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通過使用gi蛋白受體來分類和診斷脊柱側(cè)凸的方法

文檔序號:581374閱讀:314來源:國知局
專利名稱:通過使用gi蛋白受體來分類和診斷脊柱側(cè)凸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及發(fā)展脊柱側(cè)突(例如青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))傾向的診斷以及用于鑒定治療脊柱側(cè)凸的化合物的篩選方法。
背景技術(shù)
脊柱側(cè)凸是一種疾病,其患者的脊柱從一側(cè)彎向另一側(cè),也可能是旋轉(zhuǎn)的。它是異常的脊柱側(cè)向彎曲。在X射線下,典型脊柱側(cè)凸的個體的脊柱相對于直線更像“S”或“C” 形。脊柱畸形,尤其是脊柱側(cè)凸是兒童和少年畸形矯正的最常見類型,而特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIQ是脊柱側(cè)凸的最常見形式。青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)的病因?qū)W還不清楚。 AIS在數(shù)量和嚴(yán)重程度上主要影響女孩,但是一些研究表明其具有遺傳傾向,遺傳的類型依然是不確定的(Axenovich TI 等人,Am J Med Genet 1999,86(4) :389-394 ;Wise CA 等人, Spine 2000,25 (18) :2372-2380 ;Blank RD 等人,Lupus 1999,8(5) :356-360 ;Giampietro PF等人,Am J Med Genet 1999,83(3) :164-177)。已提出若干不同的觀點以更好的定義該病因?qū)W(Machida M.,Spine 1999,24(24) :2576-2583 ;Roth JA 等人,J Biol Chem 1999, 274(31) :22041-22047 ;Hyatt BA等人,Nature 1996,384(6604) :62-65 ;von Gall C等人, Eur J Neurosci 2000,12(3) :964-972)。遺傳、生長激素分泌、結(jié)締組織結(jié)構(gòu)、肌肉結(jié)構(gòu)、前庭功能障礙、褪黑激素分泌和血小板微結(jié)構(gòu)是主要的研究領(lǐng)域。現(xiàn)有觀點認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的中樞控制或處理的缺陷影響了脊柱的生長,脊柱對變形的易感性在個體之間是不同的。很遺憾,目前FDA尚未批準(zhǔn)任何方法用于鑒定具有發(fā)展IS風(fēng)險的兒童或少年, 從而預(yù)測受影響的個體需要治療以預(yù)防或停止該疾病的進(jìn)展(Weinstein SL, Dolan LA, Cheng JC 等人,Adolescent idiopathic scoliosis. Lancet 2008;371:1527-37)。因此, 現(xiàn)有治療,例如安矯形支架或外科矯治直到檢測出顯著的畸形或證實明顯的疾病進(jìn)展才得以使用,導(dǎo)致治療延遲和錯過最佳時機(Society SR. Morbidity & Mortality Committee annual Report 1997)。在需要治療的IS患者中,80-90%通過安矯形支架治療,約1 %需要通過脊柱儀器以及胸和/或腰脊柱的融合進(jìn)行手術(shù)以矯正畸形,具有產(chǎn)生并發(fā)癥的風(fēng)險 (Weiss HR, Goodall D. Rate of complications in scoliosis surgery-a systematic review of the Pub Med literature. Poliosis. 2008 ;3 :9)。現(xiàn)今在美國約有一百萬 10-16歲的兒童具有一定程度的IS。每6個診斷為脊柱側(cè)凸的兒童中有一個的彎曲程度已達(dá)到需要主動治療的地步。每年在北美要進(jìn)行約29,000例脊柱側(cè)凸手術(shù),導(dǎo)致顯著的心理和生理疾病(Goldberg MS, Mayo NE, Poitras B 等人,The Ste-Justine Adolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study. Part I -Description of the study. Spine 1994 ; 19 :1551-61 ;Poitras B, Mayo NE, Goldberg MS φ A, The Ste-Justine Adolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study. Part IV :Surgical correction and back pain. Spine 1994 ;19 :1582-8)。因此需要對具有涉及脊柱畸形(例如脊柱側(cè)凸,例如AIS)疾病的個體分類的方法,診斷對脊柱側(cè)凸的傾向以及鑒定用于預(yù)防或治療所述疾病的化合物的方法。本說明書涉及大量的文獻(xiàn),其內(nèi)容整體引入本文作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明首次證實,來自脊柱側(cè)凸患者(特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者)的細(xì)胞在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有廣泛損傷。