chapters67and68,respectively,inVirology,B.N.Fieldsetal.,eds.,3ded.,RavenPress,Ltd.，NewYork(1996)及本文提及的其它參考文獻(xiàn)中描述。腺病毒載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域熟知，包括使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，如在Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)、Watsonetal.,RecombinantDNA,2ded.,ScientificAmericanBooks(1992)及Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995)及本文提及的其它參考文獻(xiàn)中描述。培養(yǎng)本發(fā)明的生產(chǎn)細(xì)胞以增加細(xì)胞和病毒數(shù)目和/或病毒效價。培養(yǎng)細(xì)胞以使其代謝和/或生長和/或分裂和/或產(chǎn)生本發(fā)明的病毒。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實現(xiàn)，包括但不限于為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，例如在合適的培養(yǎng)基中?？梢允褂貌煌呐囵B(yǎng)基，且針對使用的細(xì)胞和環(huán)境選擇最佳培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作的一部分。對于本發(fā)明合適的培養(yǎng)基因此為技術(shù)人員熟知，且通?？梢源笈康米陨虡I(yè)資源，或者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案定制?？梢栽诶缗囵B(yǎng)皿、滾瓶或者生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，使用分批、補料分批、連續(xù)系統(tǒng)等方式培養(yǎng)。為了實現(xiàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模(連續(xù))生產(chǎn)病毒，優(yōu)選使細(xì)胞能懸浮生長，且優(yōu)選使細(xì)胞能在不存在得自動物或人的血清或者得自動物或人血清成分的條件下培養(yǎng)。本領(lǐng)域已知培養(yǎng)細(xì)胞的合適條件(見例如TissueCulture,AcademicPress,KruseandPaterson,editors(1973),及R.I.Freshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique,fourthedition(ffiley-LissInc.,2000,ISBN0-471-34889-9)。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)生物反應(yīng)器已經(jīng)廣泛用于從懸浮依賴性動物細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模生產(chǎn)生物制品。根據(jù)本發(fā)明，用于腺病毒增殖的生物反應(yīng)器可例如是攪拌罐、一次性生物反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，所述生物反應(yīng)器是攪拌罐。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述生物反應(yīng)器的工作體積在大約2L-2000L之間，“之間”是指包括所述上限和下限值，即2L是最小的工作體積，2000L是最大工作體積。具有在這些數(shù)值之間任何值的工作體積的生物反應(yīng)器均包含在本發(fā)明中。對于數(shù)值而言所用術(shù)語“大約”是指所述數(shù)值士10%。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述工作體積在10L-1000L之間，優(yōu)選在20L-800L之間，例如在30L-600L、50L-500L之間，例如為大約250L或者大約500L。使用根據(jù)本發(fā)明的工作體積的生物反應(yīng)器的優(yōu)勢是避免非常大體積的生物反應(yīng)器，即工作體積超過2000L、優(yōu)選1000L的生物反應(yīng)器，及因此不需要建造這種非常大的生物反應(yīng)器的巨大資本和時間投資。此外，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時所述產(chǎn)物-即rAd-是更濃縮的，節(jié)省了從生物反應(yīng)器中收獲和/或進(jìn)一步下游處理rAd的時間和成本。所述工作體積是生物反應(yīng)器中有效的培養(yǎng)體積。攪拌罐一般的高度與直徑比率為11至31?；谌~輪或者螺旋槳形式，所述培養(yǎng)物通常與一或多個攪拌器混合。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了比葉輪形式提供較低剪切力的攪拌系統(tǒng)。攪拌可以通過磁性結(jié)合驅(qū)動裝置直接或者間接驅(qū)動。間接驅(qū)動降低了攪拌器軸上密封裝置帶來的微生物污染的風(fēng)險。所述生物反應(yīng)器的裝置和控件包括(但不限于)攪拌速度、溫度、溶解氧、PH和生物量控制。細(xì)胞培養(yǎng)基的攪拌速度、pH、溫度、溶解氧濃度原則上不重要，依賴于選擇的細(xì)胞的類型。優(yōu)選地，選擇攪拌速度、PH、溫度、溶解氧濃度，由此對于細(xì)胞生長是最佳的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣發(fā)現(xiàn)對于培養(yǎng)的最佳攪拌速度、pH、溫度、溶解氧濃度。通常地，最佳攪拌速度在50-300rpm之間，例如100_250rpm，最佳pH在6.7-7.7之間，最佳溫度在30-39°C之間，例如34、35、36、37或者38°C。大多數(shù)大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)是分批或者補料分批方式培養(yǎng)，因為其是最簡單的運行和擴大生產(chǎn)模式。然而，基于灌注原理的連續(xù)處理變得更常見。根據(jù)本發(fā)明，將生產(chǎn)細(xì)胞在灌注系統(tǒng)中培養(yǎng)。細(xì)胞的灌注培養(yǎng)具有其在本領(lǐng)域的常規(guī)含義，即是指在培養(yǎng)期間細(xì)胞通過分離裝置被保留，所述分離裝置中有細(xì)胞密度低于分離之前的液體的流出道，及其中還有細(xì)胞培養(yǎng)基的流入道。灌注培養(yǎng)的使用是響應(yīng)高密度生長速度細(xì)胞的挑戰(zhàn)(例如10-50xl06個存活細(xì)胞/mL)。