專利名稱：用于生產(chǎn)核黃素的方法
用于生產(chǎn)核黃素的方法本發(fā)明涉及生物技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)核黃素(下文中也稱作維生素B2)的方法和手段， 和實(shí)施所述方法的手段，特別是具有提高的核黃素產(chǎn)率的經(jīng)修飾的微生物宿主細(xì)胞。本發(fā)明因此提供了調(diào)節(jié)參與宿主細(xì)胞核黃素生產(chǎn)的酶活性的表達(dá)的新穎方法和手段。核黃素是黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體分子。它們是生物細(xì)胞和生物體中大量酶促氧化還原反應(yīng)的必需輔助因子。因此，核黃素是食物和動(dòng)物飼料工業(yè)中重要的添加劑。在微生物和植物中，核黃素通常從三磷酸鳥苷(GTP)(來自嘌呤代謝)和5-磷酸核酮糖(來自磷酸戊糖途徑)通過七個(gè)酶促反應(yīng)合成。每年約有4000噸核黃素在多種微生物中被以生物技術(shù)方式生產(chǎn)。最重要的宿主生物是桿菌(bacilli)，特別是Bacillus subtilis。除此之外也使用其他微生物細(xì)胞，包括 {1 , ^° 歹lliiL Eremothecium ashbyii>Ashbya gossypii 禾口 Candida f已mata。用于核黃素合成的已知生物技術(shù)方法需要改進(jìn)，最重要的是改進(jìn)核黃素的產(chǎn)率和生產(chǎn)。因此需要提供經(jīng)改進(jìn)的生產(chǎn)方法和經(jīng)改進(jìn)的宿主細(xì)胞，特別是以微生物Bacillus subtilis為基礎(chǔ)來改進(jìn)。這特別涉及下述手段的提供，所述手段使得能夠特別簡單和有效地控制宿主細(xì)胞中的代謝活性，特別是與核黃素合成相關(guān)的酶活性。另外，這涉及提供經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞，所述經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞特別是與野生型相比具有提高的核黃素合成。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子CcpC對核黃素生產(chǎn)率(production rate)具有積極影響。CcpC屬于LysR轉(zhuǎn)錄因子家族，已知其能調(diào)節(jié)編碼三羧酸循環(huán)(TCA)酶活性的基因，最重要的是citB和citZ。驚訝地發(fā)現(xiàn)核黃素產(chǎn)率直接依賴于轉(zhuǎn)錄因子CcpC的活性和 /或細(xì)胞內(nèi)濃度。降低的CcpC活性導(dǎo)致產(chǎn)率的提高。該效應(yīng)是令人驚訝的，并且從現(xiàn)有技術(shù)不可預(yù)測，因?yàn)橐阎蹸cpC調(diào)節(jié)的TCA中的酶活性與核黃素合成的代謝途徑并無直接關(guān)聯(lián)。還令人驚訝的是生物量生產(chǎn)，特別是根據(jù)本發(fā)明被修飾的細(xì)胞(特別是CcpC-缺失的細(xì)胞，例如的ccpC敲除轉(zhuǎn)化體)的生長率保持基本不變。本發(fā)明因此涉及經(jīng)修飾的生產(chǎn)核黃素的細(xì)胞或細(xì)胞系，原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，特別是微生物細(xì)胞，其特征在于CcpC型轉(zhuǎn)錄因子和/或在細(xì)胞中存在和/或表達(dá)的其同系物或直系同源物的活性或濃度被修飾，特別是被降低。通過所述修飾，細(xì)胞或細(xì)胞壁能夠進(jìn)行提高的核黃素生產(chǎn)。特別地，要求保護(hù)下述經(jīng)修飾的生產(chǎn)核黃素的微生物，其中與未經(jīng)修飾的微生物或野生型微生物相比，CcpC型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和/或活性被降低，優(yōu)選地降低至少25%。優(yōu)選地，上述細(xì)胞或細(xì)胞系被修飾，使得編碼CcpC的基因完全不表達(dá)(表達(dá)的阻抑)或至少顯示降低的表達(dá)(低表達(dá)(underexpression))，這導(dǎo)致所述細(xì)胞/細(xì)胞系中缺失或減少/降低的CcpC蛋白質(zhì)活性。細(xì)胞/細(xì)胞系優(yōu)選地是CcpC缺失的(CcpC-cbpleted) 突變體或轉(zhuǎn)化體，特別是編碼CcpC的至少一個(gè)基因和/或其同系物和/或直系同源物的敲除突變體。在該關(guān)聯(lián)中，“降低的”被理解為表示在作為轉(zhuǎn)錄因子的功能方面，CcpC蛋白質(zhì)或其同系物或直系同源物的減少的、特別是缺失的活性，以及ccpC基因或其同系物或直系同源物的減少的、特別是缺失的表達(dá)，結(jié)果，這使得細(xì)胞(特別是CcpC缺失的細(xì)胞)中基因產(chǎn)物CcpC拷貝數(shù)低或濃度低。