專利名稱：治療自體免疫和炎性病癥的可溶性多肽的制作方法
治療自體免疫和炎性病癥的可溶性多肽本發(fā)明涉及用作藥物，特別是用于預(yù)防或治療自體免疫和炎性病癥如過(guò)敏性哮喘和炎性腸病的可溶性CD47結(jié)合多肽。本發(fā)明更具體地涉及用作藥物的可溶性CD47結(jié)合多肽，其包括SIRPa (⑶17 )的胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合人⑶47的功能衍生物。⑶47是一種細(xì)胞表面糖蛋白，其結(jié)合相對(duì)細(xì)胞的SIRP α (又稱作SHPS-1)和 SIRP γ。這一相互作用造成對(duì)免疫細(xì)胞功能的負(fù)調(diào)控或者可以用于介導(dǎo)細(xì)胞粘附和遷移。 提出將⑶47用于治療自體免疫病癥的生物產(chǎn)品(W01999/040940)。相反，對(duì)⑶47配體(如 SIRP α )用于相似治療目的的潛在用途少有證據(jù)。一種解釋是⑶47的廣泛表達(dá)將阻止⑶47 結(jié)合多肽用作潛在藥物。Yu等人，2006(J Invest Dermatol，126，797-807)所示的數(shù)據(jù)表明通過(guò)將SIRP α的胞外結(jié)構(gòu)域融合免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域得到的融合蛋白在小鼠中可以防止從源自皮膚的樹(shù)突細(xì)胞(DC)遷移至引流淋巴結(jié)，并從而(至少部分地)減弱小鼠的接觸性過(guò)敏反應(yīng)。DC的遷移和功能對(duì)于免疫或炎性應(yīng)答是至關(guān)重要的。在疾病狀況下，DC的這些加劇的應(yīng)答可以造成疾病的永存。干擾病原性DC從組織遷移到淋巴器官對(duì)于停止引起自體免疫或炎性疾病的惡性循環(huán)將是很有吸引力的機(jī)會(huì)。本發(fā)明首先提供了在疾病動(dòng)物模型中，511^^呼(構(gòu)建體適于預(yù)防或停止1111/11117以及Th2所引起的疾病的體內(nèi)證據(jù)。這些數(shù)據(jù)提供了本發(fā)明的基礎(chǔ)并且支持了源自SIRPa的蛋白療法的可藥性。本發(fā)明部分地基于下述發(fā)現(xiàn)對(duì)于CD47/SIRPci通路的操作會(huì)抑制免疫原性CD103l〗i突細(xì)胞推進(jìn)的Thl/ Thl7引起的疾病(關(guān)節(jié)炎和結(jié)腸炎)以及Th2引起的疾病(過(guò)敏性哮喘)的病理。這些新的發(fā)現(xiàn)提供了對(duì)于之前未知的疾病潛在成因的共同機(jī)制并且代表了對(duì)于多種自體免疫和炎性病癥的治療前景。此外，在近來(lái)發(fā)表的報(bào)告中的證據(jù)表明CD47的配體對(duì)于治療若干種癌癥可能是有益的(Majeti等人，Cell 2009)。但是該報(bào)告表明了⑶47抗體的應(yīng)用，而本發(fā)明涉及源自SIRPa的多肽在治療這些疾病中的應(yīng)用。因此，一方面，本發(fā)明提供用作藥物的可溶性CD47結(jié)合多肽，包含選自下組的源自SIRPa的多肽a)SIRPa的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 3) ；b)SEQ ID NO 1的片段，和c) 與SEQ ID NO :3具有至少75%同一性的SEQID NO 1的變體多肽；其中所述源自SIRP α的多肽結(jié)合人CD47 (SEQ IDNO :24)。在某些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :3的變體多肽與SEQ ID NO 3具有至少80%、85%、90%、95%或99%的同一性。為了便于閱讀，下文將本發(fā)明的可溶性CD47結(jié)合多肽稱作“本發(fā)明的可溶性多肽”。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述源自SIRPa的多肽選自⑶47的拮抗劑，即，競(jìng)爭(zhēng)性抑制 CD47配體與CD47結(jié)合的多肽。CD47配體包含但不限于SIRP a、SIRP γ或TSPl。在另一實(shí)施方式中，所述源自SIRPa的多肽選自⑶47的激動(dòng)劑，即能夠誘導(dǎo)⑶47 信號(hào)活性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可溶性⑶47結(jié)合多肽選自以2 μ M或更小的Kd與人⑶47 結(jié)合和/或由在免疫復(fù)合物刺激的樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞因子釋放檢測(cè)中所測(cè)量的抑制所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的那些。在另一實(shí)施方式中，所述源自SIRP α的多肽是包含至少SIRP α的V區(qū)的SIRP a胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 2)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的可溶性多肽是一種融合多肽，包含由與第二異源多肽融合的源自SIRPa的多肽組成的第一組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，該可溶性多肽進(jìn)一步包含在第二異源多肽和源自SIRPa的多肽之間的間隔區(qū)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，源自 SIRPa的多肽與IgG Fc結(jié)構(gòu)域融合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Fc結(jié)構(gòu)域是人IgGl同種型的沉默F(xiàn)c片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述Fc結(jié)構(gòu)域是人IgGl同種型的無(wú)糖基化 (aglycosylated)突變變體。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明的可溶性多肽用作治療自體免疫和炎性病癥的藥物。優(yōu)選的適應(yīng)癥選自Th2-介導(dǎo)的氣道炎癥、過(guò)敏性病癥、哮喘、炎性腸病和缺血性疾病。 此外，本發(fā)明的可溶性多肽可用作治療白血病或癌癥的藥物。為了可以更加容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。其他定義在詳細(xì)說(shuō)明中提
