專利名稱：生產(chǎn)琥珀酸的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物，與野生型相比其被遺傳修飾，并且其適合于生產(chǎn)有機酸，特別是琥珀酸，涉及這樣的微生物的用途以及涉及生產(chǎn)這樣的微生物的方法。本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)和背景
二羧酸具有很大的經(jīng)濟潛力，因為它們可以用作許多化學(xué)物質(zhì)的前體物質(zhì)。例如，琥珀酸充當(dāng)了生產(chǎn)基于1，4-丁二醇、四氫呋喃和γ-丁內(nèi)酯的塑料的前體。當(dāng)今，琥珀酸通過馬來酸酐到琥珀酸酐的催化氫化作用和隨后的加水，或通過馬來酸的直接催化氫化來化學(xué)地產(chǎn)生。琥珀酸也通過許多微生物在生理環(huán)境條件下由糖或氨基酸出發(fā)來產(chǎn)生。在厭氧條件下，通常地，除了琥珀酸之外，產(chǎn)生額外的發(fā)酵終產(chǎn)物，例如乙醇、乳酸、乙酸和甲酸。具有高氧含量的琥珀酸的生物合成需要還原性的(X)2固定。琥珀酸是一種通常通過厭氧發(fā)酵過程來富集的代謝物。雖然在厭氧條件下產(chǎn)品的產(chǎn)量和富集好于有氧條件下數(shù)倍，僅僅厭氧過程的缺點是生物質(zhì)生產(chǎn)的技術(shù)限制和微生物生產(chǎn)者的低生產(chǎn)力。因而，結(jié)果是相對低的生物質(zhì)/產(chǎn)物效力。此外，難以工業(yè)操作嚴格厭氧的微生物。能夠在厭氧條件下合成琥珀酸的不同的微生物是本領(lǐng)域中已知的。文獻US 5，143，834描述了產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌屬(A succiniciproducens)的變種。它是專性厭氧微生物，僅能產(chǎn)生適量的琥珀酸，此外不能耐受高滲透壓和鹽濃度。文獻US 7，063，968描述了來自牛瘤胃的微生物分離物曼氏桿菌屬屬物種 (.Mannheimia sp. ) 55E，其能夠在有氧以及厭氧條件下合成有機酸。然而這不是琥珀酸的特異性富集，而是不同有機酸的混合物，例如，甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸。這種生產(chǎn)者的缺點是，由于為了獲得琥珀酸必需應(yīng)用昂貴的富集和純化方法，如果不是完全地不可能，這種菌株的經(jīng)濟使用僅在困難的情況下是可能的。文獻US 5，869，301描述了使用五coli AFP-111在兩步發(fā)酵過程中生產(chǎn)二元羧酸的方法，其中在第一個階段微生物生物質(zhì)在有氧條件下產(chǎn)生，在第二階段琥珀酸的生產(chǎn)厭氧地進行。生物質(zhì)產(chǎn)生的第一階段在這個過程中是限制性的，因為進料-分批過程中的葡萄糖濃度必需限于1 g/L，以避免乙酸的富集，其將干擾產(chǎn)生生物質(zhì)以及產(chǎn)生琥珀酸的過程。因而，這種過程的生物質(zhì)的產(chǎn)生僅對有限的程度是可能的。此外，琥珀酸的生物合成途徑在這個過程中經(jīng)歷強烈的降解代謝產(chǎn)物抑制，因為檸檬酸循環(huán)和乙醛酸途徑的糖酵解的基因強烈地被葡萄糖抑制，這是從文獻中已知的(DeRisi等人1997)。結(jié)果是，在存在葡萄糖的情況下琥珀酸的合成被很大地抑制，因而強烈地受限制。根據(jù)文獻US 6，190，914已知這樣的微生物，其中通過調(diào)節(jié)合適的轉(zhuǎn)錄因子和激酶，各種基因的葡萄糖抑制被降低。然而，通過這樣的微生物的有機酸生產(chǎn)，特別是對于有機酸生產(chǎn)被顯著優(yōu)化的微生物的有機酸生產(chǎn)沒有在其中提及。本發(fā)明的技術(shù)問題
本發(fā)明的技術(shù)問題是給出一種微生物，通過所述微生物，可以在微生物學(xué)生產(chǎn)方法中獲得有機酸、特別是琥珀酸的改進的產(chǎn)量。本發(fā)明的基礎(chǔ)和優(yōu)選的實施方式
為了解決這個技術(shù)問題，本發(fā)明教導(dǎo)了分離的遺傳修飾的微生物，其中與野生型相比， a)基因idhl和idpl被刪除或滅活，和/或b)基因sdh2和sdhl被刪除或滅活，和/或c) 基因/^β 被刪除或滅活，或處在啟動子的控制之下，所述啟動子能通過將微生物暴露于誘導(dǎo)物質(zhì)來抑制或誘導(dǎo)，和/或d)來自由ICL1、MLSU ACSl和MDH3構(gòu)成的組的一種或多種基因被來自Crabtree陰性生物體的一個相應(yīng)的外源基因或多個相應(yīng)的外源基因替換或補充。替換或補充基因ICLl的外源基因可以與序列No. 1具有至少75%的同源性。替換或補充基因ACSl的外源基因可以與序列No. 2具有至少75%的同源性。替換或補充基因 MLSl的外源基因可以與序列No. 3具有至少75%的同源性。替換或補充基因MDH3的外源基因可以與序列No. 4具有至少75%的同源性。優(yōu)選地，所述同源性是超過80%、特別地超過 90%，最優(yōu)選地超過95%。但是，理所當(dāng)然地，也可以是與之相比相同的。根據(jù)本發(fā)明，獲得了通過酵母菌株、特別是釀酒酵母Ueiccheiromyces cerevisiae)酵母菌株，生產(chǎn)呼吸作用中央新陳代謝的琥珀酸和其他有機酸的優(yōu)化方法。這種方法允許有機羧酸、特別是酵母菌呼吸作用中央新陳代謝的二元羧酸以及羥基脂肪酸， 例如琥珀酸在生產(chǎn)時間和產(chǎn)量方面更有效的生產(chǎn)。此外，通過生長和生產(chǎn)階段的分離，而不使用抗生素依賴性的啟動子系統(tǒng)，它容許2步驟的生產(chǎn)過程。根據(jù)本發(fā)明，一種過程變成可能，在其中，起初在第一生長階段中，生物質(zhì)被富集， 在第二階段中，琥珀酸被產(chǎn)生并釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中。生長和生產(chǎn)階段的分離很大程度地促進了酵母菌中有機酸的整個生產(chǎn)過程的效率，因為不然的話細胞的生長和期望的代謝物的生產(chǎn)總是競爭性的因素。在生產(chǎn)階段期間，生物質(zhì)的生產(chǎn)是非期望的，因為為此使用的碳或底物被消耗，其最終導(dǎo)致要生產(chǎn)的代謝物，例如琥珀酸的產(chǎn)量的降低。生長和生產(chǎn)階段的分離能通過遺傳修飾的微生物，或通過遺傳突變修飾的微生物和相關(guān)的發(fā)酵方法來實現(xiàn)，其中，首先在第一階段期間，確保微生物生產(chǎn)者的最佳生物質(zhì)提高，然后，在第二階段中(生產(chǎn)階段)，隨后是羧酸，例如琥珀酸來自初始碳源(例如，葡萄糖) 和(X)2 (添補反應(yīng)，CO2固定)的富集。在生產(chǎn)階段，通過微生物的遺傳修飾，所述修飾在非在先公開的專利申請PCT/ DE 2008/000670 “生產(chǎn)琥珀酸的微生物(Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteindure)”中描述了，在中間體異檸檬酸和琥珀酸之后(附