降低的表達(dá)被理解為表示以未經(jīng)修飾的(CcpC野生型)細(xì)胞 /細(xì)胞系中ccpC基因的表達(dá)為基礎(chǔ)至少25 %的減少，優(yōu)選地至少50 %、75 %、80 %、90 %、 95%、98%或100%的減少。所述降低既涉及基因活性又涉及相應(yīng)的基因產(chǎn)物。因此，在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或根據(jù)本發(fā)明被修飾的細(xì)胞中，最重要地，當(dāng)所述基因例如在桿菌中、優(yōu)選地在生物Bacillus subtilis中表達(dá)時(shí)，ccpC基因和/或其基因產(chǎn)物被阻抑、“敲除”或其功能(活性)受損，特別是與CcpC野生型相比。用于測量基因或蛋白質(zhì)活性的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。合適的方法例如是Northern印跡，或用于測量ccpC基因活性的用途的“基因芯片，，方法，和借助于針對 CcpC的特異性抗體的Western印跡，或用于測定細(xì)胞中蛋白質(zhì)濃度的定量“2_D SDS-PAGE 凝膠”。轉(zhuǎn)錄因子(特別是CcpC)的活性也可以通過“凝膠遷移(gel shift)”實(shí)驗(yàn)來間接測定，其中測量在要被調(diào)節(jié)的基因(例如CitB或citZ)的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合的CcpC的量。通過減少ccpC的基因表達(dá)，結(jié)合的CcpC量也會降低，這可通過聚丙烯酰胺凝膠上信號的定量測量來分析。這些測量方法和其他測量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可用于測定本發(fā)明意義上的CcpC活性。用于實(shí)施本發(fā)明的合適細(xì)胞或細(xì)胞系(概括為宿主細(xì)胞)是所有已知的下述生產(chǎn)核黃素的細(xì)胞，其中ccpC基因或其同系物或直系同源物的表達(dá)可以被降低。例子是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選地是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是微生物細(xì)胞例如 Bacillus、Corynebacterium 或 Pseudomonas0 優(yōu)選的是 BaciIlus 屬的細(xì)胞，例如 Bacillus anthracis> Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus> Bacillus halodurans> Bacillus amyloliquifaciens 或 Bacillus subtilis,Bacillus subtilis 是特別優(yōu)選的， 例如 B. subtilis 168。適用于本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是B. subtilis RB50::[pRF69]n，其包含多個(gè)拷貝(例如約5到約20個(gè)拷貝)的質(zhì)粒pRF69，所述質(zhì)粒pRF69編碼經(jīng)修飾的核黃素(rib)操縱子，其中修飾在于強(qiáng)啟動(dòng)子Psp。15的插入，這導(dǎo)致核黃素基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)化(菌株的構(gòu)建和用于提高核黃素合成的培養(yǎng)條件見例如EP 405370和Perkins et al.，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，22 :8-18,1999)。B. subtilis RB50 和質(zhì)粒 pRF69 根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，分別以編號(“保藏號”)B 18502保藏在“Agricultural Research Culture Collection”(NRRL)，Peoria, IL, USA, Culture Collection Division 和以編號(“保藏號，，)ATCC 68338 保藏于“American Type Culture Collection”(ATCC)，P. 0. Box 1549， Manassas, VA 20108 USA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，在Bacillus屬的菌株(特別是Bacillus subtilis) 中實(shí)現(xiàn)ccpC基因中的修飾。本文特別優(yōu)選的是核黃素操縱子中脫調(diào)節(jié)的作為宿主細(xì)胞的 Bacillus菌株，特別是subtilis菌株。脫調(diào)節(jié)的核黃素操縱子的例子是已知的，并且包括所謂的“ribO”和“ribC”突變。脫調(diào)節(jié)引起rib基因的強(qiáng)化的基因表達(dá)。