為了使密度增加超過2_4χ106個存活細(xì)胞/mL，將培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基持續(xù)或者間斷地更換，以彌補營養(yǎng)缺乏及除去毒性產(chǎn)物。灌注也可以更好地控制培養(yǎng)環(huán)境(pH、d02、營養(yǎng)物水平等)。新鮮培養(yǎng)基經(jīng)過培養(yǎng)物灌注中可以通過用各種分離裝置保留細(xì)胞而實現(xiàn)(例如細(xì)孔旋轉(zhuǎn)過濾器，中空纖維或者平板膜過濾器，沉淀管)。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述分離裝置是包含中空纖維的過濾器模塊。術(shù)語“中空纖維”是指管狀膜。該管的內(nèi)徑優(yōu)選在0.3-6.Omm之間，更優(yōu)選在0.5-3.Omm之間，最優(yōu)選在0.5-2.Omm之間。在某些實施方案中，選擇膜的目徑(孔徑)，由此網(wǎng)孔的大小接近于細(xì)胞的直徑，保證細(xì)胞的高度保留，同時細(xì)胞碎片可通過該濾膜。在其它實施方案中，所述目徑明顯小于細(xì)胞的直徑。優(yōu)選地，所述目徑在0.1-30μπι之間，例如在0.1-3μm之間，例如大約0.2μm。包含中空纖維的過濾器模塊可商購自例如GeneralElectric(從前的Amersham)。在本發(fā)明方法的過程中，盡管腺病毒顆粒小于應(yīng)用的目徑，8但是在流出的培養(yǎng)基中未觀測到顯著量的腺病毒顆粒。使用灌注以保持希望水平的某些代謝物，及除去并從而降低培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。灌注速度可以通過各種方式測量，如在灌注期間必須保持的置換體積/單位時間或者某些代謝物的水平。典型地，灌注不是在培養(yǎng)期間的所有時間均進(jìn)行的，一般僅在培養(yǎng)期間如期間或進(jìn)行。例如，典型地，直至在某些培養(yǎng)基成分如葡萄糖開始變得耗盡及需要更換之后灌注才開始。一些灌注系統(tǒng)為本領(lǐng)域已知，且原則上適合本發(fā)明的方法。術(shù)語“灌注系統(tǒng)”是指生物反應(yīng)器與分離裝置連接的組合。所述分離裝置可以并入所述生物反應(yīng)器中(例如細(xì)網(wǎng)孔旋轉(zhuǎn)過濾器)或者保持在所述生物反應(yīng)器之外(例如中空纖維)。在這兩種情況中，如上文解釋，所述分離裝置防止細(xì)胞團塊從反應(yīng)器中清除并可以使培養(yǎng)基更新。本發(fā)明人使用一些灌注系統(tǒng)進(jìn)行了試驗，其中交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)給出最佳結(jié)果。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述生物反應(yīng)器與ATF灌注系統(tǒng)(與其連接)一起運行(例如ATFSystem,RefineTechnology,Co.,EastHanover，NJ)。所述系統(tǒng)由裝配在中空纖維外套的一端的隔膜泵組成。所述外套的另一端附著聯(lián)接件(jointassembly),其通過可用的接口(availableport)與生物反應(yīng)器連接。所述隔膜泵和控制系統(tǒng)通過中空纖維產(chǎn)生交替切向流。這是指存在與中空纖維的膜表面相同方向(即正切方向)的一個流向，其流向是前后方向(goingbackandforth)，以及存在與所述過濾器表面基本垂直方向的另一流向。切向流可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知及如在US6，544，似4中描述的方法實現(xiàn)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了ATF灌注系統(tǒng)的運行(Furey，2002)。ATF系統(tǒng)使得可以較長時間培養(yǎng)細(xì)胞，以及無需阻斷型過濾器(blockedfilter)即可達(dá)到高細(xì)胞密度。事實上，使用ATF灌注系統(tǒng)可以獲得超過IOOxIO6個存活細(xì)胞/mL的極高細(xì)胞密度，例如使用PER.C6細(xì)胞(見例如^llopetal)。然而，在先前的報道中，灌注系統(tǒng)中的PER.C6細(xì)胞用于完全不同的目的，且不用腺病毒感染。ATF系統(tǒng)的另一優(yōu)勢是該系統(tǒng)產(chǎn)生較低的剪切力。能量加在液體表面，產(chǎn)生低剪切層流。這對于本發(fā)明尤為有利，其中細(xì)胞用腺病毒感染。在灌注期間，發(fā)現(xiàn)使用ATF系統(tǒng)在細(xì)胞密度無喪失，且觀測到無不成熟細(xì)胞喪失，相反觀測到細(xì)胞生長。由于細(xì)胞保持完整，因此產(chǎn)生對于病毒增殖的最佳條件。在預(yù)培養(yǎng)階段(本發(fā)明的步驟a)使用ATF系統(tǒng)灌注因此是有利的，因為其使得可以獲得非常高的細(xì)胞密度，且細(xì)胞在良好條件下以進(jìn)行隨后的腺病毒感染，可能有助于獲得高產(chǎn)量。為了達(dá)到所述高細(xì)胞密度，在某些實施方案中所述培養(yǎng)基在所述生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞生長期間的一部分時間至少部分灌注(步驟a)。在某些實施方案中，一旦細(xì)胞密度達(dá)到在大約MlO6個存活細(xì)胞/mL至SxlO6個存活細(xì)胞/mL之間，則開始灌注。此外，使用ATF系統(tǒng)灌注在感染期之后是有利的(本發(fā)明步驟c)，因為其使得可以從感染細(xì)胞中獲得非常高的腺病毒產(chǎn)量。在因此的優(yōu)選實施方案中，在本發(fā)明方法的預(yù)培養(yǎng)階段及感染后階段均應(yīng)用ATF灌注系統(tǒng)。在ATF期間使用的培養(yǎng)基的體積可以根據(jù)細(xì)胞的需要而改變，這可易于由技術(shù)人員確定和調(diào)節(jié)，且通常在0.5-5容器體積/天(vol/d)之間變化，如l-3vol/d，例如大約2vol/d。在某些有利的實施方案中，更新速度在大約l-2vol/d之間，本發(fā)明人已經(jīng)示出由此提供在獲得的rAd35的產(chǎn)量和質(zhì)量方面的良好結(jié)果，同時培養(yǎng)基的消耗及因此的成本仍在合理范圍。最后，ATF系統(tǒng)是可升級的系統(tǒng)?？色@得不同大小的ATF單位。因為使用氣流通過中空纖維膜而驅(qū)動培養(yǎng)，因此可以產(chǎn)生非?？焖俚?、低剪切切向流速度，使得得自R&D的該技術(shù)可用于擴大生產(chǎn)規(guī)模直至1000L(Furey，2002)?？赡苓M(jìn)一步的開發(fā)使得甚至可以進(jìn)一步擴大ATF灌注系統(tǒng)的規(guī)模。在Yuketal中，使用腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生rAd5，其中在一個生物反應(yīng)器中進(jìn)行全部過程，在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中將進(jìn)行大約8-10天。