專利名稱：基因沉默治療劑的脂質(zhì)體有效遞送方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明整體上涉及用于遞送生物活性劑和藥物試劑的方法、組合物和應(yīng)用。本發(fā)明的方法和組合物可用于將治療劑遞送至所選的細(xì)胞、組織、器官或受治療者。本發(fā)明的實施方式可以提供包括核酸試劑在內(nèi)的藥物和治療劑的遞送以及制備物質(zhì)并利用其進行藥物遞送的方法。特別地，本發(fā)明涉及方法和包含脂質(zhì)體或?qū)訝钅遗莸慕M合物，和其它形式的遞送增強組合物和制劑，以及治療方法和這些遞送物質(zhì)的應(yīng)用。序列表本申請包含在此通過EFS-Web作為2009年10月14日創(chuàng)建的名為MD-08-16PCT. txt的ASCII文件提交的序列表，其大小為99，662字節(jié)，通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
治療性化合物向受治療者的遞送會因為受限于化合物到達(dá)靶細(xì)胞或組織的能力或受限于細(xì)胞內(nèi)化合物的進入或通行而受到阻礙。治療性物質(zhì)的遞送通常受限于細(xì)胞膜。 針對遞送的這些屏障和限制可能導(dǎo)致需要使用比實現(xiàn)預(yù)期結(jié)果更高的化合物濃度，這樣就帶來了毒性作用和副作用的風(fēng)險。某些治療性化合物的遞送的再一個制約是需要保護化合物在運輸過程中免受降解。特別地，通過血液循環(huán)的全身遞送可使所述化合物經(jīng)受多種蛋白、酶以及免疫學(xué)成分和因子。一種遞送策略是利用天然或合成的親脂性載體分子或聚合物載體分子來改善化合物向細(xì)胞內(nèi)的運輸。這些物質(zhì)可以充分利用為選擇性進入細(xì)胞同時仍排除外源分子(如核酸和蛋白)而存在的機制。例如，陽離子脂質(zhì)可以與藥物試劑相互作用，并與細(xì)胞膜接觸。還可以將某些天然的和合成的親脂性分子并入(organize)作為藥物試劑載體的脂質(zhì)體或顆粒。納米或亞微尺寸的脂質(zhì)體可以充分利用為選擇性進入細(xì)胞而存在的機制，例如細(xì)胞內(nèi)吞作用。脂質(zhì)體藥物載體可以保護藥物分子免受降解，同時改善細(xì)胞對其的攝取。而且，脂質(zhì)體藥物載體可以通過靜電和其它相互作用包裹或結(jié)合某些化合物，并可以與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用以啟動跨膜運輸。脂質(zhì)體的缺點是治療性脂質(zhì)體制劑的生物學(xué)活性通常依賴于進入脂質(zhì)體中的活性劑荷載程度。通常，期望高程度的荷載以提供高的治療活性。此外，脂質(zhì)體的荷載還需要保持在制劑內(nèi)的額外的載體分子。脂質(zhì)體用于藥物試劑遞送的另一個制約在于使用脂質(zhì)體增加了遞送制劑的質(zhì)量。 治療性制劑的生物學(xué)活性及其相對毒性將受到諸如用于制備制劑的親脂性分子和載體之類的其它組分的性質(zhì)和質(zhì)量的影響。用于遞送活性劑的常規(guī)基于脂質(zhì)的脂質(zhì)體制劑可具有脂質(zhì)分子的質(zhì)量與活性劑的質(zhì)量比值高10至15倍率。通常，脂質(zhì)或載體與活性劑的較低比率更有效并被人所期望。對于用于核酸試劑的此脂質(zhì)體制劑，每個脂質(zhì)體可以包含不高于數(shù)百拷貝的核酸試劑分子。其中，對調(diào)節(jié)性RNA的了解和RNA干擾(RNAi)、RNAi治療、RNA藥物、反義治療和基因治療的開發(fā)已經(jīng)加大了對將活性核酸試劑引入細(xì)胞的有效手段的需求。通常，核酸在細(xì)胞或血漿內(nèi)僅保持穩(wěn)定有限的時間。但是，基于核酸的試劑能夠在隨后可以被分散以用于細(xì)胞遞送的組合物和制劑中保持穩(wěn)定。需要用于全身和局部遞送藥物和生物學(xué)活性分子的方法、組合物和應(yīng)用。其中，需要用于制備并使用提高了生物活性治療分子的遞送效率的遞送結(jié)構(gòu)和載體(包括脂質(zhì)體形式)的方法。期望利用數(shù)量降低的載體物質(zhì)，尤其對于脂質(zhì)體制劑、基因沉默治療劑和其它制劑，產(chǎn)生高效遞送和高生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)遞送最終作為治療劑的藥物試劑的新型方法、組合物和制劑，其通常維持細(xì)胞保護作用且相對低毒。