專利名稱：用于乙醇生產的孢子形成缺陷嗜熱微生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及適于生產乙醇的微生物的生產。本發(fā)明具體地涉及為用于防止孢子形成的微生物修飾。
背景技術：
孢子形成是一個多階段的發(fā)育過程，負責使生長細胞轉變?yōu)楸环Q作孢子或內生孢子的休眠細胞類型。孢子適于在不利條件下散布并且生存很長時間，還構成很多植物、藻類和細菌(如芽孢桿菌屬種)生活周期的一部分。進入孢子形成過程的主要調節(jié)蛋白是DNA結合蛋白SpoOA(階段0的孢子形成蛋白A)，它是轉錄因子的反應調節(jié)蛋白家族(response regulator family)的成員。各種其他基因——包括編碼5種組氨酸自身激酶(KinA、KinB, KinC, KinD和KinE) 和2種反應蛋白(SpoOB和SpoOF)的基因——也參與控制孢子形成的啟動(Molle et al. ；Mol. Microbiol. ；2003，50 (5) 1683-1701)。SpoOA 的活性由多組分磷酸接力傳遞 (phosphorelay)控制，所述磷酸接力傳遞識別并且整合環(huán)境信號以啟動孢子形成(Trach KA, et al ；Mol. Microbiol. 1993 ；8(1) :69_79)。當 SpoOA-P 的調節(jié) N-末端結構域磷酸化時，SpoOA-P與被稱為“OA-盒”的DNA序列元件結合，所述OA-盒激活參與孢子形成的基因。SpoOA的C-末端結構域的缺失(沒有活性，直到N-末端被磷酸化)已被證明導致孢子形成陰性表型(Rowe-Magnus DA, et al J. Bacteriol. ；2000 ；182 (15) :4352_4355)。還已發(fā)現(xiàn)SpoOA會直接或間接地影響枯草芽孢桿菌(B. subtilis)中超過500個基因的表達的活化或抑制，并且因此通過受它控制的調節(jié)基因間接介導基因轉錄的整體模式(Molle et al. ；Mol. Microbiol. ；2003，50(5) :1683_1701)。孢子形成受分解代謝物的抑制，由此葡萄糖或其他易代謝的碳源的存在會抑制野生型細胞的孢子形成。具體地，已知葡萄糖會抑制spoOA和spoOF的轉錄(MyseliwiecJH et al J.Bacterial. ；1991 ；173(6) :1911_1919)。在商業(yè)發(fā)酵過程中，由于兩個主要原因孢子是不合需要的，所述原因為1.孢子形成暫停了生物的活性代謝(active metabolism)，導致所需代謝產物的形成的減少或終止；并且2.形成孢子的微生物更難處理和控制防范，因此需要因環(huán)境原因(包括健康和安全)避免商業(yè)過程微生物的存活，并且還需要防止商業(yè)菌株不受控地釋放。細菌代謝合適底物的一般過程是糖酵解，所述糖酵解是將葡萄糖轉化為丙酮酸并且產生ATP的一系列反應。代謝能量產生過程中丙酮酸的歸宿因微生物和環(huán)境條件而不同。丙酮酸的4個主要反應在圖5中顯示。首先，在有氧條件下，很多微生物會利用檸檬酸循環(huán)以及丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化(由丙酮酸脫氫酶(PDH)催化)產生能量。第二，在厭氧條件下，一些產乙醇生物能通過將丙酮酸脫羧轉化為乙醛(由丙酮酸脫羧酶(PDC)催化)并且隨后通過用NADH將乙醛還原為乙醇(由醇脫氫酶(ADH)催化)來進行成醇發(fā)酵(alcoholic fermentation)。第三個反應也發(fā)生在厭氧條件下，是將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化。乙酰輔酶A隨后被乙醛脫氫酶(AcDH)轉化為乙醛，乙醇是通過還原乙醛 (由ADH催化)產生。第四個過程是丙酮酸轉變?yōu)槿樗?，這通過乳酸脫氫酶(LDH)的催化發(fā)生。將微生物用于生產乙醇備受關注，其中使用在自然條件下進行厭氧發(fā)酵的微生物或使用整合了丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因的重組微生物。W02008/038019公開了包含使天然LDH和PFL基因失活并且上調PDC、PDH和ADH 基因以促進乙醇形成的修飾的微生物。需要進一步改善用微生物進行的乙醇生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明基于這樣一個意外的發(fā)現(xiàn)，即對孢子形成嗜熱微生物中spoOA基因的抑制導致所述微生物的乙醇耐受性增強，并且代謝也增強，這致使代謝終產物(如乙醇)的生產
