專利名稱：控制肺炎鏈球菌血清型19a多糖分子量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過控制收獲時(shí)間來增加分離的肺炎鏈球菌(Strdptococcus pneumoniae)血清型19A莢膜多糖的分子量的方法。背景在制備預(yù)防由肺炎鏈球菌(也稱作肺炎球菌)生物體導(dǎo)致的侵襲性疾病的多價(jià)綴合的肺炎球菌疫苗中，使選定的肺炎鏈球菌血清型生長以提供產(chǎn)生疫苗所需的多糖。細(xì)胞在發(fā)酵罐中生長，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)通過加入脫氧膽酸鈉或者另外的裂解劑誘導(dǎo)裂解。然后收獲裂解物肉湯以進(jìn)行下游的純化并回收圍繞細(xì)菌細(xì)胞的莢膜多糖。在與載體蛋白綴合后， 所述多糖包含于最終的疫苗產(chǎn)物中，并賦予疫苗靶向群體對于選定的肺炎鏈球菌血清型的免疫力。多糖大小是在每個批次制品中測定的質(zhì)量屬性，且必須適當(dāng)控制。對于肺炎鏈球菌血清型19A多糖，多糖的大小受到例如發(fā)酵作用的pH、發(fā)酵溫度和保持溫度等參數(shù)的影響。此外，19A莢膜多糖在發(fā)酵/回收以及純化過程中均可出現(xiàn)熱降解，在擴(kuò)大生產(chǎn)工藝以大規(guī)模制備19A莢膜多糖時(shí)，這對于成功處理和控制各種參數(shù)而言構(gòu)成另一個挑戰(zhàn)。因此，需要從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A莢膜多糖的改良的方法。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了從肺炎鏈球菌細(xì)胞裂解物中回收高分子量的血清型19A莢膜多糖的改良的方法。在一種方法中，將產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)，然后裂解細(xì)菌細(xì)胞，并收獲莢膜多糖。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟1)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；3)裂解發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及4)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖，由此產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液。在一個具體的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時(shí)間少于5小時(shí)。在另一個具體的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時(shí)間少于4小時(shí)。在另一個具體的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵時(shí)間在3小時(shí)到6小時(shí)之間。在另一個具體的實(shí)施方式中，分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量為至少 480kDa。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述方法還包括向產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物提供co2。因此，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括以下步驟 1)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2 ；3)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；4)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及幻從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖；由此產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液。在一具體的實(shí)施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子(HCO3-)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入 NaHCO3(碳酸氫鈉)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2包括在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根離子(CO/—)，例如在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入Na2CO3 (碳酸鈉)。在另一實(shí)施方式中， 向發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2包括首先加入NaHCO3其次加入Na2C03。在另一個實(shí)施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括用CO2覆蓋發(fā)酵培養(yǎng)物。在另一實(shí)施方式中，分離的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分子量為至少480kDa。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有高分子量的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過如上所述的任一方法制備。附圖簡述

