專(zhuān)利名稱(chēng)：流感疫苗的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)對(duì)抗流感病毒的改進(jìn)疫苗的材料和方法。本發(fā)明提供了表達(dá)來(lái)自于單一病毒株例如甲型流感病毒H5m毒株的血凝素和神經(jīng)氨酸酶、并且還具有來(lái)自于流感病毒株的所有內(nèi)部基因的重排病毒(reassortant virus)。設(shè)想了對(duì)血凝素基因進(jìn)行突變，使其與野生型毒株中的血凝素基因相比表現(xiàn)出降低的致病力。
背景技術(shù)：
高效的疫苗生產(chǎn)需要從宿主系統(tǒng)以高產(chǎn)量產(chǎn)生大量病毒的生長(zhǎng)。不同類(lèi)型的病毒需要不同生長(zhǎng)條件以獲得可接受的產(chǎn)量。因此，在其中生長(zhǎng)病毒的宿主是極為重要的。取決于病毒類(lèi)型，病毒可以生長(zhǎng)在原代組織培養(yǎng)細(xì)胞、已建立的細(xì)胞系或含胚卵例如來(lái)自雞的含胚卵中。某些用作病毒宿主系統(tǒng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以高產(chǎn)量生產(chǎn)病毒，但是這些細(xì)胞的致瘤性質(zhì)引起法規(guī)上限制它們用于疫苗生產(chǎn)。事實(shí)上，世界衛(wèi)生組織(WHO)的適用準(zhǔn)則表明， 只有幾種細(xì)胞系被允許用于病毒疫苗生產(chǎn)。存在三種一般類(lèi)型的流感病毒——甲型、乙型和丙型，由它們的內(nèi)部蛋白之間缺乏血清學(xué)交叉反應(yīng)性所定義。甲型流感病毒根據(jù)其糖蛋白——血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)蛋白的抗原性差異進(jìn)一步分成亞型。人類(lèi)對(duì)每種甲型、乙型和丙型流感病毒的感染所引起的疾病易感。當(dāng)前，人類(lèi)中流感感染的最重要病因可歸因于乙型流感以及甲型流感的Hmi和 H3N2亞型。因此，乙型流感以及甲型流感的Hmi和H3N2亞型的抗原通常被摻入到目前的季節(jié)性流感疫苗中。當(dāng)前可用的疫苗具有75-90%的保護(hù)率。然而，可能引起大流行的感染的流感毒株是例如H5W亞型的毒株，其不受典型流感疫苗的防范。H2、H7和H9亞型也具有大流行的潛力。參見(jiàn)例如 Koopmans 等，Lancet 363 :587-93,2004 ;Jos印h 等，Md Med. 6 30-2，2005 ;Cameron 等，virology 278 :36-41，2000 ；以及 Huber 等，Pediatri Infect Dis 27(10Suppl) :S113-17，2008。最近，活的減毒流感病毒疫苗已在美國(guó)批準(zhǔn)使用。許多當(dāng)前的疫苗用于季節(jié)性流感感染，并含有甲型流感的兩種組分Hmi和H3N2以及乙型流感的組分。在過(guò)去幾年中，由于流感蛋白的抗原性漂移和突變，至少一種組分每年發(fā)生變化。從受感染的患者獲取人類(lèi)流感病毒的臨床分離株，并使用實(shí)驗(yàn)室改造的高生長(zhǎng)供體病毒主毒株A/ PuertoRico/8/34(HlNl)流感毒株在雞胚卵中進(jìn)行重排(美國(guó)專(zhuān)利7，037，707)。重排的目的是通過(guò)將來(lái)自原代臨床分離株的至少HA或NA基因與主毒株供體病毒的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行重組，來(lái)實(shí)現(xiàn)候選疫苗毒株產(chǎn)量的增加。這種策略提供了具有與臨床分離株類(lèi)似的抗原決定簇的高生長(zhǎng)重排體(Wood，J. Μ.和Williams，Μ. S.，《流感教科書(shū)》(Textbook of Influenza), Blackwell Science Ltd,Oxford,1998；Robertson 等，Biologicals,20 :213,1992)。通過(guò)將這種重排的病毒株在含胚卵中生長(zhǎng)，然后通過(guò)化學(xué)手段將純化的病毒失活， 來(lái)制備疫苗。高致病性禽流感病毒能夠在鳥(niǎo)類(lèi)中引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病和死亡。該特點(diǎn)已知只屬于H5和H7亞型的HA。因?yàn)槟承┣蓊?lèi)病毒傳播給人類(lèi)的能力，它們也變成了人類(lèi)健康隱患。禽流感病毒的致病性具有多基因性質(zhì)，但是已經(jīng)顯示HA蛋白在感染中發(fā)揮主要作用。 病毒感染性的先決條件是將HA蛋白前體(HAO)切割成HAl和HA2亞基。這種切割釋放出負(fù)責(zé)病毒與內(nèi)體膜的融合的肽。低致病性病毒表達(dá)的表面HA分子只被呼吸或胃腸道細(xì)胞分泌的胰蛋白酶樣蛋白酶所活化(Perdue等，Virus Res 49 :173_86，1997)。高致病性病毒的切割位點(diǎn)發(fā)生改變的方式是使其能夠被不同細(xì)胞的蛋白酶切開(kāi)，特別是被絕大多數(shù)細(xì)胞中存在的遍在性弗林蛋白酶切開(kāi)(Steinhauer D.，Virology 258 :1-20,1999 ；Swayne D.， Vet Pathol 34,557-67,1997).所有高致病性毒株總是在切割位點(diǎn)處含有多個(gè)堿性殘基 (例如R和K) (Perdue等，同上)。因此，病毒能夠在幾乎任何器官中快速擴(kuò)散和復(fù)制，并引起全身性感染。已經(jīng)通過(guò)反向遺傳學(xué)生產(chǎn)了減毒的H5m重排病毒(RG，I^alese等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93 11354-58，1996)，其中使用了來(lái)自H5m毒株的HA和NA基因，并將這些基因插入到包含來(lái)自于致病性較低的病毒的其余內(nèi)部流感病毒基因的“骨架”病毒中。常用的骨架源自于Hmi亞型的原型毒株A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34)，其高度適應(yīng)于在卵中生長(zhǎng)，并且只有兩種表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)源自于H5W病毒。這些重排病毒被設(shè)計(jì)用于在卵中生產(chǎn)疫苗，但是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的現(xiàn)有反向遺傳學(xué)重排體在卵中和細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)不良。例如，Suguitan等(PLoS Medicine 3 1541-54，2006) 描述了使用冷適應(yīng)Ann ArboHca AA)骨架產(chǎn)生了具有來(lái)自H5m毒株A/Hong Kong/^213和 A/Vietnam/1203/2004的HA和NA基因的病毒。這些病毒被證實(shí)在體內(nèi)減毒，即在雞中不致死，并且在用野生型H5W病毒重新激惹的小鼠中還表現(xiàn)出一定的保護(hù)效應(yīng)。Shengqiang 等(J Infectious Dis 179 :1132-8,1999)也使用大流行的香港(Hong Kong)毒株的 HA 禾口 NA基因和Arm Arbor毒株的內(nèi)部基因產(chǎn)生了重組病毒。然而，這些病毒在卵中的生長(zhǎng)未達(dá)到最好。同樣，Ming 等，Chin. J.Biotech. (2006)22 :720-7 特別描述了包含來(lái)自 H9N2 病毒株的內(nèi)部基因以及來(lái)自H5m毒株的修飾的HA基因和來(lái)自H2N3的NA基因的重排病毒。 Shi等，Vaccine (2007) 25 :7379-7384特別描述了具有來(lái)自于H9N2毒株的內(nèi)部基因和來(lái)自于H5m毒株的修飾的HA和野生型NA基因的重排病毒。Hickman等(J. Gen. Virol. 89 2682-2690, 2008)特別描述了包含用來(lái)自于HlNl、H5N1和H7N2毒株的HA和/或NA基因援救的來(lái)自于H9N2毒株的骨架基因的疫苗。最近的研究嘗試了產(chǎn)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的疫苗，以避免在卵中生長(zhǎng)病毒時(shí)所通常觀察到的問(wèn)題，例如保持和維護(hù)卵設(shè)施的成本、從卵蛋白純化病毒以及對(duì)殘留卵蛋白的過(guò)敏。其中美國(guó)專(zhuān)利6，146，873和7，132，271討論了能夠生產(chǎn)疫苗級(jí)病毒的培養(yǎng)細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)。也參見(jiàn)Kistner等(Vaccine 16 =960-8,1998)，其公開(kāi)了適合于提高病毒生長(zhǎng)的VERO細(xì)胞并描述了疫苗生產(chǎn)，以及Ehrlich等(New Eng J Med 35 =2573-84,2008), 其特別描述了用甲醛溶液失活的在Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)的H5W完整病毒疫苗。因此，在本技術(shù)領(lǐng)域中仍需要生產(chǎn)與現(xiàn)有疫苗相比抗原性增加的大流行或季節(jié)性流感疫苗，其能夠在宿主中引發(fā)良好的免疫應(yīng)答，不引起感染，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出強(qiáng)健的生長(zhǎng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了針對(duì)流感病毒的改進(jìn)疫苗的生產(chǎn)，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有來(lái)自于相同的病毒性甲型流感亞型或乙型流感毒株的血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因以及來(lái)自于不同甲型流感亞型或乙型流感毒株的內(nèi)部基因。在一種情況下，HA和NA 基因以及內(nèi)部基因源自于甲型流感的高致病性H5W毒株。一方面，本發(fā)明提供了重排流感病毒，其包含來(lái)自于第一種甲型流感病毒亞型的內(nèi)部基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及來(lái)自于內(nèi)部基因所來(lái)源的流感病毒亞型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，內(nèi)部基因源自于甲型流感亞型的第一種毒株，HA和NA 基因源自于甲型流感亞型的第二種毒株。此外，設(shè)想了 NS基因包含NS1、NS2、或NSl和NS2 基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了純化的重排流感病毒，其包含甲型流感H5m毒株的內(nèi)部基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及來(lái)自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA) 和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。在相關(guān)實(shí)施方案中，HA和NA基因來(lái)自于第一個(gè)H5W進(jìn)化枝(clade)，內(nèi)部基因來(lái)自于第二個(gè)H5W進(jìn)化枝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA和NA基因以及內(nèi)部基因源于同一個(gè)進(jìn)化枝。此外還設(shè)想了 NS基因包含NS1、 NS2、或NSl禾口 NS2基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了重排流感病毒，其包含來(lái)自于第一種乙型流感病毒株的內(nèi)部基因區(qū)段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于第二種乙型流感毒株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。在又一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒的HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)(polybasic cleavage site)處被修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因中多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處的修飾是RERRRKKR(SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒的特征是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。