特別優(yōu)選的是下述宿主細(xì)胞，特別是Bacillus subtilis，其中編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子SpoOA的基因被(過)表達(dá)。 因此在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明在下述B. subtilis RB50中實(shí)現(xiàn)，所述B. subtilis RB50被突變，使得spoOA基因的活性形式被表達(dá)。公眾可通過例如以下的保藏位點(diǎn)獲得適用于本發(fā)明的其他微生物=GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) , Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Brunswick,德國，“NITE Biological Resource Center，，,2-5-8,Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, H ^ ( III ^ {^"Institute for Fermentation", Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686,日本)或 "Bacillus Genetic Stock Center，，(BGSC),The Ohio State University,Columbus,Ohio 43210 USA。就本發(fā)明而言，前述微生物還包括International Code of Nomenclature of Prokaryotes”規(guī)定的具有相同生理特性的同物異名(synonyms)和基原異名 (basonyms)。本發(fā)明中微生物的命名法是在優(yōu)先權(quán)申請時(shí)被“International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies，，官方接 S ^f1 1 I=T Tj Jf Τ" “ International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology”(IJSEM)中的命名法。本發(fā)明涉及經(jīng)突變的、特別是非功能性的基因。本發(fā)明涉及來自所述基因的經(jīng)突變的、特別是非功能性的轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明還涉及來自所述基因的經(jīng)突變的、特別是非功能性的多肽。此類經(jīng)突變的結(jié)構(gòu)在本發(fā)明的意義上特別合適用于提供經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞， 其中CcpC野生型或其同系物或直系同源物的功能被降低或抑制。因此，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)的一個(gè)要素是降低細(xì)胞中ccpC基因、CcpC轉(zhuǎn)錄本或所翻譯的轉(zhuǎn)錄因子的有效(有活性)濃度，從而提高宿主細(xì)胞中的核黃素生物合成。CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或細(xì)胞內(nèi)濃度的降低可以通過本身已知的方式實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適用于獲得所謂的CcpC缺失或ccpC敲除突變體或轉(zhuǎn)化體的生物技術(shù)方法和手段。本發(fā)明因此不限于本文中更詳細(xì)描述的優(yōu)選的變體和實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“突變”被理解為表示核酸分子的任何遺傳修飾，特別是在分子水平上的修飾，所述修飾導(dǎo)致非功能性的“經(jīng)突變的”基因產(chǎn)物。其特別被理解為表示微生物基因組中的改變，所述改變干擾基因產(chǎn)物的合成，在本文中感染CcpC型轉(zhuǎn)錄因子的合成和/或?qū)е隆敖?jīng)突變的”或經(jīng)修飾的多肽的表達(dá)，所述多肽具有被改變的“經(jīng)突變的”氨基酸序列并且與CcpC野生型相比其功能已部分或完全喪失。基因或基因產(chǎn)物中根據(jù)本發(fā)明的突變在選自轉(zhuǎn)錄、翻譯和(如果適用的話)翻譯后修飾的表達(dá)中的至少一個(gè)步驟中導(dǎo)致改變。所述突變優(yōu)選地選自基因序列中至少一個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變、缺失、取代、插入和倒位。 然而，遺傳突變的手段不限于這些優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于在基因中放置突變的其他可能性。根據(jù)本發(fā)明的突變的目的是阻抑編碼CcpC的至少一個(gè)基因的表達(dá)。 