專利名稱：通過抑制針對載脂蛋白-a1的天然反義轉(zhuǎn)錄物治療載脂蛋白-a1相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)載脂蛋白和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。雜交對于檢測特定核酸或改變其表達(dá)的各種技術(shù)也是關(guān)鍵的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交破壞基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有DNA-RNA 雜交物充當(dāng)用于通過核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，其是在大多數(shù)細(xì)胞類型中存在的活性。反義分子可以遞送到細(xì)胞內(nèi)，如對于寡聚脫氧核苷酸(ODNs)的情況，或它們可以由內(nèi)源基因表達(dá)為RNA分子。FDA近期批準(zhǔn)了反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映反義物具有治療效用。概述
提供這個概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，以簡要指出本發(fā)明的性質(zhì)和主旨。它提出將不用于解釋或限制權(quán)利要求范圍或含義的理解。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用的方法，通過使用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的一種或多種反義寡核苷酸，導(dǎo)致相應(yīng)正義基因的上調(diào)。本文還考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可以通過siRNA、核酶和小分子來達(dá)到，這被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一個實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白 (apolipoprotein,ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與多核苷酸的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO :2的核苷酸1-932內(nèi)的5 - 30個連續(xù)核苷酸(圖8);從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向ApoAl多核苷酸的天然反義序列，例如如SEQ ID NO :2中所示的多核苷酸，以及關(guān)于其的任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的例子如SEQ ID NO :81-173中所示。另一個實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl) 多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。另一個實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl) 多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與針對載脂蛋白(ApoAl)反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白 (ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包括與正義和/或反義載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸結(jié)合的一種或多種反義寡核苷酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一個或多個修飾的或取代的核苷酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一個或多個修飾的鍵。在另外一個實(shí)施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或鎖核酸(LNA)分子的修飾的堿基。優(yōu)選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用于患者。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括給患者施用至少一次反義化合物，然而，這種治療可以修改為包括經(jīng)過一段時間的多個劑量。治療可以與一種或多種其他類型的療法組合。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體中。其他方面在下文描述。附圖簡述


圖1是實(shí)時PCR結(jié)果的圖表，顯示在用針對ApoAl反義DA327409ext的一些反義寡核苷酸處理后，在H印G2細(xì)胞中的ApoAl mRNA水平顯著增加。條RH3-RH597與用SEQ ID NO:81-158處理的樣品對應(yīng)。圖2是實(shí)時PCR結(jié)果的圖表，顯示與對照比較，在用裸露LNA或硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞經(jīng)過7天后，在ApoAl mRNA (上圖)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA (下圖)中的倍數(shù)變化。指示為#6LNA、#11LNA、#6PS和#11PS的條分別代表SEQ ID NO: 159、 160、161、162。圖3是實(shí)時PCR結(jié)果的圖表，顯示在用LNA寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后，在ApoAl mRNA (橙色條)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA (藍(lán)色條)中的倍數(shù)變化。指示為6_11 的條對應(yīng)于 SEQ ID NO 159、167-170、160。圖4顯示在用寡核苷酸處理!fepG2細(xì)胞后，在ApoAl mRNA (下圖)和蛋白質(zhì)(上圖) 中的劑量依賴性增加。指示CUR-4806和CUR-4811的條分別對應(yīng)于SEQ ID NO 159和160。圖5是實(shí)時PCR結(jié)果的圖表，顯示在用針對天然ApoAl反義DA327409ext的寡核苷酸處理后，在原代非洲綠猴肝細(xì)胞中ApoAl mRNA的上調(diào)。指示⑶R-4816和⑶R-4811的條分別對應(yīng)于SEQ ID NO 173和160。圖6是顯示如分別通過實(shí)時PCR和ELISA測定的，與基線水平比較，在用⑶R-962 (針對ApoAl反義DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸)處理后，在猴肝臟活組織檢查中增加的 ApoAl mRNA和蛋白質(zhì)水平的圖表(右圖)。在用在體外顯示對ApoAl水平?jīng)]有作用的寡核苷酸(⑶R-963)給藥的對照組中相同時間段后，ApoAl mRNA或蛋白質(zhì)水平不改變(左圖)。指示CUR-962和CUR-963的條分別對應(yīng)于SEQ ID NO: 170和171。
圖7顯示來自2006年3月UCSC基因組組裝的SEQ ID NO 1，ApoAl mRNA和SEQ ID NO la, ApoAl 基因組序列(http: "genome, ucsc. edu/index. html org=Human&db=hgl8& hgsid=144980821，外顯子以大寫字母顯示，內(nèi)含子以小寫字母顯示)。圖 8 顯示 SEQ ID NO :2。圖 9A-D 顯示 SEQ ID NO :3_158。圖10顯示SEQ ID NO 159-173。*指出硫代磷酸酯鍵，+指出LNA修飾。圖11顯示人和恒河猴ApoAl天然反義序列的并排比對以及用于靶向這些序列的一些寡核苷酸的位置。發(fā)明詳述
下文就用于舉例說明的示例應(yīng)用而言描述了本發(fā)明的幾個方面。應(yīng)當(dāng)理解闡述了眾多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法，以提供本發(fā)明的全面了解。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到本發(fā)明可以無需一個或多個具體細(xì)節(jié)或用其他方法進(jìn)行實(shí)踐。本發(fā)明不受舉例說明的動作或事件排序限制，因?yàn)橐恍﹦幼骺梢砸圆煌涡蚝?或與其他動作或事件同時發(fā)生。 此外，并非需要所有舉例說明的動作或事件來實(shí)現(xiàn)依照本發(fā)明的方法。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物預(yù)期對應(yīng)于來自任何物種的同系物， 本文公開的組合物和方法可應(yīng)用于所述任何物種。因此，該術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)公開了來自特定物種的基因或基因產(chǎn)物時，這個公開內(nèi)容預(yù)期僅是示例性的，并且不解釋為限制，除非它在其中出現(xiàn)的上下文明確指出。因此，例如，對于本文公開的基因，這在一些實(shí)施方案中涉及哺乳動物核酸和氨基酸序列，預(yù)期包括來自其他動物同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物，包括但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲類、爬行類和鳥類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基因或核酸序列是人的。定義
本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并且不預(yù)期限制本發(fā)明。如本文使用的，單數(shù)形式‘‘a(chǎn)”、‘‘a(chǎn)n”和‘‘the”也預(yù)期包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說明。此外， 就術(shù)語“包括”、“具有”、“含有”或其變化用于詳述和/或權(quán)利要求來說，此類術(shù)語預(yù)期以類似于術(shù)語“包含”的方式是包括在內(nèi)的。術(shù)語“約”或“大約”意指如通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的，在關(guān)于具體值的可接受誤差范圍內(nèi)，這將部分依賴于值如何進(jìn)行測量或測定，即測量系統(tǒng)的局限性。例如，“約” 可以意指根據(jù)本領(lǐng)域的實(shí)踐在1或超過1個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)。可替代地，“約”可以意指直到給定值20%、優(yōu)選直到10%、更優(yōu)選直到5%且更優(yōu)選直到的范圍。可替代地，特別就生物系統(tǒng)或過程而言，該術(shù)語可以意指在值的一個數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選在5倍內(nèi)，且更優(yōu)選在2倍內(nèi)。 當(dāng)具體值在申請和權(quán)利要求中描述時，除非另有說明，否則應(yīng)假定術(shù)語“約”意指在關(guān)于具體值的可接受誤差范圍內(nèi)。如本文使用的，術(shù)語“mRNA”意指目前已知的靶基因的一種或多種mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及可以闡明的任何進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄物。“反義寡核苷酸”或“反義化合物”意指與另一種RNA或DNA(靶RNA、DNA)結(jié)合的RNA 或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，那么它借助于RNA-RNA相互作用與另一種RNA 靶結(jié)合，并且改變靶RNA 的活性(Eguchi 等人，1991 J/w. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可以上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意欲包括從治療、診斷或其他觀點(diǎn)看來有用的任何外來RNA或DNA分子。此類分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療編輯RNA和激動劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少部分雜交的其他寡聚化合物。像這樣，這些化合物可以以單鏈、 雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”還包括天然和/或修飾單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其置換和α-異頭物形式、肽核酸(PNA)、 鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體間相互作用的規(guī)律模式與靶多核苷酸特異性結(jié)合，例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、HoSgsteen或反向Ho5gsteen型堿基配對等。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同區(qū)域組成。在本發(fā)明的背景中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其包含2個或更多個化學(xué)區(qū)域，例如一個或多個DNA區(qū)域、一個或多個RNA 區(qū)域、一個或多個PNA區(qū)域等。每個化學(xué)區(qū)域由至少一個單體單位構(gòu)成，即在寡核苷酸化合物的情況下核苷酸。這些寡核苷酸一般包括其中寡核苷酸進(jìn)行修飾的至少一個區(qū)域，以便顯示出一種或多種所需性質(zhì)。寡核苷酸的所需性質(zhì)包括但不限于例如對核酸酶降解的抗性增加、細(xì)胞攝取增加、和/或?qū)τ诎泻怂岬慕Y(jié)合親和力增加。寡核苷酸的不同區(qū)域因此可以具有不同性質(zhì)。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可以作為2種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)形成。寡核苷酸可以由可以以“記錄器(register)”連接的區(qū)域組成，即當(dāng)單體連續(xù)連接時，如在天然DNA中，或經(jīng)由間隔物連接。間隔物預(yù)期構(gòu)成區(qū)域之間的共價“橋”，并且在優(yōu)選情況下具有不超過約100個碳原子的長度。間隔物可以攜帶不同功能性，例如具有正或負(fù)電荷，攜帶特定核酸結(jié)合性質(zhì)(插入劑、槽溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)，是親脂的，誘導(dǎo)特定二級結(jié)構(gòu)如例如誘導(dǎo)α-螺旋的含丙氨酸肽。如本文使用的，“載脂蛋白”和“載脂蛋白Α”包括所有家族成員、突變體、等位基因、 片段、種類、編碼和非編碼序列、正義和反義多核苷酸鏈等在內(nèi)。如本文使用的，術(shù)語“對……具有特異性的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶”指具有下述序列的寡核苷酸(i )能夠與靶基因的部分形成穩(wěn)定復(fù)合物，或(ii )能夠與靶基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄物的部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合物和雙鏈體的穩(wěn)定性可以通過理論計(jì)算和/或體外測定進(jìn)行測定。用于測定雜交復(fù)合物和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定在下文實(shí)施例中描述。如本文使用的，術(shù)語“靶核酸”包含DNA、由此類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括mRNA前體和 mRNA)、以及衍生自此類RNA的cDNA、編碼、非編碼序列、正義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。通過與之特異性雜交的化合物的這種靶核酸功能調(diào)節(jié)，一般被稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA 功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、RNA剪接以獲得一種或多種mRNA種類、和可以與RNA銜接或由RNA促進(jìn)的催化活性。此類靶核酸功能干擾的總體效應(yīng)是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾“RNAi”通過雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)，其與其“靶”核酸序列具有序列特異性同源性(Caplen，N. J.，等人，Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747 (2001))。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是5-25核苷酸“小干擾”RNA雙鏈體(siRNAs)。siRNAs 衍生自通過稱為 Dicer 的 RNA 酶的 dsRNA 加工(Bernstein，E.，等人，^Vaiare 409:363-366 (2001))。將siRNA雙鏈體產(chǎn)物召募到命名為RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白質(zhì) siRNA復(fù)合體內(nèi)。不希望受任何具體理論束縛，RISC隨后被認(rèn)為導(dǎo)向靶核酸(適當(dāng)?shù)豰RNA)， 當(dāng)siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用，以催化形式介導(dǎo)切割(Bernstein，Ε.，等人， Nature 409:363-366 (2001);Boutla，Α.，等人，Ω/rr. Biol. 11:1776-1780 (2001))?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的操作合成且使用可以依照本發(fā)明使用的小干擾RNAs。用于在本發(fā)明的方法中使用的小干擾RNAs適當(dāng)?shù)匕s1 -約50個核苷酸 (nt)。在非限制性實(shí)施方案的例子中，siRNAs可以包括約5 -約40 nt、約5 -約30 nt、 約10 -約30 nt、約15 -約25 nt、或約20-25個核苷酸。合適寡核苷酸的選擇通過使用計(jì)算機(jī)程序得到促進(jìn)，所述計(jì)算機(jī)程序自動比對核酸序列且指出同一性或同源性區(qū)域。此類程序用于比較獲得的核酸序列，例如通過搜索數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過測序PCR產(chǎn)物。來自一系列物種的核酸序列的比較允許選擇展示物種之間的合適同一性程度的核酸序列。在未測序的基因的情況下，執(zhí)行DNA印跡以允許測定靶物種和其他物種中在基因之間的同一性程度。通過在各種嚴(yán)格程度下執(zhí)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可以獲得同一性的近似測量。這些操作允許選擇這樣的寡核苷酸，其顯示出與待控制受試者中的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性和其他物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補(bǔ)性。技術(shù)人員將認(rèn)識到在選擇用于在本發(fā)明中使用的基因的合適區(qū)域中存在相當(dāng)大的活動余地?！懊复賀NA”意指具有酶促活性的 RNA分子(Cech，1988 7； American. Med. Assoc. 沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先與靶RNA結(jié)合起作用。此類結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶促核酸與分子的酶促部分保持緊密接近，所述分子作用于切割靶RNA。因此，酶促核酸首先識別且隨后通過堿基配對結(jié)合靶RNA，并且一旦與正確位點(diǎn)結(jié)合，就酶促作用以切割靶RNA?！罢T餌RNA”意指模擬關(guān)于配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。誘餌RNA因此與天然結(jié)合靶競爭結(jié)合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR) RNA的超表達(dá)可以充當(dāng)“誘餌”并且有效結(jié)合HIV tat蛋白質(zhì)，從而阻止其與HIV RNA中編碼的TAR序列結(jié)合 (Sullenger等人，1990，CWA63，601-608)。這意欲是特定例子。技術(shù)人員將認(rèn)識到這僅是一個例子，并且其他實(shí)施方案可以使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地生成。如本文使用的，術(shù)語“單體”一般指示通過磷酸二酯鍵或其類似物連接的單體，以形成大小范圍從幾個單體單位例如約3-4個到約數(shù)百個單體單位的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更全面描述的。在本文背景中，術(shù)語“核堿基”和“核苷酸”或“核苷”在本文中可互換使用，并且該術(shù)語涵蓋天然存在的核堿基以及非天然存在的核堿基。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明確的是先前已視為“非天然存在的”各種核堿基已隨后在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，“核堿基”不僅包括已知嘌呤和嘧啶雜環(huán)，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。核堿基的舉例說明性例子是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-乙醇-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和Bermer等人，美國專利號5，432，272中描述的“非天然存在的”核堿基。術(shù)語“核堿基”預(yù)期涵蓋這些例子以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個和全部。特別有利的核堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶和尿嘧啶，這被視為與在人中的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核堿基。核苷包括天然核苷，包括2’ -脫氧和2’ -羥基形式，例如如Kornberg和Baker，DNA Replication, 第二版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述。提及核苷的“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷，例如由下述一般描述的Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ； Freier 禾口 Altmann，Nuc 1. Acid. Res.，1997,25 (22)，4429—4443，Toulme, J. J.，Nature Biotechnology 19:17—18 (2001) ；Manoharan Μ. , Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139 (1999) ；Freier S. Μ. , Nucleic Acid Research, 25:4429-4443 (1997)， UhIman,E. ,Drug Discovery & Development, 3 :203-213 (2000),Herdewin P.,Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310 (2000)，);2，-0，3~_C-連接的[3· 2. 0] 二環(huán)阿糖核苷(參見例如，N. K Christiensen.，等人，7； Am. Chem. 5bc.，120 力458_5463 (1998)。 此類類似物包括設(shè)計(jì)為增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)的合成核苷，所述結(jié)合性質(zhì)例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。如本文使用的，“雜交”意指寡聚化合物的基本上互補(bǔ)鏈的配對。一種配對機(jī)制涉及在寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核堿基)之間的氫鍵合，這可以是沃森-克里克、HoSgsteen或反向HoSgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵而配對的互補(bǔ)核堿基。雜交可以在各種情況下發(fā)生。反義化合物是“可特異性雜交的”，當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性調(diào)節(jié)時，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，即在體內(nèi)測定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和其中在體外測定情況下執(zhí)行測定的條件下。如本文使用的，短語“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”指在其下本發(fā)明的化合物將與其靶序列雜交但與最低限度數(shù)目的其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同情況中和在本發(fā)明的背景中將是不同的，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及它們待在其中研究的測定決定。