在又一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自MRC-5、MRC-9、Lederle 130、張氏(Chang)肝細(xì)胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 禾口 CD4 表達(dá)型 HUT78、 PerC6、BHK-21細(xì)胞、BSC和LLC-MK2。在相關(guān)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物是Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實(shí)施方案中，甲型流感亞型包含Hl至H16與附至N9的任何組合，包括 HlNl、H2N1、H3N1、H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、HlONl、HlINl、H12N1、H13N1、H14N1、 Hl 5N1、H16N1 ;H1N2、H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、Hl 1N2、Hl 2N2、 Hl3N2、H14N2、Hl5N2、H16N2 ;H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、 H11N3、H12N3、H13N3、H14N3、H15N3、H16N3 ;H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、 H9N4、H10N4、H11N4、H12N4、H13N4、H14N4、H15N4、H16N4 ；H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、 H7N5、H8N5、H9N5、H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5 ；H1N6、H2N6、H3N6、 H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6 ； H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、Hl 1N7、Hl 2N7、Hl 3N7、H14N7、Hl5N7、H16N7 ;H1N8、H2N8、H3N8、H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、Hl 1N8、Hl2N8、 Hl3N8、H14N8、Hl5N8、H16N8 ;H1N9、H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、 H11N9、H12N9、H13N9、H14N9、H15N9和H16N9。在某些實(shí)施方案中，甲型流感亞型是H5m。在一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒的內(nèi)部基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域已知并在下面的詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部基因源自于選自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97, A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在具體實(shí)施方案中，內(nèi)部基因來(lái)自于A/Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒的HA和NA基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域已知并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA基因源自于選自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些實(shí)施方案中，內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他實(shí)施方案中，內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于不同病毒株。在實(shí)施方案中，HA和NA基因來(lái)自于H5m毒株A/Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA和NA基因來(lái)自于H5m毒株A/Indonesia/5/05o另一方面，本發(fā)明提供了抗原性重排流感病毒組合物，其包含來(lái)自于第一種甲型流感病毒亞型的內(nèi)部基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及來(lái)自于內(nèi)部基因所來(lái)源的流感病毒亞型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，內(nèi)部基因源自于甲型流感亞型的第一種毒株，HA和NA基因源自于甲型流感亞型的第二種毒株。還設(shè)想了 NS基因包含NS1、NS2、 或NSl禾口 NS2基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原性重排甲型流感病毒組合物包含源自于甲型流感H5W 毒株的內(nèi)部基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)以及源自于甲型流感病毒H5W的血凝素 (HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。還設(shè)想了 NS基因包含NS1、 NS2、或NSl禾口 NS2基因。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗原性重排流感病毒組合物，其包含來(lái)自于第一種乙型流感病毒株的內(nèi)部基因區(qū)段PB1、PB2、PA、NP、M和NS以及來(lái)自于第二種乙型流感毒株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，其中病毒的特征是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒的病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒的特征是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原性組合物的內(nèi)部基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域已知并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部基因源自于選自下列的 H5N1 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在具體實(shí)施方案中，內(nèi)部基因來(lái)自于A/Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原性組合物的HA和NA基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域已知并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA基因源自于選自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些實(shí)施方案中，抗原性組合物的內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于相同病毒株。 在其他實(shí)施方案中，內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于不同病毒株。在實(shí)施方案中，抗原性組合物的HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA和NA基因來(lái)自于H5m毒株A/ Indonesia/5/05。在又一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因中多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處的修飾是RERRRKKR (SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO 14)的突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原性組合物還包含可藥用載體?！矫?，本發(fā)明設(shè)想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含i)編碼表面蛋白HA的多核苷酸和編碼表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每個(gè)都源自于甲型流感病毒亞型的第一種毒株；編碼PBl的多核苷酸，編碼PA的多核苷酸，編碼PB2的多核苷酸，編碼M 的多核苷酸，編碼NS (NSl和/或NS2)的多核苷酸，編碼NP的多核苷酸，PB1、PB2、PA、NP、 M和NS的多核苷酸源自于甲型流感病毒亞型的第二種毒株，其中所述多核苷酸可操作地連接，以允許重排的多核苷酸包裝在病毒粒子中。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含 編碼表面蛋白HA的多核苷酸和編碼表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每個(gè)都源自于流感病毒H5W ；編碼PBl的多核苷酸，編碼PA的多核苷酸，編碼PB2的多核苷酸，編碼M的多核苷酸，編碼NSl (NSl和/或NS2)的多核苷酸，編碼NP的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS 的多核苷酸源自于流感病毒H5W，多核苷酸可操作地連接，以允許重排的多核苷酸包裝在病毒粒子中。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含編碼表面蛋白HA的多核苷酸和編碼表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每個(gè)都源自于乙型流感病毒的第一種毒株；編碼PBl的多核苷酸，編碼PA的多核苷酸，編碼PB2的多核苷酸，編碼 M的多核苷酸，編碼NP的多核苷酸，編碼NS的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于乙型流感病毒的第二種毒株，其中多核苷酸可操作地連接，以允許重排的多核苷酸包裝在病毒粒子中，并且其中病毒的特征是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗中的內(nèi)部基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域中已知并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述內(nèi)部基因源自于H5m毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗中的HA和NA基因源自于本技術(shù)領(lǐng)域中已知并在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的H5m病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA和NA基因源自于選自下列的 H5m 毒株A/Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05 和 A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96 樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004, A/duck/Singapore/3/97, A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。在某些實(shí)施方案中，疫苗中的內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于相同病毒株。在其他實(shí)施方案中，內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于不同病毒株。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗中的HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HA和NA基因來(lái)自于H5m毒株A/ Indonesia/5/05。在又一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因中多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處的修飾是RERRRKKR (SEQ ID NO 13) — TETR(SEQ ID NO 14)的突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗還包含佐劑。