專利名稱：△-8去飽和酶基因、由其編碼的酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼Δ -8去飽和酶的分離的多核苷酸、由分離的多核苷酸編碼的 Δ -8去飽和酶、包含分離的多核苷酸的表達載體、包含表達載體的宿主細胞和用于產(chǎn)生 Δ -8去飽和酶和多不飽和脂肪酸的方法。背景
多不飽和脂肪酸(PUFAs)在所有生命形式的正確功能中起很多作用。例如PUFAs是細胞質(zhì)膜的重要組分，它們在其中以磷脂的形式發(fā)現(xiàn)。PUFAs對于嬰兒腦的正確發(fā)育以及對于成熟哺乳動物中的組織形成和修復(fù)是必需的。許多酶，最顯著地去飽和酶和延長酶(elongase)與PUFA生物合成有關(guān)(參見圖 1)。去飽和酶催化在底物的脂肪酸烷基鏈內(nèi)的碳原子之間引入不飽和(例如，雙鍵)。延長酶催化2-碳單位對脂肪酸底物的添加。例如，亞油酸(LA，18:2n-6)通過Δ 12-去飽和酶由油酸((^，18:111-9)產(chǎn)生。二十碳二烯酸(EDA，20: &1-6)通過Δ 9-延長酶由LA產(chǎn)生。二高 Y -亞麻酸(DGLA，20 3n-6 )通過Δ 8-去飽和酶由EDA產(chǎn)生(參見

圖1)?；ㄉ南┧?ARA， 20:4η-6)通過Δ 5-去飽和酶由DGLA產(chǎn)生(參見圖1)。許多重要的長鏈PUFAs是本領(lǐng)域已知的。例如，最重要的長鏈PUFAs之一是二十碳五烯酸(EPA)。EPA在真菌和海洋油類(marine oil)中發(fā)現(xiàn)。第二種重要的長鏈PUFA是二十二碳六烯酸(DHA)。DHA最通常在魚油中發(fā)現(xiàn)，并且還可以從哺乳動物腦組織中純化。 第三種重要的長鏈PUFA是ARA。ARA在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)，并且還可以從哺乳動物組織包括肝和腎上腺中純化。ARA, EPA和/或DHA可以經(jīng)由可替代的Δ 8_去飽和酶/ Δ 9_延長酶途徑或常規(guī)Δ 6-去飽和酶途徑產(chǎn)生(參見圖1)。在用于產(chǎn)生長鏈PUFAs特別是ARA、EPA和DHA的常規(guī)Δ 6途徑中對底物脂肪酸有活性的延長酶先前已得到鑒定。用于將LA轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA 和將α-亞麻酸(ALA)轉(zhuǎn)變成ω3_ 二十碳四烯酸(ω3_ΕΤΑ)的常規(guī)Δ 6_去飽和酶途徑利用Δ 6-去飽和酶，以將LA轉(zhuǎn)變?yōu)棣?-亞麻酸(GLA)和將ALA轉(zhuǎn)變?yōu)槭颂妓南┧?(stearidonic acid) (SDA)；且利用C18-延長酶以將GLA轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA和將SDA轉(zhuǎn)變?yōu)?ω3_ΕΤΑ。然而，在特定情況下，可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9_延長酶可以優(yōu)選超過常規(guī) Δ 6-去飽和酶途徑。例如，如果在DGLA、ARA、ω3-ΕΤΑ、ΕΡΑ、ω3- 二十二碳五烯酸(DPA)和 /或DHA的生產(chǎn)過程中不需要特定殘留的ω-6或ω-3脂肪酸中間物，例如GLA或SDA，那么可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑可以用作常規(guī)Δ 6-去飽和酶途徑的替代途徑， 以回避GLA和SDA形成。Δ 8-去飽和酶在這個途徑中有用，這是因為它們在第八個和第九個碳原子(從分子的羧基末端開始編號)之間使脂肪酸去飽和，并且可以例如催化ω6_二十碳二烯酸(EDA)至 DGLA 和 / 或 ω 3-二十碳三烯酸(eicosatrienoic acid) (co3_ETrA)至 ω 3-ΕΤΑ的轉(zhuǎn)變。因此，本領(lǐng)域需要可以用于產(chǎn)生長鏈PUFAs的Δ 8_去飽和酶的新來源。發(fā)明概述
在一個方面，本發(fā)明涉及包括核苷酸序列或與核苷酸序列互補的分離的核苷酸酸或其片段，所述核苷酸序列編碼具有去飽和酶活性的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與包括SEQ ID N0:29的氨基酸序列具有至少55%序列同一性。分離的核酸或其片段編碼功能上活性的Δ 8-去飽和酶，其利用ω 6-二十碳二烯酸或ω 3-二十碳三烯酸作為底物。這種分離的核酸序列可以衍生自海洋球石藻(^wViaz7a AMh_Fi)，優(yōu)選地海洋球石藻CCMP 378。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的核苷酸序列或其片段，其包括選自SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30 的核苷酸序列的至少55%互補。分離的核苷酸序列或其片段編碼功能上活性的Δ 8-去飽和酶，其利用ω 6-二十碳二烯酸或ω 3-二十碳三烯酸作為底物。分離的核苷酸序列可以具有SEQ ID Ν0:28的序列。可替代地，分離的核苷酸序列可以具有SEQ ID Ν0:30的序列。 分離的核苷酸序列可以衍生自海洋球石藻，優(yōu)選地海洋球石藻CCMP 378。在另一個方面，本發(fā)明涉及表達載體。本發(fā)明的表達載體包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括選自SEQ ID NO:觀和SEQ ID NO:30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID NO:觀和SEQ ID N0:30的核苷酸序列的至少55% 互補。在再進一步的方面，本發(fā)明涉及包括上述表達載體的宿主細胞。宿主細胞可以是真核細胞。具體地，真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞?？梢允褂玫恼婢毎睦邮沁x自下述的真菌細胞糖酵母屬(fecdaroffij^M)物種、假絲酵母屬(Candida )物種、油脂酵母屬Uipomyces)物種、耶氏酵母屬(Yarrowia )物種、克魯維氏酵母屬(Jluyveromyces、物種、漢遜氏酵母屬Q(mào)iansenuIa、輪、曲霉屬(AspergiIlus) 物種、青霉屬Q(mào)Penicillium )物種、鏈孢霉屬、Neurospora )物種、木霉屬(Trichoderma ) 物種和畢赤氏酵母屬O0Zdia)物種?？梢允褂玫闹参锛毎睦舆x自大豆、蕓苔屬 (Sra^ica)物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻。在另外一個方面，本發(fā)明涉及包含上述表達載體的植物細胞、植物種子、植物或植物組織，其中所述載體的核苷酸序列的表達導(dǎo)致通過植物細胞、植物種子、植物或植物組織產(chǎn)生至少一種多不飽和脂肪酸。由所述表達載體產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸選自花生四烯酸 (ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二高-Y-亞麻酸(DGLA)或ω 3-二十碳四烯酸(ω 3-ΕΤΑ)及其組合。在另外一個方面，本發(fā)明涉及由上述植物細胞、植物種子、植物或植物組織產(chǎn)生的一種或多種植物油或脂肪酸。在另外一個方面，本發(fā)明涉及通過核苷酸序列編碼的純化的多肽，所述核苷酸序列包括選自SEQ ID N0J8和SEQ ID Ν0:30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID N0:28和SEQ ID N0:30的核苷酸序列的至少55%互補。在另外一個方面，本發(fā)明涉及純化的多肽，其在底物碳原子8和碳原子9之間使20 碳長多不飽和脂肪酸(C20-PUFA)底物去飽和，并且其中所述多肽與包括SEQ ID N0:29的
