專利名稱：分泌高水平必需氨基酸的耐膽汁芽孢桿菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌組合物，其特征在于在膽汁鹽(模擬的腸道環(huán)境)中快速出芽和生長以及分泌高水平的必需氨基酸。該芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑， 在飼料中其具有益生(健康促進(jìn))作用并增加動(dòng)物飼料中營養(yǎng)的消化和可利用度。
背景技術(shù)：
益生菌諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)在動(dòng)物飼料工業(yè)中用作膳食補(bǔ)充劑。其使用與芽孢桿菌代替或減少在動(dòng)物飼料工業(yè)中用作生長促進(jìn)劑的抗生素的使用的能力有關(guān)。Christian Hansen A/S (丹麥)將此益生的生長促進(jìn)產(chǎn)品的一個(gè)實(shí)例以商品名 GalliPro (保藏號(hào)為DSM 17231)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。GalliPro 為枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞組合物。除了推薦的作用方式以外(例如，免疫調(diào)節(jié)、腸道菌群調(diào)節(jié)劑)，益生的芽孢桿菌能夠產(chǎn)生許多有益的成分，諸如酶類，當(dāng)其用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑時(shí)酶類被分泌至胃腸道 (GIT)中。諸如植酸酶的酶類被分泌并改善動(dòng)物飼料的消化和較好的攝取(更高的消化率)。膳食(飼料)主要為植物來源諸如谷物、玉米、大豆、豆油和氨基酸。所有這些作用都有利于生產(chǎn)低成本的動(dòng)物產(chǎn)品。益生芽孢桿菌(probiotic bacillus)也能夠產(chǎn)生其他有益的成分諸如必需氨基酸。芽孢桿菌孢子可通過酸性胃屏障，并在動(dòng)物的胃腸道(GIT)內(nèi)出芽和生長。此特性具有很大的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楫?dāng)被攝入時(shí)，它們可分泌許多類型的有益成分，例如，細(xì)菌素，并且還分泌有用的必需氨基酸。而且，在飼料粒化過程中，芽孢桿菌孢子是耐熱的，因此其是使細(xì)菌素和例如必需氨基酸都進(jìn)入GIT (胃腸道)的優(yōu)異的遞送系統(tǒng)。在芽孢桿菌在胃腸道中的生存和增殖過程中，膽汁的作用很重要。膽汁在肝臟中產(chǎn)生并儲(chǔ)存在膽囊中。膽汁含有水、卵磷脂、膽紅素和膽綠素以及膽汁鹽。從文獻(xiàn)中知道，膽汁對(duì)芽孢桿菌孢子細(xì)胞在動(dòng)物胃腸道中的生存以及出芽并生長為營養(yǎng)細(xì)胞具有一些負(fù)面影響。因此正在進(jìn)行研究以找到益生的耐膽汁的芽孢桿菌菌株。文章(Antonie Van Leeuwenhoek. 2006Aug ；90 (2) :139-46. Epub 2006 年 7 月 4 日)說明了直接從雞腸中分離許多芽孢桿菌標(biāo)本/細(xì)胞。檢測(cè)分離的芽孢桿菌細(xì)胞的益生活性。檢測(cè)具有最高益生活性的6種芽孢桿菌的耐膽汁鹽性，并且發(fā)現(xiàn)一株特定的高益生性的芽孢桿菌具有相對(duì)高水平的耐膽汁鹽性。在此文章中沒有特別地將重點(diǎn)集中在檢測(cè)耐膽汁性的任何時(shí)段。在實(shí)驗(yàn)部分， 僅在膽汁鹽存在5天后檢測(cè)了芽孢桿菌孢子細(xì)胞的耐受性(見141頁的段落“Simulated small intestinal fluid tolerance test”( “模擬的小腸液耐受試驗(yàn)”))。US2003/0124104A說明了益生的常規(guī)芽孢桿菌內(nèi)生孢子對(duì)低濃度的膽汁鹽敏感， 即，甚至低濃度的膽汁鹽的存在都會(huì)抑制孢子出芽和/或再水化。這與其他細(xì)菌諸如腸道病原體，諸如大腸桿菌或金黃色葡萄球菌相反(見段落W014]至W015])。就此而言，建議篩選/選擇對(duì)膽汁鹽的抑制性活性具有抗性并因此能出芽成為營養(yǎng)細(xì)胞，然后在結(jié)腸定植的芽孢桿菌孢子(見W019])。在該說明書中提供的都是工作實(shí)施例，沒有提供實(shí)際篩選的具體芽孢桿菌細(xì)胞的真實(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，膽汁鹽篩選條件的說明是相對(duì)概括的。具體地，沒有指出選擇耐膽汁性的任何時(shí)段。換句話說，基于此文獻(xiàn)的粗略或概括性的說明，可選擇僅可緩慢生長(出芽)的芽孢桿菌細(xì)胞，即，能夠在相應(yīng)量的膽汁鹽的存在下在例如20小時(shí)后從孢子出芽成為營養(yǎng)細(xì)胞的芽孢桿菌細(xì)胞。在此文獻(xiàn)中，沒有對(duì)選擇快速生長(出芽)的芽孢桿菌細(xì)胞，即，能夠在相應(yīng)量的膽汁鹽的存在下在特定時(shí)間間隔內(nèi)達(dá)到規(guī)定生長點(diǎn)的從孢子出芽并生長為營養(yǎng)細(xì)胞的芽孢桿菌細(xì)胞有任何描述或建議?？傊?，關(guān)于耐膽汁芽孢桿菌細(xì)胞的選擇/篩選的現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)沒有集中在從孢子細(xì)胞快速生長/出芽成為芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/EP2008/057296的國際PCT申請(qǐng)于11/06/2008提交。申請(qǐng)人為Chr. Hansen A/S且該申請(qǐng)?jiān)诒旧暾?qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)沒有公開。PCT/EP2008/057296描述了新的芽孢桿菌孢子，其特征在于在膽汁鹽培養(yǎng)基的存在下其具有增加的/快速的從孢子出芽和生長為營養(yǎng)細(xì)胞的速度。