一般而言，嚴(yán)格雜交條件包括具有無機(jī)陽離子例如Na++或K++ (即低離子強(qiáng)度)的低濃度(<0. 15M)的鹽，高于 200C - 25°C的溫度，低于寡聚化合物靶序列復(fù)合物的Tm，和變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在。例如，雜交速率對于每甲酰胺下降1. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的例子是在60°C下0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC) /0. 1% (w/v) SDS 共 30 分鐘。如本文使用的，“互補(bǔ)性”指關(guān)于在一條或兩條寡聚鏈上的2個核堿基之間精確配對的能力。例如，如果在反義化合物的特定位置上的核堿基能夠與在靶核酸的特定位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么在寡核苷酸和靶核酸之間氫鍵合的位置被視為互補(bǔ)位置。當(dāng)每種分子中足夠數(shù)目的互補(bǔ)位置由可以彼此氫鍵合的核堿基占據(jù)時，寡聚化合物和進(jìn)一步地DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補(bǔ)。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”是用于指出在足夠數(shù)目的核堿基上足夠程度的精確配對或互補(bǔ)性的術(shù)語，從而使得穩(wěn)定和特異性結(jié)合在寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解寡聚化合物的序列無需與其靶核酸100%互補(bǔ)以是可特異性雜交的。此外，寡核苷酸可以在一個或多個區(qū)段上雜交，從而使得插入或鄰近區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包括與在它們靶向其的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85 %、或至少約 90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中的18個與靶區(qū)域互補(bǔ)且因此將特異性雜交的反義化合物，將代表90%互補(bǔ)性。在這個例子中，其余非互補(bǔ)核苷酸可以聚簇或由互補(bǔ)核苷酸間斷，并且與彼此或互補(bǔ)核苷酸無需是鄰接的。像這樣，具有4 (四)個非互補(bǔ)核苷酸的長度18個核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77. 8%總體互補(bǔ)性，并且因此將屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述非互補(bǔ)核苷酸側(cè)面為與靶核酸完全互補(bǔ)性的2個區(qū)域。使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(堿基局部比對搜索工具) 和 PowerBLAST 程序(Altschul 等人，7； Mol. Biol.，1990，215，403-410 ；Zhang 和 Madden, Genome Res.，1997，7，649-656)，可以照常規(guī)測定反義化合物與靶核酸區(qū)域的互補(bǔ)性百分比。同源性百分比、序列同一性或互補(bǔ)性可以通過例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用缺省設(shè)置進(jìn)行測定，所述Gap程序使用Smith和 Waterman 的算法(Α/κ Appl. ifeiA.，1981，2，482-489)。如本文使用的，術(shù)語“熱解鏈溫度(Tm)”指在限定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下的溫度，在其下與靶序列互補(bǔ)的50%寡核苷酸在平衡狀態(tài)中與靶序列雜交。因?yàn)榘行蛄幸话阋赃^量存在，所以在Tm下，50%的寡核苷酸在平衡狀態(tài)中占據(jù)。一般地，嚴(yán)格條件將是對于短寡核苷酸(例如，10 - 50個核苷酸)，其中鹽濃度是在pH 7.0 - 8. 3下至少約0.01 -1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)并且溫度是至少約30°C的那些。嚴(yán)格條件還可以用添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達(dá)到。如本文使用的，“調(diào)節(jié)”意指基因表達(dá)中的增加(刺激)或減少(抑制)。當(dāng)在多核苷酸序列的背景中使用時，術(shù)語“變體”可以包含與野生型基因有關(guān)的多核苷酸序列。這個定義還可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)性”變體。剪接變體可以與參考分子具有顯著同一性，但由于在mRNA加工過程中外顯子的可變剪接，一般將具有更多或更少數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)多肽可以具有另外功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的不存在。物種變體是從一個物種到另一個不同的多核苷酸序列。在本發(fā)明中具有特別效用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可以起因于核酸序列中的至少一個突變，且可能導(dǎo)致改變 mRNAs或其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不改變的多肽。任何給定天然或重組基因可以具有無一、 一個或許多個等位基因形式。引起變體的常規(guī)突變改變一般歸于核苷酸的天然缺失、添加或置換。這些類型改變各自可以單獨(dú)或與其他組合在給定序列中發(fā)生一次或多次。所得到的多肽一般將具有相對于彼此顯著的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列中的變異。多態(tài)性變體還可以包含“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)或其中多核苷酸序列通過一個堿基改變的單堿基突變。SNPs的存在可以指示例如對于疾病狀態(tài)具有傾向的特定群體，即易感性與抗性比較。衍生多核苷酸包括實(shí)施化學(xué)修飾的核酸，例如通過烷基、芳基或氨基基團(tuán)替換氫。衍生物例如衍生寡核苷酸可以包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。在這些中示例性的是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其他含硫種類。衍生核酸還可以包含標(biāo)記， 包括核糖核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等?！把苌倍嚯幕螂氖抢缤ㄟ^糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、 ?；?、化學(xué)偶聯(lián)或弱福爾馬林處理修飾的那種。衍生物還可以直接或間接進(jìn)行修飾，以包含可檢測標(biāo)記，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。如本文使用的，術(shù)語“動物”或“患者”意欲包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、 哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行類、魚類、昆蟲和蛛形類?！安溉閯游铩焙w一般在醫(yī)療護(hù)理下的溫血動物(例如人和馴養(yǎng)動物)。例子包括貓、犬、馬、牛和人，以及僅僅人?！爸委煛被颉疤幚怼焙w哺乳動物中疾病狀態(tài)的治療，并且包括(a)預(yù)防哺乳動物中的疾病狀態(tài)發(fā)生，特別是當(dāng)此類哺乳動物有疾病狀態(tài)傾向但仍未被診斷為具有其時；(b) 抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(c)緩解疾病狀態(tài)，例如促使疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終末點(diǎn)。治療還包括疾病癥狀的改善(例如減輕疼痛或不適)，其中此類改善可以直接或不直接影響疾病(例如，引起、傳染、表達(dá)等)。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子
高密度脂蛋白(HDL)挑選出血液中的額外膽固醇且使其返回到肝臟。低密度脂蛋白(或 LDL)是體內(nèi)膽固醇的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但經(jīng)過多年太多的LDL可以導(dǎo)致動脈粥樣硬化(動脈變窄和硬化)，且導(dǎo)致心臟病或心臟病發(fā)作。比值通過LDL膽固醇除HDL膽固醇決定。例如， 如果個人具有50 mg/dL的HDL膽固醇和150 mg/dL的LDL膽固醇，那么HDL/LDL比值將是 0. 33。目的是使HDL/LDL比值維持超過0. 3，其中理想HDL/LDL比值是超過0. 4。歡在一個實(shí)施方案中，靶包括載脂蛋白(ApoAl)的核酸序列，包括但不限于與 ApoA相關(guān)的正義和/或反義非編碼和/或編碼序列。人載脂蛋白A-I (ApoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)和淋巴乳糜微粒的主要蛋白質(zhì)組成成分。在人血漿中，已命名了 4種主要循環(huán)脂蛋白乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、和高密度脂蛋白 (HDL)。HDL涉及通過將其轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟或其他脂蛋白從外周組織中去除膽固醇。HDL在肝臟和小腸中作為富含蛋白質(zhì)的盤形顆粒從頭合成。HDL的主要脫輔基蛋白是apoA-I、apoA-II、apoC-I、apoC-II和apoE。新近發(fā)現(xiàn)的HDL包含極少膽固醇和膽固醇酯。通過膽固醇酯在脂蛋白顆粒中性核心中的累積，HDL由其最初盤狀形狀轉(zhuǎn)變成球狀脂蛋白顆粒。膽固醇通過HDL由乳糜顆粒殘留部分VLDL殘留部分(也稱為中間密度脂蛋白或IDL)和直接由細(xì)胞表面膜累積。膽固醇通過HDL相關(guān)酶卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶 ("LCAT")的作用得到酯化。對于將脂肪酸從卵磷脂(磷脂酰膽堿)轉(zhuǎn)移到膽固醇的C-3-0H 基團(tuán)的LCAT，需要與在HDL表面上發(fā)現(xiàn)的ApoA-I的相互作用。核心膽固醇酯的累積將新生 HDL轉(zhuǎn)變?yōu)?HDLjP HDL3。參見R. I. Levy 等人/'The structure, function and metabolism of high-density lipoproteins :A status report," Circulation,第 62 卷，第 IV4-8 頁 (1980);禾口 D. I. Silverman 等人，〃High_density lipoprotein subfractions, “ Am. J. Med.，第 94 卷，第 636-45 頁(1993)。HDL通常通過超速離心從血漿中分離。正常HDL密度范圍是1.063 g/mL - 1.21 g/mL，這大致分成 2 個范圍 HDL2 (1.063 g/mL - 1.125 g/mL)禾口 HDL3 (1.125 g/mL -1.21 g/mL)。最近，通過雙向電泳隨后為免疫印跡和酶聯(lián)差異抗體免疫吸附測定，已鑒定了 HDL中的2個主要顆粒群體。這些群體之一包含具有單獨(dú)的apoA-I的顆粒，并且另一種包含具有apoA-I和apoA-II的顆粒。apoA_I顆粒的相對比例在HDL2部分中最高，而 HDL3 更多是 apoA-I 和 apoA-II 的組合。參見 J. C. Fruchart 等人，〃Apolipoprotein Α-containing lipoprotein particles :physiological role, quantification, and clinical significance, “ Clin.伐6 ·,第 38 卷，第 793-7 頁(1992);禾口 B. F. Asztalos 等人，"Normolipidemic subjects with low HDL cholesterol levels have altered HDL subpopulations, “ Arterioscler. Thromb. Vase. 入，第 17 卷，第 1885-1893 頁 (1997)。人載脂蛋白A-I(ApoA-I)是HDL和淋巴乳糜微粒的主要蛋白質(zhì)組成成分。ApoA-I 主要在肝臟和小腸中作為前體蛋白(pr印roapo A-I)合成。ft·印roapo A-I在細(xì)胞內(nèi)切割， 以形成proapo A-I，分泌到血漿和淋巴內(nèi)的形式。在血漿中，6個氨基酸從proapo A-I中切割，以形成成熟ApoA-I。成熟ApoA-I是由已知序列的243個氨基酸組成的單個非糖基化多肽。ApoA-I充當(dāng)血漿酶(卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT))的輔因子，負(fù)責(zé)形成血漿中的大多數(shù)膽固醇酯。減少水平的ApoA-I可以導(dǎo)致血漿脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的病癥和冠心病的發(fā)展。低水平的 ApoA-I和HDL已顯示為心臟病發(fā)作和其他動脈粥樣硬化血管疾病的強(qiáng)烈危險(xiǎn)因素。參見美國專利號 5，059，528 和 6，258，596。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與載脂蛋白、高密度脂蛋白相關(guān)的疾病或病癥?？梢杂梅戳x化合物治療的疾病的例子包括高膽固醇、HDL/LDL比值、關(guān)節(jié)炎、心臟病、丹吉爾(Tangier)病、全身性非神經(jīng)源性淀粉樣變性、其他淀粉樣蛋白病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病、心血管疾病、癌癥、肥胖、動脈粥樣硬化、抑制依賴于血管發(fā)生的腫瘤生長、和減少由腫瘤形成的現(xiàn)有血管。它在治療非癌性疾病中也將是有效的，所述疾病癥狀包括血管發(fā)生中的增加，例如銀屑病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、 糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥胖和銀屑病。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸對于ApoA的多核苷酸特異，其包括但不限于非編碼區(qū)。ApoAl靶包括ApoA的變體；ApoA的突變體，包括SNPs ；ApoA的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于單獨(dú)的ApoAl多核苷酸，還延伸至 ApoA的同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)等中的任何。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向ApoAl靶的天然反義序列(對于編碼和非編碼區(qū)天然反義)，包括但不限于關(guān)于其的變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA分子。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括其中不同堿基存在于化合物中的一個或多個核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個核苷酸是腺苷，那么可以產(chǎn)生在這個位置上包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可以在反義化合物的任何位置上完成。這些化合物隨后使用本文描述的方法進(jìn)行測試，以測定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，在反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約 50%到約60%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約60%到約70%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約70 %到約80 %。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約80%到約90%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約90%、約92%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 100%。反義化合物是可特異性雜交的，當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起活性喪失時，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。此類條件包括即在體內(nèi)測定或治療性處理情況下的生理?xiàng)l件，和其中在體外測定情況下執(zhí)行測定的條件。反義化合物無論是DNA、RNA、嵌合、置換的等是可特異性雜交的，當(dāng)化合物與靶 DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能以引起效用喪失時，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，即在體內(nèi)測定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和在體外測定情況下在其中執(zhí)行測定的條件下。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoAl的靶向包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列，如SEQ ID NO=Sl - 173所示的一個或多個序列等，調(diào)節(jié)ApoA的表達(dá)或功能。在一個實(shí)施方案中，與對照比較，表達(dá)或功能是上調(diào)的。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中， 與對照比較，表達(dá)或功能是下調(diào)的。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO 81 - 173所示的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包括一個或多個修飾的核苷酸、較短或較長片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本發(fā)明的修飾寡核苷酸中可以與糖或糖類似物部分附著的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸鏈烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，及其摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸內(nèi)本身也是已知的，并且無需在本文中描述。反義的特異性和敏感性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員用于治療用途。反義寡核苷酸已在動物和人中的疾病狀態(tài)治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已安全有效地施用于人，并且眾多臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸谶M(jìn)行中。因此確定寡核苷酸可以是有用的治療模式，其可以配置為在用于治療細(xì)胞、組織和動物特別是人的治療方案中有用。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，寡聚反義化合物特別是寡核苷酸與靶核酸分子結(jié)合，并且調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、RNA剪接以獲得一種或多種mRNA種類、和可以與RNA銜接或由RNA促進(jìn)的催化活性。依賴于所需功能，此類功能可以是上調(diào)或抑制的。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、 可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少部分雜交的其他寡聚化合物。像這樣，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的背景中，使反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步過程。該過程通常以其功能待調(diào)節(jié)的靶核酸的鑒定開始。這種靶核酸可以是例如細(xì)胞基因(或由基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)，或來自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼載脂蛋白(ApoAl)。
靶向過程通常還包括測定在靶核酸內(nèi)用于反義相互作用發(fā)生的至少一個靶區(qū)域、 區(qū)段或位點(diǎn)，從而使得將產(chǎn)生所需效應(yīng)，例如表達(dá)的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的背景內(nèi)，術(shù)語“區(qū)域” 被定義為具有至少一個可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的區(qū)域內(nèi)是區(qū)段?！皡^(qū)段”被定義為在靶核酸內(nèi)的較小或亞部分區(qū)域。如在本發(fā)明中使用的，“位點(diǎn)”被定義為在靶核酸內(nèi)的位置。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)的天然反義序列結(jié)合， 并且調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl) (SEQ ID NO :1)的表達(dá)和/或功能。反義序列的例子包括SEQ ID NO :2,81-173 (ApoAl)0其他例子包括包含核心序列g(shù)ctagt (SEQ ID NO :175)的反義寡核苷酸，例如SEQ ID NO 60-69和172的寡核苷酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的一個或多個區(qū)段結(jié)合，并且調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包括載脂蛋白(ApoAl) 正義或反義多核苷酸的至少5個連續(xù)核苷酸。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對于載脂蛋白(ApoAl)的天然反義序列具有特異性，其中寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)載脂蛋白 (ApoAl)的表達(dá)和/或功能。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO 3 - 173所示序列， 使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包括一個或多個修飾的核苷酸、較短或較長片段、修飾鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本發(fā)明的修飾寡核苷酸中可以與糖或糖類似物部分附著的磷衍生物(或修飾的磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸鏈烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，及其摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸內(nèi)本身也是已知的，并且無需在本文中描述。因?yàn)槿绫绢I(lǐng)域已知的，翻譯起始密碼子一般是5’ -AUG (在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)DNA分子中為5’ -ATG)，所以翻譯起始密碼子也被稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或 "AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有含RNA序列5’ -GUG、5' -UUG或5' -CUG的翻譯起始密碼子；并且5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和 “起始密碼子”可以包含許多密碼子序列，即使每種情況下的起始子氨基酸一般是甲硫氨酸 (在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核生物和原核生物基因可以具有2個或更多個可變起始密碼子，其中任何一個都可以優(yōu)先用于在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發(fā)明的背景中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”指這樣的一個或多個密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼載脂蛋白(ApoAl)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與此類密碼子的一種或多種序列無關(guān)。基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可以具有三種序列之一，即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA (相應(yīng)DNA序列分別是5’ _TAA、5’ -TAG和 5，-TGA)ο術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”指此類mRNA或基因的部分，其包含從翻譯起始密碼子開始在任一方向中(即，5’或3’)的約25到約50個鄰接核苷酸。