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用兩個不同的生物反應(yīng)器，一個反應(yīng)器用于細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)(步驟a，預(yù)培養(yǎng)生物反應(yīng)器)，一個反應(yīng)器用于細(xì)胞的感染(步驟b)和感染后培養(yǎng)(步驟c，生產(chǎn)生物反應(yīng)器)。對于這些步驟使用兩個單獨的生物反應(yīng)器的優(yōu)勢是在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)僅需要大約1.5-5天，典型為大約2-3天，因此每年可以進(jìn)行更多次數(shù)的運行。在感染期間加入大量新鮮培養(yǎng)基進(jìn)一步有利于降低在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中在灌注期間需要的培養(yǎng)基體積。在另外的實施方案中，也可以在一個生物反應(yīng)器中進(jìn)行本發(fā)明方法的a-c所有步驟。感染在本發(fā)明的方法中，生產(chǎn)細(xì)胞用重組腺病毒感染。通常，將病毒在最佳條件下暴露于合適的生產(chǎn)細(xì)胞，容許病毒的攝取。所述最佳條件依賴于細(xì)胞的類型和選擇的腺病毒的類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣發(fā)現(xiàn)最佳條件，即攪拌速度、pH、溫度、溶解氧((102或00)、感染復(fù)數(shù)(MOI)。通常地，最佳攪拌速度是在大約50-300rpm之間，典型為大約100-200，例如大約150，典型的DO為20-60%,如40%，最佳pH在6.7-7.7之間，最佳溫度在30-39°C之間，例如34-37°C，最佳MOI在5-1000之間，例如大約50-300。典型地，腺病毒自發(fā)感染生產(chǎn)細(xì)胞，并使得所述生產(chǎn)細(xì)胞與rAd粒接觸，足以感染所述細(xì)胞。通常地，將腺病毒原種加入培養(yǎng)物中以開始感染，隨后腺病毒在生產(chǎn)細(xì)胞中增殖。這個技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員均是常規(guī)技術(shù)。在本發(fā)明的某一實施方案中，灌注在感染之前結(jié)束，并在感染后1-20小時、例如3-15小時、例如5小時重新開始。這個延遲應(yīng)使得病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞并防止病毒顆粒免于被從該系統(tǒng)中除去。感染后的灌注速度在通過灌注維持的葡萄糖水平方面被定義。例如，在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度通常維持在大約2mmol/L至20mmol/L之間的濃度，典型為大約5-10mmol/L。在高細(xì)胞密度即高于IOxlO6個存活細(xì)胞/mL用rAd35感染生物反應(yīng)器可能是有利的，保持高病毒生產(chǎn)率/細(xì)胞。在某些實施方案中，單位生產(chǎn)率保持在大約0.5x10s至UxlO5VP/細(xì)胞之間。此外，在本發(fā)明中，細(xì)胞培養(yǎng)物在感染之前的存活力保持高于75%。這是指培養(yǎng)的細(xì)胞總量中至少75%的細(xì)胞在感染時是存活的。在某些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物在感染時的存活力是至少80%，在進(jìn)一步的實施方案中是至少85%。存活力可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的常規(guī)方法測量，如臺盼藍(lán)排阻法、Casy細(xì)胞計數(shù)法等。在某一實施方案中，在感染時的細(xì)胞密度在大約IOxlO6至50xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如在大約IOxlO6至20xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如在大約IOxlO6至15xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如在大約IOxlO6至HxlO6個存活細(xì)胞/mL之間，例如大約12_13xl06個存活細(xì)胞/mL。這些細(xì)胞密度使得可以獲得高病毒生產(chǎn)率，而積聚的細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞10DNA有限。因此，本發(fā)明提供了一種rAd35生產(chǎn)優(yōu)化方法，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的大批量rAd35顆粒，同時提供了仍易于下游處理的收獲材料。在本文揭示的其它實施方案中，在感染時的細(xì)胞密度在大約15xl06至50xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如大約17xl06至45xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如大約20xl06至40xl06之間，例如在25xl06至35xl06個存活細(xì)胞/mL之間，例如大約30xl06個存活細(xì)胞/mL。在這些細(xì)胞密度進(jìn)行感染可以產(chǎn)生更高的重組腺病毒、特別是rAd35的濃度，且高于迄今為止揭示的rAd35的產(chǎn)量。如在本發(fā)明首次示出，與在高細(xì)胞密度(大于IOxlO6個存活細(xì)胞/mL)的rAd5感染相比，使用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)細(xì)胞，在大于IOxlO6個存活細(xì)胞/mL的密度用rAd35感染，在感染時隨著細(xì)胞密度增加直至至少30xl06個存活細(xì)胞/mL，仍±曾力口rAd35的容積生產(chǎn)率(volumetricproductivity)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，提供了生產(chǎn)至少lxl012rAd35病毒顆粒(VP)/mL的方法。本發(fā)明的方法使得可以回收rAd35，物理顆粒(physicalparticle)與感染顆粒的比率低于301，這對于給予人體的腺病毒是重要參數(shù)。這可以根據(jù)病毒顆粒(VP)/感染單位(IU)比率測量，例如使用QPA測定進(jìn)行(Wangetal，2005)。低比率是有利的，因為在這種情況中需要給予較少的病毒顆粒感染相同數(shù)目的細(xì)胞?，F(xiàn)行FDA規(guī)章要求VP/IU比率低于301，因此本發(fā)明描述的方法適于制備符合這個特定要求的大量rAd35。