專利名稱：用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及在細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在小鼠和人類中已經(jīng)證明的是可以通過轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)(Lowry et al., 2008 ；Maherali et al. ,2007 ；Nakagawa et al. ,2008 ；Okita et al. ,2007 ；Park et al.， 2008 ；Takahashi et al. ,2006 ；Takahashi and Yamanaka,2006 ；Wernig et al. ,2007 ；Yu et al. ,2006)來將體細(xì)胞重新編程從而變成多能性。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPQ的產(chǎn)生對(duì)于實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)人化再生藥物(Yamanaka，2007 Jaenish and Young, 2008)帶來了很大的希望，因?yàn)榭梢允褂脧幕颊咦约浩つw細(xì)胞衍生的干細(xì)胞來產(chǎn)生細(xì)胞以及組織從而修復(fù)由疾病或老化引起的損害。已經(jīng)顯示轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4以及c-Myc或0ct4、Sox2、Nanog 以及LiM8的組合的強(qiáng)制表達(dá)引起成熟細(xì)胞恢復(fù)到多能性狀態(tài)。
在早期研究中，使用多種病毒載體來表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子(Takahashi以及 Yamanaka, 2006 ；Okita 等人，2007 ；Maherali 等人，2007 ；Wernig 等人，2007 ；Takahashi 等人，2006 ；Yu等人，2006 ；Park等人，2008)。由于多個(gè)整合事件，多載體的使用存在問題，其能夠?qū)е轮铝鲂燥L(fēng)險(xiǎn)增加(Takahashi以及Yamanaka，2006 ；Aoi等人，2008))。研究人員已經(jīng)試圖通過使用單載體系統(tǒng)(Sommer等人，2009)、可切除載體(Kaji等人，2009 ；SoIdner 等人，2009 ；Woltjen等人，2009)、非整合型載體(Stadtfeld等人，2009 ；Yu等人，2009)以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Okita等人，2009)來克服這個(gè)問題。然而，在實(shí)現(xiàn)外遺傳性重新編程方面這些方法是極其無效的。
用于誘導(dǎo)多能性的方法包括轉(zhuǎn)染癌基因c-Myc，因?yàn)樗鸢┑臐摿?，該基因是不合要求的。在不轉(zhuǎn)染c-Myc下可以產(chǎn)生iPS細(xì)胞(Nakagawa等人，2008 Jernig等人，2008)。 然而，重新編程的效率被顯著地降低了。類似地，Klf4可以誘導(dǎo)發(fā)育異常Ouster等人， 2005)。
因?yàn)榕c多病毒載體整合以及誘導(dǎo)多能性的這些基因中的一些的不希望的副作用相關(guān)的這些問題，對(duì)于用能夠調(diào)節(jié)多能性誘導(dǎo)基因的表達(dá)或其表達(dá)被多能性誘導(dǎo)基因所調(diào)節(jié)的蛋白基因產(chǎn)物以及蛋白或者能夠調(diào)節(jié)誘導(dǎo)多能性的基因或蛋白的表達(dá)的小分子來替換多能性誘導(dǎo)基因的一些或全部的使用存在一種需要。對(duì)于這個(gè)目標(biāo)，已經(jīng)報(bào)道的是引入基因產(chǎn)物而不是基因也誘導(dǎo)了多能性(aiou等人，2009)。用聚精氨酸標(biāo)記以易于進(jìn)入細(xì)胞的重組體0ct4、Sox2、Klf4以及c-Myc重新編程了小鼠體細(xì)胞。其他人已經(jīng)使用了小分子來替換對(duì)于核心集合的基因之一的需要。上調(diào)Nanog的小分子消除了對(duì)Klf4基因(該基因也上調(diào)Nanog)的需要(Lyssiotis等人，2009)。在另一項(xiàng)研究中，小分子HDAC抑制劑消除了對(duì)于Klf4和c-Myc兩者的需要(Huangfu等人，2008，a&b)。這些研究顯示1)蛋白基因產(chǎn)物可以替代對(duì)這些基因的需要；2)上調(diào)基因的小分子可以替代對(duì)這些基因的需要；以及3)在同一個(gè)調(diào)節(jié)通路中的基因(或基因產(chǎn)物)可以彼此替代。
盡管取得了這些成就，但是仍存在的主要問題是這些方法是重新編程低效率的。 目前在體細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的比率太低以至于它們使得iPS細(xì)胞的治療用途變得不切實(shí)際。因此，所需要的是鑒別多種蛋白以及小分子，它們或者單獨(dú)地亦或除了已經(jīng)被鑒別的那些之外，誘導(dǎo)多能性或提高細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的效率。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明是針對(duì)在細(xì)胞中誘導(dǎo)或維持多能性的一種方法，該方法包括將該細(xì)胞與增加MUCf活性的一種生物物質(zhì)亦或化學(xué)物質(zhì)相接觸。該生物物質(zhì)可以是一種基因或一種蛋白。該蛋白可以優(yōu)選地是一種MUC1*配體，優(yōu)選地該配體是匪23。該蛋白還可以是一種抗體，優(yōu)選地是特異性識(shí)別MUCf的PSMGFR序列的二價(jià)抗體。另一方面，該化學(xué)物質(zhì)可以是一種小分子。優(yōu)選地，該小分子可以增強(qiáng)MUC1、它的裂解酶、或匪23的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，該裂解酶可以是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。進(jìn)一步地，該小分子可以增強(qiáng)對(duì)MUCl的切割。該小分子可以是一種佛波酯。
另一方面，上述基因可以編碼MUCl或MUC1*、或其有效片段、或MUC1*的配體，例如但不限于MUC1*抗體或匪23。優(yōu)選地，該片段可以是MUCl或MUC1*的胞質(zhì)尾區(qū)。
在進(jìn)一步的其他方面中，本發(fā)明的目的在于將細(xì)胞與提高誘導(dǎo)多能性的基因產(chǎn)物的表達(dá)的另外的分子相接觸，例如但不限于提高0CT4、S0X2、NANOG、KLF4或LIN28，優(yōu)選地 0CT4以及S0X2的表達(dá)的分子。
從本發(fā)明的以下說明、所附的附圖以及所附的權(quán)利要求書可以更加充分地理解本發(fā)明的這些或其他目標(biāo)。


從下面在此給出的詳細(xì)說明以及附圖可以更加充分地理解本發(fā)明，這些附圖是僅通過說明的方式給出的，并且因此對(duì)于本發(fā)明不是限制性的，并且其中 圖1A-1F顯示了 MUCf提高生長(zhǎng)速率。A.克隆形成測(cè)定顯示用MUC1*轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞(3Y1)提高了生長(zhǎng)速率但是MUCl (全長(zhǎng))未提高生長(zhǎng)速率；B. MUCf活性提高了存活率。已經(jīng)獲得對(duì)TAXOL 耐受性的乳癌細(xì)胞通過提高M(jìn)UCf表達(dá)來做到這一點(diǎn)。用抗-MUCfFab處理將獲得的耐受性反轉(zhuǎn)為TAXOL -誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；C. MUCf細(xì)胞外域的配體誘導(dǎo)的二聚作用刺激了生長(zhǎng)。加入二價(jià)抗-MUCf抗體刺激了 MUCf-陽性細(xì)胞的生長(zhǎng)。用抗-MUCf (mv)Fab進(jìn)行阻斷抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。鐘形生長(zhǎng)曲線是受體二聚的特征。對(duì)照 MUCl-陰性HEK 293細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有受到影響；D.使用特異性siRNA來抑制MUC1*消除了加入MUC1* 二聚化配體造成的生長(zhǎng)刺激作用；E.匪23是天然的MUC1*激活配體。匪23刺激了 MUCl*-陽性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并且產(chǎn)生了表明受體二聚的鐘形曲線。通過siRNA抑制MUCl來消除影響；F.通過SI3R檢測(cè)到匪23直接結(jié)合到MUC1*肽上。15nM匪23結(jié)合到MUC1*胞外域肽上但沒有結(jié)合到不相關(guān)的肽上。使用SPR(表面等離振子共振)以及包被了 NTA-Ni-SAM 的Au芯片來進(jìn)行測(cè)量。
圖2A-2F顯示了在未分化的hESC上MUCl被切割，但是在已分化的hESC上MUCl 沒有被切割。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示未分化的(多能性的)干細(xì)胞表達(dá)MUCr并且不表達(dá)全長(zhǎng)蛋白；0CT4是多能性的金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物。所有多能性干細(xì)胞是MUCf-陽性的。然而，分化一開始(失去0CT4表達(dá))，切割就停止并且僅檢測(cè)到全長(zhǎng)MUCl (MUCl-FL)。圖A-C是同一個(gè)未分化的干細(xì)胞克隆的照片，這些克隆用以下各項(xiàng)來染色A.識(shí)別PSMGFR肽的抗-MUCf抗體；B.抗-0CT4 ；C.抗-MUCl全長(zhǎng)VU4H5。圖D-F是同一個(gè)新分化的干細(xì)胞克隆的照片，這些克隆用以下各項(xiàng)來染色D.識(shí)別PSMGFR肽的抗-MUCf抗體；E.抗-0CT4 ；F.抗-MUCl全長(zhǎng) VU4H5。
圖3A-3F顯示了 NM23 (MUC1*配體)與MUC1*和0CT4共定位在未分化的hESC上并且不共定位在已分化的細(xì)胞上。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示未分化的(多能性的)干細(xì)胞表達(dá)MUCf 以及它的激活配體匪23。然而，當(dāng)干細(xì)胞開始分化時(shí)(失去0CT4表達(dá))，則順以以全長(zhǎng)蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)并且不再分泌匪23。虛線指示未分化的部分與新分化的部分之間的邊界。圖A-C是同一個(gè)未分化的干細(xì)胞克隆的照片，這些克隆用以下各項(xiàng)來染色A.識(shí)別匪23 的抗體；B.識(shí)別PSMGFR肽的抗-MUCf抗體；C. (A)、⑶以及用DAPI來染色從而將細(xì)胞核染色的相同細(xì)胞的疊加。圖D-F是同一個(gè)未分化的干細(xì)胞克隆的照片，這些克隆用以下各項(xiàng)來染色D.識(shí)別匪23的抗體；E.識(shí)別0CT4的抗體；F.⑶、(E)以及用DAPI來染色從而將細(xì)胞核染色的相同細(xì)胞的疊加。
圖4A-4B顯示在缺少bFGF以及條件培養(yǎng)基下，MUC1*的刺激促進(jìn)了生長(zhǎng)并且抑制了 hESC的分化。使用二價(jià)抗-MUCf抗體，在不加入bFGF或條件培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)五周之后，配體誘導(dǎo)的MUCf胞外域的二聚作用產(chǎn)生基本上100%的多能性克隆。將這些克隆生長(zhǎng)在基質(zhì)膠上。當(dāng)使用匪23或匪23 S120G突變體來激活MUC1*時(shí)，得到相同的結(jié)果。圖A-D(panels A-D)是多個(gè)孔的照片，在這些孔中細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加有來自成纖維細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基加上抗-MUCf或bFGF。圖E-H(panels E-H)是多個(gè)孔的照片， 在這些孔中干細(xì)胞被培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基加上抗-MUCf或bFGF中。這些圖像是用以下各項(xiàng)染色的細(xì)胞A.識(shí)別0CT4的抗體；B. (A)的細(xì)胞的DAPI染色；C.抗-MUC1* ；D. (C)的細(xì)胞的DAPI染色；E.識(shí)別0CT4的抗體；F. (E)的細(xì)胞的DAPI染色；G.抗-MUCf ；H. (G)的細(xì)胞的DAPI染色。