率提高。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，嗜熱微生物包含與野生型相比使孢子形成減少的修飾，其中第一個修飾使天然spoOA基因失活。所述微生物還可以通過失活天然乳酸脫氫酶和任選的丙酮酸甲酸裂解酶來進一步加以修飾以提高乙醇生產。可進行進一步修飾以上調天然丙酮酸脫氫酶基因或引入活性丙酮酸脫羧酶基因。所述微生物可被進一步修飾以通過提高淀粉酶的表達來增強從淀粉生產乙醇。與野生型相比，本發(fā)明的微生物表現(xiàn)出提高的乙醇生產和增強的乙醇耐受性。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一種生產乙醇的方法，包括在合適的條件下，在C3、C5、C6 糖或它們的寡聚物存在的情況下培養(yǎng)根據(jù)上文定義的微生物。


參考附圖來說明本發(fā)明，其中圖 1 是 SpoOA 核苷酸序歹Ij (SEQ ID No. 1)；圖2 是 SpoOA 氨基酸序列(SEQ ID No. 2)；圖 3 圖示了質粒 pTM014(SEQ ID No. 4)；圖4圖示了 PDH復合體的假定啟動子區(qū)域和基因；圖5圖示了丙酮酸的4個主要反應；圖 6 圖示了 pGEM -T Easy 載體；圖 7 圖示了質粒 pTM031 (SEQ ID No. 3)；圖8圖解闡述了來自從熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(G. thermoglucosidasius)中分離的基因組DNA的4480bp短序列(sequence read)的spoOA和周圍基因的排布；圖9描繪了破壞spoOA基因的兩種方法；圖10圖示了與原始spoOA基因相比，spoOA敲除的預期PCR產物大??；圖11是示出TM242在包含8% w/v纖維二糖和2%酵母提取物的培養(yǎng)基中發(fā)酵特征變化的曲線圖，其中條件是將乙醇蒸汽從發(fā)酵培養(yǎng)液中分隔開來(“脫氣”)和未將它從所述培養(yǎng)液中分隔開來；以及圖12a是示出TM242在包含8% w/v纖維二糖和2% w/v酵母提取物的培養(yǎng)基中發(fā)酵特征的曲線圖，而圖12b示出TM444在相同培養(yǎng)基中的發(fā)酵特征。
具體實施例方式本發(fā)明涉及用于防止孢子形成的對嗜熱微生物的修飾。本發(fā)明基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)，即對孢子形成的抑制與增強的乙醇耐受性有關，能夠使微生物在分批發(fā)酵過程中生產的乙醇產量更大。非孢子形成微生物還有處理優(yōu)勢，因為與孢子產生微生物相比它們更容易處理和控制。此外，由于代謝增強，已經發(fā)現(xiàn)當孢子形成被防止時發(fā)酵以更快的速度進行至完成?？赏ㄟ^修飾微生物以使天然spoOA基因失活，優(yōu)選通過缺失spoOA基因的至少一部分或通過定向破壞所述基因來防止孢子形成。優(yōu)選地，由于所述修飾，所述微生物是完全地孢子形成缺陷的。spoOA基因的編碼序列(SEQ ID No. 1)在圖1中示出。由spoOA基因編碼的多肽的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)在圖2中示出。使用該編碼序列，本領域技術人員能夠將 spoOA作為目標，通過不同機制來使所述基因失活。優(yōu)選通過使spoOA基因序列或它的一部分(優(yōu)選C-末端結構域)缺失來使所述基因失活?；谌绫疚墓嫉年P于所述基因序列的知識，使所述基因失活的方法對于本領域技術人員來說是顯而易見的?？梢允顾龌蛐蛄腥笔Щ蛘咄ㄟ^額外DNA的插入來使其失活以破壞基因表達。定向基因破壞的方法在本領域中是已知的，包括例如將溫度敏感質粒整合至染色體上的目標基因中。質粒的整合可使所述目標基因完全缺失，或者可用所述基因的無功能部分代替所述完整基因。這能夠通過以下方式來實現(xiàn)分離包含目的基因的序列，切除所述基因的一部分，擴增剩余片段，將這些片段克隆至溫度敏感質粒，然后用所述質粒轉化目標微生物。本發(fā)明不局限于使spoOA基因失活的具體方法，但是在“實施例”部分提供了對使用質粒PTM031的合適技術的詳細描述。