與之相關(guān)的一個(gè)目的是與野生型相比展示減小的活性、特別是調(diào)節(jié)活性的經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中的表達(dá)?！巴蛔儭辈粌H涉及基因編碼序列的直接修飾，而且涉及與表達(dá)相關(guān)的其他結(jié)構(gòu)或序列的修飾。這些優(yōu)選地包括基因操縱子的結(jié)構(gòu)，特別是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地選自啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)子、操縱基因(operators)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、終止子及其輔因子，不希望僅限于這些。就本發(fā)明而言，“功能”，特別是就術(shù)語“功能有關(guān)的”、“功能類似的”和“功能化”而言，被理解為表示CcpC野生型或其同系物或直系同源物用于調(diào)節(jié)操縱子或基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子功能，所述操縱子或基因具有與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的操縱基因結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)(特別是轉(zhuǎn)錄因子例如CcpC)的功能根據(jù)本發(fā)明也表述為活性，其中CcpC野生型的轉(zhuǎn)錄因子功能對應(yīng)于100%的轉(zhuǎn)錄因子活性。用于測定活性的已知合適方法的選擇如上文所述。本發(fā)明的一個(gè)主題是經(jīng)分離的核酸分子，其表示ccpC基因及其同系物和直系同源物。本發(fā)明特別涉及核苷酸序列SEQ ID No. :1中所示并且例如存在于生物Bacillus subtilis中的該基因。本發(fā)明還涉及其基因產(chǎn)物(CcpC蛋白質(zhì))，例如由氨基酸序列SEQ ID No. :2所示?；騝cpC特別是上述合適的宿主細(xì)胞之一、優(yōu)選地Bacillus subtilis中操縱子的部分。尋找同源/直系同源CcpC序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如在合適的數(shù)據(jù)庫如例如EMBL、Genbank、SwissProt等中進(jìn)行“BLAST”搜索。這些序列發(fā)揮CcpC 野生型的作用，所述CcpC野生型隨后根據(jù)本發(fā)明被修飾，這在適當(dāng)?shù)乃拗魃镏袑?dǎo)致核黃素生物合成的提高。就本發(fā)明而言，含有野生型序列的微生物被稱作野生型微生物。本發(fā)明因此涉及——優(yōu)選地經(jīng)分離的——經(jīng)突變的(經(jīng)修飾的)核酸分子，其編碼“經(jīng)突變的”轉(zhuǎn)錄因子，所述轉(zhuǎn)錄因子特別源自CcpC型或其同系物或直系同源物，其中未經(jīng)突變的(野生型)核酸分子選自由以下組成的組a)包含核苷酸序列SEQ ID No. :1或由核苷酸序列SEQ ID No. :1組成的核酸分子；b)編碼下述多聚氨基酸分子(蛋白質(zhì))的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2組成；C)與a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的核酸分子之一雜交的核酸分子；和c)根據(jù)a)或b)的核酸分子的片段和/或類似物，其編碼具有CcpC型轉(zhuǎn)錄因子功能/活性的蛋白質(zhì)，其中經(jīng)突變的核酸分子顯示至少一個(gè)遺傳突變，所述遺傳突變導(dǎo)致與CcpC野生型的活性相比降低的CcpC蛋白質(zhì)活性。如上文所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ccpC基因被完全敲除(所謂的敲除突變)。本發(fā)明的又一主題是多聚氨基酸分子(蛋白質(zhì)或多肽)，優(yōu)選地是以經(jīng)分離形式存在的分子，其選自由以下組成的組a)包含氨基酸序列SEQ ID No. :2或由氨基酸序列SEQ ID No. :2組成的多聚氨基酸分子；b)由上文表征的核酸分子編碼的多聚氨基酸分子；c)與a)或b)的分子具有至少70%同源性的多聚氨基酸分子；和d)a)或b)的多聚氨基酸分子至少之一的片段和/或類似物，其具有CcpC型轉(zhuǎn)錄因子的功能，其中a)到d)的蛋白質(zhì)是如上文所述被修飾的野生型CcpC，這導(dǎo)致作為轉(zhuǎn)錄因子的活性的降低。本發(fā)明還涉及與優(yōu)選的SEQ ID No. :1或SEQ ID No. :2分別顯示可觀的序列同一性，特別是可觀的“同源性”的此類核酸分子或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，這被理解為表示至少 70 %、優(yōu)選地至少75 %、特別優(yōu)選地至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %和至少98 % 的序列同一性。