圖1顯示了來自3L規(guī)模實(shí)驗(yàn)室研究中的發(fā)酵期期間的光密度(OD)、堿和葡萄糖水平，其中使用Na2CO3作為滴定堿。為了繪圖目的，以克數(shù)表示的堿除以10。圖2顯示了來自3L規(guī)模實(shí)驗(yàn)室研究中的發(fā)酵期期間的光密度(OD)、堿和葡萄糖水平，其中使用NaOH作為滴定堿。為了繪圖目的，以克數(shù)表示的堿除以10。圖3顯示了對于交替Na2CO3或NaOH補(bǔ)料在不同pH調(diào)節(jié)下的總蛋白質(zhì)和多糖結(jié)果。圖4顯示了作為制備19A莢膜多糖過程中的發(fā)酵收獲時(shí)間的函數(shù)的分子量。圖5顯示了作為制備19A莢膜多糖過程中的收獲時(shí)間的函數(shù)的單位時(shí)間單位光密度(OD)的堿消耗率(specific base consumption) 0為了繪圖目的，以克數(shù)表示的堿除以 10。圖6顯示了作為制備19A莢膜多糖過程中的堿利用率(specific base utilization)的函數(shù)的分子量。發(fā)明詳述肺炎鏈球菌是革蘭氏陽性的矛頭狀(lancet shaped)球菌，其通常成對(雙球菌)，但是也可見短鏈或者單細(xì)胞。其易于在血瓊脂平板上生長，具有閃光菌落(glistening colonies)，并且除厭氧生長情況下之外，其均顯示出α溶血作用，在厭氧生長中，其顯示出β溶血作用。大多數(shù)肺炎球菌血清型的細(xì)胞具有莢膜，其是圍繞每個細(xì)胞的多糖包膜 (coating)。這個莢膜是在人體內(nèi)毒力的決定因素，因?yàn)槠渫ㄟ^阻止抗體附著于細(xì)菌細(xì)胞而干擾吞噬作用。目前存在經(jīng)鑒別的90種以上的已知肺炎球菌莢膜血清型，其中23種最常見的血清型占全世界侵襲性疾病的大約90%。作為疫苗，肺炎球菌多糖包膜在具有成熟的或者未損害的免疫系統(tǒng)的個體中可賦予適度的對肺炎鏈球菌的免疫力，但是與多糖綴合的蛋白質(zhì)可在嬰幼兒和同樣處于肺炎球菌感染最大危險(xiǎn)中的老年人中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。肺炎球菌細(xì)胞在發(fā)酵罐中生長，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)誘導(dǎo)裂解。然后收獲裂解物肉湯進(jìn)行下游純化，并回收莢膜多糖。多糖大小是在每個制備批次中測定的品質(zhì)屬性，必須適當(dāng)控制。血清型19A莢膜多糖的分子量受發(fā)酵過程中的參數(shù)的影響。本發(fā)明的方法可以從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A莢膜多糖。在本發(fā)明方法的開發(fā)中，修改了 HySoy的濃度及堿滴定劑的選擇，以嘗試修飾最終的多糖產(chǎn)量和分子量。檢測了四種發(fā)酵方案。第一種方案使用具有28g/L HySoy的基線 NaOH方法。第二種方案使用20%碳酸鈉作為堿滴定劑及使用20g/L HySoy0第三種方案組合前兩種方法的優(yōu)勢，通過分批加入碳酸氫鈉而導(dǎo)入碳酸鹽及使用混合的NaOH/碳酸鹽堿滴定劑。第四種方案使用碳酸鹽作為堿滴定劑，及加入IOmM碳酸氫鹽以支持生長。
在發(fā)酵期間使用NaOH作為堿滴定劑的優(yōu)勢在于能使脫氧膽酸鹽裂解物降低至pH 5. 0而無泡沫形成，以除去蛋白質(zhì)并改良過濾，但是產(chǎn)生較低分子量的多糖(< 450kDa)。 Na2CO3提供較高分子量，但是如果脫氧膽酸鹽裂解物的PH降低，則具有泡沫形成的問題。在保持pH6. 6的較高pH下，使用Na2CO3進(jìn)行發(fā)酵形成凝膠樣材料，隨后存在過濾問題。通過使用NaOH與Na2CO3的混合物作為pH滴定劑使Na2CO3的量最小化，提供了 Na2CO3的分子量大小的益處，且由于大量(X)2的突然釋放而消除了泡沫形成及過濾問題。使用20% Na2CO3(w/ ν)作為堿滴定劑及加入IOmM NaHCO3支持生長(第四種方法)，產(chǎn)生持續(xù)的高產(chǎn)量的高分子量多糖。除了 HySoy濃度和堿滴定劑之外，還研究了收獲時(shí)間對肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖分子量的影響，發(fā)現(xiàn)使發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵少于6小時(shí)，然后裂解細(xì)菌細(xì)胞，這樣從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物產(chǎn)生了高分子量的血清型19Α莢膜多糖。本發(fā)明因此提供了改良的方法，用于從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物中回收高分子量的血清型19Α莢膜多糖。在一種方法中，提供了產(chǎn)生含有高分子量分離的肺炎鏈球菌血清型 19Α莢膜多糖的溶液的方法，所述方法包括如下步驟1)制備產(chǎn)生血清型19Α莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；3)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；及4)從所述發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖；從而產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖的溶液。在某些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵的時(shí)間少于大約7小時(shí)、少于大約6. 5小時(shí)、少于大約6小時(shí)、少于大約5. 5小時(shí)、少于大約5小時(shí)、少于大約4. 5小時(shí)、少于大約4小時(shí)、或少于大約 3. 5小時(shí)。在另一個實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵的時(shí)間在3小時(shí)至7小時(shí)之間、3小時(shí)至6. 