氨基酸序列具有至少氨基酸同一性。在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID N0J9的氨基酸序列的純化的多肽。在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生Δ 8-去飽和酶的方法。該方法包括步驟
a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少55%互補的核苷酸序列=SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30 ；
b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的分離的核苷酸序列的表達載體；
和
c)將表達載體引入宿主細胞內(nèi)一段時間且在足以產(chǎn)生Δ8-去飽和酶的條件下。在上述方法中，宿主細胞是真核細胞。具體地，真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞?？梢允褂玫恼婢毎睦邮沁x自下述的真菌細胞糖酵母屬物種、假絲酵母屬物種、油脂酵母屬物種、耶氏酵母屬物種、克魯維氏酵母屬物種、漢遜氏酵母屬物種、曲霉屬物種、青霉屬物種、鏈孢霉屬物種、木霉屬物種和畢赤氏酵母屬物種?？梢允褂玫闹参锛毎睦舆x自大豆、蕓苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻。在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其包括步驟
a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少 55%互補的核苷酸序列=SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30 ；
b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的分離的核苷酸序列的表達載
體；
c)將表達載體引入宿主細胞內(nèi)一段時間且在足以產(chǎn)生Δ8-去飽和酶的條件下；和
d)使表達的Δ8-去飽和酶暴露于選自下述的底物ω 6- 二十碳二烯酸、ω 3_ 二十碳三烯酸及其組合，以將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物多不飽和脂肪酸。在上述方法中，產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是二高-Y -亞麻酸(DGLA)、ω 3_ 二十碳四烯酸(ω3_ΕΤΑ)或其任何組合。另外，上述方法可以進一步包括步驟
使產(chǎn)物多不飽和脂肪酸暴露于至少一種另外的去飽和酶或延長酶，以將產(chǎn)物多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N或另外的多不飽和脂肪酸。所產(chǎn)生的產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ)、二十二碳五烯酸(DPA)或二十二碳六烯酸(DHA)或其任何組
口 O在另外一個方面，本發(fā)明涉及用于在宿主細胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其包括步驟
a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少 55%互補的核苷酸序列=SEQ ID NO:28禾口 SEQ ID NO:30 ；
b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的分離的核苷酸序列的表達載
體；
c)將來自b)的表達載體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體引入宿主細胞內(nèi)，所述至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體包括編碼Δ 9-延長酶的與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的分離的核苷酸序列；
d)使表達的Δ8-去飽和酶和Δ 9-延長酶暴露于選自下述的底物亞油酸(LA)、α -亞麻酸(ALA)及其組合，以將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物多不飽和脂肪酸。在上述方法中，產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是二高-Y-亞麻酸(DGLA)或ω3_ 二十碳四烯酸(ω3_ΕΤΑ)或其任何組合。上述方法可以進一步包括步驟使產(chǎn)物多不飽和脂肪酸暴露于至少一種另外的去飽和酶或延長酶，以將產(chǎn)物多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N或另外的多不飽和脂肪酸。所產(chǎn)生的產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或其任何組
口 O在上述方法中，宿主細胞是真核細胞。具體地，真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞?？梢允褂玫恼婢毎睦邮沁x自下述的真菌細胞糖酵母屬物種、假絲酵母屬物種、油脂酵母屬物種、耶氏酵母屬物種、克魯維氏酵母屬物種、漢遜氏酵母屬物種、曲霉屬物種、青霉屬物種、鏈孢霉屬物種、木霉屬物種和畢赤氏酵母屬物種?？梢允褂玫闹参锛毎睦舆x自大豆、蕓苔屬物種、紅花、向日葵、玉蜀黍、棉花和亞麻。附圖簡述
圖1顯示脂肪酸生物合成途徑和Δ 8-去飽和酶在這個途徑中的作用。圖2Α和2Β顯示由ED3-8 (SEQ ID NO: 29)編碼的氨基酸序列與來自路氏巴夫 KPavlova lutheri) CCMP 459 (SEQ ID NO:2)、鹽生巴夫藻G0aWora salina) (SEQ ID NO: 3)、細小裸藻gracialis) (SEQ ID NO: 1)和派金蟲屬(/^rh·/ 仰s) (SEQ ID N0:4)的已知Δ 8-去飽和酶的比對。等同殘基突出顯示，保守組氨酸框(box)是有下劃線的，細胞色素沾結(jié)構(gòu)域中的保守區(qū)是有下劃線的(雙線)。圖3A顯示來自細小裸藻的Δ 8-去飽和酶氨基酸序列(登記# AF139720，SEQ ID Ν0:1)。圖:3Β顯示來自路氏巴夫藻CCMP 459的Δ8_去飽和酶氨基酸序列(SEQ ID Ν0:2)。圖4A顯示來自鹽生巴夫藻的Δ 8-去飽和酶氨基酸序列(登記# DQ995518，SEQ ID N0:3)。圖4B顯示來自海水派金蟲iPerkinsus aari/ws )的Δ 8_去飽和酶氨基酸序列(登記# DQ508730, SEQ ID Ν0:4)。圖4C顯示來自卡氏棘變形蟲(Acanthamoenba cast el Iani )的Δ 8-去飽和酶氨基酸序列(登記 # CS608483, SEQ ID Ν0:5)。圖5顯示如實施例2中所述獲得的克隆ED3-8的DNA序列(SEQ ID N0:11)。圖6顯示如實施例2中所述獲得的克隆ED3-8的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。圖7A顯示如實施例2中所述獲得的克隆H(15的DNA序列(SEQ ID N0:15)。圖7B顯示如實施例2中所述獲得的克隆H(15的氨基酸序列(SEQ ID N0:16)。圖8A顯示如實施例2中所述獲得的克隆ED3-8推定的3’ -末端的DNA序列(SEQ ID N0J4)。