圖5顯示一個(gè)柱形圖，該圖表明對(duì)于多能干細(xì)胞生長(zhǎng)需要MUCf活性。用抗-MUCfFab阻斷MUCf在8_12小時(shí)內(nèi)引起全部干細(xì)胞死亡(甚至在bFGF和條件培養(yǎng)基 (CM)存在下)。二價(jià)的抗-MUCf刺激了生長(zhǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)25小時(shí)，在鈣黃綠素?zé)晒鉁y(cè)定中對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。
圖6A-6B顯示了證明MUC1*轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞核中的照片。將MUCfFab進(jìn)行熒光標(biāo)記(紅色)然后與MUCf-陽性細(xì)胞進(jìn)行孵育。這些照片顯示最初MUC1*被均勻分布在細(xì)胞表面上。然而，在40分鐘之后，MUCf被集中在細(xì)胞核中。為了比較，還用識(shí)別EEAl的熒光標(biāo)記抗體(綠色)將這些細(xì)胞染色，貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)EEAl保持均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中。A.在零時(shí)刻拍攝的細(xì)胞的照片；B.在加入抗-MUCf的Fab之后40分鐘拍攝的細(xì)胞的照片。
具體實(shí)施例方式在本申請(qǐng)中，使用“一”和“一個(gè)”是指單數(shù)以及復(fù)數(shù)的對(duì)象。
如本文中使用的，“提高M(jìn)UCf活性”是指直接地或間接地調(diào)高M(jìn)UCf信號(hào)，并且包括而不限于MUC1*受體的二聚作用以及通過切割MUCl受體來提高M(jìn)UC1*的生產(chǎn)。還可以通過MUCl受體的更高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(該MUCl受體被進(jìn)一步切割并且二聚)來提高M(jìn)UCf活性。 因此，一方面，可以通過二聚MUC1*的效應(yīng)分子的更高活性，或切割MUCl從而形成MUC1*的裂解分子的更高的活性，或MUCl的提高的表達(dá)來提高M(jìn)UCf活性。因此，能夠提高M(jìn)UCf 二聚配體的活性的任何化學(xué)的或生物物質(zhì)、用來形成MUCf的MUCl裂解酶、或增強(qiáng)MUCl表達(dá)的任何轉(zhuǎn)錄激活因子都被包括為“提高M(jìn)UCf活性”的物質(zhì)。
如本文中使用的，“MUC1生長(zhǎng)因子受體”(MGFR)是一個(gè)功能性定義是指與激活的配體(例如一種生長(zhǎng)因子或一種修飾酶(例如一種裂解酶))相互作用的MUCl受體的部分。 MUCl的MGFR區(qū)是最接近于細(xì)胞表面的胞外部分，并且由PSMGFR的大多數(shù)或全部來定義，定義如下。MGFR包括未修飾的肽和已經(jīng)經(jīng)歷酶修飾(像，例如，磷酸化、糖基化等)的肽。
如在本文中使用的，"MUC1生長(zhǎng)因子受體的一級(jí)序列”(PSMGFR)是指在一些情況下定義了 MGFR的大多數(shù)或全部的肽序列，以及該肽序列的功能性變異體和片段。該P(yáng)SMGFR 被定義為SEQ ID NO :6，以及它的所有功能性變異體以及片段，其中它的所有功能性變異體以及片段在它們的N端和/或C端具有最高到20個(gè)(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、或20)的任何整數(shù)值的氨基酸取代和/或最高到20個(gè)的任何整數(shù)值的氨基酸添加或缺失。在上述背景中“功能性變異體或片段”是指這樣的變異體或片段， 它具有特異性結(jié)合到配體上、或另外地特異性與配體相互作用的能力，這些配體特異性結(jié)合到SEQ ID NO :6的肽上，或另外地特異性與其相互作用，同時(shí)不強(qiáng)烈地結(jié)合到與它們自己一致的其他肽分子的一致的區(qū)域上，這樣使得這些肽分子將具有與其他一致的肽分子聚集的能力(即自聚集)。PSMGFR的一個(gè)實(shí)例(它是SEQ NO 6的PSMGFR肽的一種功能性變異體)是SEQ ID NO 8,它與SEQ ID NO 6不同在于包括一個(gè)-SPY-序列而不是-SRY-。
如在本文中所使用的，“MUC1*”是指N端被截短的MUCl蛋白，這樣使得胞外域基本上由 PSMGFR(SEQ ID NO 5)構(gòu)成。
如在本文中使用的，“MUC1*相關(guān)因子”是指改變、激活、調(diào)節(jié)MUC1*的活性或調(diào)節(jié) MUCf的表達(dá)的試劑。相關(guān)因子包括但不限于影響MUCf受體二聚的、提高M(jìn)UCf的產(chǎn)量的、 誘導(dǎo)切割MUCl受體的試劑，通過更高地轉(zhuǎn)錄表達(dá)MUCl受體來提高M(jìn)UC1*活性的試劑，該 MUCl受體被進(jìn)一步切割并且二聚。
如在本文所使用的，“有效量”是足以產(chǎn)生有益的或所希望的臨床結(jié)果或生物化學(xué)結(jié)果的量?？梢詫⒂行Я渴┯靡淮位蚨啻巍榱吮景l(fā)明的目的，一種抑制劑化合物的有效量是足以誘導(dǎo)或維持細(xì)胞的多能性或激活MUCf的量。
如在此所使用的，“片段”或“功能性衍生物”是指本發(fā)明的天然配體或受體的生物活性的氨基酸序列變異體以及片段，以及共價(jià)修飾，包括通過與有機(jī)衍生試劑進(jìn)行反應(yīng)得到的衍生物，翻譯后修飾、具有非蛋白質(zhì)的聚合物的衍生物、以及免疫粘附。
如在本文所使用的，“配體”是指任何分子或試劑，或特異性共價(jià)地或暫時(shí)地結(jié)合到一種分子(例如一種多肽)上的化合物。當(dāng)用于某一背景中時(shí)，配體可以包括抗體。在其他背景中，“配體”可以指試圖用來被具有高親和性的另一種分子結(jié)合的分子，例如但不限于用于MUCf的天然的或非天然的配體或結(jié)合到MUCl或MUC1*上的裂解酶或用于MUC1* 的二聚配體。
如在本文使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指兩個(gè)分子之間的一種非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)， 例如在以下各項(xiàng)之間抗體分子與抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)、或非抗體配體與另一種多肽(例如匪23與MUCf特異性結(jié)合)進(jìn)行反應(yīng)、或抗體結(jié)合到MUC1*上或裂解酶結(jié)合到MUCl或MUC1* 上。
如在此使用的，“載體”、“多核苷酸載體”、“構(gòu)建體”以及“多核苷酸構(gòu)建體”在此可互換地使用。本發(fā)明的多核苷酸載體可以是處于幾種形式中的任何一種，包括但不限于 RNA、DNA、封裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒外殼內(nèi)的RNA、封裝在腺病毒外殼內(nèi)的DNA、包裝成另一種病毒的或病毒樣的形式的DNA(例如，單純性皰疹、以及腺病毒相關(guān)病毒(AAV))、封裝在脂質(zhì)體中的DNA、與聚賴氨酸絡(luò)合的DNA、與合成的聚陽離子分子絡(luò)合的DNA、與多種化合物(例如用來免疫地“遮蔽”分子和/或增加半衰期的聚乙二醇(PEG))絡(luò)合的DNA或結(jié)合到非病毒性蛋白上的DNA。如在本文使用的，“DNA”不但包括堿基A、T、C、以及G，而且包括它們的類似物或這些堿基的修飾形式中任何一種，例如甲基化的核苷酸類、核苷酸之間的修飾(例如不帶電連接以及硫代酯)、使用糖類似物、以及修改的和/或可替代的主鏈結(jié)構(gòu)(例如聚酰胺)。
序列表獨(dú)立文本 關(guān)于使用除了 a、g、c、t之外的核苷酸符號(hào)，它們遵循WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST. 25中列出的約定(表1附件幻，其中k代表t或g ；η代表a、c、t或g ;m代表a或c ；r代表a或g ；s代表c或g ;w代表a或t,而y代表c或t。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSV LSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATffGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTS APDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTS ASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHS SVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSAQSGAGVPGffGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA ASANL(SEQ ID NO 1)描述了全長(zhǎng)MUCl受體(粘蛋白1前體，Genbank登錄號(hào) P15941) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO 2) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO :3) MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO :4) SEQ ID NO :2、3和4描述了用于將MUCl受體以及截短的同種型引導(dǎo)到細(xì)胞膜表面上的N末端MUC-I信號(hào)序列。如通過SEQ ID NOS :2、3以及4的變異體所指示的，可以在 C末端缺少達(dá)3個(gè)氨基酸。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG WGIALLVLVCVLVALAIVY LIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYP TYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASA NL (SEQ ID NO :5)描述了一種截短的MUCl受體同種型(isoform)，該同種型在它的N末端具有nat-PSMGFR并且包括全長(zhǎng)MUCl受體的跨膜序列以及細(xì)胞質(zhì)的序列。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO 6)描述了 MUCl 生長(zhǎng)因子受體的天然一級(jí)序列(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的一個(gè)實(shí)例) TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO :7)描述了 MUCl 生長(zhǎng)因子受體的天然一級(jí)序列(nat-PSMGFR- “PSMGFR”的一個(gè)實(shí)例)，在SEQ ID NO 6的N 端具有一個(gè)單氨基酸缺失。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO 8)描述了具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的MUCl生長(zhǎng)因子受體的天然一級(jí)序列的“SPY”功能性變異體 (var-PSMGFR- “PSMGFR” 的一個(gè)實(shí)例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO 9)描述了具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性的MUCl生長(zhǎng)因子受體的天然一級(jí)序列的“SPY”功能性變異體 (var-PSMGFR- “PSMGFR”的一個(gè)實(shí)例)，在SEQ ID NO 8的N端具有一個(gè)單氨基酸缺失。