優(yōu)選地，序列涉及在整個(gè)長度上分別對SEQ ID No. :1或SEQ ID No. :2的同一性。在一個(gè)優(yōu)選的變體中，前述序列同一性排他地涉及SEQ ID No. :1和SEQ ID No. 2的功能相關(guān)區(qū)域。此類區(qū)域的例子是ccpC基因中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知鑒定這些基因區(qū)域的程序?？紤]到核酸分子之間的“同源性”，“嚴(yán)格條件”下的雜交可以被理解為一種標(biāo)準(zhǔn)。對“嚴(yán)格條件”而言，參考例如在 Maniatis et al.，1989 :“Molecular cloning, a laboratory manual，，,2nd Edition, Cold Spring Harbours Laboratory, N. Y 中描述的已知技術(shù)內(nèi)容?！皣?yán)格條件”依賴于實(shí)際序列。通常這被理解為表示比特定序列的解鏈溫度 (melting point)低漲到IOK的雜交溫度，在所述解鏈溫度下50%序列相同的互補(bǔ)探針與靶序列雜交。至少50%、60%、70%或特別優(yōu)選地至少80%、最優(yōu)選地至少85%到90%、特別是至少95%的核酸序列彼此同源的條件是優(yōu)選的。在作為例子給出的在嚴(yán)格條件下雜交的一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在約45°C下于6x 氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進(jìn)行，隨后在50°C、優(yōu)選地55°C、特別優(yōu)選地60°C、尤其優(yōu)選地 65°C下，于 Ix SSC，0. SDS 中洗滌。優(yōu)選的是“高度嚴(yán)格條件”下的雜交，例如使用經(jīng)標(biāo)記的探針例如地高辛(DIG)標(biāo)記的探針，于42°C下孵育若干天，例如2到4天，之后是室溫下在h SSC, 0. 1 % SDS中一次或多次的洗滌步驟，和65到68°C下在0. 5x SSC, 0. 1% SDS或0. Ix SSC, 0. 1% SDS中至少一次的洗滌步驟。特別地，“高度嚴(yán)格條件”例如包括于42°C下，在溶液例如任選地添加 100 μ g/ml 鮭魚精核酸的"DigEasyHyb 溶液”(Roche Diagnostics GmbH)，或者包含 50 % 甲酰胺、5x SSC,0. 02% SDS,0. 1% N-月桂酰肌氨酸和 2% “封閉試劑” (Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用DIG-標(biāo)記的探針(通過例如“DIG標(biāo)記系統(tǒng)”制備，Roche Diagnostics GmbH,68298 Mannheim，德國)孵育2小時(shí)到4天，之后將濾紙于室溫下在h SSC,0. 1% SDS中洗滌兩次，每次5到15分鐘，然后于65-68°C下在0. 5x SSC，0. 1 % SDS或0. Ix SSC, 0. 1% SDS中洗滌兩次，每次15-30分鐘。在本申請中，術(shù)語“同源性”或“同一性百分比”可互換使用。為了測定兩條核酸或氨基酸序列彼此“同源”或“相同”的百分比，將兩條序列就最適比較的目的對準(zhǔn)(例如為了兩條序列的最適比對，向一條序列中引入缺口)。然后比較相應(yīng)的位置上的核苷酸。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄兄械囊粋€(gè)位置被與第二序列中相應(yīng)位置上相同的核苷酸占據(jù)時(shí)，則兩個(gè)分子在該位置上是相同的，這對應(yīng)于100%的同源性或同一性。兩條序列之間同一性的百分比數(shù)值(百分比同一性)可以被表示為所述序列共享的大量相同位置的函數(shù)(即％同一性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)(即重疊位置)χ100)。優(yōu)選被比較的序列有相同的長度。為了測定同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得多種已知的計(jì)算機(jī)程序，例如作為GCG軟件包組件的程序 “GAP”(可在 http://accelrys. com/ 獲得)，所述程序根據(jù) Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48,444-453,1970)的算法運(yùn)作。就本發(fā)明而言，術(shù)語“直系同源物”應(yīng)當(dāng)被理解為表示不同屬的基因，所述基因均從一個(gè)共有的原始基因開始產(chǎn)生。通常這些直系同源基因的功能在進(jìn)化期間是保守的。為了能夠在先前未經(jīng)測序的基因組中進(jìn)行可靠的基因功能預(yù)測，直系同源物的鑒定是重要的。與之相反，在本發(fā)明的意義上，實(shí)際源自一個(gè)共同基因、但是在進(jìn)化過程中獲得另一功能的多個(gè)基因被稱作“類似物”。