出O術(shù)語(yǔ)CD47指人CD47。人CD47包含SEQ ID NO :24，以及人CD47的任何天然多態(tài)性，例如包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)或剪接變體。在人類中發(fā)現(xiàn)的CD47核苷酸序列的剪接變體或SNP的實(shí)例描述于表1。表1:⑶47蛋白的變體
變體類型變體ID說(shuō)明剪接變體NP_001768.1 NP_942088.1 NP_001020250.1 ENSP00000381308參照；最長(zhǎng)變體；序列NO:2 不同的，較短的C-末端不同的，較短的C-末端不同的，較短的C-末端單核苷酸多態(tài)性rsl1546646 ENSSNP12389584DNA: C或G;蛋白質(zhì)A或P (NP_001768.1 的位置 96) DNA: C或G;蛋白質(zhì)V或L (NP_001768.1 的位置 246)術(shù)語(yǔ)SIRPa指顯示出與⑶47整聯(lián)蛋白相關(guān)聯(lián)蛋白粘附的信號(hào)調(diào)控蛋白α (也稱作⑶17 或SHPS-1)。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)SIRP α指如SEQ ID NO :23所限定的人SIRP α。人SIRP α含有氨基酸胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :3)，具有一個(gè)V-型結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :2)，和兩個(gè)Cl型Ig結(jié)構(gòu)域以及三個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。它具有110個(gè)氨基酸胞質(zhì)序列，具有ITIM模體，當(dāng)磷酸化時(shí)ITIM模體募集酪氨酸磷酸酶SHP-I和SHP-2。術(shù)語(yǔ)人 SIRPa還包含但不限于任何天然的多態(tài)性，例如包含人SIRP α的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或剪接變體。在人類中發(fā)現(xiàn)的SIRP α核苷酸序列的剪接變體或SNP的實(shí)例描述于表2。表2 :SIRPa蛋白的變體
權(quán)利要求
1.一種用作藥物的可溶性⑶47結(jié)合多肽，包含選自下組的源自SIRP α的多肽a)SIRP α 的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 3)；b)SEQID NO 3的片段，和c)與SEQID NO 2具有至少75%同一性的SEQ ID NO 3的變體多肽；其中所述源自SIRPa的多肽結(jié)合人CD47(SEQ ID NO :24)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的可溶性CD47結(jié)合多肽，其中所述可溶性CD47結(jié)合多肽以2μ M或更小的Kd與人CD47結(jié)合，并且如由免疫復(fù)合物刺激的樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞因子釋放檢測(cè)所測(cè)量， 抑制所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的可溶性CD47結(jié)合多肽，其中所述源自SIRPa的多肽是與IgG Fc片段融合的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的可溶性CD47結(jié)合多肽，其中所述IgGFc片段是突變的未糖基化的Fc片段。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽，其中所述SIRPα的胞外結(jié)構(gòu)域包含至少SIRP α的V區(qū)(SEQ ID NO :2)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽，用作治療自身免疫和炎性病癥的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽，用作藥物來(lái)治療a)Th2_介導(dǎo)的氣道炎癥；b)過(guò)敏性病癥；c)哮喘；d)炎性腸?。籩)關(guān)節(jié)炎；f)缺血性疾??；或g)白血病或癌癥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽，其中所述多肽基本上由與人 IgG的Fc片段融合的SIRP α的胞外結(jié)構(gòu)域組成。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽的至少兩種的蛋白質(zhì)。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽或根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)的藥物組合物。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，與一或多種的可藥用賦形劑、稀釋劑或介載體組合。
12.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的可溶性CD47結(jié)合多肽的分離的核酸。
13.包含根據(jù)權(quán)利要求12的一或多種核酸的克隆或表達(dá)載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的克隆或表達(dá)載體，其包含SEQID NO :25或沈的至少一種核酸。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求13或14的一或多種克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作藥物，特別是用于預(yù)防或治療自體免疫和炎性病癥如過(guò)敏性哮喘和炎性腸病的可溶性CD47結(jié)合多肽。本發(fā)明更具體地涉及用作藥物的可溶性CD47結(jié)合多肽，其包含SIRPα(CD172a)的胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合人CD47的功能衍生物。
文檔編號(hào)C12N15/68GK102257001SQ200980151137
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者K·韋爾岑巴赫, M·沃伊塞特施雷格爾, M·薩爾法蒂, M·雷蒙德 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司