示例性佐劑包括但不限于皂角苷、非離子型去污劑、植物油、無(wú)機(jī)凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、普盧諾尼克 (Pluronic)多元醇、聚陰離子、肽類(lèi)、油或烴類(lèi)乳液、匙孔血藍(lán)蛋白以及潛在有用的人類(lèi)佐劑例如N-乙酰-胞壁酰基-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N_乙酰-去甲胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺?；?L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕櫚酰基-s-n-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、ISC0M、納米珠、鯊烯和嵌段共聚物，它們被設(shè)想單獨(dú)或組合使用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗是失活的疫苗。設(shè)想了使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法和試劑進(jìn)行滅活，包括但不限于甲醛、UV輻射、戊二醛、二元乙烯亞胺(BEI)和β-丙內(nèi)酯。還設(shè)想了疫苗作為活的減毒病毒疫苗給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含的HA含量為Iyg至75 μ g HA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含的HA含量為每份疫苗1 μ g至30 μ g。在相關(guān)實(shí)施方案中，給藥的疫苗劑量為 1μ g、3y g、5y g、7. 5μ g、10y g、12. 5μ g、15y g、20y g、25y g、30y g HA，或者根據(jù)需要是直至100 μ g HA的任何量。因此，單次疫苗劑量包括具有約1 μ g、約2 μ g、約3 μ g、約 4μ g、@ 5μ g、@ 6μ g、@ 7 μ g> ^ 8 μ g> ^ 9 μ g> ^ 10μ g、@ 11 μ g、@ 12μ g、@ 13μ g、 約 14μ g、約 15μ g、約 16μ g、約 17μ g、約 18μ g、約 19μ g、約 20μ g、約 21μ g、約 22 μ g、 約 23μ g、約 Μμ g、約 25μ g、約 30μ g、約!35μ g、約 40μ g、約 45μ g、約 50μ g、約 55μ g、約 60μ g、約 65μ g、約 70μ g、約 75μ g、約 80μ g、約 85μ g、約 90μ g、約 95μ g、約 100 μ g 和超過(guò)100μ g血凝素的劑量，其以相同或不同的血凝素量在單劑或多劑中提供。另一方面，本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中引發(fā)針對(duì)至少一種大流行的流感病毒株的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給藥本文中所述的病毒、抗原性組合物或疫苗，其量能夠有效保護(hù)對(duì)象抵抗至少一種H5m流感病毒株的感染。在相關(guān)方面，本發(fā)明設(shè)想了用于在對(duì)象中引發(fā)針對(duì)至少一種季節(jié)性流感病毒株的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給藥本文中所述的病毒、抗原性組合物或疫苗，其量能夠有效保護(hù)對(duì)象抵抗至少一種甲型流感病毒和/或乙型流感病毒株的感染。另一方面，本發(fā)明設(shè)想了防止對(duì)象被H5m流感病毒感染的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥有效量的本文中所述的病毒、抗原性組合物或疫苗。另一方面，本發(fā)明設(shè)想了用于防止對(duì)象被甲型流感病毒或乙型流感病毒感染的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥有效量的本文中所述的病毒、抗原性組合物或疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的方法的疫苗包含的HA含量為Iyg至75 μ g HA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含的HA含量為每劑疫苗Iyg至30yg。在相關(guān)實(shí)施方案中，給藥的疫苗劑量為 1 μ g>3 μ g,5 μ g,7. 5 μ gUO μ gU2. 5 μ g,15 μ g,20 μ g,25 μ g, 30 μ g ΗΑ，或者根據(jù)需要是直至IOOyg HA的任何量。因此，單次疫苗劑量包括具有約1 μ g、 ^ 2μ 3μ g、@ 4μ g、@ 5μ g、@ 6μ g、@ 7 μ g> ^ 8 μ g> ^ 9 μ g> ^ 10μ g、@ 11 μ g、 約 12μ g、約 13μ g、約 14μ g、約 15μ g、約 16μ g、約 17μ g、約 18μ g、約 19μ g、約 20 μ g、 約 21μ g、約 22μ g、約 23μ g、約 24μ g、約 25μ g、約 30μ g、約 35μ g、約 40μ g、約 45 μ g、 約 50 μ g、約 55 μ g、約 60 μ g、約 65 μ g、約 70 μ g、約 75 μ g、約 80 μ g、約 85 μ g、約 90 μ g、約 95 μ g、約100 μ g和超過(guò)100 μ g血凝素的劑量，其提供在單劑或相同或不同血凝素量的多劑中。另一方面，本發(fā)明提供了制造包含重排流感病毒的疫苗的方法，所述重排流感病毒包含甲型流感H5m毒株的內(nèi)部基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、M、NP和NS)以及來(lái)自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于同一病毒株并且 HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾以產(chǎn)生減毒的HA基因，所述方法包含將病毒在適合于重排病毒生長(zhǎng)的條件下轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在相關(guān)實(shí)施方案中，本文描述的制造疫苗的方法可用于制造包含甲型或乙型流感的季節(jié)性流感毒株的疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自MRC-5、MRC_9、Lederle 130、張氏肝細(xì)胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 和 CD4 表達(dá)型 HUT78、 PerC6、BHK-21細(xì)胞、BSC和LLC-MK2。在相關(guān)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Vero細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中還設(shè)想了以上描述的病毒和組合物缺乏流感的所有6個(gè)內(nèi)部基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒包含2、3、4或5個(gè)流感病毒的內(nèi)部基因。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒和/或其組合物和/或疫苗缺乏所有或部分NSl基因。在另一個(gè)方面，設(shè)想了使用任何甲型和乙型流感病毒株來(lái)執(zhí)行本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，重排病毒可以具有來(lái)自甲型流感的8個(gè)流感基因的任何組合。在相關(guān)實(shí)施方案中，重排病毒可以具有來(lái)自乙型流感病毒的8個(gè)流感基因的任何組合。本發(fā)明排除了以前公開(kāi)的或例如使用骨架如A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)、A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)、A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和 B/Ann Arbor/1/66 生產(chǎn)的、具有來(lái)自于第一種亞型的一種毒株的內(nèi)部基因和來(lái)自于同一亞型的不同毒株的HA和NA基因的任何病毒(甲型流感和乙型流感)，這些病毒公開(kāi)在本文引用的任何現(xiàn)有出版物中，包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利 4，552，758,7, 037，707,7, 601，356,7, 566，458,7, 527，800,7, 510，719、 7，504， 109、7，465，456 和 7，459， 162 ；美國(guó)專(zhuān)利公布 20090297554、20090246225、 20090208527,20090175909,20090175908,20090175907,20090136530,20080069821, 20080057081,20060252132,20060153872,20060110406,20050158342,20050042229 和 20070172929 ；國(guó)際專(zhuān)利公布 Nos. WO 2008/157583、WO 2008/021959、WO 2007/048089、WO 2006/098901、WO 2006/063053、WO 2006/041819、WO 2005/116260、WO 2005/116258、WO 2005/115448, WO 2005/062820、WO 2003/091401、以及在其中鑒定到的可用于 FLUMIST 疫苗的病毒，其可以在重組病毒中包含來(lái)自一種甲型流感亞型毒株的內(nèi)部基因和同一亞型的不同毒株的HA和NA基因。所有這些文獻(xiàn)在此以其全文引為參考。在實(shí)施方案中，本發(fā)明還排除了包含流感亞型的第一種毒株的骨架以及來(lái)自同一流感亞型的第二種毒株的HA和NA基因的天然存在的重排病毒。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ) “天然存在的重排病毒”是指在自然環(huán)境例如病毒宿主中沒(méi)有外部源的干預(yù)下重組的重排病毒。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明排除了具有來(lái)自于作為骨架的第一種甲型或乙型流感亞型例如突變的 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)、A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)或 B/Ann Arbor/1/66的一個(gè)或多個(gè)修飾過(guò)的內(nèi)部基因、以及來(lái)自于相同流感病毒株的HA和NA基因的重排病毒，例如在美國(guó)專(zhuān)利公布No. 20070172929中所示例的。然而，本發(fā)明設(shè)想了將包含流感亞型的骨架毒株的修飾過(guò)的內(nèi)部基因以及來(lái)自同一亞型但是不同毒株的HA和NA基因的病毒，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明排除了使用冷適應(yīng)病毒例如A/Arm Arbor/6/60 (H2N2) ,A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) ,B/Ann Arbor/1/66 以及本技術(shù)領(lǐng)域中已知的其他冷適應(yīng)病毒作為骨架/供體毒株所產(chǎn)生的重排病毒，其中內(nèi)部骨架基因來(lái)自于第一種亞型，HA和NA基因來(lái)自于同一亞型的不同毒株。附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非編碼區(qū)修飾的A/ Vietnam/1203/04(H5N1)的HA切割位點(diǎn)核苷酸序列和其他內(nèi)部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出。圖2顯示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非編碼區(qū)修飾的A/ Indonesia/5/05 (H5N1)的HA切割位點(diǎn)核苷酸序列和其他內(nèi)部基因序列。源自于A/Hong Kong的序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出。圖3顯示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非編碼區(qū)修飾的A/Turkey/ Turkey/1/05 (H5N1)的HA切割位點(diǎn)核苷酸序列和其他內(nèi)部基因序列。源自于A/Hong Kong 的序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出。圖4顯示了使用源自于A/Hong Kong/213/03的非編碼區(qū)修飾的A/ Anhui/1/05(H5N1)的HA切割位點(diǎn)核苷酸序列和其他內(nèi)部基因序列。