在某些不同的GPCR和不同的細(xì)胞類型,包括形成骨的細(xì)胞、形成肌肉的細(xì)胞以及血細(xì)胞中均檢測到該損傷。多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)和生物活性物質(zhì)通過位于細(xì)胞膜的特異性受體控制、調(diào)節(jié)或調(diào)整生物體功能。許多所述受體通過激活與該受體偶聯(lián)的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白) 來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞。所述受體總稱為G蛋白偶聯(lián)受體(“GPCR“ )。GPCR與特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)合能引起受體的構(gòu)象變化,產(chǎn)生能結(jié)合和活化G蛋白的形式,由此觸發(fā)級聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)事件,最終導(dǎo)致生物響應(yīng)。通常,GPCR與G蛋白作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使如環(huán)式AMP、磷酸肌醇、二?;视秃外}離子的合成。更具體而言,根據(jù)本發(fā)明,提供了一種測定測試化合物對預(yù)防或治療脊柱側(cè)凸 (例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸(IS),例如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸、青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或成人脊柱側(cè)凸)是否有效的方法,所述方法包括(a)使表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體(至少一種受體)的細(xì)胞與所述受體的配體在所述測試化合物存在或不存在情況下接觸;(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度;其中若存在所述測試化合物時相對于不存在該化合物時信號水平更高,表明所述測試化合物可用于預(yù)防或治療脊柱側(cè)凸(例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸,例如AIS)。該方法可用于篩選能普遍調(diào)節(jié)Gi-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)損傷的化合物。然而,其也可用于確定何種化合物對于調(diào)節(jié),尤其是減少或消除特定患者群或患者的細(xì)胞內(nèi)Gi-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)損傷是最有效的。事實上,用于此目的的最有效化合物可能在患者間各不相同。本發(fā)明的篩選方法因此可用于鑒定哪種化合物在消除特定患者群、尤其是某個患者的Gi-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)損傷中最為有效。本發(fā)明還提供了一種用于診斷個體發(fā)展脊柱側(cè)凸(例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸,例如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸、青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))傾向的方法(例如體外方法),包括(a)使來自所述個體的表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞與所述受體的配體接觸;(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度;(c)將所述信號與相應(yīng)的參比信號進(jìn)行比較;(d)基于該比較來確定所述傾向。
本文所用的術(shù)語“發(fā)展脊柱側(cè)凸的傾向”是指個體發(fā)展脊柱側(cè)凸(即脊柱畸形)和 /或在將來發(fā)展成更嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸的遺傳或代謝傾向。另一方面,本發(fā)明提供了對具有特發(fā)性脊柱側(cè)凸、例如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸、青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)的人類患者分類的方法,包括(a)使來自所述個體的表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞與所述受體的配體接觸;以及(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度,其中根據(jù)所述測定步驟的結(jié)果能夠?qū)⒕哂刑匕l(fā)性脊柱側(cè)凸(例如AIQ的個體劃分在一個特發(fā)性脊柱側(cè)凸的亞組中。在一個實施方案中,上述特發(fā)性脊柱側(cè)凸是AIS。在一個實施方案中,AIS個體 (i)若信號強度為對照個體的細(xì)胞中測定的相應(yīng)信號強度的約34%或以下,則歸于亞組 1,( )若信號強度為對照個體的細(xì)胞中測定的相應(yīng)信號強度的約34%和約57%之間,則歸為亞組2,和(iii)若信號強度為對照個體的細(xì)胞中測定的相應(yīng)信號強度的約57%和約 80%之間,則歸為亞組3。