所述微生物可以是任一嗜熱微生物，但是所述微生物優(yōu)選是芽孢桿菌屬種。具體地，所述微生物優(yōu)選是地芽孢桿菌屬(Geobacillus)種的野生型微生物，特別是熱葡糖苷酶地芽抱桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所選用于進行修飾的微生物被稱作“野生型”，即它們除了不含本文描述的變異之外，還不含任何其他的實驗室產生的變異。所述微生物可從預計含有嗜熱生物的環(huán)境樣本中分離得到。分離的野生型微生物會有孢子形成能力。此外， 分離的野生型微生物具有從丙酮酸產生乙醇的能力，但是未被修飾，乳酸可能是主要的發(fā)酵產物。所述分離物因其能在高溫下依靠己糖和/或戊糖及其寡聚物生長的能力而被篩選出ο本發(fā)明的微生物優(yōu)選具有使其能被用于發(fā)酵過程的某些合乎需要的特征。優(yōu)選地，所述微生物應不具有限制性系統(tǒng)，由此不需要進行體內甲基化。此外，所述微生物應對至少3% w/v乙醇、優(yōu)選5-10% w/v乙醇和最優(yōu)選最多達20% w/v乙醇穩(wěn)定。所述微生物應具有利用(3丄5和(；糖(或它們的寡聚物)——包括纖維素、纖維二糖、半纖維素、淀粉和木聚糖——作為底物的能力。所述微生物優(yōu)選是可高頻轉化的。此外，所述微生物應該在連續(xù)培養(yǎng)中具有能支持0. ^T1及以上稀釋速率的生長速率。所述微生物是嗜熱生物并且會在40°C _85°C的溫度范圍內生長。所述微生物優(yōu)選在50°C-70°C的溫度范圍內生長。此外，需要所述微生物在pH 8或更低的pH下、特別pH 4. 5-pH 6. 9 下生長。本發(fā)明的優(yōu)選微生物在本文中確定為TM443和TM444，每種都保藏在NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate,Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA，NCIMB另I」 為 No. 41591 和 41588。本發(fā)明所述的嗜熱微生物還可被進一步修飾以破壞乳酸脫氫酶基因(LDH)的表達。使乳酸脫氫酶基因失活有助于防止丙酮酸分解為乳酸，并且因此促進(在合適的條件下)丙酮酸分解為乙醇，其中使用丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶。優(yōu)選地，通過在乳酸脫氫酶基因內的缺失或所述基因的缺失破壞該基因。乳酸脫氫酶的核酸序列現(xiàn)在是已知的。本領域技術人員能夠使用該序列來以乳酸脫氫酶基因為目標以通過不同的機制使所述基因失活?？赡芡ㄟ^轉座子插入來使乳酸脫氫酶基因失活。但是，優(yōu)選通過缺失所述基因序列或所述基因序列的部分來使乳酸脫氫酶基因失活。優(yōu)選缺失，因為這避免了所述基因序列再活化的難題，所述難題是使用轉座子滅活時經常遇到的。在一個優(yōu)選實施方案中，乳酸脫氫酶基因是通過溫度敏感質粒的整合而失活，所述整合實現(xiàn)了所述質粒和所述微生物染色體之間的天然同源重組或整合。所述質粒優(yōu)選是pTM014(SEQ ID No. 4)，它在圖3中示出。染色體整合體可根據(jù)它們對抗菌劑的抗性而被篩選出來。向所述乳酸脫氫酶基因內的整合可通過單交換重組事件或通過雙(或多) 交換重組事件發(fā)生。所述微生物還可被修飾以上調丙酮酸脫氫酶基因(PDH)。上調丙酮酸脫氫酶基因促進丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化，乙酰CoA隨后可被用于在合適的條件下生產乙醛并且最終產生乙醇(使用乙醛脫氫酶)。上調PDH的另一個益處是降低了對葡萄糖攝取和糖酵解有抑制作用的丙酮酸水平。這會進一步促進乙醇生產。PDH是大的酶復合體，包含3 個單元——El 丙酮酸脫羧酶(EC 1.2.4. 1，不是EC 4. 1. 1. 1) ；E2 二氫硫辛酰胺轉乙酰酶；和E3 二氫硫辛酰胺脫氫酶。所述復合體需要一些輔因子，包括NAD、FAD、輔酶A硫辛酸和焦磷酸硫胺素(TPP)。四個基因編碼所述復合體，因為El單元是α和β亞基的異二聚體，并且這四個基因通常被描述為pdhA、pdhB、pdhC和pdhD (分別對應El α、ΕΙ、Ε2β 和Ε3)。PDH的El單元以如同PDC (EC4. 1. 1. 1)需要TPP —樣需要ΤΡΡ，并且催化類似的脫羧反應，但是是在輔酶A和硫辛酸——由其他酶單元攜帶的——存在的條件下，產物是乙酰輔酶A而不是乙醛。