本文所述的芽孢桿菌孢子具有如PCT/EP2008/057296中所述同樣的增加的/快速的從孢子出芽和生長為營養(yǎng)細(xì)胞的速度。PCT/EP2008/057296僅描述了與參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467相比產(chǎn)生增加量的植酸酶的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。沒有記載且沒有提示篩選與參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467相比產(chǎn)生較多量的必需氨基酸的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)下面的描述提及現(xiàn)有技術(shù)時(shí)，其應(yīng)當(dāng)被理解為在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)公眾可以獲得的現(xiàn)有技術(shù)(例如，發(fā)表的文章/公布的專利)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種芽孢桿菌組合物，其在動(dòng)物的胃腸道(GIT)中分
泌大量的必需氨基酸。該技術(shù)方案基于本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種用于鑒定的新的改良芽孢桿菌組合物的新選擇方法。本文所述的新選擇方法的新的重要步驟是特異地篩選/選擇在膽汁鹽的存在下具有增加的/快速的從孢子出芽并生長為營養(yǎng)細(xì)胞的速度的芽孢桿菌孢子細(xì)胞。如上所述，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)說明了用于篩選能夠在膽汁鹽的存在下生長的芽孢桿菌的方法，但現(xiàn)有技術(shù)的篩選/選擇方法沒有將重點(diǎn)集中于在膽汁鹽的存在下出芽并生長的速度。因此，現(xiàn)有技術(shù)中篩選的耐膽汁細(xì)胞出芽并生長不足以快到符合本文所述出芽并生長的速度標(biāo)準(zhǔn)。例如，在腸道環(huán)境中從例如雞腸中直接分離的芽孢桿菌細(xì)胞(如，例如在上面討論的Antonie Van Leeuwenhoek的文章中所述)沒有被選擇(在常壓下)為在腸內(nèi)快速地出芽并生長。
如在本文中的工作實(shí)施例中所示，對(duì)于市售的芽孢桿菌組合物GalliPro 也是如此，在生理水平的膽汁鹽的存在下，其出芽和生長太緩慢，并在第一個(gè)20小時(shí)內(nèi)不能達(dá)到規(guī)定的生長點(diǎn)，不符合本文所述的出芽并生長的速度標(biāo)準(zhǔn)。GalliPro .是在商業(yè)上成功的一種枯草芽孢桿菌組合物。通過使用GalliPro 作為起始菌株以及如本文所述的選擇壓力法和隨后的分離在膽汁鹽的存在下快速地從孢子出芽并生長成為營養(yǎng)細(xì)胞的菌株而選擇了本文所述的新的DSM 19467。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見表1 (在本文中GalliPro 也可稱為DSM 17231)。在本文的圖1中對(duì)此進(jìn)行了示意性地圖示?？傊嘈努F(xiàn)有技術(shù)中沒有說明一種分離的芽孢桿菌組合物，其包括IO5-IO12CFU/ g芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌組合物的細(xì)胞符合如本文所述的在膽汁鹽的存在下快速出芽并生長的標(biāo)準(zhǔn)。不限于理論，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出快速出芽和生長是本發(fā)明的一個(gè)非常重要的方面，因?yàn)檠挎邨U菌孢子對(duì)膽汁有耐受性，但不能足夠快速的出芽和生長，會(huì)在芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞大量產(chǎn)生任何顯著的積極特性諸如產(chǎn)生必需氨基酸之前被排泄掉。出芽太緩慢的芽孢桿菌孢子在細(xì)菌可產(chǎn)生任何大量的例如必需氨基酸之前僅僅通過胃腸道(GIT)。在進(jìn)行了大量詳盡的試驗(yàn)和分析后，本發(fā)明人因此選擇在最多達(dá)20小時(shí)的時(shí)間范圍進(jìn)行工作，并且選擇在此時(shí)段內(nèi)在很高的生理濃度的膽汁鹽的存在下最快出芽和生長的孢子。不限于理論并基于本文詳細(xì)公開的試驗(yàn)工作，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在4和6mM膽汁鹽的存在下，分別在第一個(gè)18和19小時(shí)內(nèi)快速出芽和生長是很重要的。本發(fā)明人然后鑒定出一旦選擇出在膽汁鹽培養(yǎng)基中快速出芽和生長的芽孢桿菌細(xì)胞，這些細(xì)胞非常有用的用作起始細(xì)胞用于突變以獲得具有提高的必需氨基酸產(chǎn)量的新細(xì)胞。如在圖1和實(shí)施例4中示意性圖示的那樣，快速生長的耐膽汁選擇株DSM 19467 用作起始菌株用于典型突變，并且選擇出高必需氨基酸產(chǎn)量的菌株。在實(shí)施例4中可以看出，一些選擇株產(chǎn)生的必需氨基酸亮氨酸是DSM 19467和GalliPro 的至少5倍多。由此本文公開的新的益生芽孢桿菌細(xì)胞是一種耐膽汁的，快速出芽和生長的，并且分泌大量必需氨基酸的芽孢桿菌細(xì)胞。獲得的菌株非常有用的用作添加至動(dòng)物飼料中的益生芽孢桿菌組合物。其綜合了益生菌在動(dòng)物的腸道(存在高膽汁鹽水平)中生存和增殖， 抑制病原菌(產(chǎn)生細(xì)菌素)，并另外地分泌大量有益的必需氨基酸的所有有益能力。