因此,本發(fā)明的方法還可有利地用于確定例如疾病的類型和/或嚴(yán)重程度,或所述疾病潛在缺陷的性質(zhì)(即個體的“分類”或“分層”)。尤其感興趣的是治療或預(yù)防特發(fā)性脊柱側(cè)凸(例如AIQ最有效的藥物是否隨著不同類型和/或嚴(yán)重度的特發(fā)性脊柱側(cè)凸個體而變化。因此,本發(fā)明用于分類的方法可以為特定患者更好地選擇所用藥物。該方法也可用于已診斷的脊柱側(cè)凸患者(例如成人脊柱側(cè)凸)的分類/分層。在一個實施方案中,上述個體是可能發(fā)展成脊柱側(cè)凸、例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸(例如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))的候選者。 本文中術(shù)語“可能發(fā)展成脊柱側(cè)凸的候選者”包括至少父母之一具有脊柱側(cè)凸(例如青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸)的個體(例如兒童)。在其他因素中,年齡(青年)、性別和其他家族前輩是已知能增加發(fā)展脊柱側(cè)凸風(fēng)險的因素,在一定程度上用于評價發(fā)展成脊柱側(cè)凸的風(fēng)險。在某些個體中,脊柱側(cè)凸在短時間內(nèi)迅速發(fā)展至需要矯正手術(shù)的程度(通常為當(dāng)畸形達(dá)到科布角彡50°時)。當(dāng)診斷為脊柱側(cè)凸例如AIS時(當(dāng)脊柱側(cè)凸明顯時),現(xiàn)有可采取的措施包括觀察(當(dāng)科布角為約10-25°時)、矯形裝置(當(dāng)科布角為約25-30° )以及手術(shù)(超過45° )。更可靠的確定進(jìn)展風(fēng)險能夠1)選擇適當(dāng)?shù)娘嬍?,以排除某些已知促進(jìn)脊柱側(cè)凸的食物;幻選擇最佳的治療劑;和/或幻選擇最小侵入性的治療,例如姿勢訓(xùn)練、矯形裝置,或較少侵入性的手術(shù)或無融合手術(shù)(不融合脊椎、保留脊柱運動性的手術(shù))。本發(fā)明包括根據(jù)確定的發(fā)展脊柱側(cè)凸的風(fēng)險來選擇最有效和最小侵入性的已知預(yù)防或治療措施。本發(fā)明的方法可使用表達(dá)一種或多種與Gi蛋白(也稱為Gi α亞基)偶聯(lián)的受體的細(xì)胞。本文中,“受體”是指野生型受體和/或保留野生型受體活性(即GPCR介導(dǎo)的活性)的片段和變體。與Gi蛋白偶聯(lián)的GPCR(下文中稱為GiPCR)包括,例如CD47、血清素受體(5-HT)、腺苷受體、腎上腺素能受體、大麻素受體、組胺受體、前列腺素受體和多巴胺受體。

圖15為適合用于本發(fā)明方法的GiPCR非窮舉的列表。在一個實施方案中,上述與Gi蛋白偶聯(lián)的受體是血清素受體、α-腎上腺素能受體、腺苷受體、大麻素受體或其任意組合。在另一個實施方案中,上述受體是5-ΗΤ1Α、 α 2-AD、A3或CB2。在另一個實施方案中,上述受體不是褪黑激素受體(例如ΜΤ2)。
在一個實施方案中,上述方法使用超過一種的與Gi蛋白偶聯(lián)的受體。在另一個實施方案中,上述方法使用超過一種特異性結(jié)合與Gi蛋白偶聯(lián)的受體的配體。在另一個特定的實施方案中,各配體對于與Gi蛋白偶聯(lián)的不同受體具有特異性(例如2、3、4、5或6個配體)。圖16是GiPCR配體的非窮舉的列表。在特定的實施方案中,本發(fā)明使用的配體不是 MT2配體。本發(fā)明的方法可使用任何表達(dá)一種或多種Gi偶聯(lián)受體和/或Gi蛋白的樣品(例如細(xì)胞,組織)。所述細(xì)胞可天然或重組表達(dá)一種或多種Gi偶聯(lián)受體和/或Gi蛋白。對于重組表達(dá),編碼GiPCR的核酸和/或編碼Gi蛋白的核酸被引入適當(dāng)?shù)募?xì)胞,所述細(xì)胞在使蛋白表達(dá)的條件下孵育。本文所用細(xì)胞天然表達(dá)一種或多種Gi蛋白偶聯(lián)的受體,根據(jù)個體的收集的可能性部分選擇。因此,可有利地獲得諸如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞(PBMC)(主要包括淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞)和成肌細(xì)胞的細(xì)胞并方便地用于本發(fā)明的方法。血細(xì)胞(例如PBMC,血小板(血小板)等)尤其容易獲得并提供了更快的測試。本發(fā)明的方法可使用任何血細(xì)胞,只要其含有至少一種與Gi蛋白偶聯(lián)的GPCR受體。在一個實施方案中,細(xì)胞獲得或衍生自特發(fā)性脊柱側(cè)凸(例如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))的個體。對于本發(fā)明,PBMC不需要在培養(yǎng)物中獲得,因為本文所述方法可在含有新鮮或冷凍PBMC的細(xì)胞混懸液中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的特定方面,可使用給定的Gi-蛋白偶聯(lián)受體的任何配體。GiPCR的配體(例如天然或合成的)是本領(lǐng)域公知的,某些所述配體可從商業(yè)上獲得(例如從 Tocris Bioscience獲得)。圖15給出了單獨或與其他配體組合的適用于本發(fā)明方法的 GiPCR配體的非窮舉的列表。在一個特定的實施方案中,上述配體是所述受體的已知激動劑。