圖8B顯示如實施例2中所述獲得的克隆ED3-8推定的3’ -末端的氨基酸序列(以出現(xiàn)的次序分別為SEQ ID N0S: 25和44-46)。圖9顯示來自海洋球石藻CCMP 378的推定的Δ 8_去飽和酶的12Μ堿基對基因序列(SEQ ID Ν0:28)。圖10顯示由來自海洋球石藻CCMP 378的推定的Δ 8_去飽和酶的12Μ堿基對基因序列(SEQ ID Ν0:28)編碼的417氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ ID N0:29)。圖11顯示來自海洋球石藻CCMP 378的推定的Δ 8_去飽和酶的密碼子最佳化基因序列(SEQ ID吣:30)，指定為坨03-84卩2-5-5(，。ED3-8-EP2-5-SC與原始ED3-8基因序列(SEQ ID而:28;圖9)共享66.98%序列同一性。密碼子最佳化的基因中的修飾無一改變編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 29 ；圖10)。圖12顯示衍生自綠光等鞭金藻(i^cArpis galbana ) (IsoD9)的Δ 9_延長酶的基因序列(登記號CQ831422，SEQ ID Ν0:31)。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及來自球石藻屬物種(Mniliana sp.)的Δ 8_去飽和酶基因的核苷酸(例如基因)和翻譯的氨基酸序列，例如海洋球石藻，具體地海洋球石藻CCMP 378。此外，本發(fā)明包括基因和由這種基因編碼的酶的用途。例如，核苷酸和相應(yīng)酶可以用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸，例如DGLA、ARA, ΕΡΑ、ω 3-ETA DPA和DHA或其任何組合，其可以添加到藥物組合物、 營養(yǎng)組合物和其他有價值產(chǎn)物中。Α.定義
如本文使用的，單數(shù)形式“a” “an”和“the”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明確說明。 對于本文數(shù)字范圍的敘述，明確預(yù)期了在那之間具有相同精確度的每個插入數(shù)字。例如，對于范圍6-9，除6和9外還預(yù)期了數(shù)字7和8，并且對于范圍6. 0-7. 0，明確預(yù)期了數(shù)字6. 0、 6. 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。a)蕓苔屬物種
如本文使用的，短語“蕓苔屬物種”指芥菜iBmssica j^cea)、歐洲油菜(Ara^ica napus )、埃塞俄比亞芥(.Brassica carina ta、、甘藍(.Brassica oleracea )、黑芥(.Brassica fligra)、禾口蕓苔campestris)的任何植物。b)嵌合構(gòu)建體
如本文使用的，短語“嵌合構(gòu)建體”指在自然界中正常未發(fā)現(xiàn)在一起的核酸分子組合。 因此，嵌合構(gòu)建體可以包括衍生自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或衍生自相同來源但以不同于在自然界中正常發(fā)現(xiàn)那種的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。C)編碼序列
如本文使用的，術(shù)語“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！罢{(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、其內(nèi)或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。d)密碼子最佳化的
“密碼子最佳化的”當與基因或核酸分子結(jié)合使用時，指使其密碼子選擇頻率設(shè)計為模擬宿主細胞的優(yōu)選密碼子選擇頻率的基因或核酸分子。e)互補性
如本文使用的，術(shù)語“互補性”指2個DNA區(qū)段之間的關(guān)聯(lián)性程度。它通過測量一個 DNA區(qū)段的有義鏈在合適條件下與另一個DNA區(qū)段的反義鏈雜交以形成雙螺旋的能力進行測定。在雙螺旋中，腺嘌呤在一條鏈中出現(xiàn)，胸腺嘧啶在另一條鏈中出現(xiàn)。類似地，無論哪里在一條鏈中發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤，在另一條中都發(fā)現(xiàn)胞嘧啶。2個DNA區(qū)段的核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性越大，2個DNA區(qū)段的鏈之間形成雜交雙鏈體的能力越大。f)由……編碼、雜交和嚴格條件如本文使用的，短語“由……編碼”指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含來自由核酸序列編碼的多肽的至少3個連續(xù)氨基酸、更優(yōu)選至少8個連續(xù)氨基酸、且更加優(yōu)選至少15個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明還包含分離的核苷酸序列，其編碼具有PUFA去飽和酶活性的酶，并且在嚴格條件下可與具有這樣的核苷酸序列的核酸雜交，所述核苷酸序列包括包含SEQ ID NO:28 或SEQ ID NO: 30的核苷酸序列，或與包含SEQ ID N0J8或SEQ ID N0:30的核苷酸序列互補(參見圖9和11)。當在溫度和離子強度的合適條件下，單鏈形式的核酸分子可以與另一個核酸分子退火時，核酸分子可與另一個核酸分子“雜交”(參見，Sambrook等:K,Molecular Cloning A Laboratory Manual, ^lK (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York))。溫度和離子強度的條件決定雜交的“嚴格性”?！半s交” 要求2種核酸包含互補序列。然而，依賴于雜交的嚴格性，可以發(fā)生在堿基之間的錯配。用于使核酸雜交的合適嚴格性依賴于核酸長度和互補程度。此種變量是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。更具體而言，2個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，關(guān)于具有這些序列的核酸雜交物(hybrid)的Tm值越大。對于長度超過100個核苷酸的雜交物，已衍生出用于計算Tm的等式(參見Sambrook等人，同上)。對于具有較短序列的雜交，錯配的位置變得更重要，并且寡核苷酸的長度決定其特異性(參見Sambrook等人，同上)。一般地，嚴格條件將是這樣的，其中在pH 7. O - 8. 3下鹽濃度小于約1. 5 M Na離子，一般約0.01 - 1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)，并且溫度對于短探針(例如10 - 50個核苷酸)是至少約30°C，并且對于長探針(例如超過50個核苷酸)是至少約60°C。嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到。低嚴格條件的例子包括在37°C具有30 -35%甲酰胺、1 M NaClU % SDS (十二烷基硫酸鈉)緩沖溶液的雜交，和在50 - 55°C在1 X -2 X SSC (20 X SSC=3. O M NaCl/0. 3 M檸檬酸三鈉)中的洗滌。中等嚴格條件的例子包括在37°C在40 - 45%甲酰胺、1 M NaCl、l% SDS中的雜交，和在55 - 60°C在0. 5 X - 1 X SSC中的洗滌。高嚴格條件的例子包括在37°C在50%甲酰胺、1 M NaCl、1% SDS中的雜交，和在60 - 65°C在0. 1 X SSC中的洗滌。g)外顯子