類似地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”指此類mRNA或基因的部分，其包含從翻譯終止密碼子開始在任一方向中(即，5’或3’)的約25到約50個鄰接核苷酸。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)是可以用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的所有區(qū)域。本領(lǐng)域已知的、指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域的開放讀碼框 (ORF)或“編碼區(qū)”也是可以有效靶向的區(qū)域。在本發(fā)明的背景內(nèi)，靶向區(qū)域是包含基因開放讀碼框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。另一種靶區(qū)域包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)，指從翻譯起始密碼子開始在5’方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的5’加帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)。另外一種靶區(qū)域包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)， 指從翻譯終止密碼子開始在3’方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)。mRNA的5’加帽位點(diǎn)包括經(jīng)由5’-5’ 三磷酸鍵與mRNA的5’最末端殘基鄰接的N7-甲基化鳥苷殘基。mRNA的5’加帽位點(diǎn)被視為包括5’加帽結(jié)構(gòu)其自身以及與加帽位點(diǎn)相鄰的前50個核苷酸。關(guān)于本發(fā)明的另一種靶區(qū)域是5’加帽區(qū)。盡管一些真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄物是直接翻譯的，但許多包含稱為“內(nèi)含子”的一個或多個區(qū)域，這在其翻譯前從轉(zhuǎn)錄物中切除。其余(和因此翻譯的)區(qū)域稱為“外顯子”，并且一起剪接以形成連續(xù)mRNA序列。在一個實(shí)施方案中，靶向剪接位點(diǎn)即內(nèi)含子-外顯子連接或外顯子-內(nèi)含子連接在下述情況下是特別有用的，當(dāng)異常剪接牽涉疾病時，或當(dāng)特定剪接產(chǎn)物的生產(chǎn)過剩牽涉疾病時。由于重排或缺失的異常融合連接是靶位點(diǎn)的另一個實(shí)施方案。經(jīng)由來自不同基因來源的2種(或更多種)mRNAs的剪接過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可以使用靶向例如DNA或mRNA前體的反義化合物有效靶向。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與天然反義多核苷酸結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與正義多核苷酸結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能?？勺僐NA轉(zhuǎn)錄物可以由DNA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱為 “變體”。更具體而言，"mRNA前體變體”是由相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，其在其起始或終止位置中不同于由相同基因組DNA產(chǎn)生的其他轉(zhuǎn)錄物，并且包含內(nèi)含子和外顯子序列。在剪接過程中一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分切除后，mRNA前體變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體是經(jīng)加工的mRNA前體變體，并且由于剪接，每種獨(dú)特mRNA前體變體必須一直產(chǎn)生獨(dú)特mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。 如果不發(fā)生mRNA前體變體的剪接，那么mRNA前體變體等同于mRNA變體。變體可以通過使用可變信號產(chǎn)生以起始或終止轉(zhuǎn)錄。mRNAs前體和mRNAs可以具有超過一個起始密碼子或終止密碼子。源于使用可變起始密碼子的mRNA前體或mRNA的變體稱為那種mRNA前體或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的這些轉(zhuǎn)錄物稱為那種mRNA前體或mRNA的“可變終止變體”。一個具體類型的可變終止變體是“多聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄物起因于通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制的“多聚腺苷酸終止信號”之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特多聚腺苷酸位點(diǎn)上終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的背景內(nèi)，本文描述的變體類型也是靶核酸的實(shí)施方案。
反義化合物與之雜交的靶核酸上的定位被定義為活性反義化合物靶向其的靶區(qū)域的至少5-核堿基部分。盡管在本文中闡述了特定示例性靶區(qū)段的具體序列，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到這些用來舉例說明且描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的特定實(shí)施方案。另外靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到本公開內(nèi)容容易地鑒定。包括選自舉例說明性優(yōu)選的靶區(qū)段內(nèi)的至少五(5)個連續(xù)核苷酸段的長度5-100 個核苷酸的靶區(qū)段被視為也適合于靶向。靶區(qū)段可以包括DNA或RNA序列，其包括從舉例說明性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的5’末端開始的至少5個連續(xù)核苷酸(其余核苷酸是緊在靶區(qū)段的5’末端上游開始且繼續(xù)直至 DNA或RNA包含約5到約100個核苷酸的相同DNA或RNA連續(xù)段)。類似優(yōu)選的靶區(qū)段由 DNA或RNA序列表示，其包括從舉例說明性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的3’末端開始的至少5個連續(xù)核苷酸(其余核苷酸是緊在靶區(qū)段的3’末端下游開始且繼續(xù)直至DNA或RNA包含約5到約100個核苷酸的相同DNA或RNA連續(xù)段)。無需過度實(shí)驗(yàn)，用本文舉例說明的靶區(qū)段準(zhǔn)備的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定進(jìn)一步優(yōu)選的靶區(qū)段。一旦已鑒定一個或多個靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)，就選擇與靶充分互補(bǔ)的反義化合物， 即充分良好且具有足夠特異性雜交，以給出所需效應(yīng)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，寡核苷酸與特定靶的反義鏈結(jié)合。寡核苷酸長度是至少5個核苷酸，并且可以如此合成每個寡核苷酸靶重疊序列，從而使得合成覆蓋靶多核苷酸的完整長度的寡核苷酸。靶還包括編碼以及非編碼區(qū)。在一個實(shí)施方案中，優(yōu)選通過反義寡核苷酸靶向特異性核酸。使反義化合物靶向特定核酸是多步過程。該過程通常以其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列的鑒定開始。這可以是例如表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或由基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸例如非編碼RNA (ncRNA)0RNAs可以分類成(1)翻譯成蛋白質(zhì)的信使RNAs (mRNAs)，和(2)非蛋白質(zhì)編碼 RNAs (ncRNAs)。ncRNAs包括微小RNAs、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度終止密碼子且缺乏任何廣泛“開放讀碼框”的其他轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNAs看起來從蛋白質(zhì)編碼基因座的 3’非翻譯區(qū)(3’UTRs)中的起始位點(diǎn)開始。ncRNAs通常是罕見的，并且已通過FANTOM協(xié)會測序的至少一半ncRNAs看起來不是多聚腺苷酸化的。由于顯而易見的原因，大多數(shù)研究者集中于被加工且輸出到細(xì)胞質(zhì)的多聚腺苷酸化mRNAs。近來，已顯示非多聚腺苷酸化的核RNAs組可以是極大的，并且許多此類轉(zhuǎn)錄物起于所謂的基因間區(qū)域(Cheng，J.等人 (2005transcriptional maps of 10 human chromosomes at 5-nucleotide resolution. Science 308 (5725)，1149-1154 ;Kapranov，P.等人(2005)。通過 RACE 和高密度鑲嵌 (tiling)陣列揭示人轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜體系結(jié)構(gòu)的例子。ncRNAs通過其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的最常見機(jī)制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNAs可以分組成(1)順式編碼RNAs，其在相同基因定位上編碼，但在針對RNAs的相反鏈上，它們作用于且因此展示出與其靶的完美互補(bǔ)性，和(2)反式編碼的RNAs，其在與它們作用于其的RNAs不同的染色體定位上編碼，并且一般不顯示出與其靶的完美堿基配對潛力。不希望受理論束縛，通過本文描述的反義寡核苷酸干擾反義多核苷酸，可以改變相應(yīng)正義信使RNAs的表達(dá)。然而，這種調(diào)節(jié)可以是不協(xié)調(diào)(反義擊倒導(dǎo)致正義轉(zhuǎn)錄物升高)或協(xié)調(diào)的(反義擊倒導(dǎo)致伴隨的正義轉(zhuǎn)錄物減少)。在這些情況下，反義寡核苷酸可以靶向反義鏈的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致靶的擊倒。編碼以及非編碼反義可以以等同方式靶向，并且任一范疇都能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄物-以協(xié)調(diào)或不協(xié)調(diào)方式。在鑒定用于針對靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可以基于反義RNA轉(zhuǎn)錄物的擊倒，通過反義寡核苷酸或用于調(diào)節(jié)所需靶的任何其他方式。策略1在不協(xié)同調(diào)節(jié)的情況下，擊倒反義轉(zhuǎn)錄物升高常規(guī)(正義)基因的表達(dá)。后面一種基因應(yīng)編碼已知或假定藥物靶，然后其反義配對物的擊倒可以想得到地模擬受體激動劑或酶刺激物的作用。胃J :在協(xié)同調(diào)節(jié)的情況下，可以伴隨地?fù)舻狗戳x和正義轉(zhuǎn)錄物且從而達(dá)到常規(guī)(正義)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。如果例如反義寡核苷酸用于達(dá)到擊倒，那么這種策略可以用于應(yīng)用靶向針對正義轉(zhuǎn)錄物的一種反義寡核苷酸，和對于相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時靶向重疊正義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個有力地對稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、 siRNA化合物、單或雙鏈RNA干擾(RNAi )化合物例如siRNA化合物、和與靶核酸的至少部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。像這樣，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并且可以包含結(jié)構(gòu)元件例如內(nèi)部或末端凸起、錯配或環(huán)。反義化合物可以照常規(guī)線性制備，但可以連接或以其他方式制備，以是環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可以包括構(gòu)建體例如雜交的2條鏈，以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈，以允許雜交和形成全部或部分雙鏈的化合物。2條鏈可以內(nèi)部連接，留下游離3’或5’ 末端，或可以連接以形成連續(xù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包含在5’或3’末端上的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延長部分。雙鏈化合物任選可以包括在末端上的突出端。進(jìn)一步的修飾可以包括與末端之一、選擇的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一附著的綴合物基團(tuán)。 可替代地，2條鏈可以經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)由僅1條鏈形成時，dsRNA可以采取自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對折以形成雙鏈體。因此，dsRNAs可以是全部或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可以通過dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來達(dá)到，然而，在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能是上調(diào)的。當(dāng)由2條鏈或單鏈形成時， 所述單鏈采取在其自身上對折以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，2條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是以沃森-克里克形式堿基配對的互補(bǔ)RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)中，本發(fā)明的化合物就可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的作用，以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可以經(jīng)由基于占據(jù)機(jī)制工作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為“DNA樣的”(即，一般具有一個或多個2’ -脫氧糖，并且一般是T而不是U堿基)或“RNA樣的”(即，一般具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，并且一般是U而不是T堿基)。核酸螺旋可以采用超過一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常A和B形。一般而言， 認(rèn)為具有B形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“DNA樣的”，并且具有A形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“RNA樣的”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含A和B形區(qū)域。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所需寡核苷酸或反義化合物包括下述至少一種反義 RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、干擾RNA (RNAi)、小干擾 RNA (siRNA)；微小、干擾 RNA (miRNA)；小、瞬時 RNA (stRNA)；或小、發(fā)夾 RNA (shRNA)；
18小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；小激活RNAs (saRNAs)或其組合。dsRNA還可以激活基因表達(dá)，已命名為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。 靶向基因啟動子的dsRNAs誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。RNAa使用合成dsRNAs在人細(xì)胞中進(jìn)行證實(shí)，命名為“小激活RNAs”(saRNAs)。目前未知RNAa在其他生物中是否是保守的。小雙鏈RNA (dsRNA)例如小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)已發(fā)現(xiàn)是稱為 RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是導(dǎo)致經(jīng)由重塑染色質(zhì)的基因沉默，以從而阻遏轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA、或阻斷蛋白質(zhì)翻譯。然而，在下文實(shí)施例節(jié)段中詳細(xì)描述的情況下，寡核苷酸顯示增加載脂蛋白多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNAs還可以充當(dāng)小激活RNAs(saRNA)。不希望受理論束縛，通過靶向基因啟動子中的序列，saRNAs 將在被稱為dsRNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可以用于篩選調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸表達(dá)的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是這樣的化合物，其減少或增加編碼載脂蛋白(ApoAl)的核酸分子表達(dá)，并且包括與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括步驟使編碼載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，且選擇減少或增加編碼載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的核酸分子表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑，所述核酸分子例如SEQ ID NO :81-173. 一旦顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的核酸分子表達(dá)，調(diào)節(jié)劑隨后就可以用于載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能的進(jìn)一步調(diào)查研究，或用于用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶向反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，載脂蛋白A-I基因(NM_000039 ；UCSC 基因組數(shù)據(jù)庫)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，靶是載脂蛋白A-I基因的反義多核苷酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸(例如，登記號NM_000039) 的正義和/或天然反義序列，關(guān)于其的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子，并且靶包括反義和/或正義ApoAl多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段還可以與其分別的本發(fā)明的互補(bǔ)反義化合物組合，以形成穩(wěn)定雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。此類雙鏈寡核苷酸部分在本領(lǐng)域中已顯示調(diào)節(jié)靶表達(dá)，且經(jīng)由反義機(jī)制調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，可以對雙鏈部分實(shí)施化學(xué)修飾(Fire等人，胸tore，1998，391， 806-811 ；Timmons 禾口 Fire，yVai re 1998，395，854 ;Timmons 等人，fe/ e，2001，263，103-112 ； Tabara 等人，Science, 1998，282，430-431 ；Montgomery 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1998，95，15502-15507 ；Tuschl 等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197 ；Elbashir 等人，M i re，2001，411，494-498 ;Elbashir 等人，fe/？然 Dev. 2001，15，188-200)。例如， 此類雙鏈部分已顯示通過雙鏈體的反義鏈與靶的典型雜交抑制靶，從而觸發(fā)靶的酶促降解 (Tijsterman 等人，5bie/ ce，2002，295，694-697)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸(例如，登記號NM_000039)、關(guān)于其的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。
依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于單獨(dú)的載脂蛋白(ApoAl)，還延伸至載脂蛋白(ApoAl)分子的同種型、受體、同系物等中的任何。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向ApoAl多核苷酸的天然反義序列，例如如SEQ ID NO :2-165所示的多核苷酸，以及關(guān)于其的任何變體、等位基因、同系物、突變體、 衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的例子如SEQ ID NO=Sl - 173所示。 在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，包括但不限于與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸相關(guān)的非編碼正義和/或反義序列，且調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)分子的表達(dá)和/或功能。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID NO :2、173所示的ApoAl天然反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，且調(diào)節(jié)ApoAl分子的表達(dá)和/或功能。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO 81 - 173的至少5個連續(xù)核堿基的序列，且調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶包括ΑροΑ，包括其家族成員、ApoA的變體；ApoA的突變體，包括SNPs ； ApoA的非編碼序列；ApoA的等位基因；物種變體、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的寡核苷酸包括反義 RNA、干擾 RNA (RNAi)、小干擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小、瞬時 RNA (stRNA); 或小、發(fā)夾RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；或小激活RNA (saRNA)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸例如SEQ ID NO 81 - 173 的靶向調(diào)節(jié)這些靶的表達(dá)或功能。在一個實(shí)施方案中，與對照比較，表達(dá)或功能是上調(diào)的。 在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與對照比較，表達(dá)或功能是下調(diào)的。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義化合物包括如SEQ ID NO 81 - 173所示序列。 這些寡核苷酸可以包括一個或多個修飾的核堿基、較短或較長片段、修飾的鍵等。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO :81 - 173包括一個或多個LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以以本領(lǐng)域已知的數(shù)種方式執(zhí)行。例如，反義寡核苷酸、 siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)是能夠催化各種反應(yīng)中的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)切割其他分開核酸分子的能力。此類酶促核酸分子可以例如用于靶向事實(shí)上任何RNA轉(zhuǎn)錄物Uaug等人，324，yVatore 429 1986 ；Cech, 260 JAMA 3030，1988 ；和 Jefferies 等人，17 Nucleic Acids Research 1371，1989)。因?yàn)槠湫蛄刑禺愋?，所以反式切割的酶促核酸分子顯示作為用于人疾病的治療劑的希望(Usman 禾口 McSwiggen，1995 J/w. Rep. Med. Chem. 30,285-294 ；Christoffersen 和Marr，1995 7； Med. Chem. 38，2023-2037)。酶促核酸分子可以設(shè)計(jì)為切割在細(xì)胞RNA 背景內(nèi)的特異性RNA靶。此類切割事件致使mRNA無功能且取消來自那種RNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。以這種方式，可以選擇性抑制與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成。一般而言，具有RNA切割活性的酶促核酸通過首先與靶RNA結(jié)合起作用。此類結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶促核酸與分子的酶促部分保持緊密接近，所述分子作用于切割靶RNA。因此，酶促核酸首先識別且隨后通過互補(bǔ)堿基配對結(jié)合靶RNA，并且一旦與正確位點(diǎn)結(jié)合，就酶促作用以切割靶RNA。此類靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)合成的能力。在酶促核酸已結(jié)合且切割其RNA靶后，它從那種RNA中釋放以搜索另一個靶，并且可以重復(fù)結(jié)合且切割新靶。