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種芽孢桿菌組合物，其包含105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中芽孢桿菌組合物的特征在于(i)芽孢桿菌孢子在包含4和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速出芽和生長為營養(yǎng)細(xì)胞，其中快速出芽和生長定義為芽孢桿菌孢子分別在小于18小時(shí)和19 小時(shí)內(nèi)達(dá)到0. 40D630的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，其中營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是生長曲線中OD值開始以連續(xù)的方式增加(由營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)并達(dá)到0D630為0. 4的點(diǎn)；(I)其中膽汁鹽培養(yǎng)基是本文實(shí)施例1的補(bǔ)充了膽汁鹽混合物的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養(yǎng)基，所述膽汁鹽混合物包括結(jié)合型膽汁鹽?；敲撗跄懰猁}和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結(jié)合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60%的?；敲撗跄懰猁}、 30%的甘氨脫氧膽酸鹽和10%的脫氧膽酸鹽；以及
其中OD測(cè)定分析通過下列步驟進(jìn)行(a)在微量滴定板的孔內(nèi)裝入0. 150ml的每ml培養(yǎng)基IO8芽孢桿菌孢子的膽汁鹽培養(yǎng)基(S卩，此為零時(shí)刻)；以及(b)將滴定板在37°C下在大氣條件下孵育，使用分光光度計(jì)測(cè)定OD63tl值并在每次讀數(shù)之前攪動(dòng)，從而獲得代表性的隨時(shí)間變化的生長曲線；以及(ii)芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生至少一種必需氨基酸的量高于參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467，其中產(chǎn)生的必需氨基酸的量在本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)已知低鹽生長培養(yǎng)基 (Minimal Salts Growth Medium)中在37°C下生長2天后通過本文實(shí)施例2的基于標(biāo)準(zhǔn) GC-MS法的氨基酸測(cè)定法來測(cè)定。如上所述，通過使用GalliPro 作為起始菌株選擇在膽汁鹽的存在下的快速出芽和生長的參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467。未選擇出DSM 19467的必需氨基酸產(chǎn)量有提高。 不限于理論，相信DSM 19467的與本文相關(guān)的必需氨基酸產(chǎn)量與GalliPro ^B當(dāng)。關(guān)于第(i)項(xiàng)，GalliPro 的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)為在4和6mM膽汁鹽中孵育后的至少 20小時(shí)，并且對(duì)于新的DSM 19467株，如本文所述，其營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)在4和6mM膽汁鹽中分別在14和15小時(shí)后(見本文的圖2和工作實(shí)施例3)。在此要注意，本發(fā)明人還測(cè)試了市售產(chǎn)品CALSPORIN (Calpis Co.，Ltd.， 日本)以測(cè)定在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。如同GalliPro , 市售產(chǎn)品CALSPORIN 是用作益生飼料添加劑的一種枯草芽孢桿菌組合物。對(duì)于 CALSPORIN ,在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)在4和6mM膽汁鹽中分別為20小時(shí)以上。這大大超過了在第⑴項(xiàng)中所需的18和19小時(shí)，并且此說明，迄今為止，沒有一種市售產(chǎn)品能被選擇用于快速出芽和生長。如上所述，“天然”芽孢桿菌細(xì)胞不能在任何選擇壓力下快速出芽和生長。不限于理論，因此相信“天然”芽孢桿菌細(xì)胞不符合第一方面的第(i)項(xiàng)的條件。[第⑴項(xiàng)]的耐膽汁性測(cè)定和[第(ii)項(xiàng)]的必需氨基酸測(cè)定都基于已知的市售的標(biāo)準(zhǔn)要素(諸如，例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、膽汁鹽；標(biāo)準(zhǔn)OD測(cè)定法和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè))。參照芽孢桿菌細(xì)胞保藏為DSM 19467，因此是公眾可以得到的?？莶菅挎邨U菌細(xì)胞GalliPro 保藏為DSM 17231 (命名為“GalliPro ”)，并且因此也是公眾可以獲得的。因此，基于本文詳細(xì)的測(cè)定說明(見，例如，本文實(shí)施例1的耐膽汁性測(cè)定和本文實(shí)施例2的必需氨基酸測(cè)定)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)這些測(cè)定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌細(xì)胞是否符合本發(fā)明的第一方面的[第(i)項(xiàng)]的耐膽汁性和[第(ii) 項(xiàng)]的必需氨基酸水平。如本文所述的新芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料的益生補(bǔ)充劑。劑量和施用可根據(jù)本領(lǐng)域，例如現(xiàn)有技術(shù)GalliPro 芽孢桿菌組合物所采用的方案來進(jìn)行。