圖1中黑色十字標(biāo)出的) 檸檬酸循環(huán)(附圖la)被中斷，而這在生長階段不被中斷并具有野生型的構(gòu)型。這些中斷導(dǎo)致琥珀酸不能進一步被代謝，并作為終產(chǎn)物被富集，碳流動重定向到乙醛酸循環(huán)中(附圖 lb)。對于通過乙醛酸循環(huán)的有機酸生產(chǎn)，優(yōu)點是，在檸檬酸循環(huán)中異檸檬酸到琥珀酰-CoA 的兩個氧化脫羧作用步驟，以及雙次CO2形式的碳損失(參見附圖Ic)被阻止了。在生產(chǎn)階段期間在中間體異檸檬酸和琥珀酸之后的所描述的中斷通過外源的可控制啟動子系統(tǒng)來實現(xiàn)，所述啟動子系統(tǒng)連接到生產(chǎn)階段中要被抑制的基因的上游。然后，在生產(chǎn)階段期間相應(yīng)基因的抑制通過向培養(yǎng)介質(zhì)添加四環(huán)的抗生素，例如四環(huán)素來發(fā)生。然而在發(fā)酵中抗生素的應(yīng)用可能導(dǎo)致問題，因為它們是額外的成本因素。此外，任選地，從產(chǎn)品或培養(yǎng)肉湯再次除去的抗生素要求使得“下游加工”顯著更昂貴和更成本密集。相比之下，本發(fā)明提供了生長和生產(chǎn)階段的分離的另一種優(yōu)化的可能性，其不需要使用抗生素，還提供了在酵母菌中生產(chǎn)琥珀酸或其他有機酸的優(yōu)化的方法。對于特征a)進行以下陳述。例如在酵母菌釀酒酵母中，不考慮基因sdh2和idhl 的刪除，這導(dǎo)致檸檬酸循環(huán)的中斷，可以測量到與未修飾的野生型酵母菌可比較的生長速度。躲idhl刪除的酵母菌株的生長僅僅是可能的，因為這個刪除不導(dǎo)致異檸檬酸脫氫酶活性的完全消失。這個的原因是異檸檬酸脫氫酶的三個另外的同工酶的存在，對于α-酮戊二酸的產(chǎn)生，它們可以補償由基因7 //和7 編碼的二聚化的主要酶的損失。α-酮戊二酸的合成是酵母細胞在最小培養(yǎng)基上的生長絕對必需的，因為氨基酸谷氨酸從這個中間體產(chǎn)生，沒有谷氨酸不可能有生長。在用酵母菌生產(chǎn)琥珀酸的2步發(fā)酵過程中，因而生長和生產(chǎn)階段的有效分離僅通過生產(chǎn)菌株中異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制才是可能的，由于因此確保了谷氨酸營養(yǎng)缺陷型，結(jié)果是酵母菌在沒有補充的谷氨酸的培養(yǎng)基中不生長?？梢允褂眠@一點通過谷氨酸向培養(yǎng)介質(zhì)的補充來控制發(fā)酵過程。根據(jù)向培養(yǎng)介質(zhì)添加的谷氨酸的數(shù)量，生長階段的延續(xù)時間和期望的細胞密度可以在這個階段中被有效地控制。隨著數(shù)量提高，持續(xù)時間和細胞密度也將提高。當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中的谷氨酸被耗盡時，進一步的生長是不可能的，所有的碳可以有效地用于琥珀酸的合成，則它的產(chǎn)生不與生物質(zhì)的產(chǎn)生相競爭。如果除了基因的刪除之外，編碼異檸檬酸脫氫酶的同工酶的至少基因ii//^ (Contreras-Shannon等人2005)，優(yōu)選的還有基因idp2和idp3被刪除，通過谷氨酸的補充實現(xiàn)了發(fā)酵過程中生長和生產(chǎn)階段的分離。異檸檬酸脫氫酶活性的實際上完全的抑制確保了為此所需的谷氨酸營養(yǎng)缺陷型。異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制的另一個優(yōu)點時，在酵母菌的呼吸系統(tǒng)中所有的碳因而被重定向到乙醛酸循環(huán)中朝向琥珀酸的方向，不能流回 α-酮戊二酸，流回α-酮戊二酸將導(dǎo)致產(chǎn)量損失。對于特征b進行如下陳述。為了避免或降低進一步的產(chǎn)量損失，琥珀酸應(yīng)當(dāng)作為終產(chǎn)物被富集，不應(yīng)當(dāng)被酵母細胞進一步代謝。這不能通過基因SO^ 的簡單刪除來實現(xiàn)。 此外，根據(jù)本發(fā)明，由基因編碼的異四聚化的酶琥珀酸脫氫酶的另一個亞基被刪除。 (Kubo等人2000)檢測出在具有S0^ 刪除的酵母菌株中琥珀酸脫氫酶的殘余活性，其通過基因的額外刪除被抑制。產(chǎn)量損失還可能產(chǎn)自酶琥珀酸-半醛脫氫酶對產(chǎn)生的琥珀酸的進一步新陳代謝。這種酶是谷氨酸降解途徑的一部分，催化琥珀酸到琥珀酸-半醛的反應(yīng)。這種中間體然后通過從Y-氨基丁酸到谷氨酸被代謝。這樣，不但可能發(fā)生產(chǎn)量損失，還可能合成α -酮戊二酸和谷氨酸，其使得通過谷氨酸補充的發(fā)酵過程控制變?yōu)椴豢赡?。因而，編碼琥珀酸-半醛脫氫酶的基因卿2的額外的刪除對于生產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)化的生產(chǎn)過程是有益的。對于乙醛酸循環(huán)所必需的乙醛酸不能僅從異檸檬酸裂解酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生，其中異檸檬酸被裂解成琥珀酸和乙醛酸，還從丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)產(chǎn)生。 這種酶基于丙酮酸和甘氨酸催化乙醛酸和丙氨酸的產(chǎn)生。如果乙醛酸不必是可從異檸檬酸裂解酶反應(yīng)獲得的，乙醛酸循環(huán)也能通過丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)來確保，通過所述反應(yīng)提供乙醛酸。在這種情況下，通過異檸檬酸裂解酶活性產(chǎn)生期望的產(chǎn)物，異檸檬酸裂解酶活性不是乙醛酸循環(huán)必需的，結(jié)果是，酵母菌部分地利用由丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化的可選擇的反應(yīng)用于乙醛酸的合成。然后不產(chǎn)生琥珀酸，其將導(dǎo)致產(chǎn)量損失。因而， 編碼丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因的額外的刪除對于生產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)化的生產(chǎn)過程是有益的。 對于特征C)進行如下陳述。在細胞呼吸中，來自底物例如葡萄糖的碳不象發(fā)酵中那樣被轉(zhuǎn)化成乙醇或甘油，而是進入呼吸作用中央新陳代謝，即，進入檸檬酸循環(huán)或乙醛酸循環(huán)。當(dāng)碳通過這個兩個循環(huán)時，產(chǎn)生NADH或NADPH形式的氧化還原作用等價物，它們的電子被轉(zhuǎn)移到呼吸鏈的第一蛋白質(zhì)復(fù)合物，其位于內(nèi)線粒體膜中。這些電子然后通過呼吸鏈的進一步的蛋白質(zhì)復(fù)合物逐步地轉(zhuǎn)移到最終的電子受體氧中，氧從而被還原成水。這種受控的氫氧反應(yīng)釋放的能量被用于對抗梯度將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到線粒體的內(nèi)膜腔中，當(dāng)流回線粒體中時它們通過呼吸鏈的復(fù)合物V驅(qū)動所謂的“質(zhì)子泵送”，其中產(chǎn)生ATP形式的能力。在發(fā)酵條件下，除了甘油之外酵母菌主要產(chǎn)生乙醇，并產(chǎn)生每分子葡萄糖ATP形式的僅2個能量等價物，相比呼吸作用，其中每個分子葡萄糖可以產(chǎn)生38個ATP。在發(fā)酵中，通過乙醇或甘油的合成，NADH被重新氧化成NAD，已經(jīng)如同呼吸作用中，不通過電子在氧上的轉(zhuǎn)移， 因為在厭氧條件下氧不是可獲得的最終的電子受體。酵母菌釀酒酵母菌kSaccharomyces cerevisiae)是“Crabtree”陽性的。這是指，在初始碳來源上，例如葡萄糖，酵母菌將甚至在有氧條件下發(fā)酵并且不呼吸。這種發(fā)酵活性已經(jīng)可以在培養(yǎng)介質(zhì)中約100 mg/L葡萄糖的葡萄糖濃度下觀察到，因為在這個濃度下，達到了酵母細胞的呼吸能力的極限。這一點的原因是，在存在葡萄糖的情況下，呼吸作用中央新陳代謝的大量基因，即，檸檬酸和乙醛酸循環(huán)(參見附圖la^Pb))以及呼吸鏈的基因被轉(zhuǎn)錄地強烈抑制(Gancedo 1998)。這種現(xiàn)象也稱為葡萄糖或降解代謝產(chǎn)物抑制。發(fā)酵是另一個方面，其可能影響琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)， 因為它將導(dǎo)致非期望的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在這一點上，主要是甘油、乙酸和乙醇的產(chǎn)生構(gòu)成了難題，因為這將導(dǎo)致實質(zhì)上的產(chǎn)量損失。顯示Crabtree效應(yīng)的所有生物體，例如，酵母菌釀酒酵母，將在甚至有氧條件下發(fā)酵。在酵母菌中琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)中，發(fā)酵終產(chǎn)物，主要為乙醇的產(chǎn)生，原則上不是期望的和可避免的。