5小時(shí)之間、3小時(shí)至6小時(shí)之間、3小時(shí)至5. 5小時(shí)之間、3小時(shí)至5小時(shí)之間、3小時(shí)至4. 5小時(shí)之間、3小時(shí)至4小時(shí)之間、或3小時(shí)至3. 5小時(shí)之間。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有高分子量分離的肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過上述方法產(chǎn)生。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括向產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖的細(xì)菌細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2，這包括以下步驟1)制備產(chǎn)生血清型19Α莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；2)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2 ；幻發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物， 發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；4)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及5)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖；由此產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19Α 莢膜多糖的溶液。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有高分子量的肺炎鏈球菌血清型19Α 莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過如上所述的方法制備。本發(fā)明的方法產(chǎn)生高分子量的肺炎鏈球菌血清型19Α莢膜多糖。如本文所用， “高分子量”是指分子量為至少大約480kDa、大約490kDa、大約500kDa、大約510kDa、大約 520kDa、大約 525kDa、大約 550kDa、大約 575kDa、大約 600kDa、大約 625kDa、大約 650kDa、大約 675kDa、大約 700kDa、大約 725kDa、大約 750kDa、大約 775kDa、大約 800kDa、大約 825kDa、 大約850kDa、大約875kDa、大約900kDa、大約925kDa、大約950kDa、大約975kDa，或者大約 lOOOkDa。在某些方法中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子(HCO3-)，例如在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入NaHC03。可以加入5_50mM的NaHCO3,如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、;35mM、40mM、45mM 或者 50mM。在其它方法中，向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根(CO/—)離子，例如在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入 Na2C03。可以加入 0. 1M-2. OM 的 Na2CO3,如 0. 1M、0. 2M、0. 4M、0. 6M、0. 7M、0. 9M、1. 0M、1. 5M、 1.8厘或者2.011。也可以使用重量/體積(w/v)當(dāng)量，如5% (w/v)Na2CO3^ 10% (w/v)Na2CO3 或者20% (w/v)Na2CO30在其它方法中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中首先加入NaHCO3，其次加入Na2C03。在進(jìn)一步的方法中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括用CO2覆蓋所述發(fā)酵培養(yǎng)物?？梢允褂?% -100%的CO2覆蓋，例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或者 100%。在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌細(xì)胞可以通過使用任何裂解劑裂解?！傲呀鈩笔怯兄诩?xì)胞壁破裂并釋放導(dǎo)致細(xì)胞裂解的自溶素的任何制劑，包括例如去污劑。如本文所用，術(shù)語 “去污劑”是指能誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞裂解的任何陰離子或者陽離子去污劑。用于本發(fā)明方法中的這種去污劑的代表性實(shí)例包括脫氧膽酸鈉(DOC)、N-十二烷基肌氨酸(NLQ、鵝去氧膽酸鈉以及皂苷。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，用于裂解細(xì)菌細(xì)胞的裂解劑是DOC。DOC是膽汁酸脫氧膽酸的鈉鹽，其通常衍生自生物來源如母牛或者公牛。DOC激活LytA蛋白，LytA蛋白是在肺炎鏈球菌中參與細(xì)胞壁生長和分裂的自溶素。LyU在其C末端部分中具有膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且已知IytA基因的突變產(chǎn)生LytA突變體，其對于DOC裂解具有抗性。