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatg agcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaa g gtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg (SEQ ID NO 10)描述了 MUCl細(xì)胞質(zhì)區(qū)核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKV SAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO 11)描述了 MUCl 細(xì)胞質(zhì)區(qū)氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgctt cac ttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcg caccttt ttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttt tctcgacaa ctggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgc tagcccta attaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactat d.d.CCd.d.d.0 tcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagacccttt ttcaatgagc tgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtg aatggaaaagact gctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctt tggaacagatg gcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttt tttccttcaagtg gaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaa ggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttctt gatgtactttatgtatagaa aataa (SEQ ID NO 12)描述了 NME7 核苷酸序列(NME7 :GENBANK 登錄號(hào) AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYP⑶GSVEMHDVKNHRT FLKRTKYDNLHLEDLFIGN KVNVFSRQLVLIDY⑶QYTARQLGSRKEKTLAL IKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVD HQSRPFFNEL IQFITTGPIIAMEILRDDAICEffKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGI RNAAHGPDSFASA AREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGM LNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO 13)描述了 NME7 氨基酸序列(NME7 :GENBANK 登錄號(hào) AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatac agg aaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggaga ga ttatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttct caagg aacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggta gttg ccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagac t ccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtg g agagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaac tggatctatgaatga(SEQ ID NO :14)描述了 NM23-H1 核苷酸序列(NM23-H1 :GENBANK 登錄號(hào) AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEI IKRFEQKGFRLVGLKFMQ ASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAM VffEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNI IHGSDSVESAEK ElGLffFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO: 15)描述了 NM23-H1 氨基酸序列 (NM23-H1 :GENBANK 登錄號(hào) AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatac agg aaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggaga ga ttatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttct caagg aacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggt Bgttg ccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcaga ct ccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgt gg agagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaa c tggatctatgaatga(SEQ ID NO :16)描述了 NM23-H1 S120G 突變體核苷酸序列(匪23-H1 GENBANK 登錄號(hào) AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEI IKRFEQKGFRLVGLKFMQA SEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAM VWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHG ⑶ SVESAEK ElGLffFHPEELVDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)描述了 NM23-H1S120G 突變體氨基酸序列(匪23-H1 :GENBANK 登錄號(hào) AF487339)。
atg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccBccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcggaaaaccaagacgctcatgaagaaggataagtacacgctgcccggcgggctgCtggCCCCCggcggcaatagcatggcgagcggggtcggggtgggcgccggCCtgggCgCgggcgtgaaccagcgcatggacagttacgcgcacatgaacggctggagcaacggcagctacagcatgatgcaggaccagctgggctacccgcagcacccgggcctcaatgcgcacggcgcagcgcagatgcagcccatgcaccgctacgacgtgagcgccctgcagtacaactccatgaccagctcgcagacctacatgaacggctcgcccacctacagcatgtcctactcgcagcagggcacccctggcatggctcttggctccatgggttcggtggtcaagtccgaggccagctccagcCCCCCtgtggttacctcttcctcccactccagggcgccctgccaggccggggacctccgggacatgatcagcatgtatctCCCCggCgCCgaggtgccggaacccgccgcccccagcagacttcacatgtcccagcactaccagagcggcCCggtgCCCggcacggccattaacggcacactgcccctctcacacatgtga(SEQ ID NO18)描述了
SEQ ID No :1 人 S0X2 核苷酸序列(S0X2 :GENBANK 登錄號(hào) 003106)。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFM VWSRGQRRKMAQENPKMHN SEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALH MKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVG VGAGLGAGV NQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSAL QYNSMTSSQTYMNG SPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTS SSHSRAPCQA⑶LRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMS QHYQSGPVPGTAIN GTLPLSHM(SEQ ID NO :19)描述了人 S0X2 氨基酸序列(S0X2 :GENBANK 登錄號(hào) 003106) ο atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggg gggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatc gggc cgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtgggg ggatggc gtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctga gggcgaagca ggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctg gtgccgtgaagctgg agaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcag aaagaactcgagcaatttgc caagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtgg ggctcaccctgggggttctattt gggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttag cttcaagaacatgtgtaagctgc ggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttc aggagatatgcaaagcagaaaccct cgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtg agaggcaacctggagaatttgttcctgcag tgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagc agettgggctcgagaaggatgtggtccgagtgt ggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagca gcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgg gtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggc cccagggccccattttggtaccccaggctatgggagc cctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctg agggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactc tgggctctcccatgcattcaaactga(SEQ IDNO :20)描述了人 0CT4 核苷酸序列。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGP GVGPGSEVWGIPPCPPPYE FCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGV GVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQK ELEQFAKLL KQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEAI^QLSFK匪CKLRPLLQ KWVEEADNNENLQE ICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTL QQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQR EDFEAAGSPFSGGP VSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN (SEQ ID NO 21)描述了人0CT4氨基酸序列。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggc g agatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaaca cctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggc c ggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatc cag cagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtg at tcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgct catgactgggtctatgaataa (SEQ ID NO :22)描述了 N1C3-H2 核苷酸序列(匪M-H2 :GENBANK 登錄號(hào) AK3i:3448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLK QHYIDLKDRPFFPGLVK YMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKP GTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELV DYKSCAHDWVYE (SEQ ID NO :23)描述了匪M-H2 氨基酸序列(匪M-H2 :GENBANK 登錄號(hào) AK313448)。
atggctgtcagcgacgcgctgetcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaa gacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttccccc agtg cttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccg gtgcggctt gcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctgg acctggactttat tctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtca gcctcctcttcg tcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatc cgggccgggaacg acccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtcc gctccccctccgacggctcc cttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccg agctcctgcggccagaattggac ccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctga tgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgc tgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgt cacgaaaggcagccctgacggcagccaccc ggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacg tgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgc acccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggcc accggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagc tccccagcaggactaccccgaccctgggtcttg aggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgct tcctcccggcttccatccccacccggggcc caattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccg ccgctccattaccaagagctcatgccacc cggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgat cgtggccccggaaaaggaccgcc acccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttccca tctcaaggcacacctgcgaac ccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattc gcccgctcagatgaactga ccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgacc gagcattttccaggtc ggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt (SEQ ID NO :24)描述了 KLF4 核苷酸序列(KLF4 GENBANK 登錄號(hào) AF022184)。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVL PAGPYDLAAATVATDLESA GAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILS NSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYP IRAGNDPGV APGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIP PQQPQPPGGGLMGK FVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPY NGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHD FPLGRQLPSRTTPT LGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMP PGSCMPEEP KPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTG EKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRP FQCQKCDRAFSRSDHLALH MKRHF (SEQ ID NO 25)描述了 KLF4 氨基酸序列(KLF4 GENBANK 登錄號(hào) AF022184)。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcacca acaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccag cagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgctgcc caccc cgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgctcgccctcctacgttgcggtcacacccttctccctt cgggg agacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgct gggaggagac atggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatcc aggactgtatgt ggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgc gcgcaaagacagcgg cagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgca ggatctgagcgccgccgcc tcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagct cgcccaagtcctgcgcctcgc aagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtc ctccccgcagggcagccccga gcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctg aggaggaacaagaagatgaggaagaa atcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtc agagtctggatcaccttctgctggaggcc acagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacg tctccacacatcagcacaactacgcagcgcc tccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaag ttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagc aacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccg aggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttgg agcgccagaggaggaacgagctaaaacggagctttt ttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatga aaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagcc acagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctc atttctgaagaggacttgttgcggaaacgacg agaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtg eg (SEQ ID NO 26)描述了 c-Myc 核苷酸序列(c-Myc :GENBANK 登錄號(hào) BC000917)。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQ QQQSELQPPAPSEDIWKKF ELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDN DGGGGSFSTADQLEMVTELLG⑶MVNQSFICDPDDETFIKNII IQDCMWSGF SAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECID PSVVFPYPLNDSSS PKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHE ETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESG SPSAGGHSKPPHSP LVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPR SSDTEENVK RRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKK ATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKL EQLRNSCA(SEQ ID NO :27)描述了 c_Myc 氨基酸序列(c_Myc :GENBANK 登錄號(hào) BC000917)。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgag ga ggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagt ggttcaac gtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagt ggatgtctttg tgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggag ttcacctttaagaa gtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattggga gtgagaggcggcca aaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtgga ggtctagatcatcatgcca aggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatca gccatatggtagcctcatgtcc gctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcg agaggaagaagaagaaatccacagc cctaccctgctcccggaggcacagaat (SEQ ID NO :28)描述了 LIN^ 核苷酸序列(LI^8 :GENBANK 登錄號(hào) AF521099)。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNV RMGFGFLSMTARAGVALDP PVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSA KGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGG LDHHAKECK LPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLP EAQN(SEQ ID NO: 29)描述了 LI似8氨基酸序列(LI^8 :GENBANK登錄號(hào)AF521099)。