源自于A/Hong Kong 的序列用下劃線(xiàn)標(biāo)出詳細(xì)說(shuō)明書(shū)本發(fā)明提供了包含重排病毒的改進(jìn)的疫苗，所述重排病毒具有源自于各種流感毒株的病毒結(jié)構(gòu)蛋白——血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)以及病毒內(nèi)部基因[PB1、PB2、PA、 NS (NSl、NS2)、Ml、M2和NP]。本發(fā)明的疫苗是其中病毒內(nèi)部基因源自于特定流感毒株，并且HA和NA基因源自于相同毒株的疫苗，但是內(nèi)部基因所來(lái)源的毒株是甲型流感亞型或乙型流感毒株，其不同于HA和NA基因所來(lái)源的甲型流感亞型或乙型流感毒株。一種情況下， HA和NA基因源自于相同甲型流感亞型，而在另一種情況下，HA和NA基因源自于不同甲型流感亞型。盡管本發(fā)明通篇具體參考H5W疫苗和抗原性組合物作為示例，但應(yīng)該理解，按照描述所構(gòu)建的任何流感毒株都被本發(fā)明所涵蓋。本發(fā)明的疫苗包括針對(duì)甲型和乙型流感毒株的疫苗。甲型流感毒株包括16種HA亞型和9種NA亞型。重排病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中有效生長(zhǎng)，這是超越于含胚卵中生長(zhǎng)的傳統(tǒng)方法的改進(jìn)生產(chǎn)方法。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通專(zhuān)業(yè)人員所通常理解的相同的含義。下面的參考文獻(xiàn)為專(zhuān)業(yè)人員提供了本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的通用定義=Singleton等，《微生物和分子生物學(xué)詞典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (第二版，1994)；《劍橋科學(xué)技術(shù)詞典》(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker 主編，1988)；《遺傳學(xué)詞匯》(THE GLOSSARY OF GENETICS)第五版，R. Rieger 等主編，Springer Verlag(I99I)；以及 Hale 和 Marham，((HARPER COLLINS 生物學(xué)詞典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。在本文中引用的每個(gè)出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其他參考文獻(xiàn)，在與本公開(kāi)內(nèi)容沒(méi)有沖突的程度上以其全文引為參考。這里指出，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，沒(méi)有具體數(shù)量的指稱(chēng)包括其復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指明不是如此。當(dāng)在本文中使用時(shí)，下列術(shù)語(yǔ)具有屬于它們的意義，除非明確表明不是如此。術(shù)語(yǔ)“重排病毒”是其中來(lái)自于目標(biāo)病毒株的編碼抗原性蛋白(例如血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因)的基因區(qū)段與來(lái)自不同病毒株的編碼病毒聚合酶復(fù)合物(PB2、PB1和PA) 的基因或其他類(lèi)似基因(例如非糖蛋白基因，包括M基因和NS基因，以及核蛋白(NP)基因)的基因區(qū)段組合的病毒。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“毒株”是指給定物種例如甲型或乙型流感物種和甲型流感病毒的亞型的特定病毒變體。例如，病毒A/Vietnam/1203/2004是甲型流感病毒H5m亞型，毒株名稱(chēng)為A/Vietnam/1203/2004。術(shù)語(yǔ)“源自于”是指與野生型或天然存在的多核苷酸或多肽序列相比發(fā)生改變或突變的多核苷酸或多肽序列的全部或部分，其中源自于野生型序列的多核苷酸或多肽在一個(gè)或多個(gè)堿基或氨基酸中發(fā)生改變，使其不再具有與野生型序列相同的序列。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“亞型”是指甲型流感毒株中的不同病毒可以根據(jù)病毒株中表達(dá)的HA和NA基因分類(lèi)成亞型。甲型流感亞型的命名是根據(jù)HA亞型，例如亞型是本技術(shù)領(lǐng)域已知的16種不同HA基因中的任一種，以及NA亞型，例如本技術(shù)領(lǐng)域已知的9種不同NA基因的任一種。示例性亞型包括但不限于H5m、HlNl、H3N2和本技術(shù)領(lǐng)域中已知的許多其他亞型。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“進(jìn)化枝”是指現(xiàn)有的甲型流感病毒H5W的不同分類(lèi)。 H5N1進(jìn)化枝中的病毒是遺傳相關(guān)的，但是不共有完全相同的病毒基因組。在本技術(shù)領(lǐng)域中指明了至少7種不同的H5W亞型進(jìn)化枝，例如進(jìn)化枝1、進(jìn)化枝2、進(jìn)化枝3、進(jìn)化枝4、進(jìn)化枝5、進(jìn)化枝6和進(jìn)化枝7。進(jìn)化枝2被進(jìn)一步分成亞進(jìn)化枝。術(shù)語(yǔ)“抗原性組合物”是指包含在宿主或?qū)ο笾写碳っ庖呦到y(tǒng)并引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)的組合物。術(shù)語(yǔ)“引發(fā)免疫應(yīng)答”是指在體內(nèi)對(duì)刺激物例如抗原做出響應(yīng)刺激免疫細(xì)胞。免疫應(yīng)答由細(xì)胞免疫應(yīng)答例如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激、和體液免疫應(yīng)答例如B細(xì)胞和補(bǔ)體刺激和抗體產(chǎn)生兩者構(gòu)成。細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答不相互排斥，并且設(shè)想了其一種或兩種被本文描述的抗原性組合物、病毒或疫苗刺激。免疫應(yīng)答可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)測(cè)量，所述技術(shù)包括但不限于抗體免疫測(cè)定法、增殖測(cè)定法和詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中更詳細(xì)描述的其他技術(shù)。術(shù)語(yǔ)“減毒的”用于描述顯示出毒力降低(與野生型病毒相比)的病毒或抗原性組合物。修飾的HA是從野生型HA發(fā)生改變的HA基因，其編碼的蛋白被切開(kāi)的程度比野生型HA蛋白低，引起病毒生長(zhǎng)降低。減毒病毒典型但并不總是通過(guò)鼻內(nèi)給藥。設(shè)想了通過(guò)本文描述的任何途徑進(jìn)行減毒病毒的給藥。術(shù)語(yǔ)“失活的”在本文中用于描述在本技術(shù)領(lǐng)域中也稱(chēng)為“被殺死”或“死亡”病毒的病毒。失活的病毒是沒(méi)有毒力性質(zhì)的完整病毒，并且從“活的”病毒產(chǎn)生，而不論病毒是否以前以任何方式減毒。失活的病毒典型但并不總是通過(guò)肌肉內(nèi)注射給藥。設(shè)想了通過(guò)本文描述的任何途徑進(jìn)行失活病毒的給藥。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“疫苗，，是指包含本文所述的重排病毒的組合物，其可用于在對(duì)象中建立針對(duì)病毒的免疫力。設(shè)想了疫苗包含可藥用載體和/或佐劑。設(shè)想了疫苗是預(yù)防性或治療性的?！邦A(yù)防性”治療是對(duì)沒(méi)有表現(xiàn)出疾病征兆或僅表現(xiàn)出早期征兆的對(duì)象施用的、目的在于降低發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的治療。本發(fā)明的化合物可以作為預(yù)防治療提供，以降低發(fā)生疾病的可能性或者如果疾病發(fā)生，將其嚴(yán)重性降到最低。“治療性”治療是對(duì)表現(xiàn)出疾病征兆或癥狀的對(duì)象施用的、目的在于減輕或消除那些征兆或癥狀的治療。征兆或癥狀可以是生物化學(xué)、細(xì)胞、組織學(xué)、功能性的，可以是主觀的或客觀的。多肽的“片段”是指多肽的小于全長(zhǎng)多肽或蛋白表達(dá)產(chǎn)物的任何部分。在一種情況下，片段是全長(zhǎng)多肽的缺失類(lèi)似物，其中已經(jīng)從全長(zhǎng)多肽的氨基端和/或羧基端移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。因此，“片段”是下面描述的缺失類(lèi)似物的亞組?！澳M物”、“類(lèi)似物”或“衍生物”可以互換使用，是指與天然存在的分子在結(jié)構(gòu)上基本類(lèi)似并具有相同生物活性、盡管在某些情況下程度有所不同的化合物，例如肽或多肽。 類(lèi)似物與類(lèi)似物所來(lái)源的天然存在的多肽相比，差異在于其氨基酸序列的組成，這種差異是基于一個(gè)或多個(gè)突變，所述突變包括(i)刪除位于多肽一個(gè)或多個(gè)末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、和/或天然存在的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域，(ii)在多肽的一個(gè)或多個(gè)末端插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸(典型為“添加”類(lèi)似物)，和/或插入或添加天然存在的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域(典型為“插入”類(lèi)似物)，或(iii)將天然存在的多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代成其他氨基酸。設(shè)想了本發(fā)明的重排病毒包含病毒基因的類(lèi)似物，所述基因包括ΗΑ、ΝΑ、PB1、PB2、PA, M (Ml和M2)、NS (NSl和NS2)和NP基因中的任一個(gè)或一個(gè)以上。一種情況下，類(lèi)似物與野生型或天然存在的序列例如肽表現(xiàn)出約70%但低于 100%的序列相似性。在一種情況下，這樣的類(lèi)似物或衍生物包含非天然存在的氨基酸殘基，包括例如但不限于高精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、青霉胺和正纈氨酸，以及天然存在的氨基酸殘基。 在另一種情況下，這樣的類(lèi)似物或衍生物由一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸殘基構(gòu)成，或在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基之間含有非肽互連。在一個(gè)實(shí)施方案中，類(lèi)似物或衍生物可以是多肽的片段， 其中所述片段與野生型多肽在至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度上基本同源(即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同源)。根據(jù)被取代的氨基酸和取代它的氨基酸的物理化學(xué)或功能相關(guān)性，取代是保守或非保守的。這種類(lèi)型的取代在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。供選地，本發(fā)明也包含了非保守取代。示例性的保守取代描述在Lehninger，[《生物化學(xué)》(第二版)(Biochemistry，2nd Edition) ；Worth Publishers, Inc. , New York(1975), pp. 71-77]中，并在下面列出。保守取代
側(cè)鏈性質(zhì)氨基酸
非極性(疏水)
A.脂族ALIVP
B.芳香族FW
C.含硫M
D.臨界(borderline)G不帶電荷-極性A.羥基STY
B.酰胺NQ
C.巰基C
D.臨界G
帶正電荷(堿性)KRH
帶負(fù)電荷(酸性)DE或者，示例性保守取代直接在下面列出。保守取代II