本發(fā)明的方法和組合物可用于將藥物試劑遞送至所選的細(xì)胞、組織和器官。在一些方面，本發(fā)明提供了向細(xì)胞遞送活性核酸試劑或分子的過程、組合物和方法。所述活性劑可以或者通過藥物作用或者通過產(chǎn)生RNA干擾或反義或核酶作用的應(yīng)答， 而產(chǎn)生治療或藥理作用。本發(fā)明的活性劑可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)或用于基因治療。本發(fā)明的實施方式提供了用于制備包括含有一種或多種活性劑的脂質(zhì)體組合物在內(nèi)的組合物的多種方法，所述方法通過提供包含活性劑的含水緩沖溶液的第一流體，提供包含處于有機溶劑中的一種或多種脂質(zhì)體形成化合物的非水溶液的第二流體，使第一流體與第二流體撞擊，由此形成所述有機溶劑濃度為約20%至約50% ν/ν的撞擊流體 (impinging stream)。所述撞擊流體的pH可以為約6至約7. 4。所述撞擊流體可以在收集容器中于約20°C至約35°C的溫度下溫育約0. 5小時至約8小時，由此形成含有脂質(zhì)體的溫育物。在某些實施方式中，用于制備包含一種或多種活性劑的組合物的方法可以包括， 通過向所述溫育物中加入足以使所述有機溶劑的濃度小于約20% ν/ν的緩沖劑而使所述溫育物淬火。在一些方面，本發(fā)明的脂質(zhì)體形成化合物可以為一種或多種DILA2氨基酸化合物。DILA2氨基酸化合物是含有可以形成脂質(zhì)體的氨基酸基團的合成有機化合物。DILA2 氨基酸化合物可以在所述氨基酸基團的N-末端或C-末端或上述兩端含有遞送增強尾或親脂性尾。在一些變式中，用于制備含有一種或多種活性劑的組合物的方法可以進一步包括使含有所述活性劑的第一流體的體積流率是含有脂質(zhì)體形成分子的第二流體的體積流率的兩倍或更高。在某些變式中，第一流體的體積流率是第二流體的體積流率的三倍或更高， 或者是第二流體的體積流率的五倍或更高。本發(fā)明的活性劑可以是化11 ^、含核酸的試劑、基因沉默劑、基因調(diào)節(jié)劑、反義試劑、肽核酸試劑、核酶試劑、RNA試劑或DNA試劑。在一些實施方式中，所述活性劑可以是藥物化合物或小分子藥物。用于制備含有一種或多種活性劑的脂質(zhì)體組合物的方法可以進一步包括向收集容器中加入緩沖劑以調(diào)節(jié)所述有機溶劑的濃度。所述撞擊流體的PH經(jīng)調(diào)節(jié)可以為約3至約6。所述溫育步驟可以在pH為約3至約6下進行。
在某些方面，所述活性劑可以以大于約50%、或大于約70%的水平被包裹在脂質(zhì)體中。在一些方面，本發(fā)明可以提供在45°C的溫度下保持基因沉默活性達(dá)7天的脂質(zhì)體組合物。在某些方面，所述脂質(zhì)體組合物可以在45°C的溫度下保持包裹活性劑達(dá)7天。本發(fā)明的方法可以包括通過切向流過濾和滲濾而過濾所述溫育物。在切向流過濾后，所述脂質(zhì)體尺寸均一，其直徑可以小于約160nm，或者平均直徑可以為約40nm至約 160nm，或約80nm至約150nm。在進一步的實施方式中，所述溫育物可以經(jīng)滅菌，且所述有機溶劑可以用不同的藥學(xué)上可接受的緩沖劑交換。在本發(fā)明的某些方法中，可以通過切向過濾和滲濾而對溫育物進行過濾。在某些實施方式中，所述溫育物可以經(jīng)過滅菌。本發(fā)明的方法可以包括向第一流體中加入有機溶劑使其濃度為約至約40%
v/vo所述有機溶劑可以為(C1-6)烷醇濃度為約40%至約99% ν/ν或約70%至約95% 的無菌注射水溶液。本發(fā)明的方法的溫育時長可以為約1小時至約4小時。本發(fā)明進一步涉及通過本發(fā)明方法的任一變式制備的藥物組合物?？偟膩碚f，本發(fā)明包括用于向生物細(xì)胞遞送治療性核酸的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過根據(jù)本發(fā)明方法制備組合物并用所述組合物處理細(xì)胞而抑制生物細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法。本文公開的抑制哺乳動物中基因表達(dá)的方法包括根據(jù)本發(fā)明方法制備組合物并向所述哺乳動物施用所述組合物。