如本文使用的，術(shù)語“外顯子”指基因序列的部分，其被轉(zhuǎn)錄且在衍生自基因的成熟信使RNA中發(fā)現(xiàn)，但不必定是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的部分。h)表達、反義抑制和共抑制
如本文使用的，術(shù)語“表達”指功能終產(chǎn)物的產(chǎn)生?；虻谋磉_涉及基因轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。如本文使用的，術(shù)語“反義抑制”指能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。如本文使用的，術(shù)語“共抑制”指能夠抑制等同或基本上相似的外來或內(nèi)源基因表達的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(參見美國專利號5，231，020)。i)其為功能上等價的片段或亞片段
術(shù)語“其為功能上等價的片段或亞片段”和“功能上等價的片段或亞片段”在本文中可互換用于指分離的核酸分子的部分或子序列，其中無論片段或亞片段是否編碼活性酶，保留改變基因表達或產(chǎn)生特定表型的能力。例如，片段或亞片段可以用于設(shè)計嵌合構(gòu)建體，以
9在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生所需表型。嵌合構(gòu)建體可以設(shè)計用于在共抑制或反義抑制中使用，其通過以相對于植物啟動子序列的合適方向連接核酸片段或其亞片段(無論它是否編碼活性酶)來實現(xiàn)。j)基因、天然基因和轉(zhuǎn)基因
如本文使用的，術(shù)語“基因”指表達特異性蛋白質(zhì)的核酸分子，包括在編碼序列前(5’ 非編碼序列)和后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。如本文使用的，短語“天然基因”指如在自然界中與其自身調(diào)節(jié)序列一起發(fā)現(xiàn)的基因。如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指已通過轉(zhuǎn)化程序引入基因組內(nèi)的基因。k)棉屬(Gom雙i腫)物種
如本文使用的，短語“棉屬物種，，指樹棉(Gossypium arboreum )、海島棉(Gossypium barbadense)> 草徹、Gossypium herbaceum、、 陸地 徹、Gossypium hirsutum、、 Gossypium hirsutum var Aii^swia 、陸地棉瑪_力口蘭特變禾中(Gos1Sj^ittT hirsutum var marie-galante)、Gossypium Iapideum、斯特提豐帛(Gossypium sturtianum)、Gossypium tkuberi、瑟伯氏 iGossypium thurberi )> 夏威夷場(Mossypium tomen tosum)> 或 Gossypium tormen tosum ^7SrMiSiItlo1)同源性
術(shù)語“同源性”、“同源的”、“基本上相似的”和“基本上相應(yīng)的”在本文中可互換使用并且指核酸分子，其中在一個或多個核苷酸堿基中的改變不影響核酸分子介導(dǎo)基因表達或產(chǎn)生特定表型的能力。這些術(shù)語還指本發(fā)明的核酸分子的修飾，例如一個或多個核苷酸的缺失或插入，相對于初始、未修飾的分子，所述修飾基本上不改變所得到的核酸分子的功能性質(zhì)。因此應(yīng)當理解，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，本發(fā)明包含超過具體示例性序列。m)宿主細胞
如本文使用的，短語“宿主細胞”意指包括本發(fā)明的分離的核酸序列或其片段的細胞。 宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌(Escherichia coli )、藍細菌和枯草芽孢桿菌 {Bacillus ·5油iihi))、或真核細胞(例如真菌、昆蟲、植物或哺乳動物細胞)。可以使用的真菌細胞的例子是糖酵母屬物種、假絲酵母屬物種、油脂酵母屬物種、耶氏酵母屬物種、克魯維氏酵母屬物種、漢遜氏酵母屬物種、曲霉屬物種、青霉屬物種、 鏈孢霉屬物種、木霉屬物種和畢赤氏酵母屬物種。特別優(yōu)選的真菌細胞是啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。植物細胞可以是單子葉或雙子葉植物細胞。特別優(yōu)選的植物細胞來自大豆 {Glycine max)(例如大豆)、蕓苔屬物種、紅花(CariAafiKAs tinctorius L.)(例如紅花)、向 UmOlelianthus a/wmAs)例如(向日葵)、玉蜀黍(Zea mays)(例如玉蜀黍)、棉屬物種和亞銀(JJnum usi ta tissimum)(例如亞麻)。η)同一性、序列同一性和序列同一性百分比(同一性％)
如本文使用的，術(shù)語“同一性”或“序列同一性”如本文可互換使用的，當在核苷酸或多肽序列背景中使用時，指在2個序列中的核酸堿基或氨基酸殘基，當就最大限度對應(yīng)在指定比較窗上比對時其是相同的。因此，同一性被定義為2個DNA或多肽區(qū)段的相同鏈(有義或反義)之間的一致性、對應(yīng)性或等價性程度。
“序列同一性百分比”或“同一性％”通過下述進行計算在特定區(qū)域上比較2個最佳比對的序列，測定在其上等同堿基在2個序列中出現(xiàn)的位置數(shù)目，以獲得匹配的位置數(shù)目，將此種位置數(shù)目除以待比較區(qū)段中的位置總數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100。序列的最佳比對可以通過下述進行Smith & Waterman，為叩義Math. 2:482 (1981)的算法，Needleman & Wunsch，乂 Mol. Biol. 48443 (1970)的算法，Pearson & Lipman，/￥oc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)的方法和實現(xiàn)相關(guān)算法的計算機程序(例如，Higgins等人， CABIOS. 5L151-153 (1989))、FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information ；Altschul ^Α Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997))、PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI)或 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0, Genetics Computer Group,Madison,WI)0 (參見美國專利號5，912，120)。百分比序列同一性的有用例子包括但不限于 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、 64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%, 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %。這些同一性可以使用本文描述的任何程序進行測定。ο)間接地或直接地