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgetccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcc t ccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccgg g gacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacg get tgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccaga caagtt tggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacata atgaaatc actttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaagg cgttccgcg tgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccat gagaagcaggc cgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgaggg cggcttcctggcc catgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttg gactgtcaggaatg aggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctgg ggctcgagcattccag tgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgct gcccgatgatgaccgc cggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccct caacccaggactacctccc ggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgac gggaactttgacaccgtggc catgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgag gaataaccaagtgatggatgga tacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaaca ctgcctacgagaggaaggatggca aattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccc tggaacctggctaccccaagcacat taaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctc ttctggatgcccaatggaaagacctac ttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggca gtggatagcgagtaccccaagaacatca aagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgg gcagcgatgaagtcttcacttacttctacaa ggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtag aaccgggctaccccaagtcagccctgagggac tggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggg gactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtgg acgaggagggcggcggggcggtgagcgcggct gccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggt gggccttgcagtcttcttcttcagacgccatg ggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggac aaggtc (SEQ ID NO :30)描述了 MMP14 核苷酸序列(MMP14 :GENBANK 登錄號(hào) BC064803)。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGD LRTHTQRSPQSLSAAIAAM QKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGA EIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAI RKAFRVWES ATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLAHAYFP GPNIG⑶THFDSAE PWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIM APFYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPP QPRTTSRPSVPDKP KNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFW RGLPASINT AYERKDGKFVFFK⑶KHWVFDEASLEPGYPKHIKELGRGLPTD KIDAALFWMPNGKTYFFRGNKYYRFNEELRAVD SEYPKNIKVWEGIPESPRG SFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEG TEEE TEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPR RLLYCQRSLLDKV(SEQ ID NO :31) 描述了 MMP14氨基酸序列(MMP14 :GENBANK登錄號(hào)BC064803)。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttg caaa ccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaa agtacg gctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagc tgcca tgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccc cga tgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggac ag aaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattag a aaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatgg aga gggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgag cca tggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctc tggg attggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaa acta cctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacct ctac cgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggc c tccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattct t cgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggataccca atgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgt g ttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacc cttg gaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttca aggg agacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctg ga aagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaag ga gtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgg gc tgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactgga caacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggttt ac actgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggt g(SEQ ID NO 32)描述了 MMP16 核苷酸序列(MMP16 :GENBANK 登錄號(hào) AB009303)。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVffLQK YGYLPPTDPRMSVLRSAE TMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDffMKKPRC GVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPK VGDPETRKAIR RAFDVffQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGF LAHAYFPGPGI G⑶THFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHS NDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGP PDKIPPPTRPLPTVPPH RSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFK DQffFff RVRNNRVMDGYPMQITYFffRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYffV FKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDS AIffffEDVGKTYFFKGDRYffRYSEE MKTMDPGYPKPITVffKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYffKFNNQILK V EPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVI PCILALCLLVLVYTVFQFKRK GTPRHILYCKRSMQEffV (SEQ ID NO 33)描述了 MMP 16 氨基酸序列(MMP16 :GENBANK 登錄號(hào) AB009303)。
多能性的誘導(dǎo) 最近發(fā)現(xiàn)可以將體細(xì)胞重新編程以恢復(fù)到多能性狀態(tài)。可以將編碼轉(zhuǎn)錄因子 0CT4、S0X2、KLF4、NANOG、c-MYC以及LIN28的基因或它們自身的蛋白引入體細(xì)胞中并且引起反轉(zhuǎn)到多能性狀態(tài)。許多這些多能性因子以前被認(rèn)為是癌基因。C-Myc是熟知的癌基因， 并且類似地，已經(jīng)顯示Klf4誘導(dǎo)了發(fā)育異常Ouster等人，200 。0CT4被認(rèn)為是用于鑒別多能性干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。在細(xì)胞核中存在0CT4表明該細(xì)胞是多能性的并且它的缺少表明該細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入分化過程并且不再能夠分化成任何細(xì)胞類型。< 0} {0 > Recently, it became known that 0CT4 is also present in the nucleus of many cancer cells,but not in normal mature cells. < } 0 { >最近，變得已知的是0CT4還存在于多種癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，但不存在于正常的成熟細(xì)胞中。本申請(qǐng)的發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)MUCl跨膜蛋白(SEQID NO 1)的一種切割形式(MUCl)是一種強(qiáng)生長(zhǎng)因子受體，該受體被表達(dá)于估計(jì)75%的實(shí)體瘤癌瘤上(Raina等人，2009)并且它還以這種“致瘤的”形式被表達(dá)于多種多能性干細(xì)胞上(Hikita等人，2008)。本發(fā)明涉及MUC1*和MUC1*相關(guān)因子以及使用它們來誘導(dǎo)或維持多能性或用來提高誘導(dǎo)多能性的效率的方法。