盡管還沒有跡象表明在肺炎鏈球菌多糖純化期間使用DOC構(gòu)成健康危險(xiǎn)，但是使用這種生物衍生的制劑可以產(chǎn)生潛在的監(jiān)管問題(regulatory concerns) 0因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，用于裂解細(xì)菌細(xì)胞的裂解劑是非動物衍生的裂解劑。用于本發(fā)明方法中的非動物衍生的裂解劑包括來自非動物來源的、作用模式與DOC相似(即影響LytA功能并導(dǎo)致肺炎鏈球菌細(xì)胞裂解)的制劑。這種非動物衍生的裂解劑包括但不限于DOC的類似物、表面活性劑、去污劑，以及膽堿的結(jié)構(gòu)類似物，且可以使用如下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)中描述的方法確定。在一個實(shí)施方式中，非動物衍生的裂解劑選自癸烷磺酸(decanesulfonic acid)、叔-辛基苯氧基聚(氧乙烯)醇(例如Igepal CA-630，CAS# :9002-93-1, #自 Sigma Aldrich,St. Louis，MO)、辛基酚環(huán)氧乙烷縮合物(例如 Tritoru X-100，得自 Sigma Aldrich, St. Louis,M0)、N_十二烷基肌氨酸鈉(NLQ、N_十二烷基-亞氨基二丙酸鈉、十二烷基硫酸鈉、鵝去氧膽酸鹽、豬去氧膽酸鹽、甘氨脫氧膽酸鹽、牛磺去氧膽酸鹽、牛磺鵝去氧膽酸鹽，以及膽酸鹽。在另一實(shí)施方式中，非動物衍生的裂解劑是NLS。在本發(fā)明的方法中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離肺炎鏈球菌莢膜多糖。例如，在使產(chǎn)生肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的細(xì)菌細(xì)胞發(fā)酵之后，裂解細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞裂解物。然后使用本領(lǐng)域已知純化技術(shù)從細(xì)胞裂解物中分離莢膜多糖，包括使用離心、沉淀、超濾和柱層析技術(shù)(見例如美國專利申請200602^380、200602^381、 20070184071、20070184072、20070231340 和 20080102498)。上述方法中的改變使得可以從細(xì)胞肺炎鏈球菌裂解物中回收高分子量的血清型 19A莢膜多糖。這強(qiáng)有力地改良了發(fā)酵/回收方法，可以極大地增強(qiáng)肺炎球菌多糖的產(chǎn)生。如下實(shí)施例只是例證本發(fā)明，無限制本發(fā)明之意。
實(shí)施例
7
使產(chǎn)生血清型19A的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞生長以提供產(chǎn)生疫苗所需要的多糖，用以通過疫苗中包含的莢膜血清型對由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的侵襲性疾病進(jìn)行主動免疫。使細(xì)胞在發(fā)酵罐中生長，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)誘導(dǎo)裂解。然后收獲裂解物肉湯進(jìn)行下游純化，并回收莢膜多糖。由于多糖大小是在每批制備物中測定的品質(zhì)屬性，因此必須適當(dāng)控制多糖大小。發(fā)現(xiàn)血清型19A莢膜多糖的分子量受發(fā)酵過程中的參數(shù)影響。如下實(shí)施例描述的研究涉及在肺炎鏈球菌血清型19A發(fā)酵期間的收獲時(shí)間和提供C02。實(shí)施例1 提供二氧化碳對于多糖分子量的作用發(fā)酵在3L Braun Biostat B 發(fā)酵罐(B. Braun Biotech, Allentown, PA)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行。用 1. 8L 的 HYS 培養(yǎng)基填充該發(fā)酵罐(20g/L HySoy，2. 5g/L NaCl，0. 5g/L KH2PO4, 0. 013g/L CaCl2 · 2H20，0. 15g/L鹽酸L-半胱氨酸HC1)。然后將該發(fā)酵罐在121°C高壓蒸汽滅菌60分鐘。冷卻后，在每個裝置中加入40或60mL/L的50%葡萄糖+1%硫酸鎂(w/v) (DMS)溶液。如果需要，在接種之前加入碳酸氫鈉。將含有IL的HYS培養(yǎng)基的2L接種瓶用Type 19A凍存種(frozen seed stock) 接種，在36°C不振蕩保溫大約6-8小時(shí)。用從OD600在0. 3-0. 9之間和pH在4. 75-5. 60之間的瓶中等分取樣的100mL( 5. 2% ν/ν)體積接種所述發(fā)酵罐。發(fā)酵溫度和pH控制在希望的選定點(diǎn)。使用36°C、IL/分鐘空氣覆蓋(air overlay)、pH控制為7及在75rpm攪拌的標(biāo)準(zhǔn)條件。將兩個葉輪置于攪拌器軸的下面和中間位置。接通(hooked up)含有合適的堿滴定劑(3N NaOH, 3N NaOH混合不同濃度的NaHCO3, 3N NaOH混合不同濃度的Na2CO3和 NaHCO3,以及20% Na2CO3)的培養(yǎng)瓶以自動控制pH。在不同時(shí)間點(diǎn)針對外部pH、0D_、葡萄糖、多糖和蛋白質(zhì)從發(fā)酵罐中取樣。當(dāng)葡萄糖濃度接近耗竭時(shí)或者注意到OD不再隨著時(shí)間而增加時(shí)，終止運(yùn)行。光密度(OD6J測量發(fā)酵肉湯的細(xì)胞密度通過使用Shimadzu (Columbia，MD)UV-1601 (2nm帶寬)或者 Spectronics (ffestbury, NY) Genesys 5分光光度計(jì)(5nm帶寬)讀取樣品在600nm的吸光度而確定。所述裝置的空白對照是HYS培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基用去離子(DI)水稀釋以匹配樣品要求的稀釋度。稀釋樣品以保持讀取的吸光度低于0. 4，這完全在分光光度計(jì)的線性范圍內(nèi)。