如本文使用的，術(shù)語“間接地”當與基因及其相應(yīng)酶在多不飽和脂肪酸生產(chǎn)中的用途結(jié)合使用時，包含其中通過第一種酶將第一種酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙N酸(即途徑中間物)(例如，LA至 EDA，通過例如Δ 9-延長酶)，并且隨后通過使用第二種酶將第二種酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈谌N酸(例如，EDA至DGLA，通過例如Δ 8-去飽和酶)的情況。如本文使用的，術(shù)語“直接地”當與基因及其相應(yīng)酶在多不飽和脂肪酸生產(chǎn)中的用途結(jié)合使用時，包括其中酶直接將第一種酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙N酸的情況，其中第二種酸隨后用于組合物中(例如，LA至EDA的轉(zhuǎn)變，通過例如Δ 9-延長酶，或ω 3-ETra至ω 3-ΕΤΑ的轉(zhuǎn)變，通過例如Δ 8-去飽和酶)。ρ)內(nèi)含子
如本文使用的，術(shù)語“內(nèi)含子”指基因中不編碼蛋白質(zhì)序列的部分的間插序列。因此， 此種序列被轉(zhuǎn)錄成RNA但隨后被切除且不翻譯。該術(shù)語還用于被切除的RNA序列。q)分離的
如本文使用的，術(shù)語“分離的”指核酸分子(DNA或RNA)或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分， 其使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)從其天然存在的環(huán)境或來源中取出(例如，從細菌、藻類、真菌、植物、脊椎動物、哺乳動物等中)。分離的核酸分子或蛋白質(zhì)相當大地或基本上不含在其天然存在的環(huán)境中正常伴隨核酸分子或蛋白質(zhì)或與之相互作用的組分。r)分離的核酸片段或分離的核酸序列
如本文使用的，短語“分離的核酸片段”或“分離的核酸序列”指RNA或DNA聚合物，其是單鏈或雙鏈的，任選包含合成、非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可以包含cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區(qū)段。(特定多核苷酸的“片段”指這樣的多核苷酸序列，其包括與特定核苷酸序列區(qū)域等同或互補的大約至少約10個連續(xù)核苷酸、至少約15個連續(xù)核苷酸、至少約20個連續(xù)核苷酸等的鄰接序列。)核苷酸(通常以其5’ -單磷酸鹽形式發(fā)現(xiàn))通過其單字母指名如下提及“A”用于腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA)、“C”用于胞苷酸或脫氧胞苷酸、“G”用于鳥苷酸或脫氧鳥苷酸、“U” 用于尿苷酸、“T”用于脫氧胸苷酸、“R”用于嘌呤(A或G)，“Y”用于嘧啶(C或T)，“K”用于 G或T，“H”用于A或C或T，“I”用于肌苷、和“N”用于任何核苷酸。S)成熟的和前體
如本文使用的，術(shù)語“成熟的”當與術(shù)語“蛋白質(zhì)”結(jié)合使用時，指翻譯后加工的多肽； 即初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽或肽原已從其中去除的多肽。如本文使用的，術(shù)語“前體”當與術(shù)語“蛋白質(zhì)，，結(jié)合使用時，指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物；即仍存在前肽和肽原。前肽和肽原可以是但不限于細胞內(nèi)定位信號。t) 3’非編碼序列
如本文使用的，短語“3’非編碼序列”指位于編碼序列下游的DNA序列，并且包括多腺苷酸化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號的其他序列。多腺苷酸化信號通常特征在于影響多聚腺苷酸束(tract)對mRNA前體3’末端的添加。不同3’非編碼序列的使用由hgelbrecht等人，(1989)/ ^ Cell 7:671-680例示。U)非天然存在的
如本文使用的，短語“非天然存在的”指其為人工的事物，與在自然界中正常發(fā)現(xiàn)的不一致。ν)可操作地連接的
如本文使用的，短語“可操作地連接的”指在單個核酸分子上的核酸序列的結(jié)合，從而使得一種的功能受另一種調(diào)節(jié)。例如，啟動子與編碼序列可操作地連接，當它能夠調(diào)節(jié)那種編碼序列的表達時(即，編碼序列處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)。編碼序列可以與調(diào)節(jié)序列以有義或反義方向可操作地連接。在另一個例子中，本發(fā)明的互補RNA區(qū)可以直接地或間接地可操作地連接到靶mRNA的5’，或靶mRNA的3’，或靶mRNA內(nèi)，或第一個互補區(qū)在5’，并且其互補體對于靶mRNA在3’。w)植物
如本文使用的，術(shù)語“植物”指全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、其種子和后代。植物細胞包括但不限于來自種子、懸浮培養(yǎng)、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細胞。χ )聚合酶鏈反應(yīng)或PCR
如本文使用的，短語“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”指用于合成大量特異性DNA區(qū)段的技術(shù)， 由一系列重復(fù)循環(huán)組成(Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT)。一般地,使雙鏈DNA熱變性，與靶區(qū)段的3’邊界互補的2種引物在低溫下退火，并且隨后在中間溫度延伸。一組這3個連續(xù)步驟被稱為循環(huán)。PCR是通過模板的反復(fù)復(fù)制在短時間段內(nèi)用于使DNA擴增數(shù)百萬倍的強大技術(shù) (MaYYis 等k, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986) ;Erlich 等人，歐洲專利申請50，424 ；歐洲專利申請84，796 ；歐洲專利申請258，017,歐洲專利申請 237，362 ；Mullis，歐洲專利申請 201，184，Mullis 等人美國專利號 4，683，202 ；Erlich，美國專利號4，582，788 ；和Saiki等人，美國專利號4，683，194)。該過程利用特異性體外合成的寡核苷酸組以引發(fā)DNA合成。引物的設(shè)計依賴于需要分析的DNA序列。該技術(shù)通過多個下述循環(huán)(通常20-50個)執(zhí)行在高溫下使模板解鏈，允許引物與模板內(nèi)的互補序列退火，并且隨后用DNA聚合酶復(fù)制模板。通過在瓊脂糖凝膠中分離隨后為溴化乙錠染色和用UV透照顯現(xiàn)，分析PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。可替代地，放射性dNIPs可以添加到PCR中，以將標記摻入產(chǎn)物內(nèi)。在這種情況下，PCR產(chǎn)物通過使凝膠暴露于χ射線膠片得到顯現(xiàn)。放射性標記PCR 產(chǎn)物的附加優(yōu)點是可以定量個別擴增產(chǎn)物的水平。y)啟動子和增強子