Yuketal(2004)報道了與本文揭示的數(shù)目相比較低的絕對數(shù)，以及Yuketal(2004)揭示的樣品的VP/IU比率為大約100(Yuketal，2004中圖2A/2B)。相反，我們報道了較高的絕對產(chǎn)量及低于201的顯著更好的VP/IU比率。在因此的某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法提供了分批的rAd35，其VP/IU比率低于201，例如在大約201至大約51之間。細(xì)胞收獲和裂解方法在腺病毒感染后，病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制且從而被擴增。腺病毒感染最終導(dǎo)致感染的細(xì)胞裂解。腺病毒的裂解特性因此允許兩種不同模式的病毒產(chǎn)生。第一種模式是在細(xì)胞裂解之前收獲病毒，應(yīng)用外部因素裂解細(xì)胞。第二種模式是在通過產(chǎn)生的病毒(幾乎)完成細(xì)胞裂解之后收獲病毒上清(見例如美國專利6，485，958，其描述了不用外部因素裂解宿主細(xì)胞而收獲腺病毒)。對于后一種模式，需要較長時間以實現(xiàn)完全的細(xì)胞裂解及因此的病毒高產(chǎn)量。此外，宿主細(xì)胞內(nèi)含物逐步釋入培養(yǎng)基中對于獲得的病毒的完整性和產(chǎn)量是不利的。因此，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明所述應(yīng)用外部因素主動裂解細(xì)胞以收獲腺病毒?？捎糜谥鲃恿呀饧?xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如在WO98/22588，p.28-35中論述。這個方面可用的方法是例如冷凍-解凍、固體剪切、高滲/低滲裂解、液體剪切、超聲處理、高壓擠壓、去污劑裂解，以及上述方法的組合等。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用至少一種去污劑使細(xì)胞裂解。使用去污劑裂解具有簡便及易擴大規(guī)模的優(yōu)勢?？梢允褂玫娜ノ蹌┘捌涫褂梅绞綖楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知。一些實例在例如WO98/22588，p.29-33中論述。如本文所用，去污劑可包括陰離子、陽離子、兩性離子及非離子去污劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知去污劑的濃度可以改變，例如在大約0.-5%(w/w)范圍內(nèi)變化。在一個實施方案中，使用的去污劑是TritonX-100。核酸酶可用于除去污染物，即大部分生產(chǎn)細(xì)胞、核酸。適用于本發(fā)明中的舉例的核酸酶包括Benzonase、Pulmozyme，或者本領(lǐng)域常用的任何其它DNase和/或foiase。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸酶是Benzonase，其通過水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵而快速水解核酸，從而降低細(xì)胞裂解物的粘度。Benzonase可商購自MerckKGaA(codeW214950)。使用的核酸酶的濃度優(yōu)選在1-100單位/ml范圍內(nèi)。從生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲腺病毒的方法已經(jīng)在WO2005/080556中深入論述。根據(jù)本發(fā)明，收獲時間在感染后大約M-120小時之間，例如在感染后大約48-96小時之間，例如感染后72小時。純化方法在某些實施方案中，對收獲的腺病毒進(jìn)行進(jìn)一步純化。腺病毒的純化可以在幾個步驟中進(jìn)行，包括澄清、超濾、滲濾或者層析分離，如并入本文作參考的WO05/080556所述。澄清可以通過過濾步驟進(jìn)行，從細(xì)胞裂解物中除去細(xì)胞碎片及其它雜質(zhì)。超濾用于濃縮病毒溶液。使用超過濾器的滲濾或者緩沖液置換是一種除去和置換鹽、糖等的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣發(fā)現(xiàn)每個純化步驟的最佳條件。也并入本文參考的WO98/22588描述了生產(chǎn)和純化腺病毒載體的方法。所述方法包括生長宿主細(xì)胞、用腺病毒感染所述宿主細(xì)胞、收獲和裂解所述宿主細(xì)胞、濃縮粗制裂解物、置換粗制裂解物的緩沖液、用核酸酶處理該裂解物，以及使用層析法進(jìn)一步純化該病毒。純化可例如通過密度梯度離心實現(xiàn)，如WO98/22588，p.59-61揭示。然而優(yōu)選地，純化應(yīng)用至少一個層析步驟，如WO98/22588，p.61-70所述。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多方法以進(jìn)一步純化腺病毒，其中層析步驟包括在所述方法中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將獲知這些方法，且可以改變應(yīng)用層析步驟的實際方式以優(yōu)化所述方法。例如可以通過陰離子交換層析步驟純化腺病毒，見例如WO05/080556所述。對于腺病毒純化，優(yōu)選使用至少一個陰離子交換層析步驟。在陰離子交換層析步驟之后，所述病毒是足夠純的。然而在某些實施方案中，進(jìn)一步進(jìn)行大小排阻層析步驟，以增加該方法的魯棒性(robustness)。這個步驟可以在陰離子交換層析步驟之前或者之后進(jìn)行。顯然，其它純化步驟也可適于與陰離子交換層析步驟組合。使用陰離子交換層析進(jìn)行腺病毒純化已經(jīng)有廣泛論述，這方面是本領(lǐng)域技術(shù)人員可知的。許多不同的層析基質(zhì)已經(jīng)用于純化腺病毒且是合適的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地發(fā)現(xiàn)最佳的陰離子交換基質(zhì)以純化病毒，例如如下文獻(xiàn)所教導(dǎo)美國專利5,837,520(也見Huygheetal.,1995,HumanGeneTherapy61403-1416)描述了一種純化腺病毒的方法，其中用核酸酶處理宿主細(xì)胞裂解物，隨后進(jìn)行陰離子交換和金屬離子親和性層析。美國專利6，485，958描述了使用強陰離子交換層析以純化重組腺病毒。陰離子交換層析已經(jīng)與流動床層析柱一起用于純化腺病毒顆粒，見WO00/50573所述。此外，純化腺病毒顆粒的膨脹床陰離子交換層析及進(jìn)行陰離子交換層析的某些層析樹脂已經(jīng)在美國專利6，586，226中描述。除了陰離子交換柱之外，陰離子交換膜層析產(chǎn)物如由I^ll產(chǎn)生的那些產(chǎn)物(例如Mustang系列)及Sartorius(例如Sartobind系列)也是適合的。對于這些濾膜在腺病毒純化中的應(yīng)用及其優(yōu)勢見例如WO03/078592和WO2005/080556所述。