本發(fā)明的實施方式可進一步提供通過根據(jù)本發(fā)明方法制備組合物并向人施用所述組合物而治療人類疾病的方法，其中所述疾病為癌、膀胱癌、肝癌、肝病、高膽固醇血癥、 炎癥性疾病、代謝疾病、炎癥、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腦炎、骨折、心臟病和病毒性疾病。本發(fā)明進一步涉及治療疾病的組合物的應(yīng)用和組合物在制備用于治療疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于向細(xì)胞遞送生物試劑的多種組合物和制劑。更特別地，在某些方面，本發(fā)明提供了大小為納米級的脂質(zhì)體制劑和載體顆粒。所述載體顆?？梢员缓奢d在脂質(zhì)體內(nèi)，在遞送中可以顯示提高的穩(wěn)定性，并且可以有效地遞送藥物試劑以調(diào)節(jié)基因表達(dá)或活性。本發(fā)明提供了用于改善藥物和生物活性分子的全身和局部遞送的組合物、方法和應(yīng)用。特別地，本申請還提供了用于制備和使用可以以提高的遞送效率在細(xì)胞內(nèi)遞送活性劑的遞送結(jié)構(gòu)和載體的新型組合物和方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含脂質(zhì)體的組合物，所述脂質(zhì)體含有一種或多種載體顆粒，每種載體顆粒都含有活性核酸試劑和肽其中，所述肽的質(zhì)量和所述脂質(zhì)體的質(zhì)量之和與所述核酸試劑的質(zhì)量的比率小于約15，或者小于約12，或者小于約10，或者小于約9，或者小于約8，或者小于約5.在某些實施方式中，本發(fā)明提供了在體內(nèi)用于ApoB基因沉默的敲減活性為50% 或更高、或70%或更高、或者90%或更高的組合物。
在一些變式中，本發(fā)明的組合物可以包含含有氨基酸脂質(zhì)的脂質(zhì)體。在某些方面，本發(fā)明的組合物可以包含帶電荷的載體顆粒、帶負(fù)電荷的載體顆?；蛘邘д姾傻妮d體顆粒。在某些變式中，所述活性核酸試劑可以為RNAi誘導(dǎo)劑或反義試劑。每種脂質(zhì)體均可以包含500或更高拷貝、或者1000或更高拷貝、或者5000或更高拷貝的活性劑分子。在一些變式中，用于載體顆粒的肽可以為可切割的肽或者可交聯(lián)的肽。在一些實施方式中，所述肽是PN4110或PN183。本發(fā)明提供了用于向細(xì)胞遞送活性核酸試劑的方法，所述方法包括制備脂質(zhì)體組合物并用所述組合物處理所述細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，所述方法包括制備脂質(zhì)體組合物并用所述組合物處理所述細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括制備脂質(zhì)體組合物并向所述哺乳動物施用所述組合物。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了治療人類疾病的方法，所述疾病選自包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥性疾病，包括高膽固醇血癥的代謝性疾病，肝病，腦炎，骨折，心臟病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥，該方法包括制備脂質(zhì)體組合物并向人類施用該組合物。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體組合物在制備用于治療疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病包括包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥性疾病，包括高膽固醇血癥的代謝性疾病， 肝病，腦炎，骨折，心臟病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥。在某些變式中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體組合物用于治療疾病的應(yīng)用，所述疾病包括包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥性疾病，包括高膽固醇血癥的代謝性疾病，肝病，腦炎，骨折，心臟病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌癥。本發(fā)明的該發(fā)明內(nèi)容和具體實施方式