在一個實施方案中,上述配體是(a)用于5-HT1A受體的l-[3-(3,4-亞甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪馬來酸鹽(已知為BP5M馬來酸鹽),(b)用于a2-AD受體的 5-溴-N-(4,5-二氫-IH-咪唑-2-基)-6-喹喔啉胺(已知為UK14304),(c)用于A3受體的1-脫氧-1- -[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核糖脲酰胺(已知為IB-MECA) ; (d)用于CB2受體的N-環(huán)己基-7-氯_1-[2-(4_嗎啉基)乙基]喹啉-4 (IH)-酮-3-甲酰胺(已知為CB65)。應(yīng)當(dāng)理解,上述方法可篩選多種不同的測試化合物。測試化合物包括大量的化學(xué)種類,但通常為有機分子,優(yōu)選為分子量50到約2500道爾頓的有機小分子。測試化合物包含與蛋白結(jié)構(gòu)相互作用所必需的官能團(tuán),尤其是氫鍵,通常包括至少一個胺、羰基、羥基或羧基,優(yōu)選至少兩個所述官能團(tuán)。測試化合物通常包含環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu),其被一個或多個上述官能團(tuán)所取代。測試化合物還可以是生物分子,包括肽類(例如靶向于一種或多種涉及通過Gi蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷蛋白的肽),核酸(例如寡核苷酸,例如靶向于涉及通過Gi蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷基因的反義分子)、抗體、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。測試化合物可從廣泛來源獲得,包括合成或天然的化合物庫。例如,有多種方法可用于隨機和定向合成多種有機化合物和生物分子,包括隨機寡核苷酸的表達(dá)和寡肽?;蛘?,可獲得或方便地制備細(xì)菌、 真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫。此外,可通過常規(guī)化學(xué)、物理和生化方法方便地修飾天然或合成制備的庫和化合物,并可用于產(chǎn)生組合庫。已知的藥理學(xué)活性劑可用于定向或隨機的化學(xué)修飾,例如?;?、烷基化、酯化、酰胺化等,以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
在一個實施方案中,參比信號是從對照個體中獲得的相應(yīng)樣品(例如細(xì)胞)中獲得的信號,所述對照個體例如為未患有脊柱側(cè)凸(例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸,如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))的個體,或不傾向于發(fā)展成脊柱側(cè)凸的個體。此時,來自個體細(xì)胞中的信號相對于相應(yīng)參比信號較低,表明所述個體傾向于發(fā)展成脊柱側(cè)凸,而較高或基本相同的信號表明所述個體不易發(fā)展成脊柱側(cè)凸。在另一個實施方案中,上述參比信號是從個體(例如年齡和/或性別匹配的)中獲得的相應(yīng)樣品(例如細(xì)胞)中獲得的信號,所述個體患有脊柱側(cè)凸(例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸,如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)),或已知易于發(fā)展成脊柱側(cè)凸。此時,來自個體細(xì)胞中的信號相對于相應(yīng)參比信號較低或基本相同, 表明所述個體易于發(fā)展成脊柱側(cè)凸,而較高的信號表明所述個體不易發(fā)展成脊柱側(cè)凸。在一個實施方案中,相應(yīng)的樣品是與來自個體的細(xì)胞同種類型的細(xì)胞(例如,實驗樣品和參比樣品均為淋巴細(xì)胞)。在一個實施方案中,實驗在含有實驗樣品和對照樣品的板中進(jìn)行(例如96孔、384孔等)。在另一個實施方案中,所述板還含有來自健康個體和組 1、2和3的個體的參比樣品。在一個實施方案中,較低或較高的信號是指相對于參比信號而言從實驗樣品(從測試的個體獲得的樣品)中獲得的信號的差異至少為約10%,在其他實施方案中至少為約 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、100 %、150 %或200 %。在一個實施方案中,基本相同的信號是指與參比信號相比,差異小于10%的信號,在其他實施方案中為差異小于9%、8%、7%、6%或5%的信號。配體(例如激動劑)誘導(dǎo)的信號強度的變化可使用任何方法檢測。測定GiPCR介導(dǎo)的信號(例如細(xì)胞內(nèi)響應(yīng))幅度或強度的方法是本領(lǐng)域公知的。信號的強度可以通過例如測定諸如第二信使(例如cAMP、Ca2+)或基因產(chǎn)物(例如mRNA或蛋白質(zhì))的分子水平進(jìn)行確定,所述基因產(chǎn)物的水平在配體觸發(fā)受體后被調(diào)節(jié)。信號的強度也可以通過例如測定配體觸發(fā)受體后的蛋白-蛋白相互作用的變化(例如通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移[FRET]或生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移[BRET])進(jìn)行確定。