專利名稱：減少發(fā)酵過程中的丙二酸副產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明屬于用于在生物發(fā)酵期間基于編碼丙二酰-CoA合成酶的基因表達(dá)來減少有機(jī)酸副產(chǎn)物尤其是丙二酸的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵是通過使用生物催化劑由一種或多種底物產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的工藝，其中生物催化劑可以是整個(gè)微生物、分離的酶、或它們的任何組合。在分批發(fā)酵中，發(fā)酵從培養(yǎng)過程開始，在該過程中培養(yǎng)基接種了所需的微生物。繼而發(fā)生生長或代謝活動(dòng)。該體系內(nèi)的代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)。通常，微生物細(xì)胞的生長速率從靜態(tài)停滯期上升至高生長對數(shù)期(或指數(shù)生長)，最終達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)生長減緩或停止。雖然微生物產(chǎn)物的生成通常在高生長對數(shù)期間發(fā)生，但是由于培養(yǎng)生物的生長，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)耗盡并會(huì)使培養(yǎng)基富含產(chǎn)物(如果產(chǎn)物分泌到體外的話)和副產(chǎn)物，該生長期不能無限延續(xù)下去。除了別的物質(zhì)外，副產(chǎn)物還可包含多糖、碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、鹽和各種有機(jī)酸，所述有機(jī)酸例如乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、延胡索酸、檸檬酸、異檸檬酸、乙醛酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和丙二酸。發(fā)酵是生物合成多種微生物產(chǎn)物的重要技術(shù)，所述微生物產(chǎn)物包括氨基酸、乙醇、多不飽和脂肪酸和抗生素。一些化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)和商業(yè)化已有所報(bào)道(W. Crueger 禾口 A. Crueger, Biotechnology :A Textbook of Industrial Microbiology, Sinauer Associates :Sunderland，MA.，第 124—174 頁(1990) ；B. Atkinson 禾口 F. Mavituna， Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook，第 2 片反；Stockton :New York， 第對3-364頁(1991))。然而，生物催化工藝在很多情況下受到若干熟知的限制因素的影響，這些限制因素可包括1)產(chǎn)物范圍相對較??；幻收率、滴定濃度和生產(chǎn)率低；幻難以從水溶液中回收和純化產(chǎn)物；以及，4)產(chǎn)生有害副產(chǎn)物。因?yàn)楣に囅拗埔蛩卦黾恿怂P(guān)注產(chǎn)物的制造成本，所以將上游代謝工程(即產(chǎn)物合成)與下游生物過程工程(即產(chǎn)物分離和過程設(shè)計(jì))整合對于從工業(yè)發(fā)酵中獲得巨大價(jià)值是極為重要的。雖然各種生物化學(xué)、生理學(xué)和化學(xué)/物理因素可影響生物催化工藝的產(chǎn)量，但是重要的因素包括底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的效率，以及對能量/碳流進(jìn)入產(chǎn)生所關(guān)注產(chǎn)物的生物化學(xué)途徑的優(yōu)化?？紤]到這些因素，已開發(fā)出多種代謝工程技術(shù)，以促進(jìn)所需生物化學(xué)途徑的上調(diào)和不可取生物化學(xué)途徑的下調(diào)，不可取生物化學(xué)途徑例如與所關(guān)注生物合成途徑競爭的那些，或干擾特定終產(chǎn)物生成的那些。本公開涉及在生物發(fā)酵合成產(chǎn)物期間丙二酸副產(chǎn)物的積聚。具體地講，通過如下方式實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率產(chǎn)物和最小化廢棄副產(chǎn)物對生物進(jìn)行工程化改造，使其表達(dá)異源丙二酰-CoA合成酶進(jìn)行如下反應(yīng)丙二酸+ATP+CoA —丙二酰-CoA+AMP+焦磷酸[“PPi”]。副產(chǎn)物丙二酸向丙二酰-CoA的轉(zhuǎn)化允許生物體內(nèi)合成脂肪酸，從而避免發(fā)酵期間不能進(jìn)一步利用的丙二酸“副產(chǎn)物”的積聚。因此避免了生物體內(nèi)碳和能量的浪費(fèi)，減少了發(fā)酵過程期間維持最適PH范圍所需的堿的量，并且減少了發(fā)酵廢氣中需要中和的有機(jī)酸副產(chǎn)物的量。異源丙二酰CoA合成酶預(yù)先在微生物體內(nèi)表達(dá)，從而增加各種聚酮化合物的產(chǎn)量(美國專利6，939，691、美國專利申請公布2003/0073205)。如Lomb0，F(xiàn).等人所概述 (Biotechnol. Prog.，第17卷第4期，第612-617頁(2001))，在天然和異源宿主中聚酮化合物發(fā)酵過程的產(chǎn)量很多情況下受到體內(nèi)前體可用性的限制，該前體衍生自α-羧化CoA硫酯，例如丙二酰-CoA和QS)-甲基丙二酰-CoA。丙二酰-CoA合成酶的表達(dá)可減弱這個(gè)限制并且顯著增加聚酮化合物的產(chǎn)量。上述公開未想到利用異源丙二酰CoA合成酶的表達(dá)來減少丙二酸的產(chǎn)量，從而避免生物對碳和能量的浪費(fèi)。申請人:已經(jīng)解決所述問題，其中丙二酸“副產(chǎn)物”在生物發(fā)酵期間積聚，從而導(dǎo)致碳和能量浪費(fèi)、所關(guān)注產(chǎn)物合成量減少并產(chǎn)生需要中和的廢氣(從而增加制備的總成本)。 本文描述了表達(dá)異源丙二酰CoA合成酶蛋白的新型生物。發(fā)明概述在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于至少一種產(chǎn)物發(fā)酵的轉(zhuǎn)基因生物，該生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，該基因受到至少一種調(diào)控序列的調(diào)控；其中轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的發(fā)酵副產(chǎn)物丙二酸的量與轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的丙二酸的量相比減少，前提條件是所述相同生物a)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，b)包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。