因此，本發(fā)明的第二方面涉及一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關(guān)實(shí)施方案的芽孢桿菌組合物連同其他動(dòng)物飼料成分給予動(dòng)物。本發(fā)明的第三方面涉及一種篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a):從單芽孢桿菌孢子細(xì)胞的集合體內(nèi)篩選并分離出新芽孢桿菌孢子細(xì)胞，該新芽孢桿菌孢子細(xì)胞能夠快速地出芽和生長，使得其在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下在小于 18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)；(b)從步驟(a)的分離孢子細(xì)胞制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，并且將選擇和分離的新細(xì)胞突變以得到新芽孢桿菌單營養(yǎng)細(xì)胞的集合體；(c)從步驟(b)的新芽孢桿菌單營養(yǎng)細(xì)胞的集合體中選擇和分離能夠在第一方面的第(ii)項(xiàng)的條件下比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生更高量的至少一種必需氨基酸的新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞；以及(d)分析步驟(C)的高產(chǎn)的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞以確認(rèn)其保持了步驟(a)的快速的出芽和生長，并分離所述被選擇的細(xì)胞。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，一旦本發(fā)明人在本文中公開了相關(guān)的檢測(cè)測(cè)定法(特別是實(shí)施例1的用于檢測(cè)快速出芽和生長的測(cè)定法)加上參照菌株DSM 19467，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，選擇符合本文第一方面的標(biāo)準(zhǔn)的其他新的芽孢桿菌細(xì)胞將是常規(guī)的工作。如本文所討論的，通過使用如本文所述的新的篩選/選擇方法，本發(fā)明人已經(jīng)選擇和分離了許多新的改良芽孢桿菌細(xì)胞。下面僅通過實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方案。定義本文相關(guān)術(shù)語的所有定義均與本文相關(guān)技術(shù)內(nèi)容所屬領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員所
理解的一致。本文中術(shù)語“芽孢桿菌細(xì)胞”是指芽孢桿菌孢子細(xì)胞和芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。關(guān)于芽孢桿菌孢子細(xì)胞，本文中術(shù)語“芽孢桿菌孢子”所指的孢子根據(jù)本領(lǐng)域其特征可以是由芽孢桿菌產(chǎn)生的休眠的、堅(jiān)韌的、非生殖的結(jié)構(gòu)。孢子的主要功能通常是在環(huán)境應(yīng)激期間確保細(xì)菌的生存。因此它們對(duì)紫外線和Y射線照射、干燥、溶菌酶、溫度、饑餓和化學(xué)消毒劑有耐受性。孢子通常見于土壤和水中，它們?cè)诖丝梢陨婧荛L的時(shí)間。孢子殼對(duì)許多毒性分子不通透，并且還含有參與出芽的酶類。核心具有正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，諸如DNA和核糖體，但是代謝不活躍的。當(dāng)細(xì)菌檢測(cè)到環(huán)境條件變得不利時(shí)，它可啟動(dòng)孢子形成過程， 需要大約8小時(shí)。術(shù)語“芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞”是指功能性營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞，其可分裂產(chǎn)生更多的營養(yǎng)細(xì)胞。術(shù)語“出芽和生長”是指芽孢桿菌孢子出芽并生長為芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，當(dāng)條件有利時(shí)發(fā)生孢子的復(fù)活，并涉及出芽和生長。出芽是指休眠孢子開啟代謝活性并由此打斷休眠。其普遍的特征在于孢子殼的破裂或吸收，孢子的腫脹，代謝活性的增加，以及對(duì)環(huán)境應(yīng)激的耐受性喪失。生長在出芽之后發(fā)生，并涉及孢子核心制造新的化學(xué)成分并脫離老的孢子殼以發(fā)育成為功能性營養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，該營養(yǎng)細(xì)胞分裂以產(chǎn)生更多的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞的生長曲線(0D隨時(shí)間變化)顯示不同的生長期。當(dāng)孢子被轉(zhuǎn)移至富營養(yǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，開始出芽，緊接著OD暫時(shí)下降(I期)，這是由于吡啶二羧酸的釋放以及因此孢子殼的水合作用而造成的。在第二期(II期=生長期)中，有一個(gè)時(shí)期OD的變化相對(duì)小，直至孢子發(fā)育成為功能性營養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，該營養(yǎng)細(xì)胞可分裂以產(chǎn)生更多的細(xì)胞，從而使