原始?xì)埢纠匀〈鶤la (A)Val, Leu, lieArg (R)Lys, Gin, AsnAsn (N)Gin, His, Lys, ArgAsp (D)GluCys (C)SerGln (Q)AsnGlu (E)AspHis (H)Asn5 Gin, Lys, ArgHe (I)Leu, Val, Met, Ala, PheLeu (L)lie, Val, Met, Ala, PheLys (K)Arg, Gin, AsnMet (M)Leu, Phe, liePhe(F)Leu, Val, lie, AlaPro (P)GlySer (S)ThrThr (T)SerTrp (W)TyrTyr (Y)Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)lie, Leu, Met, Phe, Ala當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指病毒或抗原性組合物從其天然環(huán)境中取出。因此，分離的生物材料不含某些或所有細(xì)胞組分，即天然存在天然材料的細(xì)胞組分(例如細(xì)胞質(zhì)或膜組分)。在一種情況下，如果病毒或抗原性組合物存在于細(xì)胞提取物或上清液中，其被視為分離的。在核酸分子的情況下，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA 或限制性片段。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“純化的”是指病毒或抗原性組合物已經(jīng)在減少或消除存在的無(wú)關(guān)材料的條件下分離，所述無(wú)關(guān)材料即污染物、包括從中獲得組合物的內(nèi)源材料。例如而非限制性的，純化的病毒粒子基本上不含宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物組分，包括組織培養(yǎng)物或卵蛋白和非特異性病原體。在各種實(shí)施方案中，基本上不含污染物的純化材料是至少50% 純；至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 % 或甚至至少99%純的。純度可以通過(guò)層析、凝膠電泳、免疫測(cè)定法、組成分析、生物測(cè)定法和本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他方法來(lái)評(píng)估。術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指適合于給藥到對(duì)象動(dòng)物、包括人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的組合物。 藥物組合物包含藥理有效量的本發(fā)明的病毒或抗原性組合物，并且也包含可藥用載體。藥物組合物涵蓋了包含活性成分和構(gòu)成可藥用載體的惰性成分的組合物，以及由任兩種或多種成分的組合、復(fù)合或聚合所直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的藥物組合物涵蓋了通過(guò)將本發(fā)明的化合物或結(jié)合物與可藥用載體混合而制成的任何組合物。術(shù)語(yǔ)“可藥用載體”包括任何和所有臨床有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、緩沖劑和賦形劑，例如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液、5%葡萄糖或甘露糖醇水溶液和乳液例如油/水乳液或水/油乳液，以及各種類(lèi)型的潤(rùn)濕劑和/或佐劑。適合的藥物載體和制劑描述在《Remington藥物學(xué)》第19版中(Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. ) (Mack Publishing Co.，Easton，1995)?？捎糜诮M合物的藥物載體取決于活性藥劑所打算的給藥方式。典型的給藥方式包括但不限于腸(例如口服)或腸胃外(例如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射；或局部、透皮或經(jīng)粘膜給藥)。 “可藥用鹽”是能夠配制在化合物或結(jié)合物中用于藥物應(yīng)用的鹽，包括例如金屬鹽(鈉、鉀、 鎂、鈣等)以及氨或有機(jī)胺的鹽。術(shù)語(yǔ)“可藥用”或“藥理學(xué)可接受”是指在生物學(xué)等方面沒(méi)有不利的材料，即材料可以給藥于個(gè)體而不引起任何不想要的生物效應(yīng)，或與包含它的組合物中的任何組分或當(dāng)使用下面描述的本技術(shù)領(lǐng)域公知的途徑給藥時(shí)以有害的方式發(fā)生相互作用。流感基因流感病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，其屬于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科。甲型流感病毒由9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，并另外編碼一個(gè)具有調(diào)控功能的非結(jié)構(gòu)性NSl蛋白。流感病毒分節(jié)段基因組含有8個(gè)負(fù)義RNA (nsRNA)基因區(qū)段( 82181、？4、呢、賂、撤和嫩)，其編碼至少10個(gè)多肽，包括RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB 1和PA)、核蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(亞基HAl和HA2)、基質(zhì)蛋白(Ml和M2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2) (Krug 等，《在流感病毒中》(In The Influenza Viruses), R.M. Krug 主編，Plenum Press, N. Y.，1989，pp. 89152)。流感病毒引起廣泛傳播的疾病的能力是由于其通過(guò)經(jīng)歷抗原性變化而避開(kāi)免疫系統(tǒng)的能力，這種抗原性變化被認(rèn)為在宿主被動(dòng)物流感病毒和人類(lèi)流感病毒兩者同時(shí)感染時(shí)發(fā)生的。在宿主中突變和重排期間，病毒可以將來(lái)自于另一種病毒的HA和/或NA表面蛋白基因摻入到其基因組中，從而產(chǎn)生新的流感亞型并避開(kāi)免疫系統(tǒng)。血凝素
HA是病毒表面糖蛋白，其包含約560個(gè)氨基酸，占病毒總蛋白的25%。它在感染的早期階段負(fù)責(zé)病毒粒子附著及穿透到宿主細(xì)胞中。存在16種已知的HA亞型，其被分類(lèi)為 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 亞型。對(duì)于病毒感染細(xì)胞來(lái)說(shuō)，病毒HAO前體切割成HAl和HA2亞片段是必需的步驟。因此，為了將宿主細(xì)胞中的新病毒粒子轉(zhuǎn)變成能夠感染新細(xì)胞的病毒粒子，需要進(jìn)行切割。已知切割發(fā)生在整合的HAO膜蛋白從被感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向質(zhì)膜運(yùn)輸期間。在運(yùn)輸過(guò)程中， 血凝素經(jīng)歷一系列共翻譯和翻譯后修飾，包括前體HA通過(guò)蛋白水解切割成氨基端片段HAl 和羧基端片段HA2。在原代組織培養(yǎng)物或已建立的細(xì)胞系中生長(zhǎng)流感毒株的一個(gè)主要困難， 在于宿主細(xì)胞中的流感血凝素需要蛋白水解切割活化。盡管已知未切割的HA能夠介導(dǎo)病毒與其細(xì)胞表面上含神經(jīng)氨酸的受體的附著， 但它不能進(jìn)入感染周期的下一步，即融合。已經(jīng)報(bào)道，需要通過(guò)切割暴露出HA2的疏水氨基端，以便它能夠插入到靶細(xì)胞中，從而在病毒與靶細(xì)胞膜之間形成橋。在該過(guò)程之后，兩個(gè)膜融合并使病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。HA的蛋白水解活化涉及通過(guò)類(lèi)似胰蛋白酶的內(nèi)切蛋白酶在精氨酸殘基處切割，這種酶通常是鈣依賴(lài)性的細(xì)胞內(nèi)酶，并具有中性最適PH。因?yàn)榛罨缘鞍酌甘羌?xì)胞的酶，因此被感染細(xì)胞的類(lèi)型決定了 HA是否被切割。哺乳動(dòng)物流感病毒和非致病性禽流感病毒的 HA只對(duì)有限數(shù)量細(xì)胞類(lèi)型中的蛋白水解切割敏感。另一方面，H5和H7亞型中致病性禽病毒的HA被廣泛的不同宿主細(xì)胞中存在的蛋白酶切割。因此，存在著由于與病毒致病性相關(guān)的血凝素可切割性差異而導(dǎo)致的宿主范圍的差異?？汕懈钚缘牟町愂怯捎贖A的切割位點(diǎn)的氨基酸序列差異。序列分析顯示，非致病性禽流感病毒和所有哺乳動(dòng)物流感病毒的HA分子的HAl和HA2片段由單個(gè)精氨酸相連。相反，致病性禽毒株在切割位點(diǎn)處具有幾個(gè)堿性氨基酸的序列，常見(jiàn)的共同特性是賴(lài)氨酸-精氨酸或精氨酸-精氨酸，例如RRRK (SEQ ID Ν0:Μ)。所有流感病毒的血凝素被導(dǎo)致消除堿性氨基酸的同樣的通用機(jī)制切開(kāi)。神經(jīng)氨酸酶神經(jīng)氨酸酶是甲型流感病毒的第二種膜糖蛋白。已經(jīng)顯示，病毒NA的存在對(duì)于產(chǎn)生對(duì)抗感染病毒的多方面保護(hù)性免疫應(yīng)答來(lái)說(shuō)是重要的。NA是413個(gè)氨基酸的蛋白，由 1413個(gè)核苷酸的基因編碼。在流感病毒中已鑒定到9種不同的NA亞型(N1、N2、N3、N4、N5、 N6、N7、N8和N9)，它們都已在野生鳥(niǎo)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)。NA通過(guò)從被感染細(xì)胞表面上的糖部分切下末端神經(jīng)氨酸(也稱(chēng)為唾液酸)殘基，參與破壞病毒HA的細(xì)胞受體。NA也從病毒蛋白上切下唾液酸殘基，防止病毒聚集。利用這種機(jī)制，假設(shè)了 NA通過(guò)阻止新形成的病毒粒子沿著細(xì)胞膜聚集并促進(jìn)病毒運(yùn)過(guò)黏膜表面上存在的黏液，而促成病毒子代的釋放。NA是易發(fā)生抗原性變異的重要的抗原決定簇。給藥神經(jīng)氨酸酶的化學(xué)抑制劑限制了病毒感染的嚴(yán)重性和傳播。神經(jīng)氨酸酶抑制劑通過(guò)阻止病毒從宿主細(xì)胞出芽來(lái)對(duì)抗流感感染。示例性NA抑制劑包括但不限于通過(guò)吸入給藥的扎那米韋、通過(guò)口服給藥的奧司他韋和通過(guò)腸胃外給藥的帕拉米韋。流感的內(nèi)部基因除了表面蛋白HA和NA之外，流感病毒還包含6個(gè)其他內(nèi)部基因，其產(chǎn)生8種不同蛋白，包括聚合酶基因PB1、PB2和PA、基質(zhì)蛋白Ml和M2、核蛋白(NP)以及非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和 NS2 (Horimoto 等，Clin Microbiol Rev. 14(1) :129-49,2001) 為了包裝在子代病毒粒子中，病毒RNA作為核糖核蛋白復(fù)合體從核中運(yùn)輸，所述復(fù)合體由三種流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP)和病毒RNA構(gòu)成，并與流感病毒基質(zhì)I(Ml) 蛋白和核外運(yùn)蛋白結(jié)合(Marsh等，J Virol, 82 =2295-2304, 2008) 0位于包膜中的Ml蛋白被認(rèn)為在裝配和出芽中起作用。病毒粒子中整合了有限數(shù)量的M2 蛋白(Zebedee，J. Virol. 62 :2762-2772,1988) 它們形成具有H+離子通道活性的四聚體，并且當(dāng)在內(nèi)體中被低pH活化時(shí)，使病毒粒子內(nèi)部酸化，便于其脫殼(Pinto等，Cell 69 =517-528,1992)。金剛烷胺是通過(guò)干擾M2離子通道活性從而抑制病毒脫殼以阻止病毒感染的抗流感藥物。NSl蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白，其具有多種功能，包括剪接的調(diào)控和細(xì)胞mRNA的核外運(yùn)以及刺激翻譯。NSl的主要功能似乎是抵消宿主的干擾素活性，因?yàn)镹Sl敲除的病毒在干擾素非缺陷型細(xì)胞中可以存活，但是其生長(zhǎng)效率低于親代病毒(Garcia-Mstre，Virology 252 :324-330,1998)。已經(jīng)在病毒粒子中檢測(cè)到NS2蛋白。病毒粒子中NS2的平均數(shù)量據(jù)估計(jì)為130-200 個(gè)分子。體外結(jié)合測(cè)定顯示出Ml與NS2之間的直接蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸。也通過(guò)免疫沉淀在病毒感染的細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到NS2-M1復(fù)合物(Virology. 196 =249-55,1993) 0 NS2 蛋白已知存在于病毒粒子中(Richardson 等，Arch. Virol. 116 :69-80,1991 ；Yasuda 等， Virology 196 =249-255,1993)，據(jù)認(rèn)為通過(guò)與Ml蛋白相互作用在RNP從核的外運(yùn)中發(fā)揮作用(Ward 等，Arch. Virol. 140 :2067-2073,1995)。反向遺傳學(xué)和重排病毒分離和修飾特定核酸和蛋白的技術(shù)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是公知的。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)已在文獻(xiàn)中充分解釋。