優(yōu)選地，生物積聚的油量占其細(xì)胞干重至少約25%。生物選自藻類、真菌、類眼蟲、 酵母、細(xì)菌和原生藻菌(stramenopiIes)。更優(yōu)選地，生物為選自耶氏酵母屬(Yarrowia)、 假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)的含油酵母。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物具有的調(diào)控序列還包含強(qiáng)啟動(dòng)子。在第三實(shí)施方案中，包含至少一個(gè)編碼丙二酰-CoA合成酶的基因的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物可以是多拷貝的。在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶多肽的序列，該多肽具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 禾口 SEQ ID NO :22。在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的序列，其中所述序列選自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :3。在第六實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物的滴度相對于轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物的滴定濃度，未降低，前提條件是所述相同生物a)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
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b)包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物還包含至少一種基因突變。該至少一種基因突變可以造成至少一種天然過氧化物酶體生物發(fā)生(biogenesis)因子蛋白被破壞。在第八實(shí)施方案中，本發(fā)明包括操縱轉(zhuǎn)基因生物中丙二酸含量的方法，該方法包括a)提供轉(zhuǎn)基因生物，該生物用于至少一種產(chǎn)物的發(fā)酵，其中轉(zhuǎn)基因生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，該基因受到合適調(diào)控序列的調(diào)控；以及，b)培養(yǎng)所述生物以允許所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的發(fā)酵副產(chǎn)物丙二酸的量與相同生物產(chǎn)生的丙二酸的量與轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的丙二酸的量相比減少，前提條件是所述生物(i)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，(ii)包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。優(yōu)選地，至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶多肽的基因具有選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO :11、SEQ ID N0:12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22 的氨基酸序列。此外，至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3。在第九實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因耶氏酵母種(Yarrowia sp.)宿主細(xì)胞包含a)至少一種基因突變，其中該突變?yōu)橹辽僖环N天然過氧化物酶體生物發(fā)生因子蛋白中的破壞；以及，b)至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，該基因受到至少一種調(diào)控序列的調(diào)控；以及，c)編碼功能性多不飽和脂肪酸生物合成途徑的基因。附圖簡述和序列表

圖1由圖1A、圖1B、圖IC和圖ID組成，它們一起示出了豌豆根瘤菌蠶豆生物變種 3841 (Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841)丙二酰-CoA合成酶基因(GenBank登錄號YP_766603 ;SEQ ID NO :1)和經(jīng)密碼子優(yōu)化以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) 中表達(dá)的合成基因(SEQ ID NO 3)的DNA序列比對。圖2提供了 pZP2-MCS的質(zhì)粒圖譜。圖3由圖3A和圖;3B組成，它們一起示出了 ω -3/ ω -6脂肪酸生物合成途徑，并且當(dāng)考慮對該途徑的描述時(shí)應(yīng)被視為一起。圖4圖示了解脂耶氏酵母菌株W305的構(gòu)建。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述形成了本申請的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則”("Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25標(biāo)準(zhǔn)(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5. 2和49. 5 (a—bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。SEQ ID NO :1_22是編碼基因或蛋白質(zhì)或質(zhì)粒的開放閱讀框(ORF)，如表1中所示。表1:核酸和蛋白質(zhì)SEQ ID編號摘要
權(quán)利要求