美國專利6，537，793描述了使用離子交換層析從宿主細(xì)胞中純化腺病毒顆粒，為此特別教導(dǎo)優(yōu)選QSepharoseXL類型層析支持物。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用QSepharoseXL柱進(jìn)一步純化腺病毒。所述純化方法也可適當(dāng)應(yīng)用大小排阻層析步驟。國際專利申請WO97/08298描述了使用某些層析基質(zhì)純化腺病毒以防止病毒的損害，包括陰離子交換和大小排阻步驟。美國專利6，沈1，823描述了純化腺病毒的方法，其中對腺病毒制備物進(jìn)行陰離子交換層析，隨后進(jìn)行大小排阻層析。在大小排阻步驟中，實現(xiàn)從低分子量雜質(zhì)中成組分離病毒顆粒。也可以應(yīng)用羥磷灰石基質(zhì)純化腺病毒，見WO02/44348所述。也可以使用反向吸附步驟，如WO03/097797，p.沈所述。國際專利申請WO97/08298描述了使用某些層析基質(zhì)純化腺病毒以防止病毒的損害，包括陰離子交換和大小排阻步驟。某些超濾方法也非常適于純化腺病毒，如WO2006/108707所述。這種步驟可以在除了進(jìn)行某些層析純化步驟之外進(jìn)行，或者單體這些層析純化步驟。制備藥物制備物在某些實施方案中，純化的腺病毒被配制為藥物組合物。這可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法及使用各種緩沖液進(jìn)行。通常地，需要使所述腺病毒顆粒置于藥物可接受的組合物中，所述組合物包含腺病毒及至少一種藥物可接受的賦形劑。這種組合物可以在技術(shù)人員已知條件下制備，在某些實施方案中在適于給予人體的條件下制備。例如，腺病毒可以在組分離期間置換為也用于腺病毒世界標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液并最后IC存于該緩沖液(Hogansonetal,Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002，p.43—48):20mMTrispH8、25mMNaCl>2.5%甘油。顯然，可以使用一些其它緩沖液，對于純化的(腺)病毒制備物的貯存和藥物給予合適的配制物的一些實例可例如見于歐洲專利no.0853660及國際專利申請WO99/41416、WO99/12568,WO00/29024,WO01/66137,WO03/049763所述。在某些實施方案中，所述腺病毒載體用作疫苗，這些腺病毒載體典型存在于藥物可接受的載體或賦形劑和/或稀釋劑中。藥物可接受的載體或賦形劑以及稀釋劑為本領(lǐng)域熟知，且廣泛用于各種治療產(chǎn)物中。優(yōu)選地，應(yīng)用在疫苗中表現(xiàn)良好的載體。更優(yōu)選地，所述疫苗進(jìn)一步包含佐劑。佐劑為本領(lǐng)域熟知，進(jìn)一步增加對于應(yīng)用的抗原決定簇的免疫應(yīng)答，包含腺病毒和磷酸鋁佐劑的藥物組合物在例如WO2007/110409中揭示。對于給予人體，本發(fā)明可應(yīng)用包含rAd及藥物可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在本文中，術(shù)語“藥物可接受的”是指所述載體或賦形劑在使用的劑量和濃度下對給予其的對象不產(chǎn)生任何不希望的或者有害的作用。這種藥物可接受的載體和賦形劑為本領(lǐng)域熟知(見Remington'sPharmaceuticalSciences，18thedition，A.R.Gennaro,Ed.，MackPublishingCompany[1990]；PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandLHovgaard，Eds·，Taylor&Francis[2000]；及HandbookofPharmaceuticalExcipients，3rdedition，A.Kibbe,Ed.，Pharmaceuticalft~eSS[2000])。盡管在本發(fā)明范圍內(nèi)可利用凍干的制備物，但是純化的rAd優(yōu)選作為無菌溶液配制和給予。無菌溶液通過無菌過濾或者通過本領(lǐng)域已知的其它方法制備。然后將所13述溶液凍干或者充填進(jìn)藥物劑量容器中。所述溶液的PH通常在pH3.0-9.5范圍內(nèi)，例如是pH5.0-7.5。所述rAd通常在具有合適的藥物可接受的緩沖液的溶液中，且所述rAd溶液也可含有鹽。任選地，可以存在穩(wěn)定劑，如白蛋白。在某些實施方案中，加入去污劑。在某些實施方案中，rAd可以配制為可注射制備物。這些配制物含有有效量的rAd，是無菌液體溶液、液體懸浮液或者凍干形式，及任選含有穩(wěn)定劑或賦形劑。本發(fā)明揭示了以極高產(chǎn)量產(chǎn)生腺病毒載體、特別是rAd35的方法，以及據(jù)我們所知之前還未報道過本發(fā)明獲得的產(chǎn)量和本發(fā)明的揭示。在本發(fā)明的方法中，使用生物反應(yīng)器，而且具有極高數(shù)目腺病毒顆粒/體積的生物反應(yīng)器是本發(fā)明的直接(中間)產(chǎn)物。本發(fā)明因此還提供了工作體積在2L-2000L之間的生物反應(yīng)器，優(yōu)選在10L-1000L之間，所述生物反應(yīng)器包含培養(yǎng)基、生產(chǎn)細(xì)胞以及至少lxl012rAd35病毒顆粒(VP)/mL。所述培養(yǎng)基可以是適于細(xì)胞增殖和腺病毒感染的任何培養(yǎng)基，如上文所述。關(guān)于生物反應(yīng)器的體積、生產(chǎn)細(xì)胞及rAd35顆粒數(shù)目和VP/IU比率如上文針對本發(fā)明方法所述。在優(yōu)選的實施方案中，所述生物反應(yīng)器與ATF灌注系統(tǒng)連接。另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生至少lX1012rAd35病毒顆粒(VP)/mL的方法，所述方法包括a)用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為IOxlO6個存活細(xì)胞/mL至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞，以使得所述rAd35增殖，從而rAd35病毒顆粒的濃度達(dá)到至少lxl012VP/mL；以及d)收獲所述rAd35。在本發(fā)明之前，還未知這種rAd35高產(chǎn)量是否是可行的，更不用說實現(xiàn)這種高產(chǎn)量了。本發(fā)明揭示了根據(jù)本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)這些產(chǎn)量。優(yōu)選地，收獲的rAd35的物理顆粒與感染顆粒的比率低于301。有利的進(jìn)一步的實施方案如前文針對本發(fā)明的方法描述的那些實施方案。本發(fā)明在如下實施例中得以進(jìn)一步闡述。所述實施例不以任何方式限制本發(fā)明。它們只是使本發(fā)明更明了。