幾種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略(0rgel，1979，/￥oc.R. Soc. London,B 205， 435)已用于進(jìn)化能夠催化各種反應(yīng)的新核酸催化劑，例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接(Joyce，1989，fe/ e，82，83-87 ；Beaudry 等人，1992，257,635-641 Joyce, 1992, Scientific American 267，90-97 ；Breaker 等人，1994，TIBTECH 12，268 ；Bartel 等人， 1993，Science 261:1411-1418 ；Szostak，1993，TIBS 17，89-93 ；Kumar 等人，1995，F(xiàn)ASEB J. ,9,1183 ；Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech.， AA2\對于催化活性最佳的核酶的開發(fā)將顯著促成采用RNA切割核酶用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)目的的任何策略。錘頭核酶例如在飽和(10 mM)濃度的Mg2+輔因子的存在下以約1分鐘―1的催化速率(k。at)起作用。人工“RNA連接酶”核酶已顯示以約100分鐘―1的速率催化相應(yīng)自我修飾反應(yīng)。此外，已知具有由DNA制成的底物結(jié)合臂的特定修飾的錘頭核酶催化 RNA切割，具有達(dá)到100分鐘―1的多重周轉(zhuǎn)率。最后，用特定核苷酸類似物替換在錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基給出在催化速率中顯示多達(dá)10倍改善的修飾核酶。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)核酶可以促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化，其催化速率明顯大于由大多數(shù)天然自我切割性核酶在體外展示出的那些。隨后可能可以最佳化特定自我切割性核酶的結(jié)構(gòu)，以給出最大限度催化活性，或可以制備完全新的RNA基序，其展示出對于RNA磷酸二酯切割明顯更快的速率。RNA底物通過擬合“錘頭”模型的RNA催化劑的分子間切割首先在1987年顯示 (Uhlenbeck, 0. C. (1987)yVatore，3 :596_600)。RNA 催化劑恢復(fù)且與多種 RNA 分子反應(yīng)，證實(shí)它是真正催化性的?；凇板N頭”基序設(shè)計(jì)的催化RNAs已用于切割特異性靶序列，通過在催化RNA中進(jìn)行合適的堿基改變，以維持與靶序列的必需堿基配對(Haseloff和Gerlach，Nature， Α, 585(1988);ffalbot 和 Bruening,#atore, 334,196 (1988);Uhlenbeck，0· C. (1987腦腳， 328 :596-600 ；Koizumi,Μ. ,Iwai,S.和 0htsuka，E. (1988)/ 1^ Lett. ,228 :228-230)o 這已允許使用催化RNA以切割特異性靶序列，且指出根據(jù)“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化RNA可以在體內(nèi)可能地切割特異性底物RNAs。(參見Haseloff和Gerlach，Nature, 334，585 (1988)； Walbot 禾口 Bruening，#aitfre，334，196 (1988) ；Uhlenbeck, 0. C. (1987) tore, 328 596-600)。RNA干擾(RNAi)已成為用于調(diào)節(jié)哺乳動物和哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)的有力工具。這種方法要求作為RNA其自身或作為DNA的小干擾RNA (siRNA)遞送，使用表達(dá)質(zhì)?；虿《竞陀糜诩庸閟iRNAs的小發(fā)夾RNAs的編碼序列。這個系統(tǒng)使得siRNAs前體能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)至它們在其中活躍的細(xì)胞質(zhì)，且允許使用調(diào)節(jié)和組織特異性啟動子用于基因表達(dá)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)，或其模擬物、嵌合體、類似物或同系物的寡聚物或聚合物。這個術(shù)語包括由天然存在的核苷酸、糖和共價核苷間(主鏈)鍵合組成的寡核苷酸，以及類似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。通常需要此類修飾的或取代的寡核苷酸超過天然形式，由于所需性質(zhì)例如細(xì)胞攝取增強(qiáng)、對于靶核酸的親和力增強(qiáng)和在核酸酶的存在下的穩(wěn)定性增加。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如，RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同系物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA、和與靶核酸的至少部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。像這樣，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并且可以包含結(jié)構(gòu)元件例如內(nèi)部或末端凸起、錯配或環(huán)。反義化合物可以照常規(guī)線性制備，但可以連接或以其他方式制備，以是環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可以包括構(gòu)建體例如雜交的2條鏈，以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈，以允許雜交和形成全部或部分雙鏈的化合物。2條鏈可以內(nèi)部連接，留下游離3’或5’末端，或可以連接以形成連續(xù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包含在5’或3’末端上的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延長部分。雙鏈化合物任選可以包括在末端上的突出端。進(jìn)一步的修飾可以包括與末端之一、選擇的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一附著的綴合物基團(tuán)。可替代地， 2條鏈可以經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)由僅1條鏈形成時，dsRNA可以采取自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對折以形成雙鏈體。因此，dsRNAs可以是全部或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可以通過dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來達(dá)至Ij (Hammond 等人，Rev.，1991，2，110-119 ;Matzke 等人，Ω/rr. Opin. Genet.
Dev.，2001，11,221-227 ；Sharp, Genes Dev.，2001，15，485-490)。當(dāng)由 2 條鏈或單鏈形成時，所述單鏈采取在其自身上對折以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，2條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是以沃森-克里克形式堿基配對的互補(bǔ)RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)中，本發(fā)明的化合物就可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的作用，以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可以經(jīng)由基于占據(jù)機(jī)制工作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為“DNA樣的”(即，一般具有一個或多個2’ -脫氧糖，并且一般是T而不是U堿基)或“RNA樣的”(即，一般具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，并且一般是U而不是T堿基)。核酸螺旋可以采用超過一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常A和B形。一般而言， 認(rèn)為具有B形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“DNA樣的”，并且具有A形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“RNA樣的”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含A和B形區(qū)域。依照本發(fā)明的反義化合物可以包括長度約5 -約80個核苷酸(即約5 -約80 個連接核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包括5 -約80個核苷酸，并且本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包括長度5 -約80個核苷酸的反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這種錘頭反義部分長度 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或80個核苷酸，或其內(nèi)的任何范圍。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長度10 - 50個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這體現(xiàn)了具有長度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49或50個核苷酸，或其內(nèi)的任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長度是15個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有長度12或13 - 30個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這體現(xiàn)了具有長度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30個核苷酸，或其內(nèi)的任何范圍的反義部分的反義化合物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向任何一種或多種載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的至少一種寡核苷酸的施用可預(yù)防或治療與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的異常表達(dá)或功能相關(guān)的疾病，或其他相關(guān)疾病?？梢杂梅戳x寡核苷酸治療的疾病的例子包括高膽固醇、心血管疾病、心臟病、丹吉爾病、關(guān)節(jié)炎、炎癥、自身免疫、炎性疾病、神經(jīng)性疾病或病癥 (例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病)；神經(jīng)變性，癌癥，由外來生物例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、 真菌等引起的疾病或病癥。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括其中不同堿基存在于化合物中的一個或多個核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個核苷酸是腺苷，那么可以產(chǎn)生在這個位置上包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可以在反義或dsRNA化合物的任何位置上完成。這些化合物隨后使用本文描述的方法進(jìn)行測試，以測定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，在反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約 40%到約60%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約60%到約70%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約70 %到約80 %。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約80%到約90%。在一些實(shí)施方案中，序列同一性或互補(bǔ)性是約90%、約92%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 100%。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸例如SEQ ID NO: 3 - 172中所示的核酸分子包括一種或多種置換或修飾。在一個實(shí)施方案中，核苷酸由鎖核酸(LNA)置換。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向與ApoAl和如SEQ ID NO :1、2所示序列相關(guān)的核酸分子正義和/或反義編碼和/或非編碼序列的一個或多個區(qū)域。寡核苷酸還靶向SEQ ID NO :1、2的重疊區(qū)域。本發(fā)明的特定優(yōu)選寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明背景中的“嵌合寡核苷酸” 或“嵌合體”是包含2個或更多個化學(xué)上不同區(qū)域的寡核苷酸，各自由至少一個核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸一般包含賦予一種或多種有利性質(zhì)(例如，核酸酶抗性增加、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的攝取增加、對于靶的結(jié)合親和力增加)的修飾的核苷酸的至少一個區(qū)域，和其為關(guān)于能夠切割RNA:DNA或RNA:RNA雜交物的酶的底物的區(qū)域。例如，RNA酶H是細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，其切割RNA:DNA雙鏈體的RNA鏈。RNA酶H的激活因此導(dǎo)致RNA靶的切割，從而極大增強(qiáng)基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)效率。因此，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時，與和相同靶區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸比較，用較短寡核苷酸通常可以獲得可比較結(jié)果。RNA靶的切割可以照常規(guī)通過凝膠電泳進(jìn)行檢測，和需要時，本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中， 嵌合寡核苷酸包括修飾為增加靶結(jié)合親和力的至少一個區(qū)域，和通常充當(dāng)關(guān)于RNA酶H的底物的區(qū)域。寡核苷酸對于其靶(在這種情況下，編碼ras的核酸)的親和力照常規(guī)進(jìn)行測定通過測量寡核苷酸/靶對的Tm，這是在其下寡核苷酸和靶解離的溫度；分光光度計(jì)測量地檢測解離。Tm越高，寡核苷酸對于靶的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可以作為如上所述的2種或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)形成。此類化合物在本領(lǐng)域中已被稱為雜交物或gapmer。教導(dǎo)此類雜交物結(jié)構(gòu)制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利號 5，013，830 ；5，149，797 ；5，220，007 ；5，256，775 ；5，366，878 ；5，403，711 ；5，491，133 ；5，565，350 ；5，623，065 ；5，652，355 ；5，652，356 和 5，700，922 ；其各自引入本文作為參考。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸區(qū)域包括在糖的2’位置上修飾的至少一個核苷酸，最優(yōu)選2’ -0-烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟-修飾的核苷酸。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA的3’末端上在嘧啶、脫堿基殘基或倒轉(zhuǎn)堿基的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’ 0-甲基修飾。此類修飾照常規(guī)摻入寡核苷酸內(nèi)，并且這些寡核苷酸已顯示具有高于2’-脫氧寡核苷酸針對給定靶的Tm (即，更高的靶結(jié)合親和力)。此類增加的親和力的效應(yīng)是極大增強(qiáng)基因表達(dá)的RNAi寡核苷酸抑制。RNA酶H是切割RNA:DNA 雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶；這種酶的激活因此導(dǎo)致RNA靶的切害I]，并且因此可以極大增強(qiáng)RNAi抑制的效率。RNA靶的切割可以照常規(guī)通過凝膠電泳加以證實(shí)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸也進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)核酸酶抗性。細(xì)胞包含可以降解核酸的各種核酸外切和內(nèi)切酶。許多核苷酸和核苷修飾已顯示使得它們引入其的寡核苷酸比天然寡聚脫氧核苷酸對核酸酶降解更有抵抗力。核酸酶抗性照常規(guī)進(jìn)行測量通過使寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離核酸酶溶液一起孵育，且通常通過凝膠電泳測量隨著時間過去剩下的完整寡核苷酸程度。已進(jìn)行修飾以增強(qiáng)其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完整更長時間。各種寡核苷酸修飾已證實(shí)增強(qiáng)或賦予核酸酶抗性。包含至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸目前是更優(yōu)選的。在某些情況下，增強(qiáng)靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也獨(dú)立地能夠增強(qiáng)核酸酶抗性。一些希望修飾可以在De Mesmaeker等XAcc. Chem. Res. 1995， 28:366-374 中找到。設(shè)想用于本發(fā)明的一些優(yōu)選寡核苷酸的具體例子包括包含修飾主鏈的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合。最優(yōu)選的是具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的那些，特別是CH2 -NH--O-CH2、CH1--N(CH3)--O-CH2 [稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI 主鏈]、CH2 —0—N (CH3)-CH2XH2 —N (CH3)-N (CH3)-CH2 和 0—N (CH3)-CH2 -CH2 主鏈，其中天然磷酸二酯主鏈表示為 0--P—0--CH，)。由 De Mesmaeker 等人Jcc. Chem. Res. 1995,28:366-374) 公開的酰胺主鏈也是優(yōu)選的。還優(yōu)選的是具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和 Wfeller，美國專利號5，034，506)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，例如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸的磷酸二酯主鏈由聚酰胺主鏈替換，核苷酸與聚酰胺主鏈的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合 (Nielsen等^Science 1991，254，1497)。寡核苷酸還可以包括一個或多個取代糖部分。優(yōu)選寡核苷酸在 2’ 位置上包括下述之一 0H、SH、SCH3、F、0CN、0CH3 0CH3、0CH3 0 (CH2)n CH3> 0 (CH2)n NH2或0 (CH2)n CH3,其中η是1 -約10 K1 - C10低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ；OCF3 ；0—、S—或N-烷基；0—、S—或N-烯基；SOCH3 ；SO2 CH3 ；ONO2 ；NO2 ；N3 ；NH2 ；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基； 取代的甲硅烷基；RNA切割基團(tuán)；報(bào)道基團(tuán)；插入劑；用于改善寡核苷酸的藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)；或用于改善寡核苷酸的藥效性質(zhì)的基團(tuán)和具有相似性質(zhì)的其他取代物。優(yōu)選修飾包括2’ -甲氧基乙氧基[2’ -O-CH2 CH2 OCH3,也稱為2’ -0- (2-甲氧基乙基)](Martin等 k’Helv. Chim. Acta, 1995, 78,486)0 其他優(yōu)選修飾包括 2，-甲氧基(2，-0—CH3)、2，-丙氧基(2’-OCH2 CH2CH3)和2’-氟(2’-F)。相似修飾還可以在寡核苷酸上的其他位置上進(jìn)行， 特別是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基代替戊呋喃糖基。