本發(fā)明包括使用MUCf相關(guān)因子(這些因子包括蛋白因子、編碼它們的基因、或影響它們的表達(dá)的小分子)來誘導(dǎo)或提高產(chǎn)生iPS細(xì)胞的效率。我們已經(jīng)顯示MUCl跨膜蛋白的一種切割形式(MUCf)是一種主要的生長(zhǎng)因子受體，該受體介導(dǎo)了癌細(xì)胞和多能性干細(xì)胞兩者的生長(zhǎng)。干擾MUCf胞外域與它的活化配體(NM23)之間的相互作用對(duì)于多能性干細(xì)胞是致命性的(Hikita等人，2008)，這表明該通路對(duì)于多能性是至關(guān)重要的。NM23是激活MUCr的一種配體(Mahanta等人，2008) (SEQ ID NO :12-17以及22-23)。除了它能夠刺激多能性干細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)抑制分化之外，已經(jīng)顯示匪23誘導(dǎo)c-Myc的轉(zhuǎn)錄(Dexheimer等人，2009)。因此，將匪23加入到正在轉(zhuǎn)變成多能性狀態(tài)的細(xì)胞中將提供轉(zhuǎn)染該c-Myc癌基因同時(shí)減輕相關(guān)健康風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)。此外，通過匪23或一種二價(jià)抗-MUCf抗體來刺激MUCf 激活了 MAP激酶增殖通路，該通路增加了細(xì)胞存活率(Mahanta等人，2008)。NANOG表達(dá)誘導(dǎo)了多能性；腫瘤抑制劑P53抑制了 Nanog表達(dá)(Lin等人，2007)。因此，通過抑制p53 減少或消除了為了誘導(dǎo)多能性而對(duì)NANOG的需要。已經(jīng)顯示異位表達(dá)的MUCl胞質(zhì)尾區(qū)的 72-氨基酸片段(MUClO-CT)存在于癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，在那里它結(jié)合到p53啟動(dòng)子上(Wei 等人，2007)?？梢詫UCl-⑶的大致72氨基酸片段(例如SEQ ID NO=Il中所示)與其他多能性誘導(dǎo)因子相結(jié)合使用以誘導(dǎo)或增強(qiáng)iPS細(xì)胞產(chǎn)生。然而，這種肽不對(duì)應(yīng)于自然發(fā)生的MUCl種類，并且因此可能產(chǎn)生不希望的作用。本發(fā)明的諸位發(fā)明人披露了 MUCf轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中(實(shí)例1和9，以及圖6)并且因此被獨(dú)自地或與其他多能性誘導(dǎo)因子相結(jié)合來使用用來誘導(dǎo)或增強(qiáng)iPS細(xì)胞產(chǎn)生。為了支持這種方法，已經(jīng)報(bào)道的是來自該核心集合的多能性基因的幾個(gè)基因調(diào)節(jié)了 MUC1、它的裂解酶和/或它的活化配體匪23的轉(zhuǎn)錄(Boyer等人，2005)。0CT4和S0X2結(jié)合到MUCl啟動(dòng)子上并且還結(jié)合到它的裂解酶(MMP-14)的啟動(dòng)子上。S0X2和NANOG結(jié)合到匪23啟動(dòng)子上。鑒于MUC1*對(duì)于維持hESC是至關(guān)重要的并且是這些關(guān)鍵多能性基因的靶，我們披露了可以使用引入MUCf，或增加MUCl裂解為MUCf形式的試劑、連同它的活性配體(匪23) —起來替換先前鑒定的多能性誘導(dǎo)因子中的一些或全部來誘導(dǎo)或增強(qiáng)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生。
本發(fā)明披露了用來在細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的、涉及MUCf的新的試劑和方法。使用這些試劑和方法來在體細(xì)胞或成熟細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。<0}本發(fā)明的另一方面，使用它們來增加在成熟細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性的效率。<0}本發(fā)明的另一個(gè)方面，使用它們來將未成熟的細(xì)胞維持在未成熟的狀態(tài)。本發(fā)明的另一方面，使用它們來抑制分化。本發(fā)明的另一方面， 使用這些試劑和方法來將干細(xì)胞維持在多能性狀態(tài)下。
本發(fā)明包括通過將影響MUCf以及它的相關(guān)因子的表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物引入到成熟細(xì)胞，或稍微分化的細(xì)胞中來反轉(zhuǎn)分化或維持干細(xì)胞樣的特征。MUCr是跨膜蛋白MUCl 的切割形式。MUC1*相關(guān)因子包括但不限于全長(zhǎng)MUC1、切割MUCl的酶、MUC1*活化配體以及影響MUCl或MUC1*表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明還涉及將MUC1*或MUC1*相關(guān)因子的基因或基因產(chǎn)物引入到成熟細(xì)胞或稍微分化的細(xì)胞中將在這些細(xì)胞或它們的子代中誘導(dǎo)多能性或干細(xì)胞性。本發(fā)明描述了它們?cè)诟杉?xì)胞中用于維持多能性的用途。可以將影響MUCf或MUCf相關(guān)因子的表達(dá)的試劑與已知用來誘導(dǎo)多能性的一種或多種基因或基因產(chǎn)物(包括 0CT4、S0X2、KLF4、NAN0G、c-myc以及LIN28)相結(jié)合加入，或者用來將其替換。
已經(jīng)顯示轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4以及c_Myc的組合或0ct4、Sox2、Nanog以及LiM8的組合的強(qiáng)制表達(dá)引起成熟細(xì)胞恢復(fù)到多能性狀態(tài)(Takahashi以及Yamanaka， 2006)。誘導(dǎo)多能性的這些轉(zhuǎn)錄因子的每一個(gè)調(diào)節(jié)了約一打(dozen)基因的轉(zhuǎn)錄。在這些之中有幾個(gè)本發(fā)明人已經(jīng)鑒定為MUCl-相關(guān)因子。0CT4和S0X2結(jié)合到MUCl啟動(dòng)子自身上。 S0X2和NANOG結(jié)合到NM23(NME7)啟動(dòng)子上。NM23(也稱為NME)以前被本發(fā)明人鑒定為 MUC1*的活化配體(Mahanta等人，2008)。NME7是MUCl*的一種活化配體。0CT4和S0X2兩者結(jié)合到MMP16的啟動(dòng)子上，我們?cè)诖伺兜腗MP16是MUCl的一種裂解(cleavage)酶。0CT4、 S0X2 或 NANOG 還結(jié)合到裂解酶 MMP2、MMP9、MMP10、ADAM TSL-I、ADAM TS-4、ADAM-17 ( 一種 MUCl裂解酶)、ADAM-TS16、ADAM-19以及ADAM-28的啟動(dòng)子位點(diǎn)上?？梢詫⑦@些裂解酶中的一些或全部上調(diào)以增加將MUCl切割成MUCf形式的切割以便誘導(dǎo)多能性或維持它(Boyer 等人，2005)。
我們以前的關(guān)于胚胎干細(xì)胞(這些胚胎干細(xì)胞僅表達(dá)MUCl的切割形式MUC1)的工作顯示它的胞外域的二聚刺激了生長(zhǎng)并且抑制了分化(Hikita等人，2008)。使用二價(jià)抗-MUC1*抗體、重組體匪23、亦或優(yōu)選地形成二聚體的突變體匪23(S120G)通過二聚MUC1* 胞外域來實(shí)現(xiàn)這些作用(Kim等人.，2003)。使用單價(jià)的抗-MUCfFab來抑制MUC1*胞外域是在數(shù)小時(shí)內(nèi)致死的。這些發(fā)現(xiàn)表明MUCf是一種顯著的“干細(xì)胞性”因子。此外，0CT4和 S0X2結(jié)合到MUCl基因啟動(dòng)子上并且還結(jié)合到它的裂解酶的啟動(dòng)子上。S0X2和NANOG結(jié)合到匪23(NME7)啟動(dòng)子上。因?yàn)樽钄郙UC1*的胞外域?qū)τ趆ESC是致死的，它遵循的是多能性基因0CT4、S0X2、以及NANOG誘導(dǎo)表達(dá)MUC1、它的裂解酶以及它的活性配體。可以通過轉(zhuǎn)染基因或引入基因產(chǎn)物(例如，單獨(dú)地MUCf或除了它的裂解酶和/或活化配體之外的NME7、 NME-Hl、NME-H2或?qū)UCl或MUC1*的PSMGFR表位二聚的抗體)來替換已經(jīng)顯示誘導(dǎo)多能性的基因或基因產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)。
如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的，可以將引導(dǎo)所轉(zhuǎn)染的基因產(chǎn)物定位的信號(hào)序列加入到該基因中。信號(hào)序列的實(shí)例被給出為SEQ ID NO :2-4。本發(fā)明考慮了可以將MUC1* 的N端結(jié)構(gòu)域截短或延伸達(dá)九(9)個(gè)氨基酸而基本上不改變這些基因或基因產(chǎn)物的作用。 以SEQ ID NO :5來舉例說明的MUC1*以及其胞外域基本上由SEQ ID NO :6、7、8和9中給出的序列組成的變異體是優(yōu)選的。
MUCK MUC1*、或相關(guān)因子(包括上面列出的那些)可以替代誘導(dǎo)多能性的基因或基因產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)并且用于誘導(dǎo)多能性或用于維持它。
在一個(gè)實(shí)例中，用編碼MUCl蛋白的基因來轉(zhuǎn)染體細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞)，該蛋白幫助誘導(dǎo)干細(xì)胞樣特征以及在一些實(shí)例中誘導(dǎo)子代變成多能性干細(xì)胞。 本發(fā)明的另一方面，將MUCf的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以誘導(dǎo)恢復(fù)到干細(xì)胞樣狀態(tài)并且在一些實(shí)例中誘導(dǎo)實(shí)際的多能性干細(xì)胞?？梢詫UCl或MUCf基因的每一個(gè)單獨(dú)地或與幫助誘導(dǎo)多能性或干細(xì)胞樣特征的其他基因相結(jié)合引入細(xì)胞。例如，將編碼MUCl或優(yōu)選地MUCf的 DNA連同編碼0CT4、S0X2、NAN0G、LI^8、KLF4JP /或c_Myc的基因中的一種或多種一起引入細(xì)胞。將對(duì)MUC1，優(yōu)選地MUC1*的截短形式進(jìn)行編碼的DNA連同對(duì)0CT4、S0X2、NANOG、以及LIN28進(jìn)行編碼的基因一起轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中(Yu等人，2007)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼MUCl，優(yōu)選地MUC1*的截短形式的DNA連同編碼0CT4、S0X2、KLF4、以及c_Myc的基因一起轉(zhuǎn)染到體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或其他細(xì)胞中(Takahashi等人，2007)。類似地，將對(duì)MUCf 和/或它的活性配體、匪23或匪23的S120G突變體進(jìn)行編碼的DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以誘導(dǎo)多能性?？梢詫UC1*和/或NM23連同其他基因(例如0CT4、S0X2、NANOG, LIN28、KLF4、 和/或c-Myc) —起轉(zhuǎn)染以誘導(dǎo)多能性或干細(xì)胞樣特征。還可以將對(duì)識(shí)別MUCf或MUCl的抗體進(jìn)行編碼的DNA獨(dú)自地或與其他基因一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以在這些細(xì)胞或它們的子代中誘導(dǎo)干細(xì)胞特征。如果抗-MUCf抗體被分泌，抗-MUCf抗體將二聚并且因此激活MUC1* 受體以及它的促進(jìn)或維持干細(xì)胞樣特征的功能。
類似地，將諸如核酸類、蛋白類、修飾的蛋白類或影響MUC1、MUC1*或它們的相關(guān)因子的表達(dá)的小分子類的多種因子引入細(xì)胞中來誘導(dǎo)干細(xì)胞的特征或恢復(fù)到多能性。例如，將 MUCl 裂解酶的基因或基因產(chǎn)物 MMP14、MMp 16, MMP2、MMP9、MMP10、ADAM TSL-U ADAM TS-4ADAM-17 ( 一種MUCl裂解酶)、ADAM_TS16、ADAM-19以及ADAM-28引入細(xì)胞中以誘導(dǎo)多能性或類似的特征。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將非蛋白試劑加入到細(xì)胞中來誘導(dǎo)或增強(qiáng)多能性的誘導(dǎo)。 例如，佛波酯佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)是一種小分子，該分子增加了將MUCl 切割為MUC1*的切割(Thathiah等人，2003)。本發(fā)明的一個(gè)方面，將佛波酯加入正在經(jīng)歷轉(zhuǎn)變到多能性的細(xì)胞中以誘導(dǎo)或增加iPS產(chǎn)生的效率。