其他測定通過GiPCR介導(dǎo)的信號強度的方法包括,例如測定 cAMP 水平(Medhurst 等人,2003. In J Neurochem.,84),使用 GIRK-鉈流試驗測定銘流(Niswender 等人,2008 ;In :Mol Pharmacol. 73(4)),膜片鉗(Saugstad 等人,1996. In J. Neurosci. 16),使用[35SjGTP y S 標(biāo)記試驗測定 GTP y S 結(jié)合(Riobo 等人, 2006. In =Proc Natl Acad Sci USA,103),以及測定阻抗的變化(Peters 等人,2007. h J Biomol. Screen. 12 :312-9)。在一個實施方案中,所述信號強度使用受體觸發(fā)后發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)阻抗的變化(例如細(xì)胞介電譜[CDS])進(jìn)行測定。所述測定例如可使用實時細(xì)胞電子傳感(RT-CES )技術(shù)(ACEA Biosciences Inc.,San Diego, CA, USA) (Huang 等人,Analyst, 2008,133(5) :643-648 ;Solly 等人,Assay Drug Dev. Technol,2004,2 (4) :363-372)或使用CellKey 技術(shù)(MDS kiex,Concord,Ontario,加拿大)進(jìn)行,如下文所述的方法。在一個實施方案中,所述方法以適合于高通量試驗的模式進(jìn)行,例如96-或 384-孔板模式,可使用適當(dāng)?shù)臋C器人(例如移液機器人)和儀器。本發(fā)明還提供了用于實施上述方法的試劑盒。所述試劑盒可包括,例如一種或多種用于測定Gi蛋白偶聯(lián)受體信號的試劑,以及用于進(jìn)行個體試驗的緩沖液、細(xì)胞、對照樣品 (例如來自健康個體的樣品,組1、2和3的患者的參比樣品)、容器等。在需要時,所述試劑盒的各成分可放置在分開的容器中,或者某些相容的成分可預(yù)先在單個容器中組合。除上述成分外,所述試劑盒通常還包括使用試劑盒的成分來實施所述方法的說明書。用于實施所述方法的說明書通常記錄在適當(dāng)?shù)挠涗浗橘|(zhì)上。例如,說明書可印制在諸如紙張或塑料的基質(zhì)上。這樣,說明書可以以包裝插頁的形式放置在試劑盒、試劑盒的容器或其成分容器的標(biāo)簽內(nèi)(即與包裝或亞包裝一起)等。在其他實施方案中,說明書以電子存儲數(shù)據(jù)文件的形式存在于適當(dāng)?shù)挠嬎銠C可讀存儲介質(zhì)中,例如CD-ROM、磁盤等。在其他實施方案中,說明書實際并不存在于試劑盒內(nèi),而是提供從遠(yuǎn)程獲得它的手段,例如通過因特網(wǎng)提供。該實施方案的一個實例是包括web網(wǎng)址的試劑盒,其中說明書可從所述網(wǎng)址閱讀和/或下載。對于說明書而言,獲得說明書的手段記錄在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上。另一方面,本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療脊柱側(cè)凸(例如特發(fā)性脊柱側(cè)凸,如嬰兒特發(fā)性脊柱側(cè)凸、幼年特發(fā)性脊柱側(cè)凸或青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))的方法,包括向個體施用有效量的通過上述篩選方法鑒定的化合物(和/或包含化合物的組合物)。組合物(例如藥物組合物)通過將上述篩選方法鑒定的化合物(例如肽類、小分子)與任何適當(dāng)?shù)乃幱幂d體/賦形劑或藥用載體/賦形劑的組合一起配制來制備??芍苽淙魏问┯猛緩降闹苿珈o脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、口服、直腸、陰道、透皮、經(jīng)粘膜、舌下等。在一個實施方案中,上述個體是哺乳動物,在另一個實施方案中是人。通過閱讀以下借助附圖僅以舉例方式給出的非限制性的特定實施方案的說明,本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和特征將是很明顯的。附圖簡述附圖中[重新編號的頁面]圖1顯示了 Gi蛋白在CDS檢測的褪黑激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。圖中的數(shù)據(jù)來自最大阻抗響應(yīng),對應(yīng)于一式三份進(jìn)行的3次獨立實驗的平均值士SE ;圖2顯示來自對照個體(非IS)和IS患者的成骨細(xì)胞用福司柯林預(yù)處理,以誘導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶活性和隨后的cAMP生成。細(xì)胞隨后用遞增濃度的褪黑激素激發(fā),通過褪黑激素降低cAMP水平的能力評估褪黑激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能狀態(tài)。使用無褪黑激素存在下福司柯林誘導(dǎo)的cAMP生成來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù);圖3顯示了經(jīng)特異性配體活化后從AIS患者或?qū)φ諅€體獲得的成骨細(xì)胞上表達(dá)的不同的&蛋白偶聯(lián)受體的響應(yīng),其通過細(xì)胞介電譜(CDS)測定。與對照Γ)、組3(Ψ) 或組 2(Ω)的比較如下*,Ψ,Ω, ρ < 0.05 ;ΨΨ,Ω Ω, ρ < 0.01 ;ΨΨΨ,ρ < 0. 