在有氧條件下，這能通過少量葡萄糖向培養(yǎng)介質(zhì)的連續(xù)添加來部分地實現(xiàn)，這將阻止或降低葡萄糖抑制，因而在有氧條件下發(fā)酵。在厭氧條件下，氧不是可獲得的最終電子受體，因而無論如何酵母菌必須發(fā)酵來再氧化NADH， 因而保留代謝活性。防止酒精發(fā)酵，即乙醇的發(fā)酵的一種可能性是消除基于丙酮酸的乙醇生物合成。為此目的，丙酮酸脫羧酶活性可以被關(guān)閉，其在酵母菌釀酒酵母中由基因徹以、 徹仏和徹訪所編碼的3種丙酮酸脫羧酶同工酶催化。僅通過在葡萄糖上，以及在乙醇上生長，PDC6完全微弱地表達(Velmurugan等人1997)?；?^C 編碼轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物，其主要對基因徹以和/ ^的表達負責(zé)?；?^C 因而提供了在細胞中用僅一種簡單的刪除來抑制由3種基因編碼的丙酮酸脫羧酶活性的主要部分。當(dāng)然，做為選擇或另外地，基因PDC1、 PDC5和/或PDC6的一個或更多個也可以被刪除。這具有很大的優(yōu)勢，因而成問題的乙醇產(chǎn)生可以僅用酵母菌中新陳代謝的一個單獨的修飾來阻止。為了最小化或降低酵母菌中琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)量損失，副產(chǎn)物，主要是乙醇的產(chǎn)生應(yīng)當(dāng)被阻止或強烈地降低。這能通過酵母菌釀酒酵母中基因/^β 的刪除來實現(xiàn)。因為這個刪除導(dǎo)致基于葡萄糖的強烈受限的生長，可被抑制或誘導(dǎo)的啟動子可以在基因/^β 的上游提供。可以被抑制的啟動子確保了在生長階段下游提供的基因的足夠的轉(zhuǎn)錄，以及在生產(chǎn)階段通過向培養(yǎng)介質(zhì)的添加來停止轉(zhuǎn)錄?？梢员徽T導(dǎo)的啟動子在生長階段期間通過向培養(yǎng)介質(zhì)添加誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)，從而在下游提供的基因/ ^ 被充分轉(zhuǎn)錄，酵母培養(yǎng)物的生長是可能的。當(dāng)誘導(dǎo)物被消耗盡時， 進一步的生長是不可能的，啟動生產(chǎn)階段。在沒有丙酮酸脫羧酶活性的情況下，酵母細胞的生長是不可能的，因為沒有足夠的、通過乙醛和乙酸產(chǎn)生的乙酰-CoA可用于脂肪酸生物合成。對于特征d)進行如下陳述。檸檬酸和乙醛酸循環(huán)的不同的酶，其基因被葡萄糖轉(zhuǎn)錄地抑制，在蛋白質(zhì)水平上也是被葡萄糖調(diào)節(jié)或滅活的目標(biāo)。這些基因的單獨的轉(zhuǎn)錄去調(diào)節(jié)因而不足以最大程度地獲得活性的基因產(chǎn)物。對于要針對生產(chǎn)時間和產(chǎn)量進行優(yōu)化的生產(chǎn)琥珀酸的方法來說，蛋白質(zhì)水平上的滅活效果因此必需被避免。實例是乙醛酸循環(huán)的主要酶之一，異檸檬酸裂解酶。對于有機酸的有效生產(chǎn)必需的這種酶，在存在葡萄糖的情況下，是通過磷酸化和提高的蛋白水解降解來滅活的目標(biāo)(Lopez-Boado等人1988 ；Ordiz等人1996)。對于呼吸系統(tǒng)，特別是乙醛酸循環(huán)的進一步的酶，也可以設(shè)想在蛋白質(zhì)水平上葡萄糖誘導(dǎo)的負調(diào)節(jié)效果。這主要涉及乙酰-CoA合成酶(Acslp)、蘋果酸合酶(Mlslp)和蘋果酸脫氫酶(Mdh3p)。這些酶的葡萄糖誘導(dǎo)的蛋白水解降解或滅活能通過在酵母菌釀酒酵母中表達的異源同工酶來阻止。這些酶來源于天然地包含乙醛酸循環(huán)并且是“Crabtree” 陰性的微生物，因為來自這樣的生物體的乙醛酸循環(huán)的酶不受葡萄糖誘導(dǎo)的負調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)水平上的蛋白水解降解的影響?；钚缘囊胰┧嵫h(huán)對于以高產(chǎn)量在初始碳源上有效的有機酸生產(chǎn)是必需的?！癈rabtree”陰性供體生物體例如大腸桿菌(Mscherichia cWi)、厭氧電累菌屬 iAnaerobiospir i 1 Ium ) > ^ If lif M (Actinobaci llus) ^M M iMannheimia ) 或棒狀桿菌屬(Corynebacterium) 術(shù)語基因的刪除是指基因從微生物的基因組中完全除去，和/或其編碼的活性的酶從微生物中的去除?；虻臏缁钍侵杆龌蚓幋a的酶或蛋白質(zhì)的活性的降低或完全消除。這能通過常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)測試的方式測量相應(yīng)的酶活性，或通過例如免疫學(xué)檢測反應(yīng)的方式的相應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)的測定來驗證。滅活可以例如通過基因表達(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的降低或抑制來進行。為此，例如，反義核酸的誘導(dǎo)(通過添加或通過核酸序列插入到基因組中， 其可以被轉(zhuǎn)錄成反義核酸)，向內(nèi)基因突變的誘導(dǎo)，所述內(nèi)基因降低或完全消除基因產(chǎn)物的活性，基因特異性DNA結(jié)合因子的誘導(dǎo)，例如，鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其引起基因表達的降低，用編碼相應(yīng)的但是滅活或較低活性的酶或蛋白的外源基因替換內(nèi)基因。進一步的，控制相應(yīng)的內(nèi)基因的啟動子可以被刪除或突變，使得轉(zhuǎn)錄作用被降低或抑制。根據(jù)本發(fā)明滅活的基因或酶或提及的啟動子的序列(核酸序列和/或氨基酸序列) 可以根據(jù)以下基因數(shù)據(jù)庫編號獲得，或在以下文獻中描述了。SDHl NC_001143. 7 PDC2-. NC_001136. 8 IDPl NC_001136. 8 IDP2: NC_001144. 4 IDP3: NC_001146. 6 AGXl: NC_001138. 4 UGA2: NC_001134. 7 MLSl: X64407 S50520 ICLl: X65554
MDH3: M98763 ACSl: AY723758aceA: NC_000913. 2 acs: NC_004431. 1 aceB: NC_010473. 1 mdh: NC_000913. 2
ADHl: Lang C. , Looman A. C. , Appl Microbiol biotechnol. 44(1 - 2): 147 - 156 (1995)
tetO 和 tTA: Gari Ε.等人，Yeast 13: 837 - 848 (1997)。微生物例如酵母細胞的轉(zhuǎn)化，可以按照常規(guī)的方法進行，對此參考文獻khiestl R. H.,等人，Curr Genet. Dec, 16 (5-6) :339-346 (1989)，或 Manivasakam P.,等人， Nucleic Acids Res. Sep 11，21 (18): 4414—4415 (1993)，或 Morgan A. J.，Experientia Supp1. , 46 : 155-166 (1983)。適合于轉(zhuǎn)化的載體，特別是質(zhì)粒，例如是從以下文獻已知的Naumovski L.，等人， J Bacteriol. 152 (1) :323-331 (1982), Broach J. R.,等人，Gene, 8 (1) :121-133 (1979)，Sikorski R. S.,等人，Genetics, 122 (1)_19_27 (1989)。這些載體是 Y印24、 Yepl3,pRS 載體系列，以及 YCpl9 或 pYEXBX。