如本文使用的，術(shù)語“啟動子”指能夠控制編碼序列或功能RNA表達的DNA序列。啟動子序列由近側(cè)和更遠側(cè)的上游元件組成，后面一種元件通常被稱為增強子。如本文使用的，術(shù)語“增強子”指這樣的DNA序列，其可以刺激啟動子活性，并且可以是啟動子的固有元件或插入的異源元件，以增強啟動子水平或組織特異性。啟動子序列還可以定位于基因的轉(zhuǎn)錄部分內(nèi)，和/或轉(zhuǎn)錄的序列下游。啟動子可以整體衍生自天然基因，或由衍生自在自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包括合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解不同啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發(fā)育階段時，或響應(yīng)不同環(huán)境條件的表達。引起基因在大多數(shù)細胞類型中在大多數(shù)時候表達的啟動子通常被稱為“組成型啟動子”。不斷發(fā)現(xiàn)在植物細胞中有用的各種類型的新啟動子；眾多例子可以在由 Okamuro 和 Goldberg, {\°>m^Biochemistry of Plants 15:1-82 的匯編中找到。應(yīng)進一步認識到因為在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全限定， 所以一些變異的DNA分子可以具有等同啟動子活性。ζ)重組體
如本文使用的，術(shù)語“重組體”指2個否則分離的序列區(qū)段的人工組合，例如通過化學(xué)合成或通過經(jīng)由基因工程技術(shù)處理核酸的分離區(qū)段。aa)重組構(gòu)建體、表達構(gòu)建體和重組表達構(gòu)建體
短語“重組構(gòu)建體”、“表達構(gòu)建體”和“重組表達構(gòu)建體”在本文中可互換使用，并且指可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標準方法插入細胞基因組內(nèi)的遺傳材料的功能單位。 此種構(gòu)建體可以是其自身或可以與載體結(jié)合使用。如果使用載體，那么載體的選擇依賴于將用于轉(zhuǎn)化宿主植物的方法，如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員充分知道必須存在于載體上的遺傳元件，以成功轉(zhuǎn)化、選擇且繁殖包括本發(fā)明的任何分離的核酸分子的宿主細胞。技術(shù)人員還將認識到不同的獨立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同表達水平和模式(Jones 等人，(Λ腳、EMBO J. 4:2411-2418 ；De Almeida 等人，(1989)MoL Gen. Genetics218- 78-86)，并且因此必須篩選多重事件，以獲得展示出所需表達水平和模式的系。此種篩選可以通過DNA的Southern分析、mRNA表達的Northern分析、蛋白質(zhì)表達的Western分析或表型分析來完成。bb) RNA轉(zhuǎn)錄物、信使RNA、cDNA、功能RNA和內(nèi)源RNA
如本文使用的，短語“RNA轉(zhuǎn)錄物”指起因于RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。 當RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完美互補拷貝時，它被稱為初級轉(zhuǎn)錄物，或它可以是衍生自初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，并且被稱為成熟RNA。如本文使用的，短語“信使RNA (mRNA)”指不含內(nèi)含子且可以由細胞翻譯成蛋白質(zhì)的 RNA。如本文使用的，術(shù)語“cDNA”指與mRNA模板互補且使用逆轉(zhuǎn)錄酶由mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的或使用DNA聚合酶I的Klenow分子轉(zhuǎn)變成雙鏈形式?！坝辛x”RNA指包括mRNA且可以在細胞內(nèi)或在體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”指這樣的RNA轉(zhuǎn)錄物，其與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補，并且阻斷靶基因的表達 (美國專利號5，107，065)。反義RNA的互補性可以是與特異性基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即在 5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列上。如本文使用的，短語“功能RNA”指反義RNA、核酶RNA、或可以不翻譯但仍對細胞過程具有作用的其他RNA。術(shù)語“互補體”和“反向互補體”在本文中就mRNA轉(zhuǎn)錄物而言可互換使用，并且意欲定義信息的反義RNA。如本文使用的，短語“內(nèi)源RNA”指任何RNA，在用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化前，其由宿主基因組中存在的任何核酸序列編碼，無論是天然存在還是非天然存在的，即通過重組方法、誘變等引入的。cc)相似性
如本文使用的，術(shù)語“相似性”當提及2個氨基酸序列、蛋白質(zhì)或多肽之間的“相似性” 時使用時，指2個序列中的一系列等同以及保守氨基酸殘基的存在。2個氨基酸序列之間的相似性程度越高，2個序列的對應(yīng)性、一致性或等價性越高。dd)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化、瞬時轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化
如本文使用的，短語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組內(nèi)，包括核和細胞器基因組，從而導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。相比之下，如本文使用的，短語“瞬時轉(zhuǎn)化”指核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主生物的核或含 DNA細胞器內(nèi)，從而導(dǎo)致基因表達而無整合或穩(wěn)定遺傳。包含轉(zhuǎn)化的核酸分子的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物。稻、玉米和其他單子葉植物的細胞轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是使用粒子加速或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等人，(1987) ^Vatore (London) 327·. 70-73 ；美國專利號 4，945，050)，或土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的方法，其中使用包含轉(zhuǎn)基因的合適Ti 質(zhì)粒(Ishida Y.等人，(.19^)Nature Biotech. 14:745-750)。如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化。ee)翻譯前導(dǎo)序列