以及附圖、所附實施例和權(quán)利要求書整體上都作為本發(fā)明的公開內(nèi)容。


圖1 本發(fā)明的脂質(zhì)體實施方式的示意圖，其中某些脂質(zhì)體形成化合物形成了雙層囊泡10。在該實施方式中，所述脂質(zhì)體的外層受到與一種脂質(zhì)體形成分子的頭部基團連接的聚乙二醇鏈20的保護。脂質(zhì)體外層還有特異性靶向細(xì)胞或組織的配體30。在該實施方式中，所述脂質(zhì)體囊泡包含活性干擾性RNA組分的負(fù)載，其包括縮合的RNA納米顆粒40、 雙鏈RNA雙螺旋肽共軛物50、三鏈mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有長突出端80的dsRNA 和具有平末端90的siRNA，這些組分并入本實施方式中。圖2 用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。分別制備包括活性劑溶液、緩沖溶液和一種或多種脂質(zhì)體形成化合物的溶液的試劑溶液并放置于容器 200中。使活性劑溶液和脂質(zhì)體形成化合物的溶液在撞擊流體210中接觸。將撞擊流體收集在收集容器220中。將所收集的物質(zhì)置于所述容器中進行溫育過程230，該步驟之后通過淬火240使所述物質(zhì)穩(wěn)定。使淬火的物質(zhì)進行過濾過程250。濾液輸出物260繼續(xù)進行整理(finishing)過程。
圖3 用于整理本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。所述脂質(zhì)體組合物(可以為來自脂質(zhì)體組合物的制備的濾液輸出物)經(jīng)滅菌300。用于運載經(jīng)滅菌的組合物的器皿在310填裝并在320整理，之后在330冷凍所述無菌組合物并在340儲藏。將最終的組合物進行運輸350以備使用。圖4 用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。將活性劑溶液維持在容器400中。將含有脂質(zhì)體形成組分(例如DILA2化合物或脂質(zhì)體)的溶液維持在獨立的容器410中。將緩沖溶液維持在另一個容器420中。利用獨立的蠕動泵430以獨立選擇的流速抽吸溶液。所述溶液可以任選流過串聯(lián)濾器或者在裝入容器前過濾。在撞擊過程中，所述活性劑溶液與含有脂質(zhì)體形成組分的溶液在接觸點434接觸。所述撞擊流體可以任選流過一個或多個混合管436。所述撞擊流體進入收集容器440用于溫育過程。淬火過程緩沖溶液可以任選維持在獨立的容器450中。所述脂質(zhì)體組合物460從收集容器440 流出并進入過濾過程。圖5 用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。將來自收集容器的輸出460的穩(wěn)定化脂質(zhì)體組合物置于容器500中。將經(jīng)過滲濾的緩沖溶液維持在獨立的容器520中。蠕動泵502提供了穩(wěn)定化脂質(zhì)體組合物從容器500經(jīng)過含中空纖維膜的管 504的循環(huán)。切向流經(jīng)由該循環(huán)而發(fā)生以通過除去濾液530而濃縮穩(wěn)定化的脂質(zhì)體組合物。 加入來自容器520的置換緩沖液可允許以固定或可變體積滲濾。任選地，可以利用蠕動泵 506進行穩(wěn)定化脂質(zhì)體組合物的滲析以驅(qū)動來自容器MO的滲析緩沖溶液。特定濃度的所述穩(wěn)定化脂質(zhì)體組合物被輸出550至整理過程。圖6 圖6顯示聚精氨酸結(jié)合區(qū)與增加聚精氨酸結(jié)合區(qū)長度的dsRNA的結(jié)合。 圖6中，利用PN3499(總共含有10個精氨酸的二聚體肽)觀察到最強的結(jié)合(具有取代 SYBR-Gold染料的最佳能力)。
具體實施例方式本發(fā)明的實施方式還提供了包括核酸試劑的藥物和治療劑的遞送以及制備物質(zhì)并利用其進行藥物遞送的方法。本發(fā)明進一步涉及可用于將各種分子和結(jié)構(gòu)遞送至細(xì)胞的新型藥物遞送增強方法和組合物。本發(fā)明提供了最終意在藥物的遞送、治療劑以及疾病和病癥的診斷和治療、包括對受治療者基因表達(dá)或活性調(diào)控產(chǎn)生響應(yīng)的那些疾病和病癥的診斷和治療的多種方法、 化合物、組合物、制劑和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及方法和包含脂質(zhì)體或?qū)訝钅遗莸慕M合物，和其它形式的遞送增強組合物和制劑，以及這些遞送物質(zhì)的治療方法和應(yīng)用。