實施例實施例1用Ad5載體在高細(xì)胞密度感染從PER.C6工作細(xì)胞庫中使細(xì)胞解凍，并在恒濕箱中在37°C和10%CO2條件下在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3-4天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，用以在1.5L體積接種2L生物反應(yīng)器，細(xì)胞密度為0.2-0.5xl06個存活細(xì)胞/mL。使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中在37°C、40%D0及pH7.3條件下增殖。在4.7xl06細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度開始ATF灌注程序。所述ATF得自RefineTechnology,Co.,EastHanover,NJ0在89小時后，細(xì)胞密度達(dá)到12.4xl06細(xì)胞/mL。此時收獲一部分細(xì)胞，并將細(xì)胞在300g離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀以如下濃度再懸浮于新鮮無血清培養(yǎng)基中-1.3xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶，-IOxlO6個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶，-20xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶，-30xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶。將所述搖瓶用Ad5.CS(—種rAd5載體，Shottetal，2008)以90VP/細(xì)胞的MOI感染，并在36°C、10%CO2和IOOrpm保溫。在感染后第一天和第二天，對在10、20和30xl06個存活細(xì)胞/mL的密度感染的搖瓶更新培養(yǎng)基。這個培養(yǎng)基更新通過在300g離心5分鐘及將細(xì)胞沉淀再懸浮于30mL新鮮培養(yǎng)基/搖瓶中而進(jìn)行。在感染后第三天，收獲搖瓶，取樣進(jìn)行AEX-HPLC分析。收獲的細(xì)胞的裂解通過將每個搖瓶的ImL體積樣品與100μL10%TritonX-IOO混合，并在37°C保溫30分鐘而進(jìn)行。在保溫之后，將樣品與2.42μLbenzonase/MgCl2混合，隨后在37°C保溫30分鐘。最后，將IOOyL50%葡萄糖加入樣品中。在2500g離心5分鐘之后，將樣品在低于-65°C溫度下貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析，以確定產(chǎn)生的病毒顆粒的數(shù)目(VP/mL)。結(jié)果示于圖1。在IOxlO6個存活細(xì)胞/mL細(xì)胞密度感染的容積產(chǎn)量比在IxlO6個存活細(xì)胞/mL密度感染的相應(yīng)結(jié)果高10倍。在先前的報道中報道了在更低的密度有些出乎意料地產(chǎn)生細(xì)胞密度效應(yīng)(即大約0.5-3X106個細(xì)胞/mL，例如Marangaetal.，2005；Kamenetal.，2004；Altarasetal.，2005)。然而，超過IOxIO6個細(xì)胞/mL，觀測到細(xì)胞密度效應(yīng)，容積產(chǎn)量降低。因此，使用重組Ad5，在灌注系統(tǒng)中觀測到細(xì)胞密度效應(yīng)。實施例2在低細(xì)胞密度(1-1.6xl06個存活細(xì)胞/mL)用rAd35感染在實施例1中，使用rAd5。然而，已知不同腺病毒血清型并且已被描述用于不同目的。這些血清型可具有不同性質(zhì)，并因此用于一種血清型的方法不總是必須適合另一血清型。這與工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)尤為相關(guān)，其中表面上看一些較小的不同也可以具有重要經(jīng)濟利益。用于例如疫苗中的一個特別有利的血清型是Ad35，在如下實施例中我們檢測了改良rAd35產(chǎn)量以大批量獲得的可行性。這個實施例示出用rAd35載體在低細(xì)胞密度感染，與其中在較高細(xì)胞密度感染細(xì)胞的如下實施例進(jìn)行對比。從PER.C6工作細(xì)胞庫中使細(xì)胞解凍，并在恒濕箱中在37°C和10%CO2條件下在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3-4天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，用以在5L體積接種IOL生物反應(yīng)器，細(xì)胞密度為0.2-0.35xl06個存活細(xì)胞/mL。使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中在37°C、40%D0及pH7.3條件下增殖。接種后4天(當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2-3.切106個存活細(xì)胞/mL時)，將細(xì)胞懸浮液用5L新鮮培養(yǎng)基稀釋，隨后用rAd35.TB-S(一種rAd35載體，Radosevicetal，2007)以70VP/細(xì)胞的MOI感染。在36°C、pH7.3和40%DO條件下進(jìn)行病毒增殖。在感染3天后，從生物反應(yīng)器中取樣，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及病毒產(chǎn)量確定。為了釋放病毒，將每個生物反應(yīng)器的ImL樣品與100UL10%TritonX-100混合，在37°C保溫30分鐘。在保溫后，將樣品與2.42μLbenzonase/MgCl2混合，隨后在37°C保溫30分鐘。最后，將IOOyL50%葡萄糖加入樣品中。在2500g離心5分鐘之后，將樣品在低于-65°C溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。共10個生物反應(yīng)器運行，根據(jù)上述方法分析，這些運行提供一致的結(jié)果(未示出)。平均病毒顆粒產(chǎn)量為2.βχΙΟ^νΡ/πι。對于每年大約1.5xl019VP的需求量，需要加工大約65000L的這種產(chǎn)量。在疫苗開發(fā)期間這將需要較大的設(shè)備及因此較大的前期投資。實施例3在高細(xì)胞密度(>IOxIO6個存活細(xì)胞/mL)用rAd35感染的可行性研究從PER.C6工作細(xì)胞庫中使細(xì)胞解凍，并在恒濕箱中在37°C和10%CO2條件下在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3-4天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，用以在1.5L體積接種2L生物反應(yīng)器，細(xì)胞密度為0.2-0.5xl06個存活細(xì)胞/mL。使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中在37°C、40%D0及pH7.3條件下增殖。