寡核苷酸還可以另外或可替代地包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常被簡稱為“堿基”) 修飾的或取代的。如本文使用的，“未修飾”或“天然”核堿基包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核堿基包括僅在天然核酸中罕見地或暫時地發(fā)現(xiàn)的核堿基，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶特別是5-甲基胞嘧啶(也被稱為 5-甲基-2’脫氧胞嘧啶，且在本領(lǐng)域中通常被稱為5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基 HMC和龍膽二糖基HMC，以及合成核堿基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤、和 2，6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，DNA R印lication，W. H. Freeman & Co.， San Francisco，1980，第 75-77 頁；Gebeyehu，G.，等人 Nucl. Acids Res. 1987,15:4513)。 可以包括本領(lǐng)域已知的“通用”堿基例如肌苷。5-Me-C置換已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加 0.6-L2°Co (Sanghvi,Y. S. , in Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu, B.,編輯，Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton，1993，第 276-278 頁)，并且是目前優(yōu)選的堿基置換。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽固醇基部分(Letsinger等人，Natl. Acad. Sci. USA 1989，86，6553)、膽酸(]\&11101^『311 ^kBioorg. Med. Chem. Let. 1994，4，1053)、 硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan等人義/w. Y. Acad. Sci. 1992,660,306 ； Manoharan 等)^Bioorg. Med. Chem. Let. 1993，3，2765)、巰基膽固醇(Oberhauser 等k, Nucl. Acids Res. 1992，20，533)、脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基 (Saison-Behmoaras 等kEMBO J. 1991,10,111 ；Kabanov 等JkFEBS Lett. 1990,259, 327 ；Svinarchuk f^jKBiochimie 1993，75，49)、磷脂例如二 -十六烷基-消旋-甘油或三乙基1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸銨(Manoharan等人Tetrahedron Lett. 1995，36，3651 ;Shea 等人M/d Acids Res. 1990，18，3777)、聚胺或聚乙二醇鏈 (Manoharan 等^Nucleosides & Nucleotides 1995，14，969)、或金剛烷乙酸(Manoharan 等K Tetrahedron Lett. 1995，36，3651 )。包括親脂部分的寡核苷酸和用于制備此類寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如美國專利號5，138,045,5,218, 105和5，459，255。給定寡核苷酸中的所有位置不一定一致地修飾，并且事實(shí)上超過一個上述修飾可以摻入單個寡核苷酸中，并且甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個核苷上。本發(fā)明還包括了其為如上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一種部分綴合，所述另一種部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到這些分子可以在糖、堿基或磷酸基上的幾個位置上與包括任何核苷酸中的一個或多個的核酸分子連接。依照本發(fā)明使用的寡核苷酸可以方便地且照常規(guī)通過眾所周知的固相合成技術(shù)進(jìn)行制備。用于此類合成的設(shè)備由幾個廠商包括Applied Biosystems銷售。還可以采用用于此類合成的任何其他方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能內(nèi)。 還眾所周知的是使用相似技術(shù)以制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還眾所周知的是使用相似技術(shù)和商購可得的修飾的亞胺(amidites)和可控孔度玻璃(CPG) 產(chǎn)物，例如生物素、熒光素、吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的亞胺(amidites)和/或CPG (可從Glen Research, Sterling VA獲得)，以合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體以增強(qiáng)寡核苷酸的效力、特異性和作用持續(xù)時間且拓寬施用途徑包括目前化學(xué)，例如MOE、ANA、FANA、PS等(參考Recent advances in the medical chemistry of antisense oligonucleotide by UhIman, Current Opinions in Drug Discovery & Development 2000 年第 3 卷 No 2)。這可以通過經(jīng)由 LNA 單體置換目前寡核苷酸中的一些單體來達(dá)到。LNA修飾的寡核苷酸可以具有類似于母體化合物的大小或可以更大或優(yōu)選更小。優(yōu)選此類LNA修飾的寡核苷酸包含小于約70%、更優(yōu)選小于約60%、最優(yōu)選小于約50%的LNA單體，并且其大小為約5 - 25個核苷酸、更優(yōu)選約12 - 20個核苷酸。優(yōu)選修飾的寡核苷酸主鏈包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3’ -5’鍵合的硼磷酸酯 (boranophosphates)，這些的2’ _5’連接類似物，和具有倒轉(zhuǎn)極性的那些，其中核苷單位的相鄰對3’-5’與5’-3’或2’-5’與5’-2’連接。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)上述含磷鍵合制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號3，687，808 ； 4，469，863 ；4，476，301 ；5，023，243 ；5，177，196 ；5，188，897 ；5，264，423 ；5，276，019 ； 5，278，302 ；5，286，717 ；5，321，131 ；5，399，676 ；5，405，939 ；5，453，496 ；5，455,233 ； 5，466，677 ；5，476，925 ；5，519，126 ；5，536，821 ；5，541，306 ；5，550，111 ；5，563，253 ； 5，571,799 ；5, 587，361 ；和5，625，050，其各自引入本文作為參考。其中不包括磷原子的優(yōu)選修飾寡核苷酸主鏈具有這樣的主鏈，其通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成。這些包括具有嗎啉代鍵合的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲?；?formacetyl)和硫代甲?；?thioformacetyl)主鏈；亞甲基甲?；?methylene formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主鏈；含鏈烴主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基胼基主鏈；磺酸酯和氨苯磺胺主鏈；酰胺主鏈；和具有混合的N、0、S和CH2組分部分的其他。教導(dǎo)上述寡核苷制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，034，506 ； 5，166，315 ；5，185，444 ；5，214，134 ；5，216，141 ；5，235，033 ；5，264，562 ；5, 264，564 ； 5，405，938 ；5，434，257 ；5，466，677 ；5，470，967 ；5，489，677 ；5，541，307 ；5，561，225 ； 5，596，086 ； 5，602，240 ；5，610，289 ；5，602，240 ；5，608，046 ；5，610，289 ；5，618，704 ； 5，623，070 ；5，663，312 ；5，633，360 ；5，677，437 ；和 5，677，439，其各自引入本文作為參考。在其他優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間鍵合即主鏈由新型基團(tuán)替換。維持這些堿基單位用于與合適的核酸靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，已顯示具有極佳雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主鏈由含酰胺主鏈替換，特別是氨乙基甘氨酸主鏈。核堿基被保留且與主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，539，082 ；5，714，331 ；和5，719，沈2，其各自引入本文作為參考。PNA化合物的進(jìn)一步教導(dǎo)可以在 ο Nielsen 等人，5bie/ ce，1991，254，1497-1500 中找到。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷，且特別是稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈的-CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N (CH3)-CH2-, -CH2N (CH3)-N (CH3)CH2-和-0-N (CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯主鏈表示為上文提及的美國專利號5，489，677的O-P-O-CH2-,和上文提及的美國專利號5，602，240的酰胺主鏈。還優(yōu)選的是具有上文提及的美國專利號5，034，506 的嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾寡核苷酸還可以包括一個或多個取代糖部分。優(yōu)選寡核苷酸在2’位置上包括下述之一 0H ；F ；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0烷基_0_烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。特別優(yōu)選的是 0 (CH2)n OmCH3 > 0 (CH2)n, OCH3 > 0 (CH2)nNH2, 0 (CH2) nCH3、0 (CH2)nONHjPO (CH2nON (CH2)nCH3)2，其中η和m可以是1 -約10。其他優(yōu)選寡核苷酸在2’位置上包括下述之一 C至CO、低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、 SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3> NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、插入劑、用于改善寡核苷酸的藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改善寡核苷酸的藥效性質(zhì)的基團(tuán)、和具有相似性質(zhì)的其他取代物。優(yōu)選修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O-CH2CH2OCH3,也稱為2’ -0- (2-甲氧基乙基)或 2，-M0E) (Martin 等人，Wk Chim. Jcia，1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括2’-二甲基氨基氧代乙氧基，即0 (CH2)2ON (CH3)2基團(tuán)， 也稱為2’-DMA0E，如本文下文實(shí)施例中所述，和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為 2，-0- 二甲基氨基乙氧基乙基或 2，-DMAEOE),即 2，-O-CH2-O-CH2-N (CH2)20其他優(yōu)選修飾包括2’-甲氧基(2’-0 CH3)、2'-氨基丙氧基(2’-0 CH2CH2CH2NH2) 和2’-氟(2’-F)。相似修飾還可以在寡核苷酸上的其他位置上進(jìn)行，特別是在3’末端核苷酸上或在2’-5’連接寡核苷酸中的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分代替戊呋喃糖基基團(tuán)。教導(dǎo)此類修飾糖結(jié)構(gòu)物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號4，981，957 ；5, 118，800 ；5, 319，080 ；5, 359，044 ； 5，393，878 ；5，446，137 ；5，466，786 ；5，514，785 ；5，519，134 ；5，567，811 ；5，576，427 ； 5，591，722 ；5，597，909 ；5，610，300 ；5，627，053 ；5，639，873 ；5，646，265 ；5，658，873 ； 5，670，633 ；和5，700，920，其各自引入本文作為參考。寡核苷酸還可以包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常被簡稱為“堿基”)修飾的或取代的。 如本文使用的，“未修飾”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核堿基包括其他合成和天然核堿基，例如
5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、
6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵素、8-氨基、 8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵素特別是5-溴、5-三
27氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤、以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。進(jìn)一步地，核堿基包括公開于美國專利號3，687，808中的那些，公開于’The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', 第 858-859 頁， Kroschwitz, J. I.，ed. John Wiley 和 Sons，1990 中的那些，由 Englisch 等人，，Angewandle Chemie, International Edition，，1991，30，第 613 頁公開的那些，和由 Sanghvi，Y. S.，第 15 章，‘Antisense Research and Applications',第 289-302 頁，Crooke, S. Τ·禾口 Lebleu, B. ea.，CRC ft~ess，1993公開的那些。這些核堿基中的一些特別用于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤， 包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加 0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S. T.和 Lebleu，B.，編輯，‘Antisense Research and Applications' , CRC Press, Boca Raton,1993,第 276-278 頁)，并且是目前優(yōu)選的堿基置換，更加特別當(dāng)與2' -0-甲氧基乙基糖修飾組合時。教導(dǎo)上述修飾核堿基以及其他修飾核堿基制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 3，687，808 以及 4，845，205 ；5，130，302 ；5，134，066 ；5，175，273 ；5，367，066 ； 5，432，272 ；5，457，187 ；5，459，255 ；5，484，908 ；5，502，177 ；5，525，711 ；5，552，540 ； 5，587，469 ；5，596，091 ；5，614，617 ；5，750，692 和 5，681，941，其各自引入本文作為參考。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989，86，6553-6556)、膽酸(Manoharan 等)κ，Bioorg. MecL Chem. Let.，1994，4，1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan 等人，J/w. N. Y. Acad. Sci. ,1992,660,306-309 ；Manoharan φ A, Bioorg. Med. Chem. Let. , 1993,3, 2765-2770)、巰基膽固醇(Oberhauser 等人，Nucl. Acids Res.，1992，20，533-538)、脂肪族鏈例如十二烷二醇或i^一烷基殘基(Kabanov等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330 ； Svinarchuk等人，Biochimie, 1993，75，49巧4)、磷脂例如二 -十六烷基-消旋_甘油或三乙基1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸銨(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654 ；Shea等人，M/d Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等^Nucleosides & Nucleotides 1995，14，969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan 等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕櫚酰基部分(Mishra 等
Biochim. Biophys. Acta, 1995，1264，2四_237)、或十八胺或己基氨基-羰基_t羥膽固醇部分(Crooke 等人，7； Pharmacol. Exp.，1996，277，923-937)。教導(dǎo)此類寡核苷酸綴合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 4，828，979 ；4，948，882 ；5，218，105 ；5，525，465 ；5，541，313 ；5，545，730 ；5，552,538 ； 5，578，717, 5，580，731 ；5, 580，731 ；5，591，584 ；5，109，124 ；5，118，802 ；5，138，045 ； 5，414，077 ；5，486,603 ；5，512，439 ；5，578，718 ；5，608，046 ；4，587，044 ；4，605，735 ； 4，667，025 ；4，762，779 ；4，789，737 ；4，824，941 ；4，835，263 ；4，876，335 ；4，904，582 ； 4，958，013 ；5，082,830 ；5，112，963 ；5，214，136 ；5，082，830 ；5，112，963 ；5，214，136 ；5，245，022 ；5，254，469 ；5，258，506 ；5，262，536 ；5，272，250 ；5，292，873 ；5，317，098 ； 5，371，241,5，391，723 ；5，416，203,5，451，463 ；5，510，475 ；5，512，667 ；5，514，785 ； 5，565，552 ；5，567，810 ；5，574，142 ；5，585，481 ；5，587，371 ；5，595，726 ；5，597，696 ； 5，599，923 ；5，599，928和5，688，941，其各自引入本文作為參考。會萬發(fā)本發(fā)明的化合物還可以應(yīng)用于藥物開發(fā)和靶確認(rèn)領(lǐng)域。本發(fā)明包含在藥物開發(fā)努力中使用本文鑒定的化合物和優(yōu)選靶區(qū)段，以闡明在載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病狀之間存在的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸，其包括使樣品、組織、細(xì)胞或生物與本發(fā)明的化合物接觸，在治療后某時測量載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的核酸或蛋白質(zhì)水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終末點(diǎn)，和任選地使測量值與非處理樣品或用本發(fā)明的進(jìn)一步化合物處理的樣品比較。這些方法還可以與其他實(shí)驗(yàn)平行或組合執(zhí)行，以測定未知基因的功能用于靶確認(rèn)過程，或測定特定基因產(chǎn)物作為用于治療或預(yù)防特定疾病、病狀或表型的靶的有效性。評估基因表達(dá)的上調(diào)或抑制
外源核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞或生物內(nèi)可以通過直接檢測細(xì)胞或生物中核酸的存在進(jìn)行評估。此類檢測可以通過本領(lǐng)域眾所周知的幾種方法來達(dá)到。例如，外源核酸的存在可以通過DNA印跡或通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測，使用特異性擴(kuò)增與核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物。外源核酸的表達(dá)還可以使用常規(guī)方法進(jìn)行測量，包括基因表達(dá)分析。例如，由外源核酸產(chǎn)生的mRNA可以使用RNA印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)進(jìn)行檢測且定量。來自外源核酸的RNA表達(dá)也可以通過測量酶促活性或報(bào)道蛋白質(zhì)活性進(jìn)行檢測。 例如，反義調(diào)節(jié)活性可以作為靶核酸表達(dá)中的減少或增加間接地進(jìn)行測量，作為外源核酸產(chǎn)生效應(yīng)子RNA的指示。基于序列保守性，可以設(shè)計(jì)引物且用于擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。最初，來自每種基因最高度表達(dá)的編碼區(qū)可以用于構(gòu)建模型對照基因，盡管可以使用任何編碼或非編碼區(qū)。每種對照基因通過將每個編碼區(qū)插入報(bào)道編碼區(qū)及其多聚腺苷酸信號之間進(jìn)行裝配。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生具有在基因上游部分中的報(bào)道基因和在3’非編碼區(qū)中的潛在RNAi靶的mRNA。個別反義寡核苷酸的有效性將通過報(bào)道基因的調(diào)節(jié)進(jìn)行評估。在本發(fā)明的方法中有用的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(ΑΡ)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(⑶S)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、藍(lán)色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、螢光素酶 (Luc)、胭脂堿合酶(N0S)、章魚堿合酶(OCS)及其衍生物。多重可選標(biāo)記是可獲得的，其賦予對于氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、 草胺膦、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。測定報(bào)道基因調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括但不限于熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、熒光顯微鏡檢查)、抗生素抗性測定。試劑盒、研究試劑、診斷和治療