參見(jiàn)例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第二版(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition.) Cold Spring Harbor,N. Y. :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (在本文中禾爾為"Sambrook等， 1989”)；《DNA 克隆實(shí)用方法》第 I 和 II 卷(DNA Cloning. A Practical Approach, Volumes I and II) (D.N. Glover 主編，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis) (Μ· J. Gait 主編，1984)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization) [B. D. Hames & S. J. Higgins 主編，(1985)]；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription And Translation) [B. D. Hames & S. J. Higgins 主編，(1984)]；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture) [R. I. Freshney 主編，(1986)]；《固定化細(xì)胞與酶》(Immobilized Cells And Enzymes) [IRL Press, (1986)] ;B. Perbal，《分子克隆實(shí)用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984) ；Ausubel，F(xiàn). M.等主編，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons，he.，1994。這些技術(shù)包括使用具有改變的核苷酸的寡核苷酸用于產(chǎn)生具有突變的PCR產(chǎn)物的位點(diǎn)定向誘變技術(shù)。—方面，本發(fā)明是基于通過(guò)本文中描述并在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的反向遺傳學(xué)方法產(chǎn)生禽流感病毒及其疫苗。流感病毒RNA轉(zhuǎn)錄的機(jī)制是獨(dú)特的(Horimoto等，Clin Microbiol Rev. 14(1) 129-49，2001)。來(lái)自細(xì)胞mRNA的5’帽被病毒核酸內(nèi)切酶切開(kāi)，并被病毒的轉(zhuǎn)錄酶用作轉(zhuǎn)錄引物(Krug等，Cell 18 =329-334,1979) 0 8個(gè)RNA區(qū)段中的6個(gè)以單順?lè)醋臃绞睫D(zhuǎn)錄成 mRNA,并翻譯成ΗΑ、ΝΑ、NP、PBl、PB2和PA。相反，兩個(gè)RNA區(qū)段通過(guò)剪接各自轉(zhuǎn)錄成兩個(gè) mRNA。對(duì)于M和NS基因兩者來(lái)說(shuō)，編碼mRNA以不同的閱讀框翻譯，分別產(chǎn)生Ml和M2蛋白以及NSl和NS2蛋白。據(jù)認(rèn)為，游離NP濃度的增加觸發(fā)了從mRNA合成向互補(bǔ)RNA(cRNA)和病毒 RNA(vRNA)合成的轉(zhuǎn)變(Shapiro 等，J. Virol. 62 :2285-2290,1988)。新合成的 vRNA 在核中被NP包殼，在那里它們起到模板的作用，用于病毒mRNA的次級(jí)轉(zhuǎn)錄。最近開(kāi)發(fā)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)允許對(duì)流感病毒基因組進(jìn)行操作O^lese等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :11354—58，1996 ；Neumann 禾口 Kawaoka，Adv. Virus Res. 53 :265, 1999 ；Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :9345,1999 ；Fodor 等，J. Virol. 73 :9679, 1999)。流感病毒情況下的反向遺傳學(xué)的機(jī)理是將負(fù)義RNA工程化改造成cDNA，用于具有負(fù)鏈RNA基因組的生物體的重組制備。反向遺傳學(xué)技術(shù)涉及制備合成的重組病毒RNA，其含有負(fù)鏈病毒的非編碼區(qū)，是病毒RNA被病毒聚合酶識(shí)別以及產(chǎn)生成熟病毒粒子所需的包裝信號(hào)所必需。重組RNA從重組DNA模板合成，并在體外與純化的病毒聚合酶復(fù)合物重構(gòu)，以形成可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重組核糖核蛋白(RNP)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6，022，7 和6，001，634。這些重組方法允許產(chǎn)生在多肽氨基酸序列上具有特定改變的流感病毒類(lèi)型。例如，含有所需取代的HA分子可以是重組流感病毒的一部分。在一種方法中，重組流感病毒通過(guò)遺傳工程方法例如“唯質(zhì)粒(plasmid only)”系統(tǒng)來(lái)制造(Hoffmann等，Vaccine 20 3165,2002)。在另一種用于產(chǎn)生重組病毒的方法中使用了 8質(zhì)粒系統(tǒng)，其中負(fù)義RNA從pol I 啟動(dòng)子表達(dá)，并且聚合酶復(fù)合蛋白的共表達(dá)導(dǎo)致形成了感染性甲型流感病毒(Hoffmann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :6108-13, 2000)。這種技術(shù)允許從cDNA快速生產(chǎn)嵌合疫苗用于流感大流行事件，并提供了為致病性毒株減毒的能力(SiAbarao等，Virology 305 192-200,2003)，同時(shí)消除篩選重排病毒6:2配置(即6個(gè)內(nèi)部基因與2個(gè)HA和NA基因 (每種基因各一個(gè)))的需要。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，037，707。在一個(gè)實(shí)施方案中，在高致病性流感病毒例如H5m的情況下，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變除去造成病毒高致病性本質(zhì)的HA的多堿性氨基酸切割位點(diǎn)，以將病毒減毒并將其類(lèi)別從 BSL-3改變?yōu)锽SL-2。此外，將原型供體毒株的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部基因用其他亞型的病毒基因代替，以進(jìn)一步改進(jìn)生長(zhǎng)特性。這樣組合了高生長(zhǎng)特性與H5W野生型病毒的免疫優(yōu)勢(shì)的病毒，節(jié)省了生產(chǎn)時(shí)間， 并且在一種情況下是6:2重排體，具有來(lái)自于H5W病毒例如越南(Vietnam)株或印度尼西亞andonesia)株的6個(gè)內(nèi)部基因作為骨架，以及實(shí)際的H5W大流行(樣)毒株的HA(帶有用于減毒的突變的切割位點(diǎn))和NA。具有高生長(zhǎng)潛力的重排病毒的另一個(gè)實(shí)例是5:1:2 重排體，具有來(lái)自于H5W病毒例如越南株或印度尼西亞株的5個(gè)內(nèi)部基因、HlNl毒株的 PB2 (用于改進(jìn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長(zhǎng))作為骨架，以及實(shí)際的H5W大流行毒株的HA (帶有用于減毒的突變的切割位點(diǎn))和NA。在某些實(shí)施方案中，使用I^alese等的方法(Proc. Natl. Acad, ki USA 93: 11354-58,1996)制備重排病毒，所述方法描述了使用輔助病毒系統(tǒng)產(chǎn)生遺傳工程病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒使用流感輔助病毒方法產(chǎn)生。例如，為了構(gòu)建6:2重排體，可以使用減毒的VN 1203病毒作為輔助病毒以導(dǎo)入來(lái)自第二個(gè)H5W毒株例如雞埃及毒株的HA和NA (Aly等，Avian Dis. 52 =269-77, 2008) 轉(zhuǎn)染體病毒的選擇使用針對(duì)輔助病毒HA或NA 蛋白的中和抗體來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如I^lese等，同上，其中的圖2)。本文描述的兩種示例性減毒H5m重排體具有H5m進(jìn)化枝1毒株A/ Vietnam/1203/2004 的骨架，即 6 個(gè)內(nèi)部基因(PB1、PB2、PA、NP、M、NS)；—個(gè)含有 H5m 進(jìn)化枝IVietnam 1203毒株的突變的HA和NA，另一個(gè)含有不同進(jìn)化枝的H5W病毒例如進(jìn)化枝 2A/Indonesia/5/05毒株的突變和HA和NA。這兩種減毒的RG重排體具有在標(biāo)準(zhǔn)Vero細(xì)胞(含有胎牛血清)或無(wú)血清蛋白的Vero細(xì)胞中的高生長(zhǎng)潛力。這些重排病毒與現(xiàn)有的 RG H5N1/PR8重排體相比還具有誘導(dǎo)增強(qiáng)的H5W特異性免疫應(yīng)答的潛力，因?yàn)樗鼈兒兄饕?fù)責(zé)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的所有H5W蛋白，即核蛋白和基質(zhì)蛋白。這些H5W特異性免疫應(yīng)答也可能具有通過(guò)特異性誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和記憶細(xì)胞而誘導(dǎo)更廣泛的免疫應(yīng)答的能力，從而引起提高的加強(qiáng)效應(yīng)。在使用現(xiàn)有的具有源自于卵適應(yīng)性 HlNl亞型季節(jié)性毒株的內(nèi)部蛋白的H5m/PR8重排體時(shí)，不會(huì)發(fā)生這樣的結(jié)果，所述重排體不誘導(dǎo)強(qiáng)烈的H5W特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)鑒定到大量H5W毒株，其每個(gè)都適合本發(fā)明。參見(jiàn)例如 Govorkova 等，J Virol. 2005Feb ；79 (4) :2191-8 ；Proc Natl Acad Sci USA 103:2845-50， 2006 ；Horimoto 等，Clin Microbiol Rev 14 129-49，2001 和 Cauthen 等，J Virol. 74 6592-9，2000，以及其他(參見(jiàn)例如 Lee 等，J Virol 79 :3692-02,2005)。可用于本發(fā)明的H5W禽流感毒株的實(shí)例包括但不限于A/ Vietnam/1203/2004(H5N1)(CDC#2004706280) (VN1203)、A/Indonesia/05/2005(H5N1) (CDC#2005740199) (IN5/05)、A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1) (CamR04)、A/ Anhui/1/05(H5N1) (AH1/05)、A/turkey/Turkey/01/2005(H5Nl) (TTOl)(參見(jiàn)例如 Carter 等，BioDrugs. 22 :279-92,2008), A/Vietnam/1194/2004、土耳其流感病毒株 A/ Turkey/England/50-92/91 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Horimoto 等，Clin Microbiol Rev 14 129-49,2001)、A/turkey/England/87-92BFC/91(H5N1) (Londt 等，Avian Pathology, 36 :347-350, 2007)、雞流感病毒株 A/Chicken/Indonesia/03 (H5N 1)、雞流感病毒株 A/ Chicken/Hong Kong/220/97 (參見(jiàn)例如 Tumpey 等，J Virol 76 :6344-55,2002)、雞流感病毒株A/Chicken/^cotland/59(H5Nl)(參見(jiàn)例如Horimoto等，同上)、雞流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/258/97 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Horimoto 等，同上)、雞流感病毒株 A/Chicken/Nakom-Patom/Thailand/CU-K2/2004(H5Nl)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，In Silico Biol. 6 :161-8,2006 ；Viseshakul 等，Virology. 328 169-76，2004)、雞流感病毒株 A/ Chicken/Hong Kong/31. 