001 ;圖4使用不同的配體比較了 Gi偶聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,以細(xì)胞介電譜(CDS)測定的最大響應(yīng)百分比表示。對來自對照個體(非is)和IS患者(組1、2和3)的成骨細(xì)胞應(yīng)用遞增濃度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca和CB65。通過CDS在 CellKey 儀器中測定隨后的細(xì)胞響應(yīng)。從最大阻抗強度產(chǎn)生曲線。根據(jù)對照患者細(xì)胞的最大響應(yīng)來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),用一式兩份進(jìn)行的三次獨立實驗的平均值士SE表示;圖5顯示了經(jīng)特異性配體活化后從AIS患者或?qū)φ諅€體獲得的成肌細(xì)胞上表達(dá)的不同的&蛋白偶聯(lián)受體的響應(yīng),其通過細(xì)胞介電譜(CDS)測定。與對照Γ)、組3(Ψ) 或組 2(Ω)的比較如下*,Ψ,Ω, ρ < 0.05 ;ΨΨ,Ω Ω, ρ < 0.01 ;ΨΨΨ,ρ < 0. 001 ;
圖6使用不同的配體比較了 Gi偶聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,以細(xì)胞介電譜(CDS)測定的最大響應(yīng)百分比表示。對來自對照個體(非is)和IS患者(組1、2和3)的成肌細(xì)胞應(yīng)用遞增濃度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca和CB65。通過CDS在 CellKey 儀器中測定隨后的細(xì)胞響應(yīng)。從最大阻抗強度產(chǎn)生曲線。根據(jù)對照患者細(xì)胞的最大響應(yīng)來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),用一式兩份進(jìn)行的三次獨立實驗的平均值士SE表示;圖7顯示了經(jīng)特異性配體活化后從AIS患者或?qū)φ諅€體獲得的PBMC上表達(dá)的不同的Gi蛋白偶聯(lián)受體的響應(yīng),其通過細(xì)胞介電譜(CDQ測定。與對照Γ)、組3(Ψ)或組 2(Ω)的比較如下*,Ψ,Ω,ρ < 0. 05 ;**,ΨΨ,Ω Ω,ρ < 0. 01 ;***,ΨΨΨ,ρ < 0. 001 ;圖8使用不同的配體比較了 Gi偶聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,以細(xì)胞介電譜(CDS)測定的最大響應(yīng)百分比表示。對來自對照個體(非is)和IS患者(組1、2和3)的PBMC(主要含有淋巴細(xì)胞)應(yīng)用遞增濃度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP5M、UK14304、IB-meca和CB65。 隨后通過⑶S在CellKey 儀器中測定細(xì)胞響應(yīng)。從最大阻抗強度產(chǎn)生曲線。根據(jù)對照患者細(xì)胞的最大響應(yīng)來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),用一式兩份進(jìn)行的三次獨立實驗的平均值士SE表示;圖9顯示在24#家族的PBMC中檢測到Gi偶聯(lián)受體對配體刺激響應(yīng)的改變,該家族所有已顯示成員的最大阻抗通過細(xì)胞介電譜(⑶幻測定。μ*表示ρ < 0. 001 ;圖10顯示在4個家族的PBMC中檢測到Gi偶聯(lián)受體對配體刺激響應(yīng)的改變23、 MJ9和39。該家族所有已顯示成員的最大阻抗通過細(xì)胞介電譜(⑶幻測定。μ*表示ρ < 0. 001 ;圖11顯示了來自對照個體和屬于功能組1、2和3的AIS患者的成骨細(xì)胞中獲得的值的范圍,使用(A) 300 μ M褪黑激素,(B) 300 μ M碘代褪黑激素,(C) 300 μ M ΒΡ554, (D) 300 μ M UK14304, (E) 300 μ M IB-meca 禾口 (F) 300 μ M CB65,其通過細(xì)胞介電譜(CDS)測定;圖12顯示了從對照個體和A)AIS患者或B)無癥狀風(fēng)險患者的PBMC中獲得的值的范圍,使用300μΜ碘代褪黑激素,其通過細(xì)胞介電譜(CDQ測定。各個點代表每個個體 3個孔的平均值,試驗的變異系數(shù)通常小于10% ;圖13Α)顯示了經(jīng)特異性配體活化后從無癥狀風(fēng)險患者、AIS個體和對照個體獲得的PBMC上表達(dá)的不同的&蛋白偶聯(lián)受體的響應(yīng),在時間O(Ttl)和18個月后(T18)通過細(xì)胞介電譜(⑶幻測定。B)提供了對無癥狀風(fēng)險患者獲得的PBMC(主要含有淋巴細(xì)胞)上褪黑激素受體的響應(yīng)的單個圖;圖14顯示了對照個體和AIS個體(組1、2和3)的成骨細(xì)胞中GPRC信號轉(zhuǎn)導(dǎo),使用不同配體(^、Gi和Gq以確定所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是否對Gi偶聯(lián)受體具有特異性;圖15顯示了已知的Gi蛋白偶聯(lián)受體列表;以及圖16顯示了已知的Gi蛋白偶聯(lián)受體的配體列表。說明性的實施方案描述本發(fā)明通過下列非限制性的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1個體臨床特征(對照、AIS和無癥狀者)已檢查的健康個體(對照)、AIS個體和無癥狀個體的臨床特征分別如下表I-III 所示。