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了修飾(特別是降低其活性)轉(zhuǎn)錄因子 CcpC或其同系物或直系同源物的親合力和/或其與被調(diào)節(jié)的基因的操縱子、特別是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)和/或其輔助因子，從而使獲得的源自CcpC或其同系物或直系同源物的經(jīng)修飾或“經(jīng)突變的”基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))顯示與下述操縱基因結(jié)構(gòu)具有降低的結(jié)合活性和 /或相互作用，或沒有結(jié)合活性和/或相互作用，所述操縱基因結(jié)構(gòu)與被調(diào)節(jié)的基因或操縱子相關(guān)。在一個(gè)優(yōu)選的變體中，這通過原始ccpC基因(野生型)或其同系物或直系同源物的直接遺傳修飾進(jìn)行，從而獲得具有經(jīng)修飾的“經(jīng)突變的”氨基酸序列、特別是具有經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基因產(chǎn)物。在一個(gè)替代性或優(yōu)選地額外的變體中，這通過修飾選自轉(zhuǎn)錄、翻譯和(適用時(shí))翻譯后加工的至少一個(gè)過程來進(jìn)行，特別優(yōu)選地通過修飾與這些過程相關(guān)的至少一種分子結(jié)構(gòu)或其輔因子來進(jìn)行。這特別通過使用至少一種結(jié)構(gòu)或構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)，所述結(jié)構(gòu)或構(gòu)建體結(jié)合和/或失活涉及至少一種這些過程的結(jié)構(gòu)或序列。所述結(jié)構(gòu)或構(gòu)建體優(yōu)選地選擇反義構(gòu)建體和抗體，但不排他地僅限于此。優(yōu)選地，通過特異性抑制劑直接降低轉(zhuǎn)錄因子CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或濃度。此類特異性抑制劑的例子是CcpC基因或其同系物或直系同源物或根據(jù)本發(fā)明的其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的核酸分子的反義構(gòu)建體，所述反義構(gòu)建體以本身已知的方式被瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞中并在其中表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)錄因子CcpC及其同系物或直系同源物分別的表達(dá)和/或需要時(shí)其輔因子的表達(dá)的修飾，特別是濃度/活性的降低，即特別是拷貝數(shù)的降低，特別是為了降低或完全阻抑所述表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的變體中，這通過ccpC 基因或其同系物或直系同源物操縱子的直接遺傳修飾實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的變體中，為此提供控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子的修飾，并優(yōu)選地使得發(fā)生低表達(dá)或者完全不發(fā)生表達(dá)，也就是 “敲除”。在一個(gè)替代性或優(yōu)選地額外的變體中，這通過調(diào)控選自轉(zhuǎn)錄、翻譯和(適用時(shí))翻譯后加工的至少一個(gè)過程來實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選地特別通過調(diào)控與這些過程相關(guān)的至少一種分子結(jié)構(gòu)或其輔因子來實(shí)現(xiàn)。這些特別包括敲除突變，所述敲除突變可例如通過同源重組以及使用反義構(gòu)建體，以本身已知的方式獲得。可以通過普遍已知的方法將根據(jù)本發(fā)明的核酸或反義構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的方法是通過電穿孔、洗滌劑或類似手段，替代性或優(yōu)選額外地通過射擊方法(例如“基因槍”)或類似方法，使細(xì)胞壁和/或宿主細(xì)胞膜崩解，本發(fā)明不限于這些方法和手段。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是外部、特別是合成生產(chǎn)的DNA或RNA分子，其具有反義方向的根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列，所述分子可以被引入宿主細(xì)胞中。這特別包括以反義方向包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的所述核酸分子的載體。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是經(jīng)修飾的微生物細(xì)胞，所述微生物細(xì)胞被修飾以阻抑CcpC或其同系物或直系同源物的表達(dá)。在一個(gè)變體中，為了 CcpC或其同系物或直系同源物的低表達(dá)而修飾細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是編碼CcpC的至少一個(gè)基因的敲除突變體。本發(fā)明因此還包括經(jīng)修飾的細(xì)胞，所述細(xì)胞是Bacillus subtilis 的CcpC編碼基因同系物的敲除突變體。本發(fā)明因此還包括Bacillus subtilis的CcpC編