8OD值連續(xù)增加。當(dāng)OD值開始持續(xù)增加達(dá)到0. 4的OD時(shí)的點(diǎn)，在本文中被稱為“營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)”。術(shù)語“光密度”被定義為使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度的指標(biāo)。光密度(OD)是光學(xué)元件對(duì)給定波長λ每單位距離的吸光度。如果，例如，OD在波長630nm下測(cè)定，則其可稱為 OD630。


圖1 在此圖中，圖示了得到本文的新的改良株的步驟。本文的工作實(shí)施例從DSM 17231 (GalliPro )開始，其被典型地突變并篩選/選擇在膽汁鹽的存在下快速出芽并生長以得到新的選擇株DSM 19467。DSM 19467用作用于典型突變的起始菌株，并選擇高必需氨
基酸產(chǎn)量的菌株。圖加和2b 這些圖清楚地顯示與DSM 17231相比，在如本文所述的4和6mM膽汁鹽的存在下，本發(fā)明的DSM 19647芽孢桿菌孢子較快地出芽和生長。
具體實(shí)施例方式芽孢桿菌組合物術(shù)語“芽孢桿菌組合物”應(yīng)該根據(jù)本領(lǐng)域進(jìn)行理解。在本文中其被理解為包括許多具有目的特性的芽孢桿菌孢子細(xì)胞的芽孢桿菌組合物。芽孢桿菌組合物可包含不同類型的芽孢桿菌細(xì)胞(例如，枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本質(zhì)上，該組合物應(yīng)當(dāng)簡單地包括一定量的本文第一方面中指定的芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞符合第一方面中指定的標(biāo)準(zhǔn)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，本文中市售的相關(guān)芽孢桿菌孢子細(xì)胞組合物通常通過發(fā)酵來制備。獲得的孢子細(xì)胞通過被濃縮、干燥、與載體混合并被包裝在合適的容器中。組合物的適當(dāng)?shù)?，例如?05-1012CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞可以本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的市售的適當(dāng)形式存在。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞作為干燥的 (例如，噴霧干燥的)細(xì)胞或作為冷凍的孢子細(xì)胞存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌組合物包括106_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，更優(yōu)選107-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞。術(shù)語“CFU/g”是指組合物中諸如包括存在的合適的相關(guān)添加劑的組合物的克重量。其不包括用來包裝芽孢桿菌組合物的合適容器的重量。一個(gè)實(shí)施方案涉及芽孢桿菌組合物被包裝在合適的容器中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，市售的相關(guān)細(xì)菌組合物通常還包括其他相關(guān)的添加劑諸如，例如，屬于乳清、乳清滲透物、碳酸鈣/石灰石和防結(jié)塊劑諸如硅酸鋁和硅藻土的一種載體/成分。除了本文的相關(guān)芽孢桿菌細(xì)胞以外，組合物還包含其他相關(guān)的目的微生物，諸如， 例如，目的乳酸菌。芽孢桿菌細(xì)胞
芽孢桿菌細(xì)胞可以是任何相關(guān)的目的芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是選自下列芽孢桿菌種的至少一種芽孢桿菌細(xì)胞枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、單鞭毛枯草芽孢桿菌(Bacillus uniflagellatus)，側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)、側(cè)孢芽孢桿菌B0D、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)、凝固芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。最優(yōu)選的是其中芽孢桿菌細(xì)胞是枯草桿菌細(xì)胞。辦棚日龍丨屮擺·如上所述，第一方面的第(i)項(xiàng)的耐膽汁性測(cè)定基于已知的市售標(biāo)準(zhǔn)要素(諸如， 例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、膽汁鹽；標(biāo)準(zhǔn)OD測(cè)定法)。因此，基于本文詳細(xì)的測(cè)定說明(見，例如本文的實(shí)施例1)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)該測(cè)定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌孢子細(xì)胞是否符合如第(i)項(xiàng)中所述的從孢子快速出芽并生長為營養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。在第(i)項(xiàng)中，解釋了營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是在生長曲線中從對(duì)應(yīng)于0.2-0. 3左右的 OD的IO8孢子/ml開始直至OD值已經(jīng)以連續(xù)方式增加(由于營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)，并達(dá)到OD 0.4的點(diǎn)。如本文所解釋的，其與本領(lǐng)域技術(shù)人員如何理解此營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)一致， 并基于生長曲線，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地確定此生長點(diǎn)，在約士30分鐘的有限誤差范圍內(nèi)。