表I.健康對照個體的臨床數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種用于確定測試化合物是否能有效治療脊柱側(cè)凸的方法,所述方法包括(a)使表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞與所述受體的配體在所述測試化合物存在或不存在情況下接觸;(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度;其中若存在所述測試化合物時相對于不存在該化合物時信號水平更高,表明所述測試化合物可用于治療脊柱側(cè)凸。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述脊柱側(cè)凸是特發(fā)性脊柱側(cè)凸。
3.權(quán)利要求1或2的方法,其中所述特發(fā)性脊柱側(cè)凸是青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的方法,其中所述細(xì)胞從患有AIS的個體獲得。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的方法,其中所述信號是所述細(xì)胞的阻抗變化。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所述阻抗變化通過細(xì)胞介電譜(CDQ測定。
7.權(quán)利要求1-6任一項所述的方法,其中所述細(xì)胞是成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
8.權(quán)利要求1-6任一項所述的方法,其中所述細(xì)胞是PBMC。
9.權(quán)利要求8的方法,其中所述細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-9的方法,其中所述受體是血清素受體、α-腎上腺素能受體、腺苷受體或大麻素受體。
11.權(quán)利要求10的方法,其中所述血清素受體是5-ΗΤ1Α。
12.權(quán)利要求10的方法,其中所述α-腎上腺素能受體是α 2_AD。
13.權(quán)利要求10的方法,其中所述腺苷受體是A3。
14.權(quán)利要求10的方法,其中所述大麻素受體是CB2。
15.權(quán)利要求1-14任一項所述的方法,其中所述配體是激動劑。
16.權(quán)利要求11的方法,其中所述配體是1-[3-(3,4_亞甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪馬來酸鹽(BP5M馬來酸鹽)。
17.權(quán)利要求12的方法,其中所述配體是5-溴-N-(4,5- 二氫-IH-咪唑-2-基)_6_喹喔啉胺(UK14304)。
18.權(quán)利要求13的方法,其中所述配體是1-脫氧-l-W-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β -D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
19.權(quán)利要求14的方法,其中所述配體是N-環(huán)己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基] 喹啉-4 (IH)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
20.權(quán)利要求1-19任一項所述的方法,包括測定由至少兩種不同配體誘導(dǎo)的信號強度。
21.權(quán)利要求1-20任一項的方法,包括測定至少兩種不同的Gi蛋白偶聯(lián)受體的信號強度。
22.一種用于診斷個體發(fā)展脊柱側(cè)凸傾向的方法,包括(a)使來自所述個體的表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞與所述受體的配體接觸;(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度;(c)將所述信號與相應(yīng)的參比信號進(jìn)行比較;以及(d)基于該比較來確定所述傾向。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述脊柱側(cè)凸是特發(fā)性脊柱側(cè)凸。
24.權(quán)利要求23的方法,其中所述特發(fā)性脊柱側(cè)凸是青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)。
25.權(quán)利要求22或23的方法,其中所述信號是所述細(xì)胞的阻抗變化。
26.權(quán)利要求25的方法,其中所述阻抗變化通過細(xì)胞介電譜(CDQ測定。
27.權(quán)利要求2216任一項所述的方法,其中所述細(xì)胞是成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
28.權(quán)利要求2246任一項所述的方法,其中所述細(xì)胞是PBMC。
29.權(quán)利要求觀的方法,其中所述細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
30.權(quán)利要求22-29任一項的方法,其中所述受體是血清素受體、α-腎上腺素能受體、 腺苷受體或大麻素受體。
31.權(quán)利要求30的方法,其中所述血清素受體是5-ΗΤ1Α。
32.權(quán)利要求30的方法,其中所述α-腎上腺素能受體是α 2_AD。
33.權(quán)利要求30的方法,其中所述腺苷受體是A3。
34.權(quán)利要求30的方法,其中所述大麻素受體是CB2。
35.權(quán)利要求22-34任一項所述的方法,其中所述配體是激動劑。