在另一個(gè)實(shí)例中，將與MUCl或MUC1*相互作用的配體加入到體細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或稍微分化的細(xì)胞中獨(dú)自地或與其他基因相結(jié)合來誘導(dǎo)多能性從而誘導(dǎo)或維持多能性。例如，將對(duì)0CT4、S0X2、NANOG, LIN28、KLF4、和/或c_Myc進(jìn)行編碼的這些基因中的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞中并且然后在激活MUCl或MUCf的配體的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選MUCr的二聚體的、蛋白配體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將一種二價(jià)抗-MUCf抗體加入到細(xì)胞中，這些細(xì)胞已經(jīng)被影響細(xì)胞或它們的子代變成多能性干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將NM23(NM23-H1、NM23-H2、或NME7)引入到細(xì)胞中(以編碼它的基因的形式、以蛋白本身的形式或以帶有前導(dǎo)序列(例如聚精氨酸束)的蛋白的形式)以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞，以幫助誘導(dǎo)或維持多能性。最近諸位發(fā)明人顯示當(dāng)NM23是由多能性干細(xì)胞(以及癌細(xì)胞)分泌的時(shí)，它是MUCl的切割形式(MUCf)的一種活性配體并且觸發(fā)了 MAP激酶增殖通路。MUC1*的匪23刺激顯示促進(jìn)了多能性hESC的生長(zhǎng)并且抑制了它們的分化(Hikita等人，2008)。NM23還誘導(dǎo)了 c-MYC的轉(zhuǎn)錄(Dexheimer等人，2009)并且替代了對(duì)c-MYC的需要。將匪23以其天然狀態(tài)外源性地加入來激活MUC1*生長(zhǎng)因子受體亦或具有一個(gè)聚精氨酸束來促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞以及細(xì)胞核，在那里它誘導(dǎo)C-MYC表達(dá)。可以將 NM23 (NME)以編碼核酸的形式、或以表達(dá)的蛋白的形式(具有或不具有促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的修飾)加入。能夠以其天然狀態(tài)或以有利于二聚體狀態(tài)的突變體形式(例如S120G突變)來使用 NME-Hl、NME-H2 或 NME-7。
在本發(fā)明的另一方面，將結(jié)合到MUCf(PSMGFR)的胞外域上的一種二價(jià)抗體或一種二聚體MUC1*配體(例如匪23)，或者編碼它們的基因加入到表達(dá)MUC1*的細(xì)胞中用來誘導(dǎo)多能性，增加多能性誘導(dǎo)的效率，用來維持多能性或用來抑制分化。這些MUCl或MUCf相互作用蛋白被加入其中的細(xì)胞可以是自然發(fā)生的細(xì)胞或用來誘導(dǎo)干細(xì)胞樣特征的基因已經(jīng)被加入其中，或已經(jīng)進(jìn)入分化過程的那些細(xì)胞或可以是干細(xì)胞。
可以將用來誘導(dǎo)多能性的基因引入到相同的或不同的質(zhì)粒上，這些質(zhì)?？梢允锹《据d體驅(qū)動(dòng)的或者是腺病毒載體或任何整合的或非整合的病毒性或非病毒性載體，或有助于將這些基因引入到所希望的細(xì)胞中的任何其他系統(tǒng)。
在多個(gè)實(shí)例中，優(yōu)選的是通過引入蛋白本身而不是編碼它們的核酸或基因來實(shí)現(xiàn)多能性誘導(dǎo)蛋白的作用。本發(fā)明包括在此披露的用來誘導(dǎo)干細(xì)胞樣特征或多能性的基因， 這些基因可以被基因產(chǎn)物、蛋白或者以它們的天然狀態(tài)亦或用前導(dǎo)序列(例如聚精氨酸束)來修飾以允許進(jìn)入細(xì)胞中的方式來替換。將這些基因的產(chǎn)物(即蛋白)或與這些轉(zhuǎn)染基因的產(chǎn)物中一種或多種相互作用的其他蛋白引入細(xì)胞中從而誘導(dǎo)或維持多能性或其他干細(xì)胞樣特征。
在其他實(shí)例中，引入合成的試劑(例如小分子)以在成熟的或已分化的細(xì)胞中誘導(dǎo)干細(xì)胞性可能是有利的(Lyssiotis等人，2009)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將小分子加入到細(xì)胞中，這些細(xì)胞或者直接地亦或間接地誘導(dǎo)基因(這些基因誘導(dǎo)多能性)的轉(zhuǎn)錄。在其他實(shí)例中，加入直接地或間接地增加MUCf的產(chǎn)量的小分子。在一個(gè)實(shí)例中，這些小分子增加了將MUCl裂解成為MUC1*形式的裂解，該MUC1*形式是干細(xì)胞的一種特征。例如，佛波酯是增加MUCl裂解成為MUC1*的一種小分子，所以當(dāng)加入細(xì)胞時(shí)，通過產(chǎn)生MUC1*它促進(jìn)誘導(dǎo)或維持多能性狀態(tài)。
P53(它還已知是一種腫瘤抑制劑)促進(jìn)了凋亡。因此當(dāng)在體細(xì)胞或其他細(xì)胞中培養(yǎng)干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能性時(shí)抑制P53將是有利的。本發(fā)明預(yù)期使用p53抑制劑連同本發(fā)明的其他試劑以及方法一起來維持干細(xì)胞性或誘導(dǎo)干細(xì)胞樣特征或多能性特征?？梢酝ㄟ^多種方法來抑制P53。小分子(例如Pifithrin-μ (皮斐松- μ ))抑制了 ρ53的促凋亡作用 (Strom等人，2006年9月；Komarov等人，1999)并且因此可選地加入到細(xì)胞中以增加誘導(dǎo)多能性的效率或維持干細(xì)胞性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將P53抑制劑連同上調(diào)MUCl或 MUC1*的基因或基因產(chǎn)物(包括但不限于MUCl或MUC1*基因或基因產(chǎn)物、它們的活性配體以及它們的裂解酶)一起使用。
用來抑制p53活性以增加誘導(dǎo)多能性或維持干細(xì)胞性的效率的另一種方法是通過將MUC1*蛋白弓丨入到細(xì)胞培養(yǎng)物中?？梢酝ㄟ^加上一個(gè)聚精氨酸束以有助于進(jìn)入細(xì)胞來修飾MUCf蛋白。已經(jīng)報(bào)道的是MUCl的胞質(zhì)尾區(qū)(MUCl-CD)的獨(dú)自地過量表達(dá)導(dǎo)致它易位到細(xì)胞核中，在那里它被發(fā)現(xiàn)結(jié)合到P53啟動(dòng)子上。這些研究不能確定MUCl-⑶是否上調(diào)或下調(diào)P53。本發(fā)明還涉及通過異位表達(dá)MUCf來抑制p53從而增加誘導(dǎo)多能性或其他干細(xì)胞樣特征的效率?？梢酝ㄟ^將該基因插入到細(xì)胞中，通過外源性地加入該蛋白自身或者通過加入任選地用聚精氨酸束修飾的MUCf蛋白，來引入MUCf。
本發(fā)明不限于在此所述的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除了在此所述的那些具體實(shí)施方案之外的本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說根據(jù)上述說明以及附圖將是清楚的。這類修改旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。下面的實(shí)例是通過說明本發(fā)明的方式而非限制的方式來提供的。
SM 實(shí)例l.MUCf促進(jìn)了生長(zhǎng)以及細(xì)胞死亡耐受性 MUC1*促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的克隆形成生長(zhǎng)(克隆擴(kuò)增)。用全長(zhǎng)MUCl (SEQ ID NO1)，MUCrillo(SEQ ID NO 5)或空載體轉(zhuǎn)染的3Y1細(xì)胞的單細(xì)胞克隆以1000個(gè)細(xì)胞/60匪皿鋪于包含10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素以及G418(600yg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中。使細(xì)胞生長(zhǎng)9天，并且然后在室溫下在4%多聚甲醛中固定15分鐘。用水來洗滌這些皿并且然后在室溫下用70%甲醇中結(jié)晶紫染色20分鐘。用水將這些皿洗滌3次并且允許在室溫下干燥過夜并且進(jìn)行照相。圖IA顯示了當(dāng)MUC1*單細(xì)胞克隆#3和#44正在生長(zhǎng)時(shí)，被吸收的結(jié)晶紫的量(細(xì)胞數(shù)量的一種指示物)是高得多的。相比之下，與用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用全長(zhǎng)MUCl (單細(xì)胞克隆#8和#17)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未顯示出生長(zhǎng)速率增加。這表明這種切割形式(MUCf)賦予了生長(zhǎng)和/或存活的優(yōu)點(diǎn)并且全長(zhǎng)蛋白沒有這些優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)例2在曲妥珠單抗(HERCEPTIN )耐受性細(xì)胞中(通過在lug/ ml HERCEPTIN 中培養(yǎng)來生成耐受性)抗-MUCfFab通過TAXOL 阻斷了對(duì)細(xì)胞死亡的耐受性。Fessler等人于2009年報(bào)道HERCEPTIN 耐受性細(xì)胞還對(duì)TAXOL 、多柔比星以及環(huán)磷酰胺具有耐受性。如所報(bào)道的，這些藥物耐性的癌細(xì)胞通過過量表達(dá)MUCf實(shí)現(xiàn)了耐受性。以下的實(shí)驗(yàn)顯示阻斷MUCf細(xì)胞外域的PSMGFR部分逆轉(zhuǎn)了癌細(xì)胞中的獲得性耐藥性。將親本細(xì)胞(BT474)或耐受性細(xì)胞(BTResl)以10，000細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔板中0孔/條件)。第二天，在存在或不存在TAXOL (PaclitaxelSigma T7191)的情況下，將抗-MUCfFab、對(duì)照Fab、或無Fab加入細(xì)胞中。兩天之后，將細(xì)胞再懸浮于50 μ 1胰蛋白酶中，并且在臺(tái)盼藍(lán)的存在下進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞死亡百分比計(jì)算為吸收的臺(tái)盼藍(lán)的百分比。在每種條件下ΒΤ474細(xì)胞響應(yīng)于TAXOL 經(jīng)歷細(xì)胞死亡，BTResl細(xì)胞僅在MUC1*抗體的存在下經(jīng)歷細(xì)胞死亡(圖1B)。
實(shí)例3MUC1*作為生長(zhǎng)因子受體起作用，并且通過使用一種人工的(抗-MUCf抗體)或它的天然配體匪23 (NME)來二聚化它的胞外域被激活。將MUCl*-陽性的ZR-75-30 細(xì)胞(6000/孔)，或?qū)φ?MUC1-陰性的)HEK293細(xì)胞GOOO/細(xì)胞)鋪于96孔板中。第二天，進(jìn)行0小時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且每M或48小時(shí)將不同濃度的抗-MUCf抗體或Fab加入含有低(0. 1% )血清的培養(yǎng)基中。培育數(shù)天之后，將細(xì)胞再懸浮于胰蛋白酶中并且進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且計(jì)算歸一化的生長(zhǎng)百分比。ZR-75-30細(xì)胞的刺激顯示為一種鐘形曲線(如配體誘導(dǎo)的生長(zhǎng)刺激所證明的)，但是HEK293細(xì)胞沒有這種情況(圖1C)。在類似的實(shí)驗(yàn)中，使用用siRNA靶向的MUC1，或?qū)φ誷iRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MUCl*-陽性T47D乳癌細(xì)胞，刺激生長(zhǎng)僅發(fā)生在用對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)一步證明了抗體的特異性(圖1D)。對(duì)于MUCf的天然配體 (匪23)，證明了相同的結(jié)果(圖1E)。
實(shí)例4.匪23特異性地結(jié)合到PSMGFR肽上，該肽基本上由MUCf的胞外域組成。使用一臺(tái)Biacore3000儀器以及BiaEvaluation軟件通過表面等離激元(Surface Plasmon Resonance)來測(cè)量結(jié)合。將組氨酸標(biāo)記的MUCl*1110_ecd(SEQ ID NO 5)或不相關(guān)的肽(H HHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS-SEQ ID NO 34)固定在包被了 5. 7% NTA-Ni++SAM 的 SPR芯片的多個(gè)分開的流動(dòng)通道上(在我們實(shí)驗(yàn)室中制備，如Mahanta et al. 2008中所述)。將35 μ L柱塞的匪23 (純化的牛的或重組的人的)注入5uL/分鐘的恒定流動(dòng)流中并且將傳感圖記錄下來。將從牛肝中純化的匪23 (Sigma N4635)獨(dú)自地稀釋在PBS中。使用一個(gè)1 1 Langmuir模型在寬的濃度范圍上對(duì)親和性進(jìn)行測(cè)量。實(shí)際的親和性可以不同，因?yàn)橐患?jí)動(dòng)力學(xué)不能充分地描述這個(gè)系統(tǒng)(圖1F)。