本發(fā)明的方法和組合物可進一步用于遞送治療劑、預(yù)防劑和診斷劑，如核酸試劑、 多核苷酸、肽、蛋白以及小分子化合物和藥物。本發(fā)明的組合物和方法可用于諸如包裹在脂質(zhì)體或?qū)訝钅遗葜械闹愋问降闹委焺┑倪f送。這些形式可以包括各種直徑的納米顆粒。其中，對調(diào)節(jié)性RNA的了解和RNA干擾(RNAi或iRNA)、RNAi治療、RNA藥物、反義治療或核酶治療以及DNA基因治療的開發(fā)已經(jīng)加大了對將活性核酸試劑引入細(xì)胞的有效手段的需求。通常，核酸在引入至細(xì)胞或血漿內(nèi)時僅保持穩(wěn)定有限的時間。但是，基于核酸的試劑能夠被穩(wěn)定在組合物和制劑中，然后所述組合物和制劑可以被施用并分散以用于細(xì)胞遞送。核酸試劑包括含有核酸的任何分子，例如基因沉默劑、基因調(diào)節(jié)劑、反義試劑、肽核酸試劑、核酶試劑、RNA試劑和DNA試劑。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法可用于遞送包裹在脂質(zhì)體中的治療劑。在這些實施方式中，治療劑可以稱作負(fù)載。例如，圖1顯示了本發(fā)明的脂質(zhì)體實施方式的示意圖，其中某些親脂性分子形成雙層囊泡10。在該實施方式中，所述脂質(zhì)體的外層受到與一種親脂性分子的頭部基團連接的聚乙二醇鏈20的保護。脂質(zhì)體外層還有特異性靶向細(xì)胞或組織的配體30。在該實施方式中，所述脂質(zhì)體囊泡包含活性RNA組分的負(fù)載，其包括縮合的RNA納米顆粒40、雙鏈RNA 雙螺旋肽共軛物50、三鏈mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有長突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，這些組分并入本實施方式中。其它形式的治療劑負(fù)載可以包括微RNA、 發(fā)夾RNA、DNA或核酶形式。通常，在本發(fā)明的方法和組合物中可以使用任何活性劑作為負(fù)載。在一些實施方式中，所述負(fù)載可以為小的有機分子藥物試劑。在某些實施方式中，所述負(fù)載可以為帶負(fù)電荷的治療劑或中性治療劑。本發(fā)明一些方面提供的方法和組合物可以以可釋放形式或組合物遞送治療劑?？舍尫判问胶徒M合物包括結(jié)合并釋放活性劑的分子、結(jié)合活性劑并卸載有助于釋放該試劑的部分(moiety)的分子、結(jié)合活性劑并隨后在生物隔室內(nèi)以有助于該試劑的釋放的方式調(diào)節(jié)的分子，以及含有與釋放介導(dǎo)劑化合物混合的活性劑結(jié)合的分子的組合物。在某些方面，本發(fā)明提供了用于制備適合遞送治療劑的脂質(zhì)體組合物的方法和儀器。在某些實施方式中，本發(fā)明的活性劑為UsiRNA。本發(fā)明的方法可以提供核酸試劑的脂質(zhì)體組合物，例如雙鏈或三鏈RNA結(jié)構(gòu)、RNA肽共軛物、縮合的RNA納米顆粒、切丁酶底物 RNA、dsRNA、siRNA、微RNA、發(fā)夾RNA和其它活性RNA形式。本發(fā)明的活性劑可以為活性RNA試劑的肽縮合物。例如，通過縮合活性RNA試劑和肽或其它生物分子、RNA和多聚物質(zhì)的縮合物而形成的納米顆?？梢宰鳛樨?fù)載而荷載至本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物中。所述納米顆?？梢詾榻宦?lián)的。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的活性劑可以為肽、蛋白、蛋白酶、抗體、單克隆抗體、基于抗體的藥物、疫苗試劑或小分子藥物。含有活性劑的組合物可以為含水溶液。本文使用的術(shù)語“含水溶液”是指水溶液、無菌水溶液或主體溶劑為水的任何溶液。含水溶液可以包含，例如一些有機溶劑。含水溶劑的實例包括水、注射用無菌水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。含有脂質(zhì)體形成分子或親脂性分子的組合物可以為非水溶液。本文使用的術(shù)語“非水溶液”是指主體溶劑不是水的任何溶液。非水溶液可以包