36.權(quán)利要求31的方法,其中所述配體是1-[3-(3,4_亞甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪馬來酸鹽(BP5M馬來酸鹽)。
37.權(quán)利要求32的方法,其中所述配體是5-溴-N-(4,5- 二氫-IH-咪唑-2-基)_6_喹喔啉胺(UK14304)。
38.權(quán)利要求33的方法,其中所述配體是1-脫氧-l-W-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β -D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
39.權(quán)利要求34的方法,其中所述配體是N-環(huán)己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基] 喹啉-4 (IH)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
40.權(quán)利要求22-39任一項所述的方法,包括測定由至少兩種不同配體誘導(dǎo)的信號強度。
41.權(quán)利要求22-40任一項的方法,包括測定至少兩種不同的Gi蛋白偶聯(lián)受體的信號強度。
42.權(quán)利要求Μ-41任一項的方法,其中所述個體是可能發(fā)展成青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸的候選者。
43.對具有特發(fā)性脊柱側(cè)凸的人類個體分類的方法,包括(a)使來自所述個體的表達(dá)與抑制性鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(Gi)蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞與所述受體的配體接觸;以及(b)測定所述配體在該細(xì)胞中誘導(dǎo)的信號強度,其中根據(jù)所述測定步驟的結(jié)果能夠?qū)⒕哂刑匕l(fā)性脊柱側(cè)凸的個體劃分在一個亞組中。
44.權(quán)利要求43的方法,其中所述特發(fā)性脊柱側(cè)凸是青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)。
45.權(quán)利要求43或44的方法,還包括基于測定步驟的結(jié)果為所述個體選擇治療。
46.權(quán)利要求43-45任一項的方法,其中所述信號是所述細(xì)胞阻抗的變化。
47.權(quán)利要求46的方法,其中所述阻抗的變化通過細(xì)胞介電譜(CDQ測定。
48.權(quán)利要求43所述的方法,其中所述細(xì)胞是成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。
49.權(quán)利要求43-48任一項的方法,其中所述受體是血清素受體、α-腎上腺素能受體、 腺苷受體或大麻素受體。
50.權(quán)利要求49的方法,其中所述血清素受體是5-ΗΤ1Α。
51.權(quán)利要求49的方法,其中所述α-腎上腺素能受體是CI2-AD。
52.權(quán)利要求49的方法,其中所述腺苷受體是Α3。
53.權(quán)利要求49的方法,其中所述大麻素受體是CB2。
54.權(quán)利要求43-53任一項所述的方法,其中所述配體是激動劑。
55.權(quán)利要求50的方法,其中所述配體是1-[3-(3,4_亞甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪馬來酸鹽(ΒΡ5Μ馬來酸鹽)。
56.權(quán)利要求51的方法,其中所述配體是5-溴-N-(4,5- 二氫-IH-咪唑-2-基)_6_喹喔啉胺(UK14304)。
57.權(quán)利要求52的方法,其中所述配體是1-脫氧-l-W-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β -D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
58.權(quán)利要求53的方法,其中所述配體是N-環(huán)己基-7-氯-1-[2-(4-嗎啉基)乙基] 喹啉-4 (IH)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
59.權(quán)利要求43-58任一項所述的方法,包括測定由至少兩種不同配體誘導(dǎo)的信號強度。
60.權(quán)利要求43-59任一項的方法,包括測定至少兩種不同的Gi蛋白偶聯(lián)受體的信號強度。
全文摘要
描述了用于診斷發(fā)展脊柱側(cè)凸(例如青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS))的傾向和鑒定基于Gi蛋白偶聯(lián)受體活性的調(diào)節(jié)來治療脊柱側(cè)凸的化合物的方法。該方法包括測定表達(dá)Gi蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞與配體的阻抗信號的改變。為了鑒定用于治療的化合物,使細(xì)胞與測試化合物和配體接觸。若存在所述測試化合物時相對于不存在測試化合物時阻抗更高,則測試化合物可用于治療脊柱側(cè)凸。
文檔編號C12Q1/00GK102239411SQ200980148704
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日
發(fā)明者A·莫羅, 東 M-Y·阿庫姆 申請人:圣-賈斯汀大學(xué)中心醫(yī)院
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