葡萄糖濃度葡萄糖水平通過離心細(xì)胞及使用直接的上清液或者用DI水3X稀釋的上清液確定。在 Nova Biomedical (ffaltham, MA)BioProfile 400 上分析樣品。多糖分析在最終發(fā)酵讀數(shù)時(shí)取樣品，用12%脫氧膽酸鈉(DOC)處理為濃度為0. 13% (w/v) 并輕輕攪拌。將其在5°C保持8-M小時(shí)，然后用50%乙酸將pH調(diào)節(jié)為5. 0，以沉淀大部分 DOC和蛋白質(zhì)。在5°C再次保持12- 小時(shí)之后，將樣品離心(14000rpm, Sorvall (Thermo Fisher Scientific,ffaltham,MA) SS34 rotor，在 15°C離心 10 分鐘)。將上清液的 pH 調(diào)節(jié)為 6. 0。然后將上清液通過 0. 45 μ m Pall (East Hills, NY) HT Tuffryn Membrane 針頭過濾器(其為低蛋白質(zhì)結(jié)合的)過濾。過濾的產(chǎn)物通過高效尺寸排阻層析(HPLC-SEC)分析，使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(見例如Aquilar，M. "HPLC of Peptides and Proteins Methods and Protocols，，Totowa，NJ :Humana Press (2004))。蛋白質(zhì)分析通過本領(lǐng)域熟知的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分析蛋白質(zhì)水平(見例如 Walker，J. M. "The Protein Protocols Handbook" Totowa, NJ =Humana ft~eSS(2002))。將如上所述制備的過濾的細(xì)胞裂解物(上清液)等份置于微離心管中， 65 μ L/管。在每個樣品中加入還原劑(10 μ L 二硫蘇糖醇(DTT))和NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) 4X十二烷基硫酸鋰(LDS)樣品緩沖液(25 μ L)。將樣品渦旋及加熱10分鐘，之后以IOyL/泳道加樣于NuPAGE 4-12% Bis-Tris 12孔凝膠上。凝膠在NuPAGE' MES-SDS緩沖液中于150V運(yùn)行，進(jìn)行大約60分鐘，隨后使用Zoion染色方案(Zoion Biotech,Worcester,MA)染色。使用 UVP Imager (UVP Inc. ,Upland,CA)及 LabWorks (UVP Inc.) V. 3軟件進(jìn)行樣品分析，獲得感興趣的特定蛋白質(zhì)條帶的適當(dāng)濃度。牛血清白蛋白 (BSA)級分V用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算樣品的適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)值(在裂解的細(xì)胞肉湯中)。分子量分析將1-2L發(fā)酵樣品用12% DOC鈉處理為濃度0. 13% (w/v)，在200rpm攪拌。樣品在5°C或者20°C保持8-M小時(shí)。然后用50%乙酸將樣品調(diào)節(jié)為pH 5.0或？!16.6，以沉淀出大部分DOC和蛋白質(zhì)。在5°C再次保持12-24小時(shí)之后，將樣品離心(llOOOrpm， Sorvall (Thermo Fisher Scientif ic，Waltham，MA) SLA_3000rotor，在 10°C離心 15 分鐘)。 用 3N NaOH 將上清液樣品調(diào)節(jié)為 pH 6.0，及用 0. 45 μ m Millipore (Billerica，ΜΑ)MP60 過濾器過濾。然后將樣品進(jìn)行修改的純化方法，包括IOOK分子量截?cái)嘀?MWCO)滲濾(5Χ 濃縮隨后用DI水7. 5 X滲濾)、0. 1%ΗΒ沉淀以及碳過濾。然后將純化的材料進(jìn)行Multi Angle Laser Light Scattering(MALLS) ^lf。發(fā)酵方法研究基于先前的研究，通過將Na2CO3轉(zhuǎn)換為NaOH作為堿滴定劑而優(yōu)化發(fā)酵方法。使用 NaOH使得回收pH降低至5.0，導(dǎo)致顯著的蛋白質(zhì)沉淀。Na2CO3會在低pH( < 6. 6)釋放C02， 導(dǎo)致泡沫形成。檢測堿滴定劑對于Type 19A多糖和蛋白質(zhì)水平的影響。建立兩個3L發(fā)酵罐，其中一個發(fā)酵罐作為原始方法對照，使用20% Na2CO3溶液(w/v)作為堿補(bǔ)料。另一發(fā)酵罐使用3NNa0H作為堿補(bǔ)料。在回收階段期間，在發(fā)酵罐中用D0C(終濃度0. 13% (w/v))以及將發(fā)酵罐在36°C 保持30分鐘使細(xì)胞裂解。在這個步驟之后，使裂解物保持在室溫(22°C )攪拌過夜。在裂解物保持之后，從未調(diào)節(jié)至4. 5的范圍進(jìn)行pH滴定，樣品在不同pH選點(diǎn)取出(pull)。將這些樣品在室溫保持過夜，之后進(jìn)行處理及分析多糖和蛋白質(zhì)濃度。在發(fā)酵階段期間的0D、堿和葡萄糖水平在圖1和圖2中示出。主要不同是碳酸鹽運(yùn)行的較高最終0D。也檢測了 DOC后裂解物pH調(diào)節(jié)對于總蛋白質(zhì)水平的作用，結(jié)果在圖3中示出。 在NaOH運(yùn)行和Na2CO3運(yùn)行中，較低的pH水平均降低無細(xì)胞肉湯中荷載的蛋白質(zhì)。較低的 PH( < 6. 6)對于多糖產(chǎn)量無負(fù)面影響。發(fā)酵分析結(jié)果表明在發(fā)酵期間NaOH堿補(bǔ)料是可接受的替代Na2CO3堿補(bǔ)料，但是與用Na2CO3補(bǔ)料獲得的產(chǎn)量相比產(chǎn)生較低的產(chǎn)量。堿滴定劑對于19A分子量的作用在3L規(guī)模進(jìn)行一系列發(fā)酵，以確定堿滴定劑、HySoy濃度和pH保持步驟是否影響血清型19A分子量。在修改的純化方法之后，使用MALLS測定進(jìn)行分子量確定。結(jié)果在表 1中示出。表1 堿滴定劑對19A分子量的影響(1^9331-94)