如本文使用的，短語“翻譯前導(dǎo)序列”指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的DNA 序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級轉(zhuǎn)錄物至mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子已得到描述(Turner，R.禾口 Foster，G. D. (Λ995)Molecular Biotechnology J:225)。本文引用的所有專利、專利出版物和優(yōu)先權(quán)文件在此整體引入作為參考。B. Δ 8-去飽和酶基因和由其編碼的酶
由本發(fā)明的Δ 8-去飽和酶基因編碼的酶是具有至少2個不飽和(雙鍵)且全長20個碳原子或更長的多不飽和脂肪酸(PUFAs)生產(chǎn)中必需的。具體地，本發(fā)明的酶是功能上活性的(例如具有Δ 8-去飽和酶活性)，意指它在PUFA的碳原子編號8 (C8)和碳原子9 (C9) 之間添加雙鍵，所述PUFA長度至少20個碳原子，并且具有在位置Δ 9、Δ 12和/或Δ 15 上的預(yù)先存在的雙鍵。如圖1中所示，經(jīng)由可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑， 由本發(fā)明的Δ 8-去飽和酶基因編碼的酶產(chǎn)生具有長度20個碳原子或更長的PUFAs。底物 ω 6-二十碳二烯酸、ω 3-二十碳三烯酸或ω 6_ 二十碳二烯酸和ω 3_ 二十碳三烯酸，由本
14發(fā)明的Δ 8-去飽和酶在這個途徑中利用。本發(fā)明的Δ 8-去飽和酶基因從球石藻屬物種，即海洋球石藻，具體地海洋球石藻 CCMP 378中分離。來自海洋球石藻CCMP 378的分離的Δ 8-去飽和酶基因的核苷酸序列顯示于圖9和SEQ ID Ν0:28中。推定的核苷酸序列的分離的密碼子最佳化核苷酸序列顯示于圖11和SEQ ID Ν0:30中。由SEQ ID N0J8和SEQ ID NO: 30編碼的分離或純化的氨基酸序列顯示于圖10和SEQ ID NO:29中。使用Δ 9-延長酶和Δ 8-去飽和酶的LA至DGLA和ALA至ω 3-ΕΤΑ轉(zhuǎn)變被稱為可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑。用于將LA轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA和將ALA轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3-ΕΤΑ 的常規(guī)Δ 6途徑分別利用Δ 6-去飽和酶，以將LA轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA和將ALA轉(zhuǎn)變?yōu)镾DA，和Δ -6 延長酶，以將GLA轉(zhuǎn)變?yōu)镈GLA和將SDA轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3-ΕΤΑ。在任一途徑中，ARA或EPA的產(chǎn)生隨后通過例如Δ 5-去飽和酶催化。DHA例如可以在EPA轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3-二十二碳五烯酸(DPA) 和ω 3- 二十二碳五烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈HA后產(chǎn)生，其中分別利用C20-延長酶和Δ 4_去飽和酶。盡管例如DGLA、ARA, ω 3_ETrA、ω 3-ETA, EPA、DPA和/或DHA可以經(jīng)由可替代的 Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑或常規(guī)Δ 6途徑產(chǎn)生，但在特定情況下，可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑可以優(yōu)選超過常規(guī)Δ 6途徑。例如，如果在DGLA、ARA、ω 3_ETrA、 ω 3-ΕΤΑ, EPA、DPA和/或DHA的生產(chǎn)過程中不需要特定殘留的ω-6或ω-3脂肪酸中間物，例如GLA或SDA，那么可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑可以用作常規(guī)Δ 6途徑的替代途徑，以回避GLA和SDA形成。如上所述，Δ 8-去飽和酶是可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑中的必需酶。如果沒有Δ 8-去飽和酶基因和由其編碼的酶，那么例如不能經(jīng)由可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑合成ΕΡΑ。如圖1中所示，本發(fā)明的分離的Δ 8-去飽和酶例如將EDA 轉(zhuǎn)變?yōu)?DGLA 和將 ω 3-ETrA 轉(zhuǎn)變?yōu)?ω 3-ΕΤΑ ω 3-ΕΤΑ 由 ω 3-ETrA 和 EPA 由 ω 3-ΕΤΑ 的生產(chǎn)隨后分別通過例如Δ 8-去飽和酶和Δ 5-去飽和酶進行催化。由于使用可替代的Δ 8-去飽和酶/ Δ 9-延長酶途徑，所以回避了中間物GLA和SDA脂肪酸。本發(fā)明還包括具有這樣的序列的分離或純化的核苷酸序列(和相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì))，所述序列包括序列(即與之具有序列同一性)SEQ ID NO:28(來自海洋球石藻CCMP 378 的分離的Δ 8-去飽和酶核苷酸序列)或SEQ ID NO:30(來自海洋球石藻CCMP 378的分離的密碼子最佳化核苷酸序列)中的至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、 64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%, 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸、由之組成或與之互補。此種序列可以來自人來源以及其他非人來源(例如，秀麗隱桿線蟲(C elegans)或小鼠)。另外，本發(fā)明還包含片段和衍生物，其包括SEQ ID NO:觀或SEQ ID NO: 30的核苷酸序列，或由SEQ ID N0J8或SEQ ID NO: 30的核苷酸序列組成。衍生自SEQ ID N0J8或 SEQ ID N0:30的片段可以具有包括10 - 1250個核苷酸、10 - 1000個核苷酸、10 - 750個核苷酸、10 - 500個核苷酸、10 - 250個核苷酸、10 -約100個核苷酸或10 -約50個核苷酸或15 - 40個核苷酸，或由之組成的長度。在一個方面，SEQ ID N0:觀和SEQ ID N0:30 的片段編碼具有Δ 8-去飽和酶活性的多肽。在另一個方面，SEQ ID Ν0:觀和SEQ ID N0:30 的片段可以用作引物和探針。制備引物和探針的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此種引物和探針可以具有10 - 50個核苷酸、優(yōu)選15 - 40個核苷酸的長度。本文還預(yù)期了 SEQ ID N0J8和SEQ ID NO: 30的核苷酸序列變體。此種變體可以包含一個或多個堿基對添加、取代或缺失，條件是此種添加、取代或缺失在三(3)個高度保守的“組氨酸框(box)”區(qū)域的任何一個中或在SEQ ID N0:29的5’末端上發(fā)現(xiàn)的細胞色素 b5樣結(jié)構(gòu)域中不出現(xiàn)(參見圖2)。“組氨酸框”區(qū)域和細胞色素b5樣結(jié)構(gòu)域在本文中與SEQ ID NO:四的氨基酸變體結(jié)合更詳細地進行討論。由本發(fā)明包含的核苷酸變體的例子顯示于下表A中。表 A
權(quán)利要求