本發(fā)明的化合物可以用于診斷、治療和預(yù)防，并且用作研究試劑和試劑盒組分。此外， 能夠以強(qiáng)烈特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸通常由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能，或區(qū)分生物途徑的各種成員的功能。對于在試劑盒和診斷中以及在各種生物系統(tǒng)中的使用，本發(fā)明的化合物單獨(dú)或與其他化合物或治療劑組合用作區(qū)分和/或組合分析中的工具，以闡明在細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的部分或完整互補(bǔ)體的表達(dá)模式。如本文使用的，術(shù)語“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為任何生物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)或組織，其表達(dá)或使得能夠表達(dá)載脂蛋白(ApoAl)基因的產(chǎn)物。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個非限制性例子，在用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未用反義化合物處理的對照細(xì)胞或組織比較，并且產(chǎn)生的模式就基因表達(dá)的差異水平進(jìn)行分析，因?yàn)樗鼈兝缟婕氨粰z查基因的疾病相關(guān)、信號途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可以對刺激或未刺激細(xì)胞并且在影響表達(dá)模式的其他化合物的存在或不存在下執(zhí)行。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析的方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma和 Vilo, FEBS Lett.，2000 480,17-24 ；Celis,等人，F(xiàn)EBS Lett.，2000 480,2-16), SAGE (基因表達(dá)的系列分析(Madden,等人，Drug Disco v. Today, 2000, 5，415-425)、READS (消化 cDNAs 的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman，Methods Enzymol.，1999，303， 258-72)、TOGA (總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe,等人，Natl. Acad. Sci. U. S. Α., 2000，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis,等 k，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480， 2-16 Jungblut,等人，^VeciroMoresis，1999，20，2100-10)、已表達(dá)序列標(biāo)記(EST)測序(Celis,等人，/Zeii.，2000，480，2-16 ;Larsson,等人，7； Biotechnol. ,2000,80, 143-57)、消減RNA指紋法(SuRF)(Fuchs,等X,Anal. Biochem.，2000，286，91-98 ；Larson, 等人，O^offleiir，2000，41，203-208)、消減克隆、差異顯示(DD) (Jurecic 和 Belmont，Ci/rr. Opin. ifo'cro力io人，2000，3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli,等人，7； Cell Biochem. Suppl. , 1998,31,286-96), FISH (熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson，及/r. J. Caflcer，1999，35，1895-904)和質(zhì)譜法(To，Chem. High Throughput Screen, 2000, 3，235-41)。本發(fā)明的化合物對于研究和診斷有用，因?yàn)檫@些化合物與編碼載脂蛋白(ApoAl) 的核酸雜交。例如，以此類效率且在如本文公開的此類條件下雜交以成為有效載脂蛋白 (ApoAl)調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，在有利于基因擴(kuò)增或檢測的條件下分別是有效引物或探針。這些引物和探針用于要求編碼載脂蛋白(ApoAl)的核酸分子的特異性檢測的方法，和用于所述核酸分子的擴(kuò)增用于檢測或用于在載脂蛋白(ApoAl)的進(jìn)一步研究中使用。本發(fā)明的反義寡核苷酸特別是引物和探針與編碼載脂蛋白(ApoAl)的核酸的雜交可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行檢測。此類方法可以包括酶與寡核苷酸的綴合、寡核苷酸的放射性標(biāo)記、或任何其他合適的檢測方法。還可以制備使用此類檢測方法用于檢測樣品中的載脂蛋白(ApoAl) 水平的試劑盒。反義的特異性和敏感性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員用于治療用途。反義化合物已在動物包括人中的疾病狀態(tài)治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全有效地施用于人，并且眾多臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸谶M(jìn)行中。因此確定反義化合物可以是有用的治療模式，其可以配置為在用于治療細(xì)胞、組織和動物特別是人的治療方案中有用。對于治療，懷疑具有可以通過調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動物優(yōu)選人通過施用依照本發(fā)明的反義化合物進(jìn)行治療。例如，在一個非限制性實(shí)施方案中，該方法包括步驟給需要治療的動物施用治療有效量的載脂蛋白(ApoAl)調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的載脂蛋白(ApoAl)調(diào)節(jié)劑有效調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)蛋白質(zhì)的活性，或調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoAl)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，與對照比較，在動物中載脂蛋白 (ApoAl)的活性或表達(dá)被抑制約10%。優(yōu)選地，在動物中載脂蛋白(ApoAl)的活性或表達(dá)被抑制約30%。更優(yōu)選地，在動物中載脂蛋白(ApoAl)的活性或表達(dá)被抑制50%或更多。 因此，與對照比較，寡聚化合物使載脂蛋白(ApoAl) mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、 至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個實(shí)施方案中，與對照比較，在動物中載脂蛋白(ApoAl)的活性或表達(dá)增加約 10%。優(yōu)選地，在動物中載脂蛋白(ApoAl)的活性或表達(dá)增加約30%。更優(yōu)選地，在動物中載脂蛋白(ApoAl)的活性或表達(dá)增加50%或更多。因此，與對照比較，寡聚化合物使載脂蛋白(ApoADmRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少 98%、至少 99%或 100%。例如，載脂蛋白(ApoAl)的表達(dá)減少可以在血清、血液、脂肪組織、肝臟或動物的任何其他體液、組織或器官中進(jìn)行測量。優(yōu)選地，在待分析的所述液體、組織或器官中包含的細(xì)胞包含編碼載脂蛋白(ApoAl)肽的核酸分子和/或載脂蛋白(ApoAl)蛋白質(zhì)其自身。通過將有效量的化合物加入合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中，本發(fā)明的化合物可以用于藥物組合物中。本發(fā)明的化合物和方法的使用也可以是預(yù)防上有用的。綴合物
本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。這些部分或綴合物可以包括與官能團(tuán)例如伯或仲醇羥基共價結(jié)合的綴合物基團(tuán)。本發(fā)明的綴合物基團(tuán)包括插入劑、報(bào)道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚物的藥效性質(zhì)的基團(tuán)、和增強(qiáng)寡聚物的藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。一般的綴合物基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、 葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明的背景中，增強(qiáng)藥效性質(zhì)的基團(tuán)包括改善攝取、增強(qiáng)對降解的抗性、和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明的背景中，增強(qiáng)藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善本發(fā)明的化合物的攝取、分布、代謝或排出的基團(tuán)。代表性綴合物基團(tuán)公開于1992年10月23日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US92/09196和美國專利號6，觀7，860中，其引入本文作為參考。綴合物部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇、巰基膽固醇、 脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-消旋-甘油或三乙基 1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚?；糠只蚴税坊蚣夯被?羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可以與活性原料藥綴合，例如阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S) - ( + )-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。教導(dǎo)此類寡核苷酸綴合物的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 4，828，979； 4，948，882； 5，218，105； 5，525，465； 5，541，313; 5，545，730； 5，552，538；5，578，717，5，580，731;5，580，731;5，591，584;5，109，124;5，118，802;5，138，0455，414，077;5，486，603;5，512，439;5，578，718;5，608，046;4，587，044;4，605，7354，667，025;4，762，779;4，789，737;4，824，941;4，835，263;4，876，335;4，904，5824，958，013;5，082，830;5，112，963;5，214，136;5，082，830;5，112，963;5，214，1365，245，022;5，254，469;5，258，506;5，262，536;5，272，250;5，292，873;5，317，0985，371，241，5，391，723;5，416，203，5，451，463;5，510，475;5，512，667;5，514，7855，565，552;5，567，810;5，574，142;5，585，481;5，587，371;5，595，726;5，597，696
5，599，923 ； 5，599，928 和 5，688，941。制齊IJ
本發(fā)明的化合物還可以與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物混合物混合、封裝、綴合或以其他方式結(jié)合，作為例如脂質(zhì)體，受體靶向分子，經(jīng)口、直腸、局部或其他制劑，用于幫助攝取、 分布和/或吸收。教導(dǎo)此類攝取、分布和/或吸收輔助制劑制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 5，108，921 ；5，354，844 ；5，416，016 ；5, 459, 127 ；5，521,291 ；5，543，165 ； 5，547，932 ；5，583，020 ；5，591，721 ；4，426，330 ；4，534，899 ；5，013，556 ；5，108，921 ； 5，213，804 ；5，227，170 ；5，264，221 ；5，356，633 ；5，395，619 ；5，416，016 ；5，417，978 ； 5，462，854 ；5，469，854 ；5，512，295 ；5，527，528 ；5，534，259 ；5，543，152 ；5，556，948 ； 5，580，575 ；和5，595，756，其各自引入本文作為參考。盡管反義寡核苷酸無需在載體的背景中施用，以便調(diào)節(jié)靶表達(dá)和/或功能，但本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，包括啟動子、雜合啟動子基因序列，且具有強(qiáng)組成型啟動子活性，或可以在所需情況下誘導(dǎo)的啟動子活性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)踐涉及用合適的核酸遞送系統(tǒng)施用前述反義寡核苷酸中的至少一種。在一個實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括與多核苷酸可操作地連接的非病毒載體。 此類非病毒載體的例子包括單獨(dú)(例如，SEQ ID NO 81 - 173中的任何一個或多個)或與合適蛋白質(zhì)、多糖或脂質(zhì)制劑組合的寡核苷酸。另外合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，一般是來自下述中的至少一種的序列 腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、輔助病毒依賴型腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或血凝病毒的日本脂質(zhì)體 (HVJ)復(fù)合物。優(yōu)選地，病毒載體包括與多核苷酸可操作地連接的強(qiáng)真核啟動子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠類白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少2種載體，其中g(shù)ag和pol基因來自HIV基因組，并且mr基因來自另一種病毒。DNA病毒載體是優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體例如正痘病毒或雞痘病毒載體、皰疹病毒載體例如單純皰疹 I 病毒(HSV)載體[Geller，Α. I.等人，7； Neurochem, 64 :487 (1995) ；Lim, F.，等人’ in DNA Cloning MammaIian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995) ；Geller, A. I.等k，Proc Natl. Acad. Sci. :U. S. A. :90 7603 (1993)； Geller, A. I.，等人，Proc Natl. Acad. Sci USA :87:1149 (1990)]、腺病毒載體[LeGal LaSalle 等人，5bie/ ce，259:988 (1993) ；Davidson,等人，Genet. 3 219 (1993)； Yang,等人，7； Virol. 69: 2004 (1995)]和腺相關(guān)病毒載體[Kaplitt，M. G.，等人， Genet. 8:148 (1994)]。
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本發(fā)明的反義化合物包含任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或此類酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用于動物包括人后，能夠提供(直接或間接地)生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物或其殘
ο術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽即保留母體化合物的所需生物活性且不對其賦予不希望有的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽。對于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽的優(yōu)選例子及其用途在美國專利號6，觀7，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以許多方式施用，依賴于是需要局部還是全身性治療和依賴于待治療的區(qū)域。施用可以是局部的(包括眼和至粘膜包括陰道和直腸遞送)、肺的例如通過粉劑或氣溶膠的吸入或吹入，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮)、經(jīng)口或腸胃外的。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。具有至少一個2’-0_甲氧基乙基修飾的寡核苷酸被認(rèn)為對于經(jīng)口施用特別有用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體，水、粉末或油基，增稠劑等可以是需要或希望的。包被避孕套、手套等也可以是有用的?？梢苑奖愕匾詥挝粍┬统尸F(xiàn)的本發(fā)明的藥物制劑可以根據(jù)醫(yī)藥工業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。此類技術(shù)包括使活性成分與一種或多種藥學(xué)載體或賦形劑達(dá)到結(jié)合的步驟。一般而言，制劑通過下述進(jìn)行制備使活性成分與液體載體或精細(xì)分開的固體載體或兩者均勻地且緊密地達(dá)到結(jié)合，并且隨后在需要時使產(chǎn)物成形。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能劑型中的任何，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以在水、非水或混合介質(zhì)中配制為栓劑。水懸浮液可以進(jìn)一步包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或右旋糖酐。懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳狀液、泡沫和含脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可以包括一種或多種穿透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳狀液一般是一種液體在以直徑通常超過0. 1 μ m的小滴形式的另一種中分散的非均勻系。乳狀液可以包含另外組分加上分散相，以及可以作為在水相、油相中的溶液或其自身作為分離相存在的有效藥。微乳液包括作為本發(fā)明的一個實(shí)施方案。乳狀液及其用途是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在美國專利號6，287, 860中進(jìn)一步描述。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。如在本發(fā)明中使用的，術(shù)語“脂質(zhì)體”意指由在一個或多個球狀雙層或雙層中排列的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，其具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水內(nèi)部。陽離子脂質(zhì)體是帶正電的脂質(zhì)體， 其被認(rèn)為與帶負(fù)電的DNA分子相互作用，以形成穩(wěn)定復(fù)合物。其為pH敏感或帶負(fù)電的脂質(zhì)體被認(rèn)為誘陷DNA而不是與之復(fù)合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體已用于將DNA遞送至細(xì)胞。脂質(zhì)體還包括“立體穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，如本文使用的，指包括一種或多種專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體的術(shù)語。當(dāng)摻入脂質(zhì)體內(nèi)時，這些專門脂質(zhì)導(dǎo)致相對于缺乏此類專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體，具有增強(qiáng)的循環(huán)壽命的脂質(zhì)體。立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體的例子是其中脂質(zhì)體的囊泡形成脂質(zhì)部分的部分包括一種或多種糖脂，或由一種或多種親水聚合物例如聚乙二醇(PEG)部分衍生的那些。脂質(zhì)體及其用途在美國專利號6，287, 860中進(jìn)一步描述。本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可以包括表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳狀液中的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。表面活性劑及其用途在美國專利號6，287, 860 中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明采用各種穿透促進(jìn)劑，以實(shí)現(xiàn)核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除幫助非親脂藥物擴(kuò)散越過細(xì)胞膜外，穿透促進(jìn)劑還增強(qiáng)親脂藥物的滲透性。穿透促進(jìn)劑可以分類為屬于5個廣泛范疇之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、和非螯合非表面活性劑。穿透促進(jìn)劑及其用途在美國專利號6，觀7，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到照常規(guī)根據(jù)其預(yù)期用途即施用途徑來設(shè)計(jì)制劑。用于局部施用的優(yōu)選制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送試劑混合的那些，所述局部遞送試劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑。 優(yōu)選脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿 DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子的(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺D0TMA)。對于局部或其他施用，本發(fā)明的寡核苷酸可以封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或可以與其特別是與陽離子脂質(zhì)體形成復(fù)合物。可替代地，寡核苷酸可以與脂質(zhì)特別是與陽離子脂質(zhì)復(fù)合。優(yōu)選脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及其用途在美國專利號6，287, 860中進(jìn)一步描述。用于經(jīng)口施用的組合物和制劑包括粉劑或顆粒劑、微粒、納米顆粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或小片。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、 分散助劑或結(jié)合劑可能是希望的。優(yōu)選經(jīng)口制劑是其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種穿透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑結(jié)合施用的那些。優(yōu)選表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。優(yōu)選膽汁酸/鹽和脂肪酸及其用途在美國專利號6，287, 860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。還優(yōu)選的是穿透促進(jìn)劑的組合，例如與膽汁酸/鹽組合的脂肪酸/鹽。特別優(yōu)選的組合是月桂酸的鈉鹽、癸酸和UDCA。進(jìn)一步的穿透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以以顆粒形式包括噴霧干燥顆粒經(jīng)口遞送，或復(fù)合以形成微?；蚣{米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其用途在美國專利號6，287, 860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。用于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適添加劑，例如但不限于穿透促進(jìn)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的特定實(shí)施方案提供包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他化學(xué)治療劑的藥物組合物，所述其他化學(xué)治療劑通過非反義機(jī)制起作用。此類化學(xué)治療劑的例子包括但不限于癌癥化學(xué)治療藥，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、依達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿糖核苷、雙-氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光輝霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、它莫西芬、 達(dá)卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、噴司他丁、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤 (MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、依立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時，此類化學(xué)治療劑可以個別(例如5-FU和寡核苷酸)、順次(例如5-FU和寡核苷酸一段時間，隨后為 MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他此類化學(xué)治療劑組合(例如5-FU、MTX和寡核苷酸， 或5-FU放射療法和寡核苷酸)使用。抗炎藥包括但不限于非留體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇，和抗病毒藥包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，也可以在本發(fā)明的組合物中組合。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。2種或更多種組合化合物可以一起或順次使用。在另一個相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含靶向第一種核酸的一種或多種反義化合物特別是寡核苷酸，和靶向第二種核酸靶的一種或多種另外反義化合物。例如， 第一種靶可以是載脂蛋白(ApoAl)的特定反義序列，并且第二種靶可以是來自另一種核酸序列的區(qū)域?？商娲?，本發(fā)明的組合物可以包含靶向相同載脂蛋白(ApoAl)核酸靶的不同區(qū)域的2種或更多種反義化合物。反義化合物的眾多例子在本文中舉例說明，并且其他可以選自本領(lǐng)域已知的合適化合物。2種或更多種組合化合物可以一起或順次使用。給藥:
治療組合物的配制及其后續(xù)施用(給藥)被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。給藥依賴于待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和應(yīng)答性，連同持續(xù)數(shù)天到數(shù)月的治療過程，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的縮減。最佳給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物蓄積測量進(jìn)行計(jì)算。普通技術(shù)人員可以容易地決定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)速率。最佳劑量可以依賴于個別寡核苷酸的相對功效而變，并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC5(ls進(jìn)行估計(jì)。一般而言， 劑量是0.01 μ g - 100 g/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2 - 20年給予一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地估計(jì)關(guān)于給藥的重復(fù)速率，基于在體液或組織中測量的藥物停留時間和濃度。在成功治療后，可以希望使患者經(jīng)歷維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量施用，范圍為0.01 μ g - 100 g/kg體重，每天一次或多次，到每20年一次。盡管已在上文描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解它們僅作為例子而不是限制呈現(xiàn)。依照本文公開內(nèi)容可以進(jìn)行對于公開實(shí)施方案的眾多改變，而不背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)受上述實(shí)施方案中的任何限制。本文提及的所有文件引入本文作為參考。本申請中引用的所有出版物和專利文件為了所有目的引入作為參考，其程度與每個個別出版物或?qū)＠募绱藗€別指出相同。通過其在本文件的各種參考文獻(xiàn)中的引用，申請人不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)是其發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案在下述實(shí)施例中舉例說明。
實(shí)施例下述非限制性實(shí)施例用來舉例說明本發(fā)明的選擇實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解在所示組分元件中的比例和可替代物中的變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且在本發(fā)明的實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)施例1 對于載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的核酸分子反義和/或正義鏈特異的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)
如上所述，術(shù)語“對于特異的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶”指具有下述序列的寡核苷酸 (i)能夠與靶基因的部分形成穩(wěn)定復(fù)合物，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的部分形成穩(wěn)定雙鏈體。合適寡核苷酸的選擇通過使用計(jì)算機(jī)程序得到促進(jìn)，所述計(jì)算機(jī)程序自動比對核酸序列且指出同一性或同源性區(qū)域。此類程序用于比較獲得的核酸序列，例如通過搜索數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過測序PCR產(chǎn)物。來自一系列物種的核酸序列的比較允許選擇展示物種之間的合適同一性程度的核酸序列。在未測序的基因的情況下，執(zhí)行DNA印跡以允許測定靶物種和其他物種中在基因之間的同一性程度。通過在各種嚴(yán)格程度下執(zhí)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可以獲得同一性的近似測量。這些操作允許選擇這樣的寡核苷酸，其顯示出與待控制受試者中的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性和其他物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補(bǔ)性。技術(shù)人員將認(rèn)識到在選擇用于在本發(fā)明中使用的基因的合適區(qū)域中存在相當(dāng)大的活動余地。反義化合物是“可特異性雜交的”，當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性調(diào)節(jié)時，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，即在體內(nèi)測定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和其中在體外測定情況下執(zhí)行測定的條件下。本文描述的寡核苷酸的雜交性質(zhì)可以通過如本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測定進(jìn)行測定。例如，使用解鏈曲線測定，通過測定靶天然反義和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度可以獲得本文描述的寡核苷酸的性質(zhì)。使用測量分子間相互作用強(qiáng)度的任何確定方法例如解鏈曲線測定，可以估計(jì)靶天然反義和潛在藥物分子(分子)之間的結(jié)合強(qiáng)度。解鏈曲線測定確定在其下對于天然反義/分子復(fù)合物發(fā)生從雙鏈到單鏈構(gòu)象的快速轉(zhuǎn)變的溫度。這個溫度被廣泛公認(rèn)為2種分子之間的相互作用強(qiáng)度的可靠測量。使用實(shí)際天然反義RNA分子的cDNA拷貝或與分子的結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)的合成DNA或 RNA核苷酸，可以執(zhí)行解鏈曲線測定。包含執(zhí)行這種測定的所有必需試劑的多重試劑盒是可獲得的(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括包含雙鏈DNA (dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、STOR Green、SYT0等)之一的合適緩沖溶液。 dsDNA染料的性質(zhì)是這樣的，使得它們以游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但在與dsDNA結(jié)合時是高度熒光的。為了執(zhí)行測定，使cDNA或相應(yīng)寡核苷酸與分子以由具體制造商的方案限定的濃度混合。使混合物加熱至95°C，以解離所有預(yù)形成的dsDNA復(fù)合物，隨后緩慢冷卻至室溫或由試劑盒制造商限定的其他較低溫度，以允許DNA分子退火。新近形成的復(fù)合物隨后緩慢加熱至95°C，伴隨關(guān)于由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的同時連續(xù)數(shù)據(jù)收集。熒光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的dsDNA量成反比。數(shù)據(jù)可以使用與試劑盒相容的實(shí)時PCR儀器(例如ABI，s StepOne Plus Real Time PCR System LightTyper Χ^, Roche Diagnostics, Lewes, UK) ^f1Bt 集。使用合適軟件(例如LightTyper (Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI), 過針對溫度(X軸)標(biāo)繪就溫度而言的熒光負(fù)衍生物(在y軸上的-d (熒光)/dT)構(gòu)建解鏈峰。分析數(shù)據(jù)以鑒定從dsDNA復(fù)合物到單鏈分子的快速轉(zhuǎn)變的溫度。這個溫度被稱為Tm， 并且與2種分子之間的相互作用強(qiáng)度成正比。一般地，Tm將超過40°C。實(shí)施例2 .-ApoAl多核苷酸的調(diào)節(jié)材料與方法
細(xì)胞用下述方法中的任一進(jìn)行處理
方法1 用裸露反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞
使來自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號HB-8065)在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone 目錄號 SH30024 或 Mediatech 目錄號 MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號 MT30-002-CI))中在 37°C和 5% (X)2 下生長。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以0.5 X 104/ml的密度再鋪平板到6孔板內(nèi)，并且在37°C 和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為1. 5 ml/孔新鮮生長培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸在水中稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ 1這種溶液與400 μ 1 新鮮生長培養(yǎng)基混合，并且應(yīng)用于具有IfepG2細(xì)胞的6孔板的每個孔。包括2 μ 水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬處理對照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后72小時，如上文中所述使細(xì)胞再次給藥。在第二次給藥后48-72小時，去除培養(yǎng)基，并且使用來自Promega的SV Total RNA Isolation System (目錄號 Z3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試齊[J 盒(目錄號74181)，根據(jù)制造商的說明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來自 Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過實(shí)時PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(用于18S目錄號4319413E，用于ApoAl Hs00163641_ml,Applied Biosystems Inc. ,Foster City CA) 使用下述PCR循環(huán)使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40 個循環(huán)(95°C 15秒，60°C 1分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。方法2 用反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞
使來自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號HB-8065)在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone 目錄號 SH30024 或 Mediatech 目錄號 MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號 MT30-002-CI))中在 37°C和 5% (X)2 下生長。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪平板到6孔板內(nèi)，并且在37°C 和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ 1這種溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號 31985-070)和 4 μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號 11668019)在室溫下孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個孔。包括2 μ 1水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時，去除培養(yǎng)基，并且使用來自Promega 的 SV Total RNA Isolation System (目錄號 ^3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號74181 )，根據(jù)制造商的說明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過實(shí)時PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號4369510) 和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(用于18S目錄號4319413E，用于ApoAl Hs00163641_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA) 使用下述 PCR 循環(huán)使用 Mx4000 熱循環(huán)儀 (Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個循環(huán)(95°C 15秒，60°C 1分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。結(jié)果
實(shí)時PCR結(jié)果顯示在!fepG2細(xì)胞中在用針對ApoAl反義DA327409ext的反義寡核苷酸處理后48小時，在H印G2細(xì)胞中的ApoAl mRNA水平顯著增加(圖1)。實(shí)施例3 .-ApoA基因表達(dá)的調(diào)節(jié)材料與方法
細(xì)胞用下述方法中的任一進(jìn)行處理
方法1 用裸露反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞
使!fepG2細(xì)胞在MEM/EBSS(Hyclone目錄號SH300M)+10% FBS +青霉素/鏈霉素中在37°C和5% CO2下生長。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1. 5 X 104/ml的密度再鋪平板到6孔板內(nèi)，并且留在37°C和5% CO2下。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮MEM/EBSS +10% FBS0由IDT制造的所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ 1這種溶液與 400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號31985-070)孵育，并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的 6孔板的每個孔。包括2 μ 1水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對照。在加入反義寡核苷酸后72小時，去除培養(yǎng)基，并且如上文中所述重復(fù)給藥操作。在重復(fù)給藥后48-72 小時，使用來自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System (目錄號 Z3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號 74181 )，根據(jù)制造商的說明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來自Thermo kientific的 Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過實(shí)時PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(用于18S目錄號4319413E，用于ApoAl Hs00163641_ml，和用于ApoAl反義DA327409ext的用戶定制設(shè)計(jì)測定，全部由Applied Biosystems Inc. , Foster City CA提供)。使用下述PCR循環(huán)使用Mx4000熱循環(huán)儀 (Stratagene)的 50°C 2 分鐘，95°C 10 分鐘，40 個循環(huán)(95°C 15 秒，60°C 1 分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。用于ApoAl天然反義DA327409ext的用戶定制設(shè)計(jì)Taqman測定的引物和探針。大寫字母指示未修飾的脫氧核糖核苷酸
正向引物序列 CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (SEQ ID NO :163) 反向引物序列 CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (SEQ ID NO 164 ) 探針序列(FAM 標(biāo)記的)TTTGGATCTGGACGACTTC (SEQ ID NO :165)。方法2 用反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞
使來自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號HB-8065)在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號 SH30024 或 Mediatech 目錄號 MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號 MT30-002-CI))中在 37°C和 5% (X)2 下生長。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪平板到6孔板內(nèi)，并且在37°C 和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ 1這種溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號 31985-070)和 4 μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號 11668019)在室溫下孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個孔。包括2 μ 1水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時，去除培養(yǎng)基，并且使用來自Promega 的 SV Total RNA Isolation System (目錄號 ^3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號74181 )，根據(jù)制造商的說明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號 AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過實(shí)時PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(用于18S目錄號4319413E，用于ApoAl Hs00163641_ml，和用于 ApoAl 反義 DA327409ext 的用戶定制設(shè)計(jì)測定，全部由 Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City CA)ο使用下述PCR循環(huán)使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10 分鐘，40個循環(huán)(95°C 15秒，60°C 1分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt 中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。用于ApoAl天然反義DA327409ext的用戶定制設(shè)計(jì)Taqman測定的引物和探針。大寫字母指示未修飾的脫氧核糖核苷酸。正向引物序列CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (SEQ ID NO :163) 反向引物序列 CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (SEQ ID NO 164 )
探針序列(FAM 標(biāo)記的)TTTGGATCTGGACGACTTC (SEQ ID NO :165)。原代猴肝細(xì)胞的處理。通過RxGen Inc.將原代猴肝細(xì)胞引入培養(yǎng)，并且在6孔板中鋪平板。它們?nèi)缦掠霉押塑账徇M(jìn)行處理。將6孔板中的培養(yǎng)基替換為由William’ s Medium E (Sigma目錄號W4128)組成的新鮮生長培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有5% FBS、50 U/ml青霉素和50 ug/ml鏈霉素、4 ug/ml胰島素、1 uM地塞米松、10 ug/ml菌纖維素(InVivogen， San Diego CA)。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ 1這種溶液與400 μ 1 Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco 目錄號 31985-070)和 4 μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號11668019)在室溫下孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有細(xì)胞的6孔板的每個孔。包括2 μ 1水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對照。在37°C和5% CO2下孵育3-18 小時后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時，去除培養(yǎng)基，并且使用來自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System (目錄號 ^3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號74181 )，根據(jù)制造商的說明書從細(xì)胞中提取 RNA。將600 ng RNA加入使用來自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過實(shí)時PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(用于18S目錄號4319413E，用于ApoAl Hs00163641_ml，和用于 ApoAl 反義 DA327409ext 的用戶定制設(shè)計(jì)測定，全部由 Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City CA)ο使用下述PCR循環(huán)使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10 分鐘，40個循環(huán)(95°C 15秒，60°C 1分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt 中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。根據(jù)制造商的說明書，使用MabTech Inc. ApoAl ELISA試劑盒目錄號3710_11_6 執(zhí)行 54。結(jié)果顯示于圖2、3、4和5中。圖2顯示如通過檢測到的ApoAl mRNA (上圖)和 ApoAl反義DA327409ext RNA(下圖)量測量的，具有硫代磷酸酯主鏈即核苷酸間鍵合的2種寡核苷酸和LNA寡核苷酸在調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)中是有效的。圖3顯示在用針對DA327409ext 設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理的H印G2細(xì)胞中的ApoAl mRNA (橙色條)和ApoAl反義DA327409ext RNA (藍(lán)色條)水平。圖4顯示在用針對DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理的IfepG2培養(yǎng)物中ApoAl mRNA(下圖)和蛋白質(zhì)(上圖)的劑量依賴性上調(diào)。圖5顯示在用針對DA327409ext 設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理后，在原代非洲綠猴肝細(xì)胞中ApoAl mRNA的上調(diào)。 實(shí)施例4 在原代非洲綠猴中CUR-962的功效和作用持續(xù)時間研究
這個研究的目的是評估且比較不協(xié)調(diào)非編碼反義序列的反義擊倒效應(yīng)，所述不協(xié)調(diào)非編碼反義序列在非人靈長類模型中在靜脈內(nèi)施用后調(diào)節(jié)APOAl基因。設(shè)計(jì)為抑制ApoAl調(diào)節(jié)序列的反義寡核苷酸測試物品命名為CUR-962。CUR-962 :+G*+C*T* A*G*T* C*T*G* +T*+T*+G (SEQ ID NO :170)。CUR-963 (對照)+G*+T*C* T*G*A* T*G*G* +A*+G*+A (SEQ ID N0:171)。調(diào)節(jié)測試指導(dǎo)
這個研究依照公認(rèn)的毒理學(xué)原理且遵照hternational Conference of Harmonization(ICH)Harmonized Tripartite GuidelinesCNon-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals ICH M3 (m),2000 November 9)和一般公認(rèn)用于治療劑測試的操作進(jìn)行設(shè)計(jì)。測試和對照物品測試物品鑒定和制備
測試物品CUR-962是化學(xué)上穩(wěn)定的反義寡核苷酸。用于靜脈內(nèi)遞送的載體是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。載體表征
對于PBS載體，組成、批號、有效期限和貯存條件(溫度和光/暗)得自供應(yīng)商。測試物品貯存和處理
測試物質(zhì)和載體根據(jù)相應(yīng)地由發(fā)起人和制造商提供的公認(rèn)貯存條件進(jìn)行貯存。測試物品制劑的分析
測試物品制劑的樣品將冷凍保存用于分析測試物質(zhì)制劑的濃度、穩(wěn)定性和同質(zhì)性。測試系統(tǒng)原理