適合于本發(fā)明的目的的表達盒的產(chǎn)生一般地通過啟動子與編碼基因的核酸序列， 以及任選的終止子的融合，通過常規(guī)的重組和克隆技術(shù)來進行，例如在以下文獻中描述的， Maniatis Τ.,等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYj USA, 1989，或Sihlavy Τ. J.,等人，Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYj USA, 1984，or Ausubel F. Μ.,等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience，1987。本發(fā)明進一步涉及根據(jù)本發(fā)明的微生物用于生產(chǎn)乙醛酸和/或檸檬酸循環(huán)的有機羧酸，特別是有機二元羧酸，優(yōu)選的琥珀酸的用途，以及涉及其在生產(chǎn)乙醛酸和/或檸檬酸循環(huán)的有機羧酸，特別是有機二元羧酸，優(yōu)選琥珀酸的方法中的用途，包括以下方法步驟:A)在生長方法步驟中，在優(yōu)選的有氧條件下、任選的在添加用于誘導(dǎo)可被誘導(dǎo)的啟動子的誘導(dǎo)物質(zhì)和/或谷氨酸的情況下，培養(yǎng)和增殖所述微生物，B)然后，在生產(chǎn)階段中，在優(yōu)選的厭氧條件下，任選的在添加用于抑制可被抑制的啟動子的誘導(dǎo)物質(zhì)的情況下，培養(yǎng)所述微生物，C)然后在步驟B)之后或在步驟B)期間，從培養(yǎng)物上清液分離所述羧酸，以及任選地純化所述羧酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是進行步驟A)直到達到至少100 g干生物質(zhì)/1， 優(yōu)選的至少120 g/Ι，最優(yōu)選的至少140 g/Ι的細胞密度。可以進行步驟B)直到達到至少 0. 4摩爾/1，優(yōu)選的至少0. 8摩爾/1，最優(yōu)選的至少1. O摩爾/1的羧酸濃度。在步驟A) 中，范圍從4到9，優(yōu)選的從6到8的pH值，范圍從0. 01到0. 5摩爾/1，優(yōu)選的從0. 05到 0.2摩爾/1，最優(yōu)選的從0.05到0.1摩爾/1的的鹽濃度可以進行調(diào)整。在步驟B)中，范圍從4到9，優(yōu)選的從6到8的pH值，范圍從0. 01到0. 5摩爾/1，優(yōu)選的從0. 05到0. 2摩爾/1，最優(yōu)選的從0. 05到0. 1摩爾/1的的鹽濃度可以進行調(diào)整。步驟A)優(yōu)選的在20到 350C，優(yōu)選28到30°C的溫度進行1到1，000 h，優(yōu)選的2到500 h，最優(yōu)選的2到200 h。在步驟B)中，15到40°C，優(yōu)選的20到35°C，最優(yōu)選的觀到30°C的溫度，進行1到1，000 h，優(yōu)選的2到500 h，最優(yōu)選的2到200 h的時間是優(yōu)選的。例如，步驟A)的培養(yǎng)介質(zhì)可以是使用的WMVIII介質(zhì)(Lang C.，Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44 (1-2) :147-156 (1995))。培養(yǎng)介質(zhì)中四環(huán)素的數(shù)量是優(yōu)選的低于20 mg/L，更優(yōu)選的低于10 mg/L，最優(yōu)選的低于1 mg/L，低至低于檢測極限的值，和/或如果使用的話，培養(yǎng)介質(zhì)中CUS04&度優(yōu)選的高于1 μΜ，最優(yōu)選的高于5 μ M0 范圍可以是例如1到3 μ M或3到15 μΜ。例如，步驟B)的培養(yǎng)介質(zhì)可以是使用的WMVIII-介質(zhì)，但也可以使用常規(guī)的糖蜜介質(zhì)。如果使用的話，四環(huán)素的數(shù)量是優(yōu)選的高于1 mg/1，最優(yōu)選的高于3 mg/L·范圍可以是例如1到3 mg/1或3到15 mg/L·培養(yǎng)介質(zhì)中使用的CuSO4濃度優(yōu)選低于20 μ M，更優(yōu)選低于10 μ Μ，最優(yōu)選低于1 μ Μ，低至低于檢測極限的值。然后在步驟B)之后進行步驟C)。然后，例如通過過濾或離心，從微生物分離培養(yǎng)物上清液。然而，步驟C)也可以在步驟B)期間進行，并且是連續(xù)地或不連續(xù)地。在后一情況中，至少部分培養(yǎng)物上清液被除去并用新的培養(yǎng)介質(zhì)替換，如果可應(yīng)用的話，這個過程重復(fù)幾次。從除去的培養(yǎng)物上清液中，獲得琥珀酸。通過適合的膜，或引導(dǎo)培養(yǎng)介質(zhì)流動通過用于分離琥珀酸的設(shè)備，可以進行連續(xù)分離。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的微生物的方法，其中a)基因idhl和idpl被刪除或滅活，和/或b)基因sdh2和sdhl被刪除或滅活，和/或c)基因/^C 被刪除或滅活，或處在啟動子的控制之下，所述啟動子能通過將微生物暴露于誘導(dǎo)物質(zhì)來抑制或誘導(dǎo)， 和/或d)來自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3構(gòu)成的組的一種或多種基因被來自Crabtree陰性生物體的相應(yīng)的外源基因、或相應(yīng)的多個外源基因替換或補充。原則上，對于根據(jù)本發(fā)明的微生物給出的所有解釋也以類似的方式適用于根據(jù)本發(fā)明的用途和方法。上文提及的文獻和下文中簡短形式的引證的書目如下 Contreras-Shannon, V., A. P. Lin, Μ. T. McCammon 禾口 L. McAlister-Henn
(2005). "Kinetic properties and metabolic contributions of yeast mitochondrial and cytosolic NADP+-specific isocitrate dehydrogenases. 〃 J Biol Chem 280 (6) :4469-75。DeRisi, J. L. , V. R. Iyer 和 P. 0. Brown (1997). "Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. 〃 Science 278 (5338):680-6。Gancedo, J. M. (1998) . "Yeast carbon catabolite repression." Microbiol Mol Biol Rev 62 (2) : 334-61。Guldener, U. , S. Heck, T. Fielder, J. Beinhauer 禾口 J. H. HegemannC 1996). 〃A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. 〃 Nucleic Acids Res 24 (13):2519-24。Kubo, Y. , H. Takagi 禾口 S. Nakamori (2000) . "Effect of gene disruption of succinate dehydrogenase on succinate production in a sake yeast strain. 〃 J Biosci Bioeng 90 (6) :619— 24。Lang, C.禾口 A. C. Looman (1995) . "Efficient expression and secretion ofAspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. " Appl Microbiol Biotechnol 44 (1-2) : 147-56。Lopez-Boadoj Y. S.，P. Herreroj Τ. Fernandez, R. Fernandez 禾口 F. Moreno (1988). ^Glucose-stimulated phosphorylation of yeast isocitrate lyase in vivo·〃 J Gen Microbiol 134 (9) :2499-505.