但是，已測量了 El單元未與PDH中的其他單元復合時的PDC活性 (Lessard&Perham ；The Journal of Biological Chemistry ； 1994,269 ； 14,10378-10383 ； Tomar et al ；Applied Microbiology and Biotechnology ；2003,62,76-82 ；Frank et al ； Science ；2004，306 ；Oct 29，872-876，supplementary data)。因此，EC 1. 2. 4. 1 的 PDC 活性可通過上調PDH來加以增強，這樣使得除了乙酰輔酶A外還產生乙醛。還試圖增強PDH活性以除去在LDH失活菌株中觀察到的丙酮酸瓶頸，以使得可以產生更多的乙醇并且使得作為副產物的乙酸和甲酸更少。為此目的，使用標準的“基因組步移”(genome walking)技術分離PDH基因和周圍序列。大約8. Skb的DNA被分離、測序并且發(fā)現(xiàn)包含圖4和表1中所示的以下基因。表 1
基因位置(bp)提出的功能框(5，和3’的象基酸)大小(氛基酸)Pdft746-192肽去曱?；?3 (MIT - IER)184ονβ868-1497未知定的蛋白質+1 (MQR - IWK)209pdhA(a)1875-2984丙酮酸脫氫酶的α-亞基+3 (MGA - ESK)369ρΜΑ(β)3003-3965丙酮酸脫氫酶的β-亞基+3 (MIQ - INF)320pdhB4058-5368二氫硫辛酰胺轉乙酰酶+2 (VAF - MEA)436Ipd5373-6785硫辛酰胺脫氫酶+3 (MW - ISK)470orp7432-6833未知-假定的蛋白質-1 (MNK-CTE)199οτβ7964-8647轉座·+2 (MDL -SPP)227假定的啟動子區(qū)域在圖4中示出(箭頭)——一個是PdhA起點的上游，第二個可能的啟動子在PdhB前面。枯草芽孢桿菌中PDH簇中的第二啟動子的在前實例已有報道(Gao et al Journal of Bacteriology，2002，184 10，2780-2788)，但是大部分被描述的PDH基因簇僅有在所述簇上游的一個啟動子(Neveling et al ；Biochimica Acta ； 1998 1385.367-372)。上調可使用本領域中已知的技術進行。具體地，可通過在PDH復合體上游引入合適的啟動子或增強子序列來進行上調。已知所述酶復合體可在有氧和厭氧條件下工作(Carlsson et al ；Infection and Immunity ； 1985,49 (3) :674-678)，但是它一般被認為是需氧酶(Ch 15 ；Principles of Biochemistry ;Lehninger, Nelson&Cox ;2ndEd, Worth Publishers, New York,1993, P447)，丙酮酸甲酸裂解酶(PEL)是它的厭氧對應物。這兩種酶都將在糖酵解中產生的丙酮酸轉化為乙酰輔酶A以進入TCA循環(huán)，但是所述循環(huán)僅在有氧條件下徹底地進行。但是，由于需要使用厭氧條件，本發(fā)明優(yōu)選使用在厭氧條件下起作用的啟動子。因此，可使用被認為在厭氧條件下起作用的酶啟動子，實例是LDH啟動子(來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (G. stearothermophilus) NCA1503 的 P_ldh)、PFL 啟動子(來自蠟狀芽孢桿菌 ATCC14579 和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌NCIMBl 1955的P_pf 1)和鐵氧還蛋白啟動子(來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM13M0的P_ferrA)，如以引用方式納入本文的PCT/GB2007/03699所述。在一個優(yōu)選的實施方案中，引入另一個修飾以增強PDC活性，從而促進丙酮酸轉化為乙醛。這可以通過使E2(EC 2.3.1.1 失活進行。失活可以類似使LDH失活的方式進行，但以E2基因作為破壞目標。在另一個實施方案中，本發(fā)明的微生物包含使丙酮酸甲酸裂解酶失活的修飾，從而防止/減少丙酮酸轉化為乙酰輔酶A和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脫氫酶 (PDH)的“厭氧對應物”并且將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A和甲酸(參見圖6)。