9碼基因的直系同源物的敲除突變體。本發(fā)明還包括CcpC及其基因的其他功能類似物的敲除突變體。在宿主細(xì)胞遺傳修飾的一個(gè)替代性或優(yōu)選額外的變體中，遺傳修飾發(fā)生在CcpC 轉(zhuǎn)錄因子的至少一個(gè)和優(yōu)選若干個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)及其片段上。這些優(yōu)選地是宿主細(xì)胞中由CcpC 調(diào)節(jié)的基因的操縱基因結(jié)構(gòu)。被調(diào)節(jié)的基因特別是citB和citZ，本發(fā)明不旨在僅限于此。通過接近CcpC調(diào)節(jié)的基因操縱基因區(qū)段附近的根據(jù)本發(fā)明的至少一種優(yōu)選地提供的突變，根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子與操縱基因的結(jié)合應(yīng)當(dāng)被阻止或減少，使得關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)效應(yīng)發(fā)生至降低的程度，或完全不發(fā)生。用于修飾被轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因的操縱基因區(qū)段(特別是它們對轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。被調(diào)節(jié)的基因citB和citZ的結(jié)合序列和ccpC基因自身中的結(jié)合序列例如公開/參考于“Bacillus subtilis中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)庫”(DBTBS 見httD://dbtbs.hgC. jp/)中。ccpC基因自身調(diào)節(jié)序列中已知結(jié)合序列的例子位于相對于起始密碼子第-10到+15位(SEQ ID No. 3)處， 特別是第-5到+10位(SEQ ID No. :8)處。citB的已知結(jié)合序列位于相對于起始密碼子第-75 到-52 位(SEQ ID No. 4)處，特別是第 _73 到-68 位(SEQ ID No. 9)處或第-64 到-60 位(SEQ ID No. 10)處，和第-35 到-22 位(SEQ ID No. 5)處或第 _；35 到-17 位 (SEQ ID No. 11)處，特別是第-27到-22位(SEQ ID No. 12)處，citZ的已知結(jié)合序列位于相對于起始密碼子第-11到+5位(SEQ ID No. 6)處，特別是第-11到_8位(SEQ ID No. 13)位處，和第+21 到+44 位(SEQ ID No. :7)處，特別是第+23 到 M6 位(SEQ ID No. 14)處或第+34到+37位(SEQ ID No. 15)處。前述已知結(jié)合序列和相應(yīng)的操縱子列于表 1中。被CcpC調(diào)節(jié)的已知基因及其操縱子的列表。“絕對位置”以“NCBI序列文件 (登記號no. NC 000964)”中的位置為基礎(chǔ)計(jì)算。精確的結(jié)合序列(順式元件)加有下劃線。來源;http://dbtbs. hRC. ip/。
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾的生產(chǎn)核黃素的微生物，其特征在于，與未經(jīng)修飾的野生型微生物相比，CcpC 型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和/或活性被降低，優(yōu)選地被降低至少25%。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，其包含處于被CcpC型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的至少一個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合序列中的至少一個(gè)突變，優(yōu)選地處于citZ和/或CitB基因的結(jié)合序列中的至少一個(gè)突變。
3.如權(quán)利要求2所述的微生物，其特征在于，其包含處于根據(jù)SEQID Nos. :3、4、5、6、 7的序列或其片段中，特別是SEQ ID Nos. :8、9、10、11、12、13、14或15中的至少一個(gè)突變。