2/2002 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，同上)、雞流感病毒株 A/ Chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，同上)、雞流感病毒株 A/Chicken/ Vietnam/38/2004 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，同上)、雞流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/1000/97 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Shan 等，Biochem Biophys Res Commun. 302 :377-83, 2003)、雞流感病毒株 A/Chicken/Hong Kong/317. 5/01 和鴨流感病毒株 A/Duck/Anyang/ A VL-1/01 (參見(jiàn)例如 Tumpey 等，J Virol 76 :6344_55，2002)、鴨流感病毒株 A/Duck/ Vietnam/11/2004 (H5N1)、A/Hatay/2004/ (H5N1)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，同上)、鴨流感病毒株 A/Duck/Korea/ES/03(腳 1)、A/Duck/Korea/ESD1/03(腳 1)和 A/Duck/Hong Kong/821/02 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Lee 等，J Virol 79 :3692_02，2005)、鴨流感病毒株A/Duck/Vietnam/11/2004 (H5N1)、A/Duck/China/E319-2/03 (參見(jiàn) Lee 等，Vet Microbiol 124 193-201,2007)、白鷺流感病毒 A/egret/Hong Kong/757. 2/02 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Lee 等， J Virol 79 :3692-02, 2005)、鵝流感病毒株 A/Goose/Guangdong/1/96 (參見(jiàn)例如 Cauthen 等，J Virol. 74 =6592-9,2000)、禽流感病毒株 A/Env/HK/437-4/99 (參見(jiàn)例如 Cauthen 等， 同上)、禽流感病毒株A/Env/HK/437-6/99 (參見(jiàn)例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/ Env/HK/437-8/99(參見(jiàn)例如 Cauthen 等，同上)、禽流感病毒株 A/Env/HK/437_10/99 (參見(jiàn)例如Cauthen等，同上)、禽流感病毒株A/Quail/Vietnam/36/04 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Anwar 等，同上)、禽流感病毒株 A/Swan/Italy/179/06 (H5N1)(參見(jiàn)例如 Terregino 等， Vet Rec. 158 :491，2006)、禽流感病毒株 A/Hong Kong/156/97 (H5N1) (HK156)(參見(jiàn)例如 Cauthen 等，同上)和禽流感病毒株 A/Hong Kong/213/03 (H5N1) (HK213)(參見(jiàn)例如 Shinya 等，J. Virol. 79 :9926-32, 2005)，以及在 Lee 等，Emerging Infect Dis. 14 :487-90, 2008 中所公開(kāi)的那些。在對(duì)來(lái)自于H5W毒株的內(nèi)部基因與HA和NA基因了解后，將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在供選實(shí)施方案中，可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域公知和常用的技術(shù)合成編碼這些基因的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其他甲型流感病毒亞型和乙型流感病毒的流感病毒可用于本發(fā)明的方法和組合物中。例如，設(shè)想了具有任何HA亞型、包括Hl至H16亞型中的任一種的甲型流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)想了可以在本發(fā)明中使用具有m至N9任一 NA 亞型的流感病毒。在某些實(shí)施方案中，設(shè)想了當(dāng)產(chǎn)生重排體時(shí)，HA和NA亞型源自于相同毒株，并且骨架源自于同一亞型的流感病毒。示例性的組合包括但不限于例如H3N2骨架并具有來(lái)自于不同H3N2病毒株的H3和N2基因，或H15N8骨架并具有來(lái)自于不同H15N8病毒株的H15和 N8基因。此外，設(shè)想了在本發(fā)明中可以使用任一下列甲型流感病毒亞型HlNl、H2m、H3Nl、 H4N1、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、H10N1、H11N1、H12N1、H13N1、H14N1、H15N1、H16N1 ；H1N2、 H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、Hl1N2、Hl2N2、Hl3N2、H14N2、Hl5N2、 H16N2 ;H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、Hl 1N3、Hl2N3、Hl3N3、 H14N3、H15N3、H16N3 ；H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、H9N4、H10N4、Hl 1N4、 H12N4、H13N4、H14N4、H15N4, H16N4 ； H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、H7N5、H8N5、H9N5、 H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5 ;H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、 H8N6、H9N6、H10N6、H11N6、H12N6、H13N6、H14N6、H15N6、H16N6 ；H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、 H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、H11N7、H12N7、H13N7、H14N7、H15N7、H16N7 ；H1N8、H2N8、H3N8、 H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、H11N8、H12N8、H13N8、H14N8、H15N8、H16N8 ；H1N9、 H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、Hl 1N9、Hl 2N9、Hl 3N9、H14N9、Hl 5N9 和H16N9。以前已經(jīng)鑒定到下列亞型的甲型流感病毒；Hmi、H2N2、HlN2、H3N2、H3N8、H4N6、 H5N1、H5N2、H5N3、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、 H13N6、H14N5、H15N8、H15N9、H16N3。表1列出了來(lái)自于可用于產(chǎn)生重排病毒的甲型流感毒株的示例性HA和NA基因。
權(quán)利要求
1.一種重排流感病毒，其包含來(lái)自于第一種甲型流感病毒亞型的內(nèi)部基因區(qū)段PBl、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于內(nèi)部基因區(qū)段所來(lái)源的該流感病毒亞型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，內(nèi)部基因區(qū)段源自于甲型流感亞型的第一種毒株，以及HA和NA基因源自于該甲型流感亞型的第二種毒株。
2.權(quán)利要求1的純化的重排流感病毒，其包含甲型流感H5W毒株的內(nèi)部基因區(qū)段 PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA) 基因，HA和NA基因源自于相同病毒株。
3.權(quán)利要求2的重排病毒，其中HA和NA基因來(lái)自于第一個(gè)H5W進(jìn)化枝，和內(nèi)部基因來(lái)自于第二個(gè)H5m進(jìn)化枝。
4.權(quán)利要求2的重排病毒，其中HA和NA基因以及內(nèi)部基因來(lái)自于同一個(gè)H5W進(jìn)化枝。
5.權(quán)利要求1或2的重排病毒，其中HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒病毒。
6.權(quán)利要求5的病毒，其中所述HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。
7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的病毒，其特征為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。
8.權(quán)利要求7的病毒，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自MRC-5、MRC-9、Lederle130、張氏肝細(xì)胞和 ffI-38 ；U937、Vero、CV-U IMR-90 和 IMR-91、MDCK, MDBK, HEK、H9、CEM 和 CD4 表達(dá)型 HUT78、PerC6、BHK-21 細(xì)胞、BSC 和 LLC-MK2。
9.權(quán)利要求7的病毒，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物是Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。
10.權(quán)利要求1的病毒，其中所述內(nèi)部基因源自于選自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004> A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05> A/turkey/Turkey/l/05> A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1)、A/chicken/Nakorn-Patom/Thai 1 and/ CU-K2/04, A/chicken/Vietnam/C58/04, A/quail/Vietnam/36/04, MDk/JX/1653/05, MDk/1657/JX/05、 BH goose/QH/65/05、 Gs/GD/1/96-樣、Dk/Vietnam/568/05、 Gs/ GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05, MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/ GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/ duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
11.權(quán)利要求1的病毒，所述HA和NA基因源自于選自下列的H5W毒 ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05,A/Hong Kong/156/97 (H5N1)、A/Indonesia/5/05 (H5N1)、A/turkey/Turkey/01/2005 (H5N1)、A/ Anhui/1/05 (H5N1) 、 A/Cambodia/R0405050/2007 (H5N1) 、 A/chicken/Nakorn-Patom/ Thailand/CU-K2/04, A/chicken/Vietnam/C58/04, A/quail/Vietnam/36/04, MDk/ JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、Dk/Vietnam/568/05、 Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、MDk/JX/2300/05、Dk/ GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/Vietnam/453/2004、A/ duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
12.權(quán)利要求1的病毒，其中內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于相同病毒株。
13.權(quán)利要求1的病毒，其中內(nèi)部基因與HA和NA基因源自于不同病毒株。
14.權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的病毒，其中所述內(nèi)部基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
15.權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的病毒，其中HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