實(shí)例5. MUC1*生長(zhǎng)因子受體以及它的配體匪23是在未分化的hESC上的，并且不在已分化的hESC上。通過免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)來分析處于未分化(多能性的)狀態(tài)下或處于新分化狀態(tài)下的人胚胎干細(xì)胞。將人胚胎干細(xì)胞(hESC)手工地切開并且鋪于8孔腔室載玻片(Nunc)中，這些腔室載玻片已經(jīng)用基質(zhì)膠進(jìn)行了預(yù)包被。對(duì)于未分化的細(xì)胞，在鋪板之后將細(xì)胞固定5-7天。對(duì)于已分化的細(xì)胞，在鋪板之后5-7天將bFGF從培養(yǎng)基中移去， 并且在固定之前允許細(xì)胞分化14天。在4°C下用0. IM 二甲胂酸鹽緩沖液中4%多聚甲醛固定15分鐘之前，用PBS來洗滌細(xì)胞。用BSA以及PBS中1 %驢或山羊血清將細(xì)胞封閉1小時(shí)。0.1% NP-40與抗細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體一起使用。將一抗稀釋于封閉液中并且在 4°C下與細(xì)胞一起孵育1小時(shí)。使用以下蛋白的一抗0CT4 (Santa Cruz，克隆ClonesH_134 以及 C-10，l 100 稀釋)、全長(zhǎng) MUCl (VU4H5，Santa CruzBiotechnology, 1 50 稀釋)、 MUC1* (Minerva, 1 250 稀釋)、或 NM23 (SantaCruz，克隆 NM301，1 100 稀釋))。在用以下二抗孵育30分鐘之前，在PBS中將細(xì)胞洗滌3次每次5分鐘=AlexaFluor 488山羊抗-兔 IgG、AlexaFluor555 山羊抗-小鼠 IgG、AlexaFluor 350 山羊抗-兔 IgG(Invitrogen, 1 200)、山羊抗-小鼠IgM-TRGanta Cruz，l 100)。在使用防褪色封片劑(Biomeda) 來封固蓋玻片之前，在PBS中將細(xì)胞洗滌3次每次5分鐘。通過DAPI染色(1 μ g/ml)5分鐘從而可以看到細(xì)胞核。在一臺(tái)奧林巴斯BX-51落射熒光顯微鏡上來看到免疫染色的細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示MUCf是在未分化的細(xì)胞(多能性干細(xì)胞)的表面上的(圖2A、 3B、3C)并且不在已分化的hESC上(圖2D)。圖3顯示MUC1*的配體(匪23)與MUC1*共定位(圖3A-C)。MUC1*和它的配體匪23僅表達(dá)于多能性干細(xì)胞(0CT4-陽性細(xì)胞)上并且不在已分化的那些細(xì)胞上，圖3C和3F(DAPI染色0CT4-陰性細(xì)胞的細(xì)胞核)。
實(shí)例6. MUCf調(diào)節(jié)多能性干細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在多能性干細(xì)胞上使用二價(jià)抗MUCf來進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以確定刺激性MUCf的影響。 這些結(jié)果顯示加入MUCf 二聚化配體刺激了多能性(0CT4-陽性)干細(xì)胞生長(zhǎng)并且還使它們?cè)谌鄙傥桂B(yǎng)細(xì)胞、喂養(yǎng)細(xì)胞的提取物或bFGF下能夠進(jìn)行生長(zhǎng)。
多能性(0CT4-陽性)hESC的長(zhǎng)期生長(zhǎng)是由MUCf刺激來調(diào)節(jié)的。將hESC進(jìn)行胰蛋白酶分離并且以4xl04細(xì)胞/孔種在預(yù)包被有基質(zhì)膠的8孔腔室載玻片中。更換培養(yǎng)基并且每隔一天以對(duì)于二價(jià)抗-MUCf終濃度為1 μ g/ml加入抗體直至可以看到分離的克隆。 培養(yǎng)條件包括含有和不含有bFGF添加物的“基本干細(xì)胞培養(yǎng)基”(無喂養(yǎng)細(xì)胞(feeder)-條件培養(yǎng)基的hESC培養(yǎng)基)以及Hs27-條件培養(yǎng)基。對(duì)于每種情況，以一式四份的方式生長(zhǎng)細(xì)胞。用PBS來洗滌細(xì)胞并且進(jìn)行固定，如上所述進(jìn)行0CT4免疫染色。圖4A-D是在來自加入成纖維細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞的基質(zhì)膠以及條件培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞的照片。圖E-H是在基質(zhì)膠上生長(zhǎng)的細(xì)胞的照片，該基質(zhì)膠中沒有加入來自成纖維細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。與添加了 bFGF的生長(zhǎng)相比(圖4A、B)，將抗-MUCf抗體加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中(圖4C、D)導(dǎo)致更多的多能性干細(xì)胞。將抗-MUCf抗體加入到在缺少來自成纖維細(xì)胞喂養(yǎng)細(xì)胞的(圖4G、 H)條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)的細(xì)胞中導(dǎo)致了豐富的多能性干細(xì)胞，這與通過加入bFGF(圖.4 E， F)生長(zhǎng)的細(xì)胞形成強(qiáng)烈對(duì)比(其導(dǎo)致無多能性細(xì)胞(缺少0CT4))。
實(shí)例7.在定量鈣黃綠素測(cè)定法中直接地測(cè)量刺激性MUCf對(duì)增強(qiáng)多能性干細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響。將人胚胎干細(xì)胞(hESC)手動(dòng)切開并且以1. 9xl04細(xì)胞/孔的密度在96孔板的包被了基質(zhì)膠的孔上進(jìn)行生長(zhǎng)。培養(yǎng)基包含添加有30% Hs27-條件培養(yǎng)基以及如8/ ml bFGF的hESC培養(yǎng)基。在對(duì)于二價(jià)抗-MUCf終濃度為1 μ g/ml,以及對(duì)于一價(jià)抗-MUCf終濃度為100 μ g/ml情況下加入抗體。以一式三份的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。抗體處理后41小時(shí)， 按照制造廠家的說明書用LIVE/DEAD生存力/細(xì)胞毒性試劑盒(Molecular Probes)對(duì)活的和死亡的細(xì)胞進(jìn)行定量。使用一臺(tái)Victor3V酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)來測(cè)量熒光。圖5的柱形圖顯示使用二聚配體(抗-MUCf)來刺激MUCf增強(qiáng)了干細(xì)胞生長(zhǎng)，而用抗-MUCfFab 阻斷了 MUCf的胞外域，導(dǎo)致了全部干細(xì)胞死亡。
實(shí)例8.進(jìn)行長(zhǎng)期干細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)來比較使用二價(jià)抗-MUCf抗體、匪23、匪23-突變體、或bFGF對(duì)刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。用胰蛋白酶來分離hESC并且以8. 2xl04細(xì)胞 /孔的密度種在預(yù)包被有基質(zhì)膠的8孔腔室載玻片中。更換培養(yǎng)基并且每隔一天以對(duì)于抗-MUC1*抗體終濃度80ng/ml，對(duì)于野生型重組體匪23或突變體(S120G)匪23終濃度InM， 加入抗體或野生型或突變型NM23蛋白，或以終濃度為“基礎(chǔ)干細(xì)胞培養(yǎng)基”(無喂養(yǎng)細(xì)胞-調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的hESC培養(yǎng)基)中^g/ml的重組體bFGF。細(xì)胞還在含有30%來自Hs27 成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基以及4ng/ml重組體bFGF(P^rotech #100_18B)的基礎(chǔ)干細(xì)胞培養(yǎng)基中作為對(duì)照進(jìn)行生長(zhǎng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明與條件培養(yǎng)基加上bFGF的情況(在基質(zhì)膠上這些細(xì)胞的“正?！鄙L(zhǎng)培養(yǎng)基)相比較，MUCf配體在多能性克隆的基本培養(yǎng)基中刺激生長(zhǎng)上表現(xiàn)更好。表1詳細(xì)描述了這些結(jié)果。
表1.在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的hESC
權(quán)利要求
1.一種用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)或維持多能性的方法，包括將所述細(xì)胞與增加MUCf活性的生物物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)相接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物物質(zhì)是基因。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物物質(zhì)是蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述蛋白是MUCf配體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述配體是匪23。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述蛋白是識(shí)別MUCr的PSMGFR序列的抗體。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)物質(zhì)是小分子。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述小分子增強(qiáng)了MUC1、它的裂解酶或匪23的轉(zhuǎn)錄。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述裂解酶是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述小分子增強(qiáng)了對(duì)MUCl的切割。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述小分子是佛波醇酯。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述基因編碼MUCl。
13.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述基因編碼MUC1*。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述基因編碼MUCr的配體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述配體是MUC1*抗體或匪23。
16.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述蛋白是MUCr或其有效片段。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述片段是胞質(zhì)尾區(qū)。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞與提高基因產(chǎn)物表達(dá)的分子相接觸，所述基因產(chǎn)物誘導(dǎo)多能性。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分子提高0CT4、S0X2、NANOG,KLF4或LIN28 的表達(dá)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述分子提高0CT4以及S0X2的表達(dá)。
全文摘要
本申請(qǐng)記載了通過將細(xì)胞與增加MUC1*活性的生物物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)相接觸從而在細(xì)胞中誘導(dǎo)或維持多能性的方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102272290SQ200980149448
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者辛西婭·巴姆達(dá)德, 肖恩·費(fèi)斯勒 申請(qǐng)人:米納瓦生物技術(shù)公司, 辛西婭·巴姆達(dá)德