1.用于至少一種產(chǎn)物發(fā)酵的轉(zhuǎn)基因生物，所述生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，所述基因受到至少一種調(diào)控序列的調(diào)控；其中所述轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的發(fā)酵副產(chǎn)物丙二酸的量與轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的丙二酸的量相比減少，前提條件是所述相同生物c)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，d)包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述生物選自藻類、真菌、類眼蟲、酵母、細(xì)菌和原生藻菌。
3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述生物積聚占其細(xì)胞干重至少約25%的量的油。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述生物為含油酵母，所述含油酵母選自耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬 (Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)。
5.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述至少一種調(diào)控序列包括強(qiáng)啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1或5的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因是多拷貝的。
7.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶多肽的序列具有選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO :2, SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18、SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20、SEQ ID NO: 21 禾口 SEQ ID NO :22。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的序列選自 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :3。
9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因生物，其中至少一種產(chǎn)物的滴度相對于轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的所述至少一種產(chǎn)物的滴度未降低，前提條件是所述相同生物c)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，d)包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。
10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述轉(zhuǎn)基因生物還包含至少一種基因突變。
11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因生物，其中所述至少一種基因突變?yōu)樵谥辽僖环N天然過氧化物酶體生物發(fā)生因子蛋白中的破壞。
12.操縱轉(zhuǎn)基因生物中丙二酸含量的方法，所述方法包括a)提供轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物用于至少一種產(chǎn)物的發(fā)酵，其中所述轉(zhuǎn)基因生物包含至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，所述基因受到合適調(diào)控序列的調(diào)控；以及，b)培養(yǎng)所述生物以允許所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因的表達(dá)，使得所述轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的發(fā)酵副產(chǎn)物丙二酸的量與轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的相同生物產(chǎn)生的丙二酸的量相比減少，前提條件是所述相同生物(i)不包含編碼丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，( )包含編碼丙二酰-CoA合成酶但不表達(dá)的基因。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶多肽的基因具有選自 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21 和 SEQ ID NO :22 的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因選自SEQID NO :1 禾口 SEQ ID NO :3。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因生物選自耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
16.轉(zhuǎn)基因耶氏酵母種(Yarrowiasp.)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含d)至少一種基因突變，其中所述突變?yōu)樵谥辽僖环N天然過氧化物酶體生物發(fā)生因子蛋白中的破壞；以及，e)至少一種編碼丙二酰-CoA合成酶的基因，所述基因受到至少一種調(diào)控序列的調(diào)控； 以及，f)編碼功能性多不飽和脂肪酸生物合成途徑的基因。
全文摘要
本發(fā)明描述了在生物發(fā)酵期間基于異源丙二酰-CoA合成酶的表達(dá)來減少副產(chǎn)物有機(jī)酸的量的方法。產(chǎn)生多不飽和脂肪酸[“PUFA”]的所述含油酵母—解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株經(jīng)工程改造表達(dá)異源丙二酰-CoA合成酶基因。所述表達(dá)不會(huì)影響PUFA的產(chǎn)量，但是相比所述不表達(dá)丙二酰-CoA合成酶的親代菌株中產(chǎn)生的丙二酸的量，所述表達(dá)會(huì)導(dǎo)致丙二酸的量減少。
文檔編號C12P7/64GK102257126SQ200980151146
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者Q·Q·朱, Z·薛 申請人:納幕爾杜邦公司