16.權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的病毒，其中HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Indonesia/5/05。
17.權(quán)利要求1到16任一項(xiàng)的病毒，其中多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處的修飾是從 RERRRKKR(SEQ ID NO :13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突變。
18.—種抗原性重排流感病毒組合物，其包含來(lái)自于第一種甲型流感病毒亞型的內(nèi)部基因區(qū)段PBl、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于內(nèi)部基因區(qū)段所來(lái)源的流感病毒亞型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，所述內(nèi)部基因區(qū)段源自于甲型流感亞型的第一種毒株，以及HA和NA基因源自于該甲型流感亞型的第二種毒株。
19.權(quán)利要求18的抗原性重排病毒組合物，所述抗原性組合物包含源自于甲型流感 H5N1毒株的內(nèi)部基因區(qū)段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，所述HA和NA基因源自于相同病毒株。
20.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的抗原性重排流感病毒組合物，所述HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒病毒。
21.權(quán)利要求20的抗原性重排流感病毒組合物，所述HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。
22.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的抗原性重排流感病毒組合物，所述流感病毒的特征為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖的能力。
23.權(quán)利要求19的抗原性組合物，所述HA和NA基因源自于選自下列的H5W _ ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007, A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
24.權(quán)利要求19的抗原性組合物，其中所述內(nèi)部基因源自于選自下列的H5m _ ^ :A/Vietnam/1203/2004, A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05, A/Hong Kong/156/97、A/turkey/Turkey/01/2005, A/Anhui/1/05、A/Cambodia/R0405050/2007、 A/chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
25.權(quán)利要求18的抗原性組合物，其中內(nèi)部基因區(qū)段與HA和NA基因源自于相同病毒株。
26.權(quán)利要求18的抗原性組合物，其中內(nèi)部基因區(qū)段與HA和NA基因源自于不同病毒株。
27.權(quán)利要求18-26任一項(xiàng)的抗原性組合物，其中內(nèi)部基因區(qū)段來(lái)自于A/ Vietnam/1203/2004。
28.權(quán)利要求18到27任一項(xiàng)的抗原性組合物，其中HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
29.權(quán)利要求18到27任一項(xiàng)的抗原性組合物，其中HA和NA基因來(lái)自于H5N1毒株 A/Indonesia/5/05。
30.權(quán)利要求21到四任一項(xiàng)的抗原性組合物，其中多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處的修飾是從 RERRRKKR(SEQ ID NO :13) — TETR(SEQ ID NO :14)的突變。
31.權(quán)利要求18到四任一項(xiàng)的抗原性組合物，還包含可藥用載體。
32.一種包含重排流感病毒的疫苗，所述病毒包含編碼表面蛋白HA的多核苷酸和編碼表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每個(gè)都源自于甲型流感病毒亞型的第一種毒株；編碼PBl的多核苷酸，編碼PA的多核苷酸，編碼PB2的多核苷酸，編碼M的多核苷酸，編碼NP的多核苷酸，編碼NS的多核苷酸，？81、 4182、呢和 NS的多核苷酸源自于甲型流感病毒亞型的第二種毒株，其中所述多核苷酸可操作地連接，以允許重排的多核苷酸包裝在病毒粒子中。
33.權(quán)利要求32的包含重排甲型流感病毒的疫苗，所述病毒包含編碼表面蛋白HA的多核苷酸和編碼表面蛋白NA的多核苷酸，HA和NA每個(gè)都源自于流感病毒H5W ；編碼PBl 的多核苷酸，編碼PA的多核苷酸，編碼PB2的多核苷酸，編碼M的多核苷酸，編碼NP的多核苷酸，編碼NS的多核苷酸，PB1、PA、PB2、M、NP和NS的多核苷酸源自于流感病毒H5W，所述多核苷酸可操作地連接，以允許重排的多核苷酸包裝在病毒粒子中。
34.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的抗原性重排流感病毒組合物，所述HA基因被修飾以產(chǎn)生減毒病毒。
35.權(quán)利要求34的抗原性重排流感病毒組合物，所述HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。
36.權(quán)利要求33的疫苗，其中所述內(nèi)部基因源自于選自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03, A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、 A/turkey/Turkey/O 1/2005, A/Anhui/1/05、 A/Cambodia/R0405050/2007, A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05, Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004、A/duck/Singapore/3/97、A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
37.權(quán)利要求33的疫苗，所述HA和NA基因源自于選自下列的H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004、A/Hong Kong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Hong Kong/156/97、 A/turkey/Turkey/O1/2005, A/Anhui/1/05、 A/Cambodia/R0405050/2007 , A/ chicken/Nakorn-Patom/Thailand/CU-K2/04> A/chicken/Vietnam/C58/04> A/quail/ Vietnam/36/04、MDk/JX/1653/05、MDk/1657/JX/05、BH goose/QH/65/05、Gs/GD/1/96-樣、 Dk/Vietnam/568/05、Gs/GX/345/05、MDk/JX/1701/05、MDk/JX/2136/05、MDk/JX/2295/05、 MDk/JX/2300/05、Dk/GX/351/04、Dk/GX/380/04、Dk/ST/4610/03、Ck/MYS/5858/04、Ck/ Salatiga/BBVet-I/05 和 Dk/VNM/S654/05、A/chicken/Vietnam/C58/05、A/Muscovy Duck/ Vietnam/453/2004,A/duck/Singapore/3/97,A/HK/156/97 和 A/Hong Kong/156/1996。
38.權(quán)利要求32或33任一項(xiàng)的疫苗，其中內(nèi)部基因區(qū)段與HA和NA基因源自于相同病毒株。
39.權(quán)利要求32或33任一項(xiàng)的疫苗，其中內(nèi)部基因區(qū)段與HA和NA基因源自于不同病毒株。
40.權(quán)利要求32到39任一項(xiàng)的疫苗，其中HA和NA基因來(lái)自于H5W毒株A/ Vietnam/1203/2004。
41.權(quán)利要求32到39任一項(xiàng)的疫苗，其中HA和NA基因來(lái)自于H5N1毒株A/ Indonesia/5/05。
42.權(quán)利要求32到41任一項(xiàng)的疫苗，其中HA通過(guò)從RERRRKKR(SEQID NO 13) -TETR(SEQ ID NO 14)的突變?cè)诙鄩A性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾。
43.權(quán)利要求32到42任一項(xiàng)的疫苗，其還包含佐劑。
44.權(quán)利要求32到43任一項(xiàng)的疫苗，其中疫苗是滅活疫苗。
45.權(quán)利要求32到44任一項(xiàng)的疫苗，其包含的HA含量為1μ g至100 μ g HA。
46.一種用于在對(duì)象中引發(fā)針對(duì)至少一種大流行流感病毒株的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給藥權(quán)利要求18到31任一項(xiàng)的抗原性組合物或權(quán)利要求32到45任一項(xiàng)的疫苗， 給藥量有效保護(hù)對(duì)象免于至少一種H5W流感病毒株的感染。
47.一種用于預(yù)防對(duì)象被流感病毒感染的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥有效量的權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的病毒、權(quán)利要求18到31任一項(xiàng)的抗原性組合物或權(quán)利要求32到 45任一項(xiàng)的疫苗。
48.一種用于預(yù)防對(duì)象被H5W流感病毒感染的方法，所述方法包含向?qū)ο蠼o藥有效量的權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的病毒、權(quán)利要求18到31任一項(xiàng)的抗原性組合物或權(quán)利要求32 到45任一項(xiàng)的疫苗。
49.權(quán)利要求48的方法，其中疫苗包含的HA含量為1μ g至100 μ gHA。
50.權(quán)利要求49的方法，其中疫苗包含的HA含量為1μ g至30 μ gHA。
51.權(quán)利要求49的方法，其中疫苗包含Iyg至15μ g HA。
52.權(quán)利要求48的方法，其中疫苗包含的HA含量為IOng至1μ g HA單位。
53.一種制造包含重排流感病毒的疫苗的方法，所述重排流感病毒包含甲型流感H5W 毒株的內(nèi)部基因區(qū)段PB1、PB2、PA、M、NP和NS以及來(lái)自于甲型流感病毒H5W的血凝素(HA) 和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，HA和NA基因源自于相同病毒株并且HA基因在多堿性氨基酸切割位點(diǎn)處被修飾以產(chǎn)生減毒的HA基因，所述方法包含將病毒在適合于重排病毒生長(zhǎng)的條件下轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
54.權(quán)利要求53的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自MRC-5、MRC-9、Lederle130、張氏肝細(xì)胞和 WI-38 ;U937、Vero、CV-l、IMR-90 和 IMR-91、MDCK、MDBK、HEK、H9、CEM 和 CD4 表達(dá)型 HUT78、PerC6、BHK-21 細(xì)胞、BSC 和 LLC-MK2。
55.權(quán)利要求53的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是Vero細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)改進(jìn)的抗流感病毒疫苗的材料和方法，其中疫苗包含重排病毒，所述重排病毒具有來(lái)自于相同甲型流感病毒亞型或乙型流感病毒株的血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因以及來(lái)自于不同甲型流感病毒亞型或乙型流感病毒株的內(nèi)部基因。在一種情況下，HA和NA基因以及內(nèi)部基因來(lái)自于高致病性甲型流感H5N1毒株。
文檔編號(hào)C12N7/04GK102257135SQ200980150850
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者哈特穆特·埃利克, 奧特弗里德·基斯特納, 法爾科-京特·法爾科納, 諾埃爾·巴雷特 申請(qǐng)人:巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 巴克斯特國(guó)際公司