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌(Sti^ptococcuspneumoniae)血清型19A 莢膜多糖的溶液的方法，所述方法包括a)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；b)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；c)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及d)從所述發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的分子量為至少480kD。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟c)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于5小時(shí)。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟c)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于4小時(shí)。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟c)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間在3小時(shí)至6小時(shí)之間。
6.含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法制備。
7.產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液的方法，所述方法包括a)制備產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物；b)向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2；c)發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)；d)裂解所述發(fā)酵培養(yǎng)物中的細(xì)菌細(xì)胞；以及e)從所述發(fā)酵培養(yǎng)物中分離肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的分子量為至少480kD。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中步驟c)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于5小時(shí)。
10.權(quán)利要求7或8的方法，其中步驟c)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于4小時(shí)。
11.權(quán)利要求7或8的方法，其中步驟C)包括發(fā)酵所述發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間在3小時(shí)至6小時(shí)之間。
12.權(quán)利要求7或8的方法，其中向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子(HC03_)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入HCO3-包括加入NaHC03。
14.權(quán)利要求7或8的方法，其中向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根離子(C032_)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入CO:包括加入Na2C03。
16.權(quán)利要求7或8的方法，其中向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括首先加入NaHCO3，其次加入Nei2CO3。
17.權(quán)利要求7或8的方法，其中向所述發(fā)酵培養(yǎng)物提供(X)2包括用(X)2覆蓋所述發(fā)酵培養(yǎng)物。
18.含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液，其中所述溶液通過權(quán)利要求7至17中任一項(xiàng)的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生含有高分子量的分離的肺炎鏈球菌血清型19A莢膜多糖的溶液的改良的方法。在某些方法中，發(fā)酵產(chǎn)生血清型19A莢膜多糖的肺炎鏈球菌的發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵時(shí)間少于6小時(shí)，然后裂解細(xì)菌細(xì)胞并收獲莢膜多糖。在其他的實(shí)施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2。向發(fā)酵培養(yǎng)物提供CO2包括在所述發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根離子、在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸根離子、在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入碳酸氫根和碳酸根離子，以及用CO2覆蓋該發(fā)酵培養(yǎng)物。
文檔編號C12P19/04GK102257155SQ200980150879
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者J·H·克林尼恩 申請人:惠氏有限責(zé)任公司