1.一種分離的核苷酸酸或其片段，其包括編碼具有去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，或與編碼具有去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列互補，其中所述多肽的氨基酸序列與包括SEQ ID N0:29的氨基酸序列具有至少55%序列同一性。
2.一種分離的核苷酸序列或其片段，其包括選自SEQ ID N0J8和SEQ ID N0:30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID NO:觀和SEQ ID NO: 30的核苷酸序列的至少55% 互補。
3.權(quán)利要求2的分離的核苷酸序列，其中所述序列編碼功能上活性的Δ8-去飽和酶， 其利用ω 6-二十碳二烯酸或ω 3-二十碳三烯酸作為底物。
4.一種表達載體，其包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括選自SEQ ID NO:28 和SEQ ID NO: 30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 30的核苷酸序列的至少互補。
5.一種宿主細胞，其包括權(quán)利要求4的載體。
6.權(quán)利要求5的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真核細胞，其中所述真核細胞選自哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。
7.一種包括權(quán)利要求4的載體的植物細胞、植物種子、植物或植物組織，其中所述載體的核苷酸序列的表達導(dǎo)致由所述植物細胞、植物種子、植物或植物組織產(chǎn)生至少一種多不飽和脂肪酸。
8.權(quán)利要求7的植物細胞、植物種子、植物或植物組織，其中所述多不飽和脂肪酸選自花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二高-γ-亞麻酸 (DGLA)或ω 3- 二十碳四烯酸(ω 3-ΕΤΑ)及其組合。
9.一種或多種植物油或脂肪酸，其通過權(quán)利要求8的植物細胞、植物種子、植物或植物組織產(chǎn)生。
10.一種純化的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列包括選自SEQ ID N0J8和 SEQ ID Ν0:30的核苷酸序列的至少55%，或與選自SEQ ID N0:沘和SEQ ID N0:30的核苷酸序列的至少55%互補。
11.一種純化的多肽，其在底物碳原子8和碳原子9之間使20碳長多不飽和脂肪酸 (C20-PUFA)底物去飽和，并且其中所述多肽與包括SEQ ID N0:29的氨基酸序列具有至少氨基酸同一性。
12.權(quán)利要求11的純化的多肽，其中所述多肽具有SEQID N0:29的氨基酸序列。
13.一種產(chǎn)生Δ 8-去飽和酶的方法，該方法包括步驟a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少 55%互補的核苷酸序列=SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO: 30 ；b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的所述分離的核苷酸序列的表達載體；和c)將所述表達載體引入宿主細胞內(nèi)一段時間且在足以產(chǎn)生所述Δ8-去飽和酶的條件下。
14.一種用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其包括步驟a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少55%互補的核苷酸序列=SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30 ；b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的所述分離的核苷酸序列的表達載體；c)將所述表達載體引入宿主細胞內(nèi)一段時間且在足以產(chǎn)生所述Δ8-去飽和酶的條件下；和d)使所述表達的Δ8-去飽和酶暴露于選自下述的底物ω 6- 二十碳二烯酸、ω 3_ 二十碳三烯酸及其組合，以將所述底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物多不飽和脂肪酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是二高-Y-亞麻酸(DGLA)、 ω 3- 二十碳四烯酸(ω 3-ΕΤΑ)或其任何組合。
16.權(quán)利要求14的方法，其進一步包括步驟使所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸暴露于至少一種另外的去飽和酶或延長酶，以將所述多不飽和脂肪酸產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N或另外的多不飽和脂肪酸。
17.一種用于在宿主細胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其包括步驟a)分離包括選自下述的核苷酸序列的至少55%或與選自下述的核苷酸序列的至少 55%互補的核苷酸序列=SEQ ID N0:28禾口 SEQ ID NO:30 ；b)構(gòu)建包括與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的來自步驟a)的所述分離核苷酸序列的表達載體；c)將來自b)的所述表達載體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體引入宿主細胞內(nèi)，所述至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體包括編碼Δ 9-延長酶的與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的分離的核苷酸序列；d)使所述表達的Δ8-去飽和酶和Δ 9-延長酶暴露于選自下述的底物亞油酸(LA)、 α -亞麻酸(ALA)及其組合，以將所述底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物多不飽和脂肪酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是二高-Y-亞麻酸(DGLA)或 ω 3- 二十碳四烯酸(ω 3-ΕΤΑ)或其任何組合。
19.權(quán)利要求17的方法，其進一步包括步驟使所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸暴露于至少一種另外的去飽和酶或延長酶，以將所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N或另外的多不飽和脂肪酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述產(chǎn)物多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或其任何組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼△-8去飽和酶的分離的多核苷酸、由分離的多核苷酸編碼的△-8去飽和酶、包含分離的多核苷酸的表達載體、包含表達載體的宿主細胞和用于產(chǎn)生△-8去飽和酶和多不飽和脂肪酸的方法。
文檔編號C12N9/02GK102239254SQ200980148676
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者克里什南 P., 穆克吉 P., 佩雷拉 S., 達斯 T. 申請人:雅培制藥有限公司