Ordizj I. , P. Herreroj R. Rodicio 禾口 F. Moreno (1996) . "Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae is mediated by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits Tpkl and Tpk2.〃 FEBS Lett 385 (1-2) :43-6。Velmuruganj S. , Z. Lobo 禾口 P. K. Maitra (1997). "Suppression of pdc2 regulating pyruvate decarboxylase synthesis in yeast· 〃 Genetics 145(3):587_940附圖意圖解釋如上所述的通過本發(fā)明的遺傳性手段的各種合成途徑，以及其變型方案。其中
附圖1:檸檬酸和乙醛酸循環(huán)與涉及的基因、代謝物和酶或蛋白質(zhì)的示意圖，以及附圖2:在野生型中琥珀酸到谷氨酸的新陳代謝。在下文中，參考不同的實施例更詳細地解釋本發(fā)明。對于僅僅為示范性的微生物描述了根據(jù)本發(fā)明的個體特征。描述的遺傳性手段當(dāng)然也可以轉(zhuǎn)移到其他微生物，特別是酵母菌。進一步的，各種遺傳學(xué)手段也可以在其他的組合中提供。實施例1:利用在轉(zhuǎn)錄上和蛋白質(zhì)水平上不受葡萄糖抑制影響的乙醛酸循環(huán)的微生物的產(chǎn)生，用于生產(chǎn)呼吸作用中央新陳代謝的有機酸，特別是琥珀酸。檸檬酸和乙醛酸循環(huán)的不同的酶，其基因被葡萄糖轉(zhuǎn)錄地抑制，是酵母菌釀酒酵母中以及在蛋白質(zhì)水平上被葡萄糖調(diào)節(jié)或滅活的目標(biāo)。這些基因的轉(zhuǎn)錄去調(diào)節(jié)因而不足以最大程度地獲得活性的基因產(chǎn)物。因而，對于要針對生產(chǎn)時間和產(chǎn)量進行優(yōu)化的生產(chǎn)琥珀酸的方法來說，蛋白質(zhì)水平上的滅活效果也必需被阻止。乙醛酸循環(huán)的酶的葡萄糖誘導(dǎo)的蛋白水解降解或滅活能通過在酵母菌釀酒酵母中表達的異源同工酶來阻止。這些酶來源于天然地包含乙醛酸循環(huán)并且是“Crabtree” 陰性的微生物，因為來自這樣的生物體的乙醛酸循環(huán)的酶不受葡萄糖誘導(dǎo)的負調(diào)節(jié)或蛋白質(zhì)水平上的蛋白水解降解的影響。供體生物體可以是，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、方文線桿菌屬(Actinobacillus)、曼氏桿菌屬 (Mannheimia)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。這些酶的轉(zhuǎn)錄去調(diào)節(jié)能通過將相應(yīng)的基因置于組成型啟動子的控制下來實現(xiàn)。為此，基因acs (乙酰-CoA合成酶)、卿A (異檸檬酸裂解酶)、aceB (蘋果酸合酶 k),mdh (蘋果酸脫氫酶)通過PCR的方式從菌株五coli JM109的細菌DNA擴增，并裝上限制性接頭，然后在組成型ADHl啟動子的控制之下整合到酵母菌染色體中。對于這個基因在酵母菌釀酒酵母中去調(diào)節(jié)的表達，使用組成型^ 啟動子，其由非常長時間上天然序列的修飾而產(chǎn)生，來進行獨立于葡萄糖和乙醇的組成型表達(Lang和Looman 1995)。g ADHlprom-acs (aceA, aceB, fflt/力)-TRPlterm.的表達盒的編碼核酸序列通過利用標(biāo)準(zhǔn)方法的PCR從載體pFlatl-acs (aceA, aceB, 中擴增。獲得的DNA片段在Klenow處理之后鈍端克隆到載體pUG6的EcoRV接口中，產(chǎn)生載體pUGe-acs (aceA,aceB, mdh\在質(zhì)粒分離之后，通過PCR方式從載體pUGe-acs CaceA, aceB,擴增
擴展的片段，從而產(chǎn)生的片段由以下成分組成loxP-kanMX-loxP-ADHl-prom-acs CaceA, aceB,色氨酸終止子。引物是選擇的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出處分別含有
acs (aceA, aceB, 基因的5’或3’序列，以及在退火的區(qū)域含有IoxP區(qū)域的5’和色氨酸終止子的3’的序列。因而，這確保了，在一個方面，包括KanR和acs的完整片段(acd， aceB, 被擴增，另一方面，這個片段然后可以轉(zhuǎn)化到酵母菌中，并通過同源重組將這個完整片段整合到酵母菌的相應(yīng)基因座中。選擇標(biāo)志物提供了針對G418的相應(yīng)的抗性。然后為了再次除去針對G418的抗性， 相應(yīng)的形成的酵母菌株用ere重組酶載體pSH47 (Guldener等人1996)轉(zhuǎn)化。通過這種載體，酵母菌中的ere重組酶被表達，結(jié)果是兩個IoxP序列內(nèi)的序列區(qū)域重新組合出來。結(jié)果是，兩個IoxP序列的僅一個和相應(yīng)的表達盒仍然包含在初始的相應(yīng)基因座中。結(jié)果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通過酵母菌株中這種cre-lox系統(tǒng)的方式適合于整合或除去另外的基因。載體PSH47然后能通過在補充尿嘧啶(20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB瓊脂平板上反選擇來再次除去。為此，帶有這個質(zhì)粒的細胞必需首先在非選擇性條件下培養(yǎng)，然后在含有FOA的選擇平板上抽取。在這些條件下，僅那些自己不能合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是不再含有任何質(zhì)粒(PSH47)的細胞。實施例2:用于琥珀酸和其他有機酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的微生物的產(chǎn)生，其通過降低產(chǎn)量損失使得更有效的生產(chǎn)過程成為可能。為了降低酵母菌釀酒酵母中琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)期間的產(chǎn)量損失，琥珀酸必需作為終產(chǎn)物富集，并且必需不被酵母細胞進一步代謝。這不能通過基因sdh2的簡單刪除來最大程度地實現(xiàn)。此外，由基因編碼的異四聚化的酶琥珀酸脫氫酶的另一個亞基必須被刪除。產(chǎn)量損失還可能產(chǎn)自通過酶琥珀酸半醛脫氫酶對形成的琥珀酸的進一步新陳代謝。這種酶是谷氨酸降解途徑的一部分，催化琥珀酸到琥珀酸-半醛的反應(yīng)。這種中間體然后被Y-氨基丁酸代謝成谷氨酸。這樣，不但可能發(fā)生產(chǎn)量損失，還可能合成α-酮戊二酸和谷氨酸，其使得通過谷氨酸補充的發(fā)酵過程控制變?yōu)椴豢赡堋Ｒ蚨?，編碼琥珀酸-半醛脫氫酶的基因卿2的額外的刪除對于生產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)化的生產(chǎn)過程是有益的。對于乙醛酸循環(huán)所必需的乙醛酸不能僅從異檸檬酸裂解酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生，其中異檸檬酸被裂解成琥珀酸和乙醛酸，還從丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)產(chǎn)生。這種酶基于丙酮酸和甘氨酸催化乙醛酸和丙氨酸的產(chǎn)生。如果乙醛酸不必然地通過異檸檬酸裂解酶反應(yīng)來提供，乙醛酸循環(huán)也能通過丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的反應(yīng)來確保，通過所述反應(yīng)提供乙醛酸。