含一些水。非水溶劑的實例包括易于與水、烷醇、(C1-6)烷醇、乙醇、異丙醇、異丁醇、仲丁醇、 叔丁醇、烷醇-水、乙醇-水、乙腈、丙酮、甲酮、二甲基亞砜、表面活性劑溶液、去污劑溶液及它們的混合物混合的有機溶劑。用于脂質(zhì)體組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實施方式可以提供用于制備含有活性劑的含脂質(zhì)體組合物的多種方法以及藥物遞送的方法。在一些方面，可以通過撞擊兩種組合物，例如含有一種或多種活性劑的組合物和含有一種或多種脂質(zhì)體形成分子的獨立的組合物而制備脂質(zhì)體組合物。通常，本發(fā)明的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)在完成制備方法的所有步驟前不是以完全活性形式構(gòu)成的。本發(fā)明方法的每個步驟都需要一定的時間。通常，脂質(zhì)體組合物的形成比例將依賴于多種可變因素(例如流速、溫度、PH和各組分的濃度)的組合的不可預(yù)測的作用。在一些實施方式中，使用溫育時間以控制形成過程。圖2顯示了用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。圖2中， 單獨制備包括活性劑溶液、緩沖溶液和一種或多種脂質(zhì)體形成化合物的溶液的試劑溶液并置于溶液容器200中。所述試劑溶液可任選單獨過濾或者在無菌條件下制備。所述活性劑溶液和脂質(zhì)體形成化合物的溶液在撞擊過程210中接觸。將撞擊流體收集在收集容器220 中。將所收集的物質(zhì)保持在容器中用于溫育過程230，該步驟之后通過淬火240而使物質(zhì)穩(wěn)定。使淬火的物質(zhì)進行過濾過程250。移除過濾輸出物260至整理過程。本發(fā)明包括用于制備脂質(zhì)體組合物的包括撞擊過程的方法的實施方式。撞擊過程可以具有通過使包含有活性劑的組合物與含有脂質(zhì)體形成分子的組合物撞擊而產(chǎn)生撞擊流體的一個或多個步驟。在一些方面，本發(fā)明用于制備活性劑的脂質(zhì)體組合物的方法可以具有溫育過程的一個或多個步驟。溫育過程可以包括收集撞擊流體并將其保持在容器中持續(xù)溫育時間。本發(fā)明的實施方式可進一步包括用于制備脂質(zhì)體組合物的方法，其中所溫育的組合物被淬火?？梢酝ㄟ^加入溶劑、緩沖劑或稀釋劑至所溫育的組合物流體或組合物的混合物中而進行淬火。淬火可以將特定組分(例如有機溶劑或分散劑)的濃度稀釋至預(yù)定水平以下。通常，所溫育的組合物的淬火可以形成在進一步的過程或整理步驟中穩(wěn)定的組合物。 淬火的步驟是可操作的以使所溫育的可包含脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的組合物穩(wěn)定。收集容器中撞擊流體的溫育以及方法的其它步驟可以提供其中的活性劑被脂質(zhì)體高度包裹的脂質(zhì)體制劑。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物和結(jié)構(gòu)的形成可需要撞擊、混合、稀釋、收集、溫育、調(diào)節(jié)PH、淬火和過濾的任何步驟。 用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的方法可以進一步包括一個或多個過濾步驟。過濾步驟可用于改變多種過程參數(shù)，例如控制或改變組分的濃度或者改變粒度或分散性以及其它物理溶液參數(shù)。圖3顯示了用于整理本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的某些實施方式的流程圖。參見圖3， 所述脂質(zhì)體組合物(可以為來自脂質(zhì)體組合物的制備的濾液輸出物)經(jīng)滅菌300。用于運載無菌組合物的容器在310填裝并在320后處理，之后在330冷凍所述無菌組合物并在340 儲藏。將最終的組合物進行運輸350以備使用。本發(fā)明涉及物質(zhì)的滅菌、填裝和整理至容器以及所形成的制劑的儲藏的過程可以使用本領(lǐng)域已知的步驟和方法，例如Remington，s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)中描述的那些。用于評價脂質(zhì)體的包裹、大小和一般制備的一些方法描述在，例如W02001005374， 美國專利
發(fā)明者巴里·A·波利斯基, 皮埃羅·哈維, 羅格·C·阿達(dá)米, 賈亞·S·吉亞納尼, 邁克爾·E·休斯頓, 邁克爾·V·滕普林, 雷切爾·E·約翰斯 申請人:瑪瑞納生物技術(shù)有限公司