在細(xì)胞密度為6.8xl06細(xì)胞/mL時使用ATF系統(tǒng)開始培養(yǎng)基灌注。在70小時后，細(xì)胞密度達(dá)到36.SxlO6細(xì)胞/mL。此時進(jìn)行如下感染在如下細(xì)胞密度在搖瓶中感染〇1.3xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶〇IOxlO6個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶〇20xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶〇30xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶在8.7xl06總細(xì)胞/mL(84%存活率)密度在2L生物反應(yīng)器規(guī)模感染〇在生物反應(yīng)器感染之后1小時，從生物反應(yīng)器中取樣品，并移至兩個250mL搖瓶中，30mL/搖瓶。對于在250mL搖瓶中的感染程序，從2L生物反應(yīng)器中收獲一部分細(xì)胞懸浮液，并將這個懸浮液在300g離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀以上述濃度再懸浮于新鮮無血清培養(yǎng)基中。將搖瓶用Ad35.TB-S在70VP/細(xì)胞的MOI感染，并在36°C、10%CO2和IOOrpm條件下保溫。在感染后第1天和第2天，對在10、20和30xl06個存活細(xì)胞/mL密度感染的搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)基更新。這個培養(yǎng)基更新是通過在300g離心5分鐘及將細(xì)胞沉淀再懸浮于30mL新鮮培養(yǎng)基/搖瓶中進(jìn)行。感染后第3天，收獲所述搖瓶，取樣進(jìn)行AEX-HPLC分析。通過將每個搖瓶ImL樣品體積與100μL10%TritonX-IOO混合及在37°C保溫30分鐘進(jìn)行收獲物細(xì)胞裂解。在保溫后，將樣品與2.42μLbenzonase/MgCl2混合，隨后在37°C保溫30分鐘。最后，將IOOyL50%葡萄糖加入樣品中。在2500g離心5分鐘后，將樣品在低于-65°C溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。將2L生物反應(yīng)器中剩余的細(xì)胞用新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為8.7xl06細(xì)胞/mL(84%存活率)。將該生物反應(yīng)器用Ad35.TB-S在70VP/細(xì)胞的MOI感染，并在36°C、PH7.3和40%DO條件下保溫。感染后15小時開始ATF系統(tǒng)，培養(yǎng)基更新速度為1個生物反應(yīng)器體積/天。在感染后第1、2、3和4天，對生物反應(yīng)器取樣，通過AEX-HPLC進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(CASY細(xì)胞計數(shù)儀)和病毒產(chǎn)生確定。樣品制備如上述進(jìn)行。將樣品在低于_65°C溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。在生物反應(yīng)器感染大約1小時后，從2L生物反應(yīng)器中取至少60mL樣品，以30mL/搖瓶開始兩次感染(在250mL搖瓶中)。在感染后第1天和第2天，進(jìn)行培養(yǎng)基更新以模擬灌注系統(tǒng)。這個培養(yǎng)基更新是通過在300g離心5分鐘并將細(xì)胞沉淀再懸浮于30mL新鮮培養(yǎng)基/搖瓶中而進(jìn)行。在感染后第3天，收獲搖瓶并取樣進(jìn)行AEX-HPLC分析。如上述進(jìn)行樣品制備。將樣品在低于_65°C溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖2。結(jié)果表明在1.3xl06個存活細(xì)胞/mL至30xl06個存活細(xì)胞/mL之間感染是可能的。與使用rAd5的結(jié)果相反，rAd35總產(chǎn)量隨著感染的細(xì)胞密度的增加而增加，甚至在細(xì)胞密度高于IOxlO6個存活細(xì)胞/mL的樣品中也是如此。在30xl06個存活細(xì)胞/mL感染，達(dá)到1.4xl012VP/mL的容積產(chǎn)量。結(jié)果清晰表明在高細(xì)胞密度即IOxlO6個存活細(xì)胞/mL或更高密度用Ad35.TB_S感染是可能的。甚至在30xl06個存活細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度感染，仍提供較高的容積產(chǎn)量。注意到單位生產(chǎn)率降低，從在1.3xl06細(xì)胞的120，000VP/細(xì)胞降低至在30xl06個存活細(xì)胞/mL的47.000VP/細(xì)胞。起自在生物反應(yīng)器中感染的細(xì)胞懸浮液的搖瓶示出收獲產(chǎn)量為8.OXIOIIVPAIL,單位生產(chǎn)率為92.000VP/細(xì)胞。在2L生物反應(yīng)器中的結(jié)果略低收獲產(chǎn)量達(dá)到^dO11VPAiL,這是57.000VP/細(xì)胞的單位生產(chǎn)率。實施例4使用另一種rAd35載體在高細(xì)胞密度感染的可行性從PER.C6工作細(xì)胞庫中使細(xì)胞解凍，并在恒濕箱中在37°C和10%CO2條件下在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3-4天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，用以在1.5L體積接種2L生物反應(yīng)器，細(xì)胞密度為0.2-0.5xl06個存活細(xì)胞/mL。使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中在37°C、40%DO及pH7.3條件下增殖。在細(xì)胞密度達(dá)到5.IxlO6細(xì)胞/mL時開始ATF灌注程序。在70小時后，細(xì)胞密度達(dá)到25xl06細(xì)胞/mL。此時收獲一部分細(xì)胞。將該細(xì)胞在300g離心5分鐘，并將細(xì)胞沉淀以如下濃度再懸浮于新鮮無血清培養(yǎng)基中·1.3xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶·IOxlO6個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶·20xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶·30xl06個存活細(xì)胞/mL，30mL/搖瓶，2個250mL搖瓶將所述搖瓶用Ad35.eGFP(包含另一轉(zhuǎn)基因(即GFP基因)的rAd35)在70VP/細(xì)胞的MOI感染，并在36°C、10%CO2和IOOrpm條件下保溫。在感染后第1天和第2天，對在10、20和30xl06個存活細(xì)胞/mL密度感染的搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)基更新。