在這種情況下，通過異檸檬酸裂解酶活性產(chǎn)生期望的產(chǎn)物，異檸檬酸裂解酶活性不是乙醛酸循環(huán)必需的，結(jié)果是，酵母菌部分地利用由丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化的可選擇的反應(yīng)用于乙醛酸合成。其中，不產(chǎn)生可能導(dǎo)致產(chǎn)量損失的琥珀酸。因而，編碼丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因3#7的額外的刪除對于生產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)化的生產(chǎn)過程是有益的。idhl刪除不導(dǎo)致異檸檬酸脫氫酶活性的完全消失。其理由是異檸檬酸脫氫酶的 3種另外的同工酶，對于α -酮戊二酸的產(chǎn)生，它們可以補償由基因IDHl和7 編碼的二聚的主要酶的缺失。除了基因的刪除之外，至少編碼異檸檬酸脫氫酶的同工酶的基因idpl也必需被刪除，以完全地阻止對葡萄糖的異檸檬酸脫氫酶活性。異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制具有優(yōu)點是，酵母菌的呼吸系統(tǒng)中的所有的碳被重定向到乙醛酸循環(huán)中朝向琥珀酸的方向，不能流到將導(dǎo)致產(chǎn)量損失的α-酮戊二酸。簡言之，除了基因sdh2和idhl之外，通過刪除基因sdhl、agxl、uga2和idpl，在酵母菌中琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)期間的產(chǎn)量損失可以被最小化或降低。為此，刪除盒l(wèi)oxP-kanMX-loxP的編碼核酸序列通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法的PCR從載體 pUG6擴增(Guldener等人1996)，從而產(chǎn)生的片段由以下成分組成loxP-kanMX_loxP。引物是選擇的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出處分別含有要刪除的基因(5^7,3^^4^^, idpl)的天然座位的起始和末端的5’或3’序列，以及在退火區(qū)域含有IoxP區(qū)域的5’和第二 IoxP區(qū)域的3’的序列。因而，它確保了，在一方面，完整片段loxP-kanMX-loxP被擴增，另一方面，這個片段然后被轉(zhuǎn)化到酵母菌中，通過同源重組將這個完整片段整合到酵母菌的要刪除的基因座中。選擇標(biāo)志物提供了針對G418的抗性(由kanMX編碼)。然后為了再次除去針對G418 的抗性和容許進一步使用kanMX標(biāo)志物，形成的酵母菌株用ere重組載體pSH47(Guldener 等人1996)轉(zhuǎn)化。通過這種載體，酵母菌中的ere重組酶被表達，結(jié)果是兩個IoxP序列內(nèi)的序列區(qū)域重新組合出來。結(jié)果是，兩個IoxP序列的僅一個序列保留在刪除的基因座處 (.sdhl,agxl,uga2,idpl).結(jié)果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通過酵母菌株中這種 cre-lox系統(tǒng)的方式適合于整合或除去另外的基因。載體pSH47然后能通過在補充尿嘧啶 (20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB瓊脂平板上反選擇來再次除去。為此，帶有這個質(zhì)粒的細胞必需首先在非選擇性條件下培養(yǎng)，然后在含有FOA的選擇平板上抽取。 在這些條件下，僅那些自己不能合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是不再含有任何質(zhì)粒(PSH47)的細胞。這樣，要刪除的所有基因Qsdhl, agxl, uga2, idpl)被迭代地刪除。表1 示范性地顯示了，在 3. 52 g/Ι 硫酸銨和 0. 05 M Na2HPO4 和 0. 05 M NaH2HPO4 作為緩沖液、具有組氨酸100 mg/1、亮氨酸400 mg/1、尿嘧啶100 mg/1的WM8介質(zhì)(Lang 和Looman，1995)中培養(yǎng)表格中提及的菌株72小時之后，通過上述刪除的產(chǎn)量提高。C源是5%葡萄糖。接種用來自48 h預(yù)培養(yǎng)物以1%進行。培養(yǎng)在30°C和150 rpm的搖晃孵化器上100 ml搖瓶中進行。由于菌株5和6不在沒有谷氨酸的介質(zhì)中生長，首先生物質(zhì)用這些菌株在具有谷氨酸鈉和葡萄糖5%的75 ml標(biāo)準(zhǔn)WM8介質(zhì)中在250 mL擋板燒瓶(Schikanekolbe)中產(chǎn)生。 細胞在上述介質(zhì)中洗滌和重懸浮用于進一步培養(yǎng)。表1:提及的菌株在上述條件下在WM8介質(zhì)中72小時培養(yǎng)之后的琥珀酸滴度。 在表1中可以看出，與野生型相比，所有進行的刪除導(dǎo)致培養(yǎng)上清液中更高的琥珀酸數(shù)量。四刪除突變種AXa^raJ」sdh2A sdhl Δ idhl Δ idpl富集了最高數(shù)量的琥珀酸。用其他微生物或酵母菌也獲得了相應(yīng)的結(jié)果。實施例3:用于琥珀酸和其他有機酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的微生物的產(chǎn)生，其通過降低副產(chǎn)物產(chǎn)生，特別是乙醇和乙酸，使得更有效的生產(chǎn)過程成為可能。發(fā)酵是另一個主要方面，其對于琥珀酸的生物技術(shù)生產(chǎn)是不利的，因為它將導(dǎo)致非期望的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在這一點上，主要是乙酸和乙醇的產(chǎn)生構(gòu)成了難題，因為這將導(dǎo)致嚴重的產(chǎn)量損失。防止酒精發(fā)酵，即形成乙醇的一種可能性是關(guān)閉基于丙酮酸的乙醇生物合成。從而，通過乙醛的乙酸產(chǎn)生也被阻止。為此目的，丙酮酸脫羧酶活性必須被關(guān)閉，其在酵母菌釀酒酵母中由基因/ 1/、PDC5和PDC6所編碼的3種丙酮酸脫羧酶同工酶催化。基因PDC2 編碼轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物，其主要對基因/ 1/和/ ^的表達負責(zé)。因而，基因/^C 提供了用一個單獨的刪除來消除由細胞中3種基因編碼的丙酮酸脫羧酶活性的主要部分的可能性。這具有很大的優(yōu)勢，從而成問題的乙醇產(chǎn)生可以僅用酵母菌中新陳代謝的單個修飾來阻止。這能通過酵母菌釀酒酵母中基因/^β 的刪除來實現(xiàn)。因為這個刪除導(dǎo)致在葡萄糖上強烈受限的生長，可以被誘導(dǎo)的啟動子可以連接到基因/^β 的上游?？梢员徽T導(dǎo)的啟動子在生長階段期間通過向培養(yǎng)介質(zhì)添加誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)，從而下游基因/^β 被充分轉(zhuǎn)錄， 確保了酵母培養(yǎng)物的生長。當(dāng)誘導(dǎo)物被耗盡時，進一步的生長是不可能的，啟動了沒有乙醇和乙酸形式的副產(chǎn)物產(chǎn)生的生產(chǎn)階段?？杀徽T導(dǎo)的啟動子，CUPl啟動子被選擇，染色體地整合到基因/^C 的“開放閱讀框”之前，從而后者在可由銅誘導(dǎo)的CUPl啟動子的控制下。對此，CPUl啟動子盒的編碼核酸序列利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過PCR擴增，從而產(chǎn)生的片段由以下成分組成l0XP-kanMX-l0XP-CUPlpr。