盡管乙酰輔酶A可通過乙醛脫氫酶(AcHD)轉化為乙醇，但是甲酸是不需要的副產物，它可能抑制產乙醇生物的生長。選擇PFL作為敲除的目標以促進向乙醇產生方向的代謝流，并且改善其余乙醇合成路線的氧化還原平衡。此工作的另一個益處是消除甲酸的產生。PFL活性可通過轉座子插入、基因缺失或部分基因缺失而失活，以產生不依賴于針對所述改變表型的持續(xù)進行抗生素選擇的突變體。但是，丙酮酸甲酸裂解酶基因優(yōu)選通過缺失所述基因序列或所述基因序列的部分而失活。優(yōu)選缺失，因為這避免了所述基因序列再活化的難題，所述難題是使用轉座子滅活時經常遇到的。在該實施方案中，所述微生物優(yōu)選包含乳酸脫氫酶失活和丙酮酸脫氫酶上調，這樣使得乙醇生產在厭氧條件下得到提高。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物還包含上調的丙酮酸脫羧酶和/或醇脫氫酶基因。這些基因的表達致使酶的產生，所述酶使代謝改向從而使得乙醇成為主要發(fā)酵產物。如果PDC基因是EC4. 1. 1. 1，則所述基因將是異源的并且可被插入表達盒中，這是本領域技術人員會理解的。如果PDC基因是ECl. 2.4. 1，則它可以是上調的同源基因。ADH基因可以是同源或異源的。如果使用天然基因，則可通過本領域已知的方法使其上調。優(yōu)選PDC 和ADH都在所述微生物中表達。所述基因可從通常進行厭氧發(fā)酵的微生物——包括發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)種，包括運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)——中獲得?；蛑苽浜蛽饺胛⑸锏姆椒ㄊ潜绢I域已知的，例如在hgram等， Biotech&BioEng, 198 ；58 (2 and 3) :204-214 和 US5916787 中，每份文獻的內容都以引用的方式納入本文。所述基因可被引入質?；虮徽线M入染色體，這是本領域技術人員會理解的。本發(fā)明的嗜熱微生物可被進一步修飾以與野生型相比增加淀粉酶基因的表達。這樣的修飾在W02009/022158(其內容以引用的方式納入本文)中有詳細描述。這使得所述微生物可水解淀粉為葡萄糖單元單元，所述葡萄糖單體單元隨后可被用作糖酵解底物，用于形成丙酮酸，隨后形成乙醇。因此該修飾使得可提高乙醇從便宜、豐富、粗制植物材料中的生產。增強淀粉酶表達和酶活性的方法包括使用強上游啟動子以調節(jié)所述基因的轉錄、 摻入額外的比天然淀粉酶基因更高頻表達的淀粉酶基因或者表達更活躍的淀粉酶基因。術語“強啟動子”在本文中被定義為表達相應蛋白質至超過細胞內可溶蛋白0. 5%的水平的啟動子。在一個優(yōu)選實施方案中，異源淀粉酶基因編碼α-淀粉酶(α-1，4_葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3. 2. 1. 1)。優(yōu)選地，所述淀粉酶基因是來自地芽胞桿菌屬種，特別是嗜熱脂肪地芽孢桿菌。已經闡明了 α -淀粉酶基因的編碼序列，并且分離和擴增所述基因的技術是本領域公知的。為了使本發(fā)明的微生物能夠表現(xiàn)出比野生型更高的淀粉酶表達，優(yōu)選將所述淀粉酶基因置于強啟動子的控制之下，所述強啟動子在利于嗜熱微生物生產乙醇的低程度充氣或厭氧條件下起作用。所述啟動子優(yōu)選地是Idh啟動子并且可以是自體同源的，但是優(yōu)選地是異源的，并且最優(yōu)選地來自與所述淀粉酶基因相同的種。合適啟動子的實例包括但不局限于來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌NCA1503的P_ldh、來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌DSM13M0 的P_ferrA和來自蠟狀芽孢桿菌(B. cereus) ATCC14579的P_pfl。在本發(fā)明的另一個實施方案中，一系列不同的強啟動子被置于所述淀粉酶基因的上游以進一步增強表達。合適的強啟動子的實例包括但不局限于甘油醛-3-磷酸啟動子 (P_GAPDH)和來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(G. stearothermophilus)NCA 1503的淀粉酶啟動子。