4.如權(quán)利要求1或2所述的微生物，其特征在于，編碼Ccpc的基因被敲除。
5.如權(quán)利要求1或4所述的微生物，其特征在于，包含選自下組的核酸分子，所述組由以下組成a)包含核苷酸序列SEQID No. 1或由核苷酸序列SEQ ID No. 1組成的核酸分子；b)編碼下述多聚氨基酸分子(蛋白質(zhì))的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2組成；c)與a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的核酸分子之一雜交的核酸分子；和c)根據(jù)a)或b)的核酸分子的片段和/或類似物，其編碼具有CcpC型轉(zhuǎn)錄因子功能/ 活性的蛋白質(zhì)，其中根據(jù)a)到c)的核酸分子具有至少一處下述遺傳突變，所述遺傳突變導(dǎo)致與CcpC 野生型的活性相比降低的、優(yōu)選地降低至少25%的CcpC蛋白質(zhì)活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的微生物，其特征在于，與未經(jīng)修飾的微生物或野生型微生物相比具有提高至少10%的核黃素產(chǎn)率。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微生物，其特征在于，選自由以下組成的組Bacillus、Corynebacterium 禾口 Pseudomonas，優(yōu)選地 Bacillus anthracis、 Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus amyloliquifaciens 或 Bacillus subtilis。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的微生物用于與未經(jīng)修飾的微生物或野生型微生物中的核黃素合成相比提高核黃素合成、特別是提高至少10%的用途。
9.編碼CcpC型轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)修飾的核酸分子的用途，其特征在于，所述修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子功能的降低，優(yōu)選地導(dǎo)致至少25 %的降低，特征在于要被修飾的核酸分子選自由以下組成的組a)包含核苷酸序列SEQID No. 1或由核苷酸序列SEQ ID No. 1組成的核酸分子；b)編碼下述多聚氨基酸分子(蛋白質(zhì))的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No. 2或由氨基酸序列SEQ ID No. 2組成；c)與a)或b)的核酸分子具有至少70%同源性的核酸分子；d)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的核酸分子之一雜交的核酸分子；和c)根據(jù)a)或b)的核酸分子的片段和/或類似物，其編碼具有CcpC型轉(zhuǎn)錄因子功能/ 活性的蛋白質(zhì)。
10.經(jīng)修飾的核酸分子的用途，其特征在于，所述修飾導(dǎo)致CcpC型轉(zhuǎn)錄因子功能的降低，優(yōu)選地導(dǎo)致至少25%的降低，特征在于要被修飾的核酸分子選自所述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述經(jīng)修飾的核酸分子選自由SEQID Nos. :3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 和 15 組成的組。
12.用于生產(chǎn)核黃素的方法，其特征在于所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的微生物。
13.用于生產(chǎn)核黃素的方法，其特征在于包括步驟a)提供根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的合適的宿主細(xì)胞，b)在適用于核黃素生產(chǎn)的發(fā)酵條件下培養(yǎng)，和c)將核黃素與培養(yǎng)基和/或經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)核黃素(在下文中也稱作維生素B2)的方法和手段，和實(shí)施所述方法的手段，特別是具有提高的核黃素產(chǎn)率的經(jīng)修飾的微生物宿主細(xì)胞。本發(fā)明因此公開了調(diào)節(jié)參與宿主細(xì)胞核黃素生產(chǎn)的酶活性的表達(dá)的新穎方法和手段。
文檔編號C12N15/31GK102245781SQ200980150515
公開日2011年11月16日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者克勞斯·穆徹, 卓阿克姆·施密德, 弗洛瑞娜·柯克納 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司