靈長類是對于管理當(dāng)局可接受作為潛在危害指示劑的合適非嚙齒類物種，并且關(guān)于其的廣泛背景信息是可獲得的。非洲綠猴特別是多種人生理學(xué)和疾病狀態(tài)的高度臨床相關(guān)模型。靜脈內(nèi)施用途徑與可能的人治療途徑對應(yīng)。測試物品的劑量基于先前在非洲綠猴中執(zhí)行的類似化合物的劑量發(fā)現(xiàn)研究的結(jié)果。選擇非洲綠猴作為選擇的靈長類，因?yàn)闇y試物品的靶序列跨越物種是保守的，在靈長類中具有100%同源性。另外，測試物質(zhì)是合成寡核苷酸。因此，在靈長類中給藥允許這些化合物功效的優(yōu)良評估，所述化合物將比在任何其他物種中更反映在人中可能可見的攝取。動物
物種
Chlorocebus sa辦a<9"5·，非人靈長類。品種
St. Kitts本土非洲綠猴。來源
RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies。期望年齡測試動物是成年的。期望體重
猴重量約3-4 kg。實(shí)際范圍可以改變但將記錄在數(shù)據(jù)中。性別
測試動物是成年雌性。動物數(shù)目
篩選10只動物以確保適合于加入研究中的8只動物的鑒定。研究數(shù)目雌性8。關(guān)于研究數(shù)目的論證
這個研究設(shè)計(jì)為使用最少可能數(shù)目的動物，與評估測試物品在非洲綠猴中的治療功效的主要目標(biāo)和這類寡核苷酸在這個物種中的全身性施用的先前研究一致。動物規(guī)格
在研究中采用重量范圍3 - 4 kg的10只成年非洲綠猴。猴是從居住于島的野生群體中人道捕獲的首次用于藥物的成年動物。被捕獲猴用驅(qū)腸蟲劑(antihelminthics)處理，以消除任何可能的腸寄生蟲負(fù)荷，并且在就研究加入篩選前隔離觀察最低限度4周。被捕獲猴的年齡通過大小和齒形結(jié)構(gòu)進(jìn)行估計(jì)，從研究中排除年長動物。在研究加入前，對每只猴執(zhí)行臨床檢查，包括移動和靈巧評估。獲得血樣且送往Antech Diagnostics(Memphis,TN), 用于綜合臨床化學(xué)和全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和脂肪譜(參見關(guān)于規(guī)格的節(jié)段9. 2和319567擬8)。如通過與在Kitts集落中對于猴確定的正常范圍比較測定的，從研究中排除具有異常實(shí)驗(yàn)室值的猴。為了鑒定滿足這個標(biāo)準(zhǔn)的8只猴，篩選10只猴，根據(jù)需要篩選另外動物。在研究開始前，將選擇的猴轉(zhuǎn)移至個別籠，以適應(yīng)個別飼養(yǎng)一周時期。僅認(rèn)為適合于實(shí)驗(yàn)的動物將加入研究。在研究開始時的實(shí)際(或估計(jì))年齡和重量范圍將在原始數(shù)據(jù)和最后報(bào)告中詳述。動物健康與福利
遵循最高標(biāo)準(zhǔn)的動物福利且堅(jiān)持由Kitts農(nóng)業(yè)部(D印artment of Agriculture) 和美國衛(wèi)生和公眾服務(wù)部(U. S. Department of Health and Human Services)規(guī)定的指導(dǎo)。所有研究將依照這些要求以及用于實(shí)驗(yàn)動物管理和飼養(yǎng)的所有可應(yīng)用實(shí)踐規(guī)范進(jìn)行。 關(guān)于獸醫(yī)學(xué)管理、操作和審查的所有可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)如NIH動物管理和使用指導(dǎo)(Guide for the Care and Use of Animals)中包含的。St. Kitts設(shè)施保持如由指導(dǎo)要求的審查方案且檢查設(shè)施的動物研究委員會?；饡哂杏蓪?shí)驗(yàn)動物福利局(Office of Laboratory Animal Welfare)提交的批準(zhǔn)保證，如由指導(dǎo)#A4384_01 (Axion研究基金會(Research Foundation) /St. Kitts 生物醫(yī)學(xué)基金會(Biomedical Foundation))要求的。不存在由這個研究中指定的研究提出的專門非人靈長類獸醫(yī)學(xué)管理內(nèi)容和生物危害內(nèi)容。飼養(yǎng)和環(huán)境
為了允許檢測任何處理相關(guān)臨床體征，在手術(shù)前和手術(shù)后動物個別飼養(yǎng)直至處死時。 個別籠位于其中的靈長類建筑物完全由環(huán)境光照明，如U. S. D. H. H. S指導(dǎo)中推薦的，這在北緯17度約12小時12小時光-暗周期。RxGen靈長類建筑物完全通風(fēng)至室外。另外的空氣流動通過吊扇確保，以維持23-35°C的恒定靶溫度，如Kitts全年一般的。每天測量M小時溫度極端和相對濕度(這也將不受控制)。在研究過程中，籠定期進(jìn)行清潔。飲食和水
每只動物提供約90克/天的標(biāo)準(zhǔn)猴食物飲食(TekLad，Madison, WI )。記錄飲食的具體營養(yǎng)組成。水定期分析微生物純度。關(guān)于常備飲食和水供應(yīng)中可接受水平的污染物標(biāo)準(zhǔn)分別在由飲食制造商確定的分析規(guī)格和定期設(shè)施水評估內(nèi)。水符合對于證明為可接受用于人消耗所需的所有標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動物標(biāo)識和隨機(jī)化
借助于基于體重和血漿膽固醇譜的分層隨機(jī)化操作完成分配。在分配至組前和后，每只動物通過腹部上的紋身進(jìn)行鑒定。紋身置于所有集落動物上，作為在常規(guī)健康檢查過程中的鑒定方法。擬定籠計(jì)劃以鑒定在內(nèi)飼養(yǎng)的個體，并且個別猴通過與其分別籠附著的標(biāo)記標(biāo)簽進(jìn)一步鑒定。組大小、劑量和標(biāo)識號
動物分配至2個處理組，由每個組中的4只猴組成。根據(jù)設(shè)施編號系統(tǒng)，對每只猴提供專門動物標(biāo)識號。這個系統(tǒng)通過字母隨后為3個阿拉伯?dāng)?shù)字例如Y032獨(dú)特地鑒定每只猴。施用途徑和頻率
在靜脈內(nèi)遞送的第1、3和5天時，動物通過手動輸注經(jīng)過 10分鐘每天給藥一次。輸注率將是對mL/kg/小時。在給藥操作前和過程中，動物用氯胺酮和賽拉嗪進(jìn)行鎮(zhèn)靜。將靜脈導(dǎo)管(Terumo微型靜脈輸液裝置，20號針，或相似的合適輸液裝置)插入隱靜脈內(nèi)。給藥在每只猴中在8:00和10:00 a. m之間發(fā)生，在動物醒來后不久且在進(jìn)食前。如下文血液化學(xué)節(jié)段中所述，僅在每次輸注前收集血樣，以評估血漿膽固醇和其他脂質(zhì)水平。采血在2 次取樣間隔時的進(jìn)食前，以使飲食對膽固醇測量的作用降到最低。臨床觀察在每天給藥時記錄治療反應(yīng)的所有可見體征。此外，動物就物理屬性例如外表和一般狀況每周檢查至少一次。體重
在處理過程中和處理后時期以每周間隔記錄體重。食物消耗
不定量個體食物消耗。然而，監(jiān)控進(jìn)食方式且作出任何較大改變的備注。死亡率和發(fā)病率
將記錄死亡率和發(fā)病率。在研究負(fù)責(zé)人和可能的發(fā)起人的監(jiān)控科學(xué)家商量后，作出關(guān)于過早處死的任何決定。將對發(fā)現(xiàn)死亡或被過早殺死的動物實(shí)施尸檢，收集肝臟、腎、心臟和脾肺組織用于組織病理學(xué)。在過早處死的事件中，還將獲取血樣(可能時)且測定參數(shù)。 在固定工作時間后發(fā)現(xiàn)死亡的動物將冷凍過夜，且在下一個工作日開始時執(zhí)行尸檢。如果動物狀況需要過早處死，那么它將通過靜脈內(nèi)過劑量的戊巴比妥鈉實(shí)施安樂死。所有研究受動物使用原則(Principles for Use of Animals)控制。RxGen由法律要求遵照美國衛(wèi)生和公眾服務(wù)部靈長類設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，這指示必須遵守在這個研究內(nèi)指定為溫和的操作的嚴(yán)重性水平。臨床實(shí)驗(yàn)室研究血樣
在處理前從所有動物獲得3個血樣，以確定血漿膽固醇基線。在處理后收集血樣且經(jīng)由淺表靜脈穿刺獲取。在任何一個取樣時間點(diǎn)時收集的體積不超過8 ml，這代表成年猴的約4%總血容量。動物在2個基線時間點(diǎn)時以及在研究第1、3、5、7、9、11、13和15天時具有抽血，伴
隨如果意識到擾動那么其后繼續(xù)的 每周收集，直至組1中的血漿膽固醇標(biāo)準(zhǔn)化(ApoAl)。 在第1、6和11天時收集8毫升血液，以允許評估臨床化學(xué)、脂質(zhì)譜和凝固譜。在所有其他天數(shù)時，僅收集足夠用于臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜的5毫升血液。在進(jìn)行化學(xué)和血液學(xué)測量當(dāng)天將血樣分成3份。將一個樣品收集到包含25 μ 1肝素的血漿收集管內(nèi)，并且標(biāo)記有研究編號、劑量水平、天數(shù)、日期、獨(dú)特動物標(biāo)識號。在分離后，取出1毫升血漿至攜帶上述細(xì)節(jié)的無菌凍存管，且適當(dāng)貯存直至運(yùn)送用于血液化學(xué)分析。取出一個血液等分試樣(0. 5毫升)至標(biāo)記有上述細(xì)節(jié)的無菌凍存管，且適當(dāng)貯存直至運(yùn)送用于血漿膽固醇分布和載脂蛋白分析。使另外1毫升和0. 5毫升血漿等分試樣速凍且貯存于液氮中，以充當(dāng)備份樣品用于可能的另外分析。2個另外的全血樣等分試樣(各2. 5毫升)用酸性檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)抗凝劑處理且標(biāo)記，并且貯存于4°C直至運(yùn)送用于下文詳述的凝固和CBC測量。運(yùn)送樣品以在取樣M小時內(nèi)達(dá)到，或在穩(wěn)定條件下貯存用于在確定合適的時間時運(yùn)送。僅在取樣方法或測定方法被認(rèn)為超出正常質(zhì)量限制范圍時獲取重復(fù)樣品。將樣品獲取到標(biāo)記管內(nèi)。血液學(xué)
對在第1、6和11天時(以及如果在這些時間點(diǎn)中的任何時檢測到擾動的另外天時)收集的所有樣品測量全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)、凝血酶原時間、PTT、纖維蛋白原和D-二聚體。對在
43包含EDTA的真空采血管中收集的1毫升全血評估血細(xì)胞計(jì)數(shù)。對在包含酸性檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)抗凝劑的真空采血管中收集的約2. 0毫升血液執(zhí)行凝固譜測定。血液化學(xué)
葡萄糖、血尿素氮、肌酸酐、總蛋白質(zhì)、白蛋白、總膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽固醇、鈣、磷、鈉、鉀、氯化物、A/G比值、BUN/肌酸酐 (計(jì)算的)、球蛋白(計(jì)算的)、脂肪酶、淀粉酶、甘油三酯、CPK、乳酸脫氫酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 (GGT)、鎂、總膽固醇 LDL、VLDL、HDL、ApoAl、ApoA2、ApoB、ApoE、ApoLp (a)。對每一個血菜樣品進(jìn)行超化學(xué)(superchemistries)以及LDL和HDL測量。在評估LDL和HDL數(shù)據(jù)后，對選擇樣品進(jìn)行載脂蛋白測量。對約1. O mL血漿執(zhí)行測定用于超化學(xué)測量，且對0. 5ml血漿執(zhí)行測定用于膽固醇分布和載脂蛋白測量。收集另外的血漿等分試樣且貯存用于可能的未來分析。肝臟活組織檢查
在基線時以及在第7和17天時，對所有猴執(zhí)行經(jīng)皮肝臟穿刺活組織檢查。將采用14號活組織檢查針(INRAD)，以獲得來自肝臟右和左葉的2個中心活組織檢查(長度 1. O cm)。 在如下所述的再分前，通過在活組織檢查針上的活組織檢查樣品的目視檢查證實(shí)成功的活組織檢查。合并樣品且隨后以下述方式分開。將來自左葉的一個活組織檢查的一半廣0.5 cm)浸入多聚甲醛中，用于切片用于組織病理學(xué)和原位分析。緊將每個分開活組織檢查的其余一半以及其他2個完整的活組織檢查浸入包含2 mis RNAlater (Qiagen)的標(biāo)記凍存管中，并且在4°C下孵育過夜，這之后抽吸RNAlater且使樣品管在液氮中速凍。在液氮中轉(zhuǎn)運(yùn)后，采用iTrizol或TriReagent法分離總RNA，具有 40 μ g/1. O cm 14 g中心活組織檢查的期望得率(對于衍生自來自單只猴的所有4個合并中心活組織檢查的合并RNA總共 ^80-100 μ g，不存在保存用于組織病理學(xué)和原位的組分)。5yg RNA餾分用于靶特異性實(shí)時qPCR (TaqMan miRNA測定，ABI )。其余RNA餾分保存用于可能的全基因組表達(dá)分析。處理固定組織用于石蠟包埋。切片染色用于H&E和在肉眼組織學(xué)發(fā)現(xiàn)下報(bào)告的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。在這個工作中生成的所有載玻片攜帶具有研究編號、劑量水平、天數(shù)、日期、 獨(dú)特動物標(biāo)識號的標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)
執(zhí)行關(guān)于血液學(xué)、臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜的描述統(tǒng)計(jì)學(xué)。對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合適生物信息學(xué)分析。樣本大小
基于給非洲綠猴施用修飾反義寡核苷酸且產(chǎn)生臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜改變的先前實(shí)驗(yàn)和相關(guān)變異性進(jìn)行樣本大小測定。用于功效評估的受試者總數(shù)目是20只加入的(enrolled) 動物，其中4只動物/處理組，和4只另外篩選的動物。結(jié)果
結(jié)果顯示于下述圖中。圖6 如分別通過實(shí)時PCR和ELISA測定的(2個左圖)，與基線水平比較，在用⑶R-962針對ApoAl反義DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理后，在猴肝臟活組織檢查中增加的ApoAl mRNA (上圖)和蛋白質(zhì)(下圖)水平。在用在體外顯示對ApoAl水平?jīng)]有作用的寡核苷酸(⑶R-963，2個右圖)給藥的對照組中相同時間段后，ApoAl mRNA和蛋白質(zhì)水平不改變。盡管本發(fā)明已就一個或多個實(shí)現(xiàn)而言舉例說明且描述，但在閱讀和理解本說明書和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到等價改變和修飾。此外，雖然本發(fā)明的特定特征可以就幾個實(shí)現(xiàn)中的唯一一個而言公開，但此類特征可以與其他實(shí)現(xiàn)的一個或多個其他特征組合， 如對于任何給定或特定應(yīng)用可以是所需和有利的。公開內(nèi)容的摘要將允許讀者快速確定技術(shù)公開內(nèi)容的性質(zhì)。在理解上認(rèn)為它將不用于解釋或限制下述權(quán)利要求范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(apolipoprotein，ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與多核苷酸的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID N0:2的核苷酸1-932內(nèi)的5 - 30個連續(xù)核苷酸(圖8);從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。
2.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。
3.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與針對載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)。
4.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的天然反義的區(qū)域的反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸功能和/ 或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中相對于對照，所述載脂蛋白(ApoAl)的表達(dá)和/或功能在體內(nèi)或體外增加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向包括載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包括一種或多種修飾，其包括修飾的糖部分、修飾的核苷間鍵合、修飾的核苷酸和/或其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述修飾的糖部分包括2’-O-甲氧基乙基修飾的糖部分、 2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分或二環(huán)糖部分。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述修飾的核苷間鍵合包括硫代磷酸酯、2’-O-甲氧基乙基(M0E)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、 碳酸酯、磷酸三酯、亞氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述寡核苷酸任選具有至少一種修飾的核苷酸，其包括肽核酸、鎖核酸(LNA)分子、阿糖核酸(FANA)、肽核酸(PNAs)、其類似物或衍生物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸包括核心序列g(shù)ctagt(SEQ ID NO、172)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO=Sl - 173所示的至少一個寡核苷酸序列。
15.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)基因表達(dá)和/ 或功能的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度5 - 30個核苷酸的小干擾RNA (siRNA)寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸對于載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義多核苷酸具有特異性，其中所述寡核苷酸與所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義和/或正義核酸分子的至少約5個連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)基因表達(dá)和/或功能。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述寡核苷酸與所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義和/或正義核酸分子的至少約5個連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少80%序列同一性。
17.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)基因表達(dá)和/ 或功能的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長度約5 - 30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對于編碼載脂蛋白(ApoAl)分子的多核苷酸的正義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列具有特異性，其中所述反義寡核苷酸與如SEQ ID NO=Sl - 173所示的至少一個核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中的載脂蛋白(ApoAl)基因表達(dá)和/或功能。
18.—種包括至少一種修飾的合成的、修飾的寡核苷酸，其中所述修飾包括下述中的至少一種核苷酸間鍵合烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亞氨酸乙酯、羧甲基酯或其組合，其中與正常對照比較， 所述寡核苷酸是在體內(nèi)或體外與載脂蛋白(ApoAl)分子雜交，且調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能的反義化合物。
19.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合和選自下述的至少一個核苷酸間鍵合的組合烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亞氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其組合。
20.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵I=I O
21.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的主鏈。
22.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸任選包括至少一種修飾的核苷酸，其包括肽核酸，鎖核酸(LNA)分子，其類似物、衍生物和/或組合。
23.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括修飾的糖部分，其包括2’-O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分或二環(huán)糖部分。
24.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸長度至少約5- 30個核苷酸，并且與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的正義和/或反義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義和/或正義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%序列同一性。
25.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的反義和/或正義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約 80%序列同一性。
26.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中與正常對照比較，所述寡核苷酸在體內(nèi)或體外與至少一種載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸雜交，且調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
27.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括核心序列g(shù)ctagt(SEQ ID NO 172)。
28.權(quán)利要求18的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO 81 - 173所示的序列。
29.一種組合物，其包括對于載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸具有特異性的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括其反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體或片段。
30.權(quán)利要求四的組合物，其中所述寡核苷酸包括與如SEQID NO=Sl - 173所示的任何一個核苷酸序列比較至少約40%的核苷酸序列同一性。
31.權(quán)利要求四的組合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQID NO 1 - 173所示的寡核苷酸序列。
32.權(quán)利要求觀的組合物，其中如SEQID NO 81 - 173所示的所述寡核苷酸序列包括一種或多種修飾的或取代的核苷酸。
33.權(quán)利要求四的組合物，其中所述修飾的核苷酸包括修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子。
34.一種預(yù)防或治療與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，其包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，其與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，且調(diào)節(jié)所述載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
35.權(quán)利要求34的方法，其中與載脂蛋白(ApoAl)多核苷酸相關(guān)的疾病包括心血管病癥、膽固醇、糖尿病、心臟病、關(guān)節(jié)炎、炎癥、神經(jīng)性疾病或病癥、自身免疫疾病、癌癥或肥胖。
36.一種鑒定和選擇寡核苷酸用于體內(nèi)施用的方法，其包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包括至少5個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，其與所述鑒定的多核苷酸互補(bǔ)或處于反義方向；和在嚴(yán)格雜交條件下測量在反義寡核苷酸和靶多核苷酸結(jié)合之間的熱解鏈溫度；和，鑒定和選擇寡核苷酸用于體內(nèi)施用。
全文摘要
寡核苷酸化合物調(diào)節(jié)載脂蛋白(ApoA1)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。用于治療與載脂蛋白-A1(ApoA1)相關(guān)的疾病的方法包括給患者施用設(shè)計(jì)為抑制Apo-A1天然反義轉(zhuǎn)錄物的一種或多種寡核苷酸化合物。
文檔編號C12N15/113GK102239260SQ200980148401
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者J·科拉德, O·霍爾科瓦 申請人:歐科庫爾納有限責(zé)任公司