P_ldh的核酸序列也是已知的，并且克隆和裝配所述啟動子序列至淀粉酶基因上游的技術是本領域技術人員已知的。所述啟動子/淀粉酶序列可被克隆至合適的包含多個限制性位點的質?；虮磉_載體中。有很多市售的合適表達載體，如PGEM -T fesy載體(圖6)。可使用限制性內切酶將P_ldh/淀粉酶構建體切割成特定片段，所述片段可被連接至如pTM031 (圖7，SEQ ID No. 3)的溫度敏感質粒的相應限制性位點中，可使用丙酮酸甲酸裂解酶敲除質粒。隨后包含所述淀粉酶基因/Idh啟動子的質粒構建體可被電穿孔至本發(fā)明的微生物中，隨后與基因組DNA同源重組。染色體整合體可基于它們對抗菌劑——如氨芐青霉素或卡那霉素的抗性而被選出。淀粉酶活性還可從淀粉空斑區(qū)(zone of starch clearing)看出，例如在平板分析中。所述培養(yǎng)基可優(yōu)選地包含至少 Λ淀粉，優(yōu)選至少10% w/v淀粉，最優(yōu)選至少 20%W/v淀粉。所述淀粉可以是可溶的或不可溶的(例如谷物淀粉)?，F(xiàn)在參考附圖，在以下實施例中描述本發(fā)明的實施方案。通過實施例描述本發(fā)明但本發(fā)明不局限于實施例。實施例構建兩個不同的SpoOA敲除構建體以考慮目標spoOA鄰近的其他孢子形成基因， 所述其他孢子形成基因可在框外spoOA破壞時在轉錄方面受到影響，如圖8所示。因此如圖9所示，制造了框外和框內敲除盒。所述框外盒是通過以下方式產生的 除去所述spoOA基因的一段區(qū)域并代之以經工程改造的NotI限制性位點，以使得能夠雜交用于對包含spoOA缺失的片段進行PCR擴增的引物；而所述框內盒是通過除去天然存在的150bp MscI-MscI片段來構建的。將得到的片段克隆至pTM031，pTM031是來自插入pUC19中的EcoRI/SnaBI pUBllO 片段的5. Ikb質粒。pTM031的質粒圖譜在圖3中示出，pTM031的核酸序列與SEQ ID No. 7 對應。核苷酸1-239、洸；34-2791和沘48_5082來自pUC19，核苷酸對0_洸33來自pUBllO， 剩余的核苷酸07924848)與多克隆位點(MCS)對應。然后將得到的質粒用于轉化含有下文描述的其他修飾的地芽孢桿菌微生物。在如下所述的多種菌株背景中使用通過篩選雙交換突變體進行的轉化、初步整合和穩(wěn)定的方
法。
熱葡糖苷酶:地芽孢桿菌菌株背景
權利要求
1.一種嗜熱微生物，包含與野生型相比孢子形成減少的修飾。
2.權利要求1的微生物，其中所述修飾使天然spoOA基因失活。
3.權利要求2的微生物，其中所述修飾包括缺失所述spoOA基因的至少一部分。
4.權利要求3的微生物，其中所述修飾還包括用編碼限制性位點的DNA代替所述 spoOA基因的缺失部分。
5.權利要求4的微生物，其中所述限制性位點是NotI限制性位點。
6.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物是地芽孢桿菌屬(Geobacillus)種。
7.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物是熱葡糖苷酶地芽孢桿菌 (Geobacillus thermoglucosidasius)0
8.前述權利要求任一項的微生物，還包含使天然乳酸脫氫酶基因失活的修飾。
9.權利要求8的微生物，其中所述乳酸脫氫酶基因或其一部分已缺失。
10.權利要求8或9的微生物，其中所述微生物在所述乳酸脫氫酶基因中不包含整合元件。
11.前述權利要求任一項的微生物，還包含使天然丙酮酸甲酸裂解酶基因失活的修飾。
12.權利要求11的微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因或其一部分已缺失。
13.前述權利要求任一項的微生物，還包含上調所述丙酮酸脫氫酶基因的修飾。
14.權利要求13的微生物，其中將基因啟動子插入到所述丙酮酸脫氫酶基因的上游， 并且其中所述啟動子在厭氧條件下起作用。
15.前述權利要求任一項的微生物，還包含增強丙酮酸脫羧酶活性的修飾。
16.權利要求15的微生物，其中所述修飾使二氫硫辛酰胺轉乙酰酶基因(EC 2. 3. 1. 12)失活。
17.權利要求15或16的微生物，其中所述二氫硫氫酰胺轉乙酰酶基因或其部分缺失。
18.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物包含異源丙酮酸脫羧酶基因。