作為引物，選擇寡核苷酸序列，其在5’和3’ 突出分別含有/^β 基因的天然啟動子的5’或3’序列，以及在退火區(qū)域中含有IoxP-區(qū)域的5’和CUPlprom的3’的序列。因而，這確保了，在一個方面，包括kanMX和CUPl啟動子的完整片段被擴增，另一方面，這個片段然后可以轉(zhuǎn)化到酵母菌中，并通過同源重組將這個完整片段整合到酵母菌的PDC2基因座中，基因PDC2的編碼區(qū)域之前。選擇標(biāo)志物提供了針對G418的抗性。產(chǎn)生的菌株含有處在銅調(diào)節(jié)的CUPl啟動子以及天然/^β 終止子控制下的基因/^β 的拷貝。然后為了再次除去針對G418的抗性，相應(yīng)的形成的酵母菌株用ere重組酶載體pSH47 (Guldener等人1996)轉(zhuǎn)化。通過這種載體，酵母菌中的cre重組酶被表達，結(jié)果是兩個IoxP序列內(nèi)的序列區(qū)域重新組合出來。結(jié)果是，兩個IoxP序列的僅一個以及CUPl啟動子盒仍然包含在基因/^C 的編碼序列之前。 結(jié)果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通過酵母菌株中這種cre-lox系統(tǒng)的方式適合于整合或除去另外的基因。載體PSH47然后能通過在補充尿嘧啶(20 mg/L)和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB瓊脂平板上反選擇來再次除去。為此，帶有這個質(zhì)粒的細胞必需首先在非選擇性條件下培養(yǎng)，然后在含有FOA的選擇平板上抽取。在這些條件下，僅那些自己不能合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是不再含有任何質(zhì)粒(PSH47)的細胞。實施例4:用于琥珀酸和其他有機酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的微生物的產(chǎn)生，其通過谷氨酸補充使得生長和生產(chǎn)階段的分離成為可能。在下文中，描述了生長和生產(chǎn)階段的分離的可能性，其不需要使用抗生素。在酵母菌釀酒酵母中，不考慮導(dǎo)致檸檬酸循環(huán)中斷的基因SiZAi^niofei的刪除，(參見附圖1，黑色十字)，可以測量生長速度，其與未修飾的野生型酵母菌是可比較的(在在100 ml搖瓶的YDP 介質(zhì)中，菌株AH22ura3 Δ HKidhl具有與菌株AH22ura3 (野生型)相比僅低11%的生長速度，來源自有數(shù)據(jù))。具有刪除的酵母菌株的生長是可能的，只是因為這個刪除不導(dǎo)致異檸檬酸脫氫酶活性的完全消失。這的理由是異檸檬酸脫氫酶的3種另外的同工酶，對于α-酮戊二酸的產(chǎn)生，它們可以補償由基因IDHl和IDH2編碼的二聚的主要酶的缺失。α -酮戊二酸的合成是酵母細胞在最小培養(yǎng)基上的生長絕對必需的，因為氨基酸谷氨酸從這個中間體產(chǎn)生，沒有谷氨酸不可能有生長。在用酵母菌生產(chǎn)琥珀酸的2步發(fā)酵過程中，因而生長和生產(chǎn)階段的有效分離僅通過生產(chǎn)菌株中異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制才是可能的，因為由此確保了谷氨酸營養(yǎng)缺陷型，結(jié)果是酵母菌在沒有補充的谷氨酸的培養(yǎng)基中不生長。這可以用于通過谷氨酸向培養(yǎng)介質(zhì)的補充來控制發(fā)酵過程。根據(jù)向培養(yǎng)介質(zhì)添加的谷氨酸的數(shù)量，生長階段的時間和期望的細胞密度可以在這個階段中被有效地控制。隨著數(shù)量提高，持續(xù)時間和細胞密度也將提高。當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中的谷氨酸被耗盡時，進一步的生長是不可能的，所有的碳可以有效地用于琥珀酸的合成，則它的產(chǎn)生不與生物質(zhì)的產(chǎn)生相競爭。這實質(zhì)上促進了產(chǎn)量的提高和生產(chǎn)過程的效力的提高。如果除了基因的刪除之外，至少編碼異檸檬酸脫氫酶的同工酶的基因idpl也被刪除，通過谷氨酸的補充在葡萄糖和其他可發(fā)酵的碳源上發(fā)酵過程中生長和生產(chǎn)階段的分離才能實現(xiàn)。異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制才確保了必要的谷氨酸營養(yǎng)缺陷型。異檸檬酸脫氫酶活性的完全抑制的另一個優(yōu)點是，因而酵母菌的呼吸系統(tǒng)中所有的碳被重定向到乙醛酸循環(huán)中琥珀酸的方向，不能流出到導(dǎo)致產(chǎn)量損失的α-酮戊二酸 (參見附圖le)。為此，刪除盒l(wèi)oxP-kanMX-loxP的編碼核酸序列通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法的PCR從載體 pUG6擴增(Guldener等人1996)，從而產(chǎn)生的片段由以下成分組成loxP-kanMX_loxP。引物是選擇的寡核苷酸序列，其在5’和3’突出處分別含有要刪除的基因i辦7的天然基因座的起始和末端處的5’或3’序列，以及在退火區(qū)域含有IoxP區(qū)域的5’和第二 IoxP區(qū)域的 3’的序列。因而，它確保了，在一方面，完整片段loxP-kanMX-loxP被擴增，另一方面，這個片段然后被轉(zhuǎn)化到酵母菌中，通過同源重組將這個完整片段整合到酵母菌的要刪除的基因座中。選擇標(biāo)志物提供了針對G418的相應(yīng)抗性(由kanMX編碼)。然后為了再次除去針對 G418的抗性和由此容許進一步使用kanMX標(biāo)志物，形成的酵母菌株用ere重組載體pSH47 (Guldener等人1996)轉(zhuǎn)化。通過這種載體，酵母菌中的ere重組酶被表達，結(jié)果是兩個 IoxP序列內(nèi)的序列區(qū)域重新組合出來。結(jié)果是，兩個IoxP序列的僅一個保留在刪除的基因座/辦7上。結(jié)果是，酵母菌株再次失去G418抗性，因而通過酵母菌株中這種cre-lox系統(tǒng)的方式適合于整合或除去另外的基因。載體PSH47然后能通過在補充尿嘧啶(20 mg/L) 和FOA (5-氟乳清酸)(1 g/L)的YNB瓊脂平板上反選擇來再次除去。為此，帶有這個質(zhì)粒的細胞必需首先在非選擇性條件下培養(yǎng)，然后在含有FOA的選擇平板上抽取。在這些條件下，僅那些自己不能合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是不再含有任何質(zhì)粒 (PSH47)的細胞。生產(chǎn)菌株AH22ura3 Δ sdhl Δ sdh2 AiVAi Δ idpl評估有和沒有補充的谷氨酸的情況下它的生長性質(zhì)。采用AH22ura3AsdhlAsdh2Aii/A7作為參考菌株，其是沒有idpl的額外刪除的菌株。兩個菌株在100 ml燒瓶中的20 ml WM8介質(zhì)中培養(yǎng)，3. 52 g/Ι硫酸銨(作為氮源)， 0.05 M K2HPO4 和 0.05 M KH2HPO4 作為緩沖液，在標(biāo)準(zhǔn)的 WM8 介質(zhì)(Lang 和 Looman 1995) 中，其含有10 g谷氨酸鈉作為氮源。64h之后，測定4個培養(yǎng)物的光密度。結(jié)果在表2中示
出ο表2 在有和沒有谷氨酸的WM8介質(zhì)中64小時培養(yǎng)之后提及的菌株的光密度。在沒有谷氨酸的介質(zhì)中，補充NH3SO4作為氮源。