本文的工作實(shí)施例1提供了適于選擇在膽汁鹽的存在下快速出芽和生長的耐膽汁性測(cè)定的詳細(xì)描述。此實(shí)施例1的詳細(xì)條件是確定目的芽孢桿菌孢子細(xì)胞是否符合第一方面的第(i)項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)選測(cè)定法。術(shù)語“膽汁鹽”是指膽汁酸的鹽。膽汁酸是主要在哺乳動(dòng)物的膽汁中發(fā)現(xiàn)的類固醇酸。它們通過膽固醇的氧化在肝內(nèi)產(chǎn)生，并儲(chǔ)存在膽囊中并以鹽的形式分泌至腸內(nèi)。它們用作表面活性劑、乳化脂質(zhì)并協(xié)助其吸收和消化。模擬豬膽汁鹽的生理濃度和組合物制備用于實(shí)施例1中的膽汁鹽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，與鳥類膽汁鹽組合物相比，豬膽汁鹽組合物在本文中可被認(rèn)為是相對(duì)“苛刻”的條件。術(shù)語“膽汁鹽培養(yǎng)基”是指包含相關(guān)的芽孢桿菌生長成分諸如相關(guān)的養(yǎng)分和膽汁鹽的培養(yǎng)基。營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)-在膽汁鹽測(cè)定中-第一方面的第(i)項(xiàng)如上所述，關(guān)于第一方面的第(i)項(xiàng)，如本文所述，芽孢桿菌孢子細(xì)胞從孢子出芽并生長成為營養(yǎng)細(xì)胞的速度很快使得它們?cè)?和6mM膽汁鹽中分別在少于18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到0. 40D的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。如上所述，新的DSM 19467株在4和6mM膽汁鹽中分別在孵育14和15小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌孢子在4 和6mM膽汁鹽中分別在孵育17和18小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，更優(yōu)選在第一方面的第 ⑴項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌孢子在4和6mM膽汁鹽中在孵育15和16小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生 "be 點(diǎn) ο如上所解釋以及在圖1中示意性的顯示，本文所述的新的DSM 19467株是通過使用市售的GalliPro 作為起始菌株如本文所述在膽汁鹽的存在下進(jìn)行突變并選擇快速的生長而被選擇。 GalliPro 是一種包含枯草芽孢桿菌細(xì)胞的組合物，并且該枯草芽孢桿菌被保藏為DSM 17231。因此，在本文中GalliPro 可被看作是參照菌株。如上所述，GalliPro 的營養(yǎng)細(xì)胞生長起始點(diǎn)為在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下在4和6mM膽汁鹽中孵育20小時(shí)后。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 ( “GalliPro ”)的參照枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少3小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，更優(yōu)選在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 (“GalliPro ”)的參照枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少4小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，且最優(yōu)選在第一方面的第(i)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM 17231 (“GalliPro ”)的參照枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少5小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長起始點(diǎn)ο必需氨基酸如本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的那樣，必需氨基酸可以是選自由下列組成的組的必需氨基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，必需氨基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需氨基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，必需氨基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。一種與本文非常相關(guān)的必需氨基酸是亮氨酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞可以產(chǎn)生較高量的多于一種的必需氨基酸，諸如，例如，較高量的兩種或三種或更多種不同的必需氨基酸。氨基酸測(cè)定如上所述，第一方面的第(ii)項(xiàng)的氨基酸測(cè)定基于標(biāo)準(zhǔn)已知的市售要素(諸如， 例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè))。因此，基于本文詳細(xì)的測(cè)定說明(見，例如，本文的實(shí)施例幻，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)該測(cè)定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞是否符合如第(ii)項(xiàng)中所述的必需氨基酸產(chǎn)生量。本文的工作實(shí)施例2提供了必需氨基酸測(cè)定的詳細(xì)描述。此實(shí)施例2的詳細(xì)條件在本文中是優(yōu)選的必需氨基酸測(cè)定以確定目的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞是否符合第一方面的第(ii)項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)。- m-^mmm ( )工頁