19.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物包含異源醇脫氫酶基因。
20.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物在包含至少3%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
21.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物在包含至少10%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
22.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物在包含最高達20%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。
23.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物可被高頻轉化。
24.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物在40°C-85°C、優(yōu)選在50°C -70°C 的溫度下生長。
25.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物被鑒定為TM443(登記號41591)或 TM444(登記號 41588)。
26.前述權利要求任一項的微生物，其中所述微生物包含受控于在厭氧條件下起作用的啟動子的異源淀粉酶基因。
27.權利要求26的微生物，其中所述啟動子是Idh啟動子。
28.權利要求27的微生物，其中所述Idh啟動子是異源的。
29.權利要求28的微生物，其中所述Idh啟動子來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus)0
30.權利要求26的微生物，其中所述淀粉酶基因受控于一系列強啟動子。
31.權利要求30的微生物，其中所述強啟動子是異源的。
32.權利要求31的微生物，其中所述強啟動子包括淀粉酶啟動子。
33.權利要求31或32的微生物，其中所述啟動子來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
34.權利要求26至33任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因來自地芽孢桿菌屬 (Geobacillus)禾中。
35.權利要求26至34任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
36.權利要求26至35任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因編碼α淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)。
37.一種生產乙醇的方法，包括在合適的條件下，在C3、C5或C6糖或它們的寡聚物存在的情況下培養(yǎng)前述任一項權利要求的微生物。
38.權利要求37的方法，其中所述方法在40°C_70°C的溫度下進行。
39.權利要求38的方法，其中所述溫度是52°C-65°C。
40.權利要求37至39任一項的方法，其中所述微生物被保持在pH為4.0至8. 0的培養(yǎng)基中。
41.一種生產乙醇的方法，包括在包含至少淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求26 至36任一項的微生物。
42.權利要求41的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少10%w/v淀粉。
43.權利要求42的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少20%w/v淀粉。
全文摘要
包含防止孢子形成的修飾的嗜熱微生物，其中所述修飾使天然spo0A基因失活。
文檔編號C12P7/06GK102203237SQ200980144253
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權日2008年11月5日
發(fā)明者A·阿特金森, K·埃利, 羅杰·克里普斯 申請人:Tmo可再生能源有限公司