菌株有谷氨酸鈉的WM8中的0D600/ml沒有谷氨酸鈉的WM8中的0D600/mllAH22ura3Δsdh2Δ sdhlΔ idhl26. 4102AH22ura3 Δ sdh2 Δ sAhl Mdhl Δ idpl29. 50 在表2中可以看出，菌株中idpl的額外刪除導(dǎo)致在葡萄糖上的谷氨酸營養(yǎng)缺陷型，因為菌株m22\xr。Lsdh2 Lsdhl Δ idhl Δ idpl在沒有谷氨酸的介質(zhì)中不顯示生長， 與L sdh2 L sdhl L idhl不。ii/^W的單獨的刪除不導(dǎo)致谷氨酸營養(yǎng)缺陷型。通過谷氨酸補充在葡萄糖上生產(chǎn)琥珀酸和其他有機酸的2步生產(chǎn)過程中生長和生產(chǎn)階段的分離，僅在具有刪除的基因和iW的菌株中是可能的。當(dāng)添加其他氮源，例如硫酸銨時，」IdhlAidpl突變種的生長在極低數(shù)量的補充的谷氨酸(約20 mg/1)的最小培養(yǎng)基中是可能的。
權(quán)利要求
1.分離的遺傳修飾的微生物，其中與野生型相比，a)idhl和idpl基因被刪除或滅活，和/或b)sdh2和sdhl基因被刪除或滅活，和/或基因被刪除或滅活，或處在啟動子的控制之下，所述啟動子能通過所述微生物暴露于誘導(dǎo)物質(zhì)來抑制或誘導(dǎo)，和/或d)來自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3構(gòu)成的組的一種或多種基因被來自Crabtree陰性生物體的一個相應(yīng)的外源基因或多個相應(yīng)的外源基因替換或補充。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中除了基因idhl和idpl之外，基因idp2或idp3之一或這兩個基因被刪除或滅活。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的微生物，其中除了基因sdh2和sdhl之外，基因uga2或agxl 之一或這兩個基因被刪除或滅活。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3之一的微生物，其中連接在基因/^β 上游的啟動子是可以被誘導(dǎo)的啟動子，例如，CUPl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3之一的微生物，其中連接在基因/^β 上游的啟動子是可以被抑制的啟動子，例如，四環(huán)素調(diào)節(jié)的tetO啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5之一的微生物，其中所述外源基因來源于來自以下構(gòu)成的組的 Crabtree陰性生物體大腸桿菌、厭氧螺菌屬、放線桿菌屬、曼氏桿菌屬、根霉屬、棒狀桿菌屬、裂殖酵母屬、威克酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、 克勒克酵母屬、念珠菌屬、Ogataea, Kuraishia, Komagatael la、耶氏酵母屬、梅奇酵母屬屬、 ffilliopsis, Nakazawaea、克盧費氏酵母屬、隱球酵母屬、有孢圓酵母屬、布勒擲孢酵母屬、 紅酵母屬、Willopsis、克勒克酵母屬、絲孢酵母(Trichosporon)、Yamadazmya和擲孢酵母 jM ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6之一的微生物，其中所述外源基因處在組成型活性啟動子，例如，ADHl啟動子的控制下。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7之一的微生物，其中所述微生物是酵母菌，優(yōu)選選自以下構(gòu)成的組釀酒酵母、酵母屬、Saccharomycecopsis、類酵母屬、裂殖酵母屬、威克酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、念珠菌屬、接合酵母屬、 Ogataea、Kurai shia、Komagatael la、耳氏酵母屬、梅奇酵母屬、Wi 11 iopsi s、Nakazawaea、克盧費氏酵母屬、隱球酵母屬、有孢圓酵母屬、布勒擲孢酵母屬、紅酵母屬、Willopsis、克勒克酵母屬和擲孢酵母屬。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8之一的微生物用于生產(chǎn)乙醛酸和/或檸檬酸循環(huán)的有機羧酸， 特別是有機二元羧酸，優(yōu)選琥珀酸的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8之一的微生物在生產(chǎn)乙醛酸和/或檸檬酸循環(huán)的有機羧酸，特別是有機二元羧酸，優(yōu)選琥珀酸的方法中的用途，包括下列方法步驟A)在生長方法步驟中，在優(yōu)選有氧條件下、任選的在添加用于誘導(dǎo)可被誘導(dǎo)的啟動子的誘導(dǎo)物質(zhì)和/或谷氨酸的情況下，培養(yǎng)和增殖所述微生物，B)然后，在生產(chǎn)階段中，在優(yōu)選厭氧條件下，任選的在添加用于抑制可被抑制的啟動子的誘導(dǎo)物質(zhì)的情況下，培養(yǎng)所述微生物，C)在步驟B)之后或在步驟B)期間，從培養(yǎng)物上清液分離所述羧酸，以及任選地純化所述羧酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中進行步驟A)直到達到至少100g干生物質(zhì)/1，優(yōu)選至少120 g干生物質(zhì)/1，最優(yōu)選至少140 g干生物質(zhì)/1的細胞密度。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11之一的用途，其中進行步驟B)直到達到至少0.4摩爾/1， 優(yōu)選至少0. 8摩爾/1，最優(yōu)選至少1. 0摩爾/1的羧酸濃度。
13.根據(jù)權(quán)利要求10到12之一的用途，其中在20到35°C，優(yōu)選觀到30°C的溫度進行步驟A) 1到1，000 h，優(yōu)選2到500 h，最優(yōu)選2到200 h。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13之一的用途，其中在15到40°C，優(yōu)選20到25°C的溫度進行步驟B) 1到1，000 h，優(yōu)選2到500 h，最優(yōu)選2到200 h。
15.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1到8之一的微生物的方法，其中a)idhl和idpl基因被刪除或滅活，和/或b)sdh2和sdhl基因被刪除或滅活，和/或基因被刪除或滅活，或處在啟動子的控制之下，所述啟動子能通過將所述微生物暴露于誘導(dǎo)物質(zhì)來抑制或誘導(dǎo)，和/或d)來自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3構(gòu)成的組的一種或多種基因被來自Crabtree陰性生物體的一個相應(yīng)的外源基因或多個相應(yīng)的外源基因替換或補充。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的遺傳修飾的微生物，其中與野生型相比，a)idh1和idp1基因已經(jīng)被刪除或滅活，和/或b)sdh2和sdh1基因被刪除或滅活，和/或c)PDC2基因被刪除或滅活，或處在啟動子的控制之下，所述啟動子能通過將微生物暴露于誘導(dǎo)物質(zhì)來抑制或誘導(dǎo)，和/或d)來自由ICL1、MLS1、ACS1和MDH3構(gòu)成的組的一種或多種基因被來自Crabtree陰性生物體的一個相應(yīng)的外源基因、或多個相應(yīng)的外源基因替換或補充。
文檔編號C12N1/18GK102257152SQ200980151009
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者拉布 A., 蘭 C. 申請人:器官平衡有限責(zé)任公司