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關(guān)于第一方面的第(ii)項(xiàng)，在第一方面的第(ii)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生多至少2倍量的一種必需氨基酸。在關(guān)于第一方面的第(ii)項(xiàng)的更優(yōu)選實(shí)施方案中，在第一方面的第(ii)項(xiàng)的條件下，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生多至少4倍量的一種必
需氨基酸。鮮賄斬好· /會(huì)合狗力_誠如上所述，本發(fā)明的第二方面涉及一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關(guān)實(shí)施方案的芽孢桿菌組合物連同其他動(dòng)物飼料成分給予動(dòng)物。動(dòng)物可以是任意的目的動(dòng)物。優(yōu)選地，動(dòng)物是選自家禽、反芻動(dòng)物、牛、豬、兔、馬、 魚和寵物的動(dòng)物。當(dāng)給予根據(jù)本領(lǐng)域的GalliPro 時(shí)，正常以約l04-l08CFU/g飼料，通常以一餐 105-106CFU/g飼料的劑量或以與正常攝食量/kg動(dòng)物活重相當(dāng)?shù)膭┝客瓿伞？蛇x地，芽孢桿菌孢子可以下列方式之一給予動(dòng)物(1)將其放入動(dòng)物飲用水中；O):噴霧至動(dòng)物體表；或(3)經(jīng)糊劑、凝膠或大丸劑應(yīng)用。篩詵和分離新的芽孢桿菌細(xì)胞的方法如上所述，第三方面涉及篩選和分離新的芽孢桿菌細(xì)胞的方法。在第三方面的方法中，選擇能夠滿足第一方面的第(i)項(xiàng)和第(ii)項(xiàng)的條件的芽孢桿菌細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本文詳述的具體的耐膽汁性和必需氨基酸量測(cè)定 (見，例如，本文的用于耐膽汁性測(cè)定的實(shí)施例1和本文的用于必需氨基酸測(cè)定的實(shí)施例2) 參數(shù)可被改變成替代的篩選方法，該方法仍然能獲得如本文所述的主要目標(biāo)，即，能夠滿足第一方面的第(i)項(xiàng)和第(ii)項(xiàng)的條件的芽孢桿菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)施例1的耐膽汁性測(cè)定用于第三方面的篩選方法的步驟 (a)中，且實(shí)施例2的必需氨基酸測(cè)定用于第三方面的篩選方法的步驟(c)中。在第三方面的步驟(d)中，分離營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞。此營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞可用來制備芽孢桿菌孢子形式。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，緊接著第三方面的篩選方法之后是額外步驟(e)，其中步驟(d)的分離的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞被發(fā)酵以制成IO5-IO12芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，且這些 IO5-IO12芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞用來制成IO5-IO12芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其被分離以得到芽孢桿菌組合物，該組合物包含105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞。步驟(e)的最終結(jié)果是新的芽孢桿菌組合物，該組合物包含105_1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，并且其中芽孢桿菌細(xì)胞能夠滿足第一方面的第(i)項(xiàng)和第(ii)項(xiàng)的條件。因此，本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的方面涉及一種芽孢桿菌組合物，該組合物包括 105-l(^CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，并且其中芽孢桿菌細(xì)胞能夠滿足第一方面的第(i)項(xiàng)和第(ii)項(xiàng)的條件，該細(xì)胞可通過第三方面的篩選方法緊接著上述的額外步驟(f)而獲得。在第三方面的篩選方法的步驟(b)中，對(duì)以前選擇的耐膽汁芽孢桿菌細(xì)胞進(jìn)行突變以在步驟(C)中選擇高必需氨基酸產(chǎn)量的細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，例如，此步驟可通過基因特異性交換的典型突變(例如通過化學(xué)處理或UV)以制成所謂的基因修飾生物(GMO)。保藏的菌株一株新枯草芽孢桿菌菌株的樣品已經(jīng)被保藏在DSMZ(DeutSChe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg lb, D_38124Braunschweig), 保藏號(hào)為DSM 19467，保藏日為2007年6月27日。