這個培養(yǎng)基更新是通過在300g離心5分鐘及將細(xì)胞沉淀再懸浮于30mL新鮮培養(yǎng)基/搖瓶中進(jìn)行。感染后第3天，收獲所述搖瓶，取樣進(jìn)行AEX-HPLC分析。通過將每個搖瓶ImL樣品體積與100μL10%TritonX-IOO混合及在37°C保溫30分鐘進(jìn)行收獲物細(xì)胞裂解。在保溫后，將樣品與2.42μLbenzonase/MgCl2混合，隨后在37°C保溫30分鐘。最后，將100μL50%葡萄糖加入樣品中。在2500g離心5分鐘后，將樣品在低于_65°C溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖3.結(jié)果表明使用另一種Ad35載體(Ad35.eGFP)在高細(xì)胞密度感染也是可行的。容積產(chǎn)量(圖幻和單位生產(chǎn)率(數(shù)據(jù)未示出)均在使用Ad35.TB-S載體的相同范圍內(nèi)。實施例5用rAd35載體在高細(xì)胞密度感染的進(jìn)一步實驗從PER.C6工作細(xì)胞庫中使細(xì)胞解凍，并在恒濕箱中在37°C和10%CO2條件下在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3-4天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)，直至達(dá)到足夠的細(xì)胞密度，用以在0.25xl06個存活細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種2L生物反應(yīng)器。使細(xì)胞在2L生物反應(yīng)器中在37°C、40%DO及pH7.3條件下增殖。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約3.7xl06細(xì)胞/mL時(在接種后4天)，起始ATF系統(tǒng)。67小時后，細(xì)胞密度達(dá)到40.7xl06細(xì)胞/mL。此時，收獲一部分細(xì)胞懸浮液，并將剩余細(xì)胞在2L生物反應(yīng)器中用新鮮培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為12.7xl06細(xì)胞/mL(87%存活率，因此IlxlO6個存活細(xì)胞/mL)。隨后，用Ad35.TB-S在70VP/細(xì)胞的MOI感染所述2L生物反應(yīng)器，并在36°C、pH7.3及40%DO條件下保溫。在感染后15小時開始ATF系統(tǒng)，培養(yǎng)基更新速度為5個容器體積/天。在感染后第1天、第2天、第3天和第4天，從所述2L生物反應(yīng)器中取樣，通過AEX-HPLC進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及病毒產(chǎn)生確定。為了釋放病毒，將ImL樣品與100μL10%TritonX-IOO混合，并在37°C保溫30分鐘。在保溫后，將樣品與2.42μLbenzonase/MgCl2混合，隨后在37°C保溫30分鐘。最后，將100μL50%葡萄糖加入樣品中。在2500g離心5分鐘之后，將樣品在低于-65°C的溫度貯存直至通過AEX-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于表1。表1:實施例5的結(jié)果權(quán)利要求1.一種產(chǎn)生重組腺病毒血清型35(rAd30的方法，所述方法包括a)用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為IOxlO6個存活細(xì)胞/mL至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞以使所述rAd35增殖；和d)收獲所述rAd35。2.權(quán)利要求1的方法，其中用rAd35感染其密度為大約IOxlO6至HxlO6個存活細(xì)胞/mL之間的步驟b)中的所述細(xì)胞。3.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟c)中所述灌注系統(tǒng)是交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)。4.前述任一項權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括e)純化所述rAd35，及任選f)制備含有所述純化的rAd35的藥物組合物。5.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述重組腺病毒缺少至少一部分El區(qū)，并且包含異源核酸。6.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟a)中所述灌注系統(tǒng)是交替切向流(ATF)灌注系統(tǒng)。7.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟a)在第一生物反應(yīng)器中進(jìn)行，步驟b)和c)在第二生物反應(yīng)器中進(jìn)行。8.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中產(chǎn)生的rAd35的物理顆粒與感染性顆粒的比率(VP/IU)低于301，優(yōu)選低于201。9.一種生物反應(yīng)器，其包含培養(yǎng)基、生產(chǎn)細(xì)胞和病毒顆粒，其中所述生物反應(yīng)器的工作體積在2L-1000L之間，優(yōu)選在50L-500L之間，且特征在于所述生物反應(yīng)器包含至少IxlO12個rAd35病毒顆粒(VP)/mL。10.權(quán)利要求9的生物反應(yīng)器，其與ATF灌注系統(tǒng)連接。11.權(quán)利要求9或10的生物反應(yīng)器，其中所述rAd35病毒顆粒的VP/IU比率低于301，優(yōu)選低于201。12.—種產(chǎn)生至少IxlO12個rAd35病毒顆粒(VP)/mL的方法，所述方法包括a)用灌注系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞；b)用rAd35感染其密度為IOxlO6個存活細(xì)胞/mL至16xl06個存活細(xì)胞/mL之間的所述細(xì)胞；c)用灌注系統(tǒng)進(jìn)一步培養(yǎng)感染的細(xì)胞以使所述rAd35增殖，從而rAd35病毒顆粒的濃度達(dá)到至少IxlO12個VP/mL；以及d)收獲所述rAd35。全文摘要本發(fā)明提供了使用灌注系統(tǒng)和非常高的細(xì)胞密度感染來大規(guī)模生產(chǎn)重組腺病毒血清型35的方法。文檔編號C12M3/06GK102203242SQ200980143895公開日2011年9月28日申請日期2009年10月29日優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日發(fā)明者A·魯伊琴斯,J·A·劉易斯申請人:克魯塞爾荷蘭公司