已經(jīng)在國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條件下進(jìn)行了保藏。實(shí)施例實(shí)施例1 耐膽汁性測(cè)定培養(yǎng)基培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)非選擇性市售培養(yǎng)基小牛肉浸出液肉湯(VIB) (Difco, 234420)。在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)，來自供應(yīng)商BD Diagnostic Systems (www. bd. com)的產(chǎn)品目錄(“DifCoTM/BBLTM手冊(cè))關(guān)于小牛肉浸出液肉湯是如此敘述的“來自瘦小牛肉和蛋白胨的浸出液提供小牛肉浸出液中的氮、微生物、碳和氨基酸。氯化鈉維持制劑的滲透壓平衡”；以及根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書通過下列步驟制備培養(yǎng)基將25g小牛肉浸出液肉湯粉懸浮在IL純水中(2. 5%溶液)，加熱并頻繁攪動(dòng)，煮沸1分鐘以完全地溶解粉末。2. 5%小牛肉浸出液肉湯溶液每升包含瘦小牛肉，浸出液IOg月示蛋白胨IOg氯化鈉5g培養(yǎng)基被分配至無菌瓶中并在121°C下高壓滅菌15min。膽汁鹽溶液/培養(yǎng)基模擬豬膽汁中膽汁鹽的生理組成和濃度制備膽汁鹽混合物，且膽汁鹽溶解在如上制備的小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基中以得到膽汁鹽的終濃度為8mM。結(jié)合型膽汁鹽為?；敲撗跄懰猁}(Sigma T-0875，美國)和甘氨脫氧膽酸鹽 (Sigma G-9910，美國)以及去結(jié)合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽(Sigma D-5670美國)，且最終的 8mM混合膽汁鹽溶液含有60%?；敲撗跄懰猁}，30%甘氨脫氧膽酸鹽和10%脫氧膽酸鹽。 使用氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)至PH 7. 4，然后在121°C下高壓滅菌15分鐘。將此制備的SmM膽汁鹽培養(yǎng)基稀釋以得到0、1、2、4、6和SmM的膽汁鹽濃度。膽汁鹽以濃縮形式加至小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基中。因此，瘦小牛肉浸出液、月示蛋白胨和氯化鈉的最終量與在加入膽汁鹽之前的2. 5%小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基基本相同。孢子混懸液為了區(qū)分營養(yǎng)細(xì)胞和孢子，并確保純孢子產(chǎn)品用于接種，使用在80°C下+/_熱處理IOmin測(cè)定芽孢桿菌產(chǎn)品的孢子計(jì)數(shù)。在熱處理并隨后冷卻至室溫后，在蛋白胨鹽水溶液中進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋。從適當(dāng)?shù)氖断♂屢褐腥?. Iml接種至雙份的胰蛋白血瓊脂板 (Difco 0232-01)中。這些板在37°C下孵育至第二天?；谙惹爱a(chǎn)品的孢子計(jì)數(shù)測(cè)定，在無菌蒸餾水中制備孢子混懸液以達(dá)到最終計(jì)算的孢子濃度108CFU/ml。使用上述的方法測(cè)
13定最終接種物中營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的計(jì)數(shù)。108CFU/ml的終濃度對(duì)應(yīng)于起始OD63tlO. 2-0. 3。生長測(cè)定光密度測(cè)定使用無菌平底96孔微量滴定板(Greiner Bio-one GmbH，德國)。每個(gè)孔填充以 0. 150ml接種了孢子( 1 X IO8孢子/ml相當(dāng)/相當(dāng)于起始OD63tl 0. 2-0. 3)的VIB，滴定板在37°C下孵育20小時(shí)，每次讀數(shù)前用強(qiáng)度4(高)的周期振搖1分鐘。為了避免在滴定板蓋的內(nèi)側(cè)上發(fā)生凝聚，蓋子與Triton X-100的稀釋溶液接觸。芽孢桿菌菌株的出芽和生長動(dòng)力學(xué)使用分光光度計(jì)(Bio-tek Instruments, Inc. VE)在波長630nm(0D63CI)下測(cè)定。以10分鐘的間隔進(jìn)行讀數(shù)，并使用KC4 軟件(Bio-tek Instruments, Inc.，USA)分析。20h后，數(shù)據(jù)輸出至Excel 電子表格程序以進(jìn)一步分析，輸入至SAS 9. 0版并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)施例2 氨基酸測(cè)定在本研究中使用的測(cè)定和定量由芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的氨基酸的方法是用于含水樣品的標(biāo)準(zhǔn)GC-MS法，該方法使用氯甲酸甲酯作為衍生化試劑。芽孢桿菌細(xì)胞的生長芽孢桿菌細(xì)胞接種并生長在低鹽生長培養(yǎng)基(Minimal Salts Growth Medium) 37°C，150rpm下，并生長2天，然后如下所述在測(cè)量上清液中氨基酸的量。芽孢桿菌細(xì)胞在具有下列組成的根據(jù)Chapman(197》的低鹽培養(yǎng)基中繁殖(NH4)2S04 (Merck 1.01217.1000) lg/1
K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) 7g/1
KH2PO4 (Merck 1.04873.1000) 3g/l
MgSO4-Vmo (Merck 1.05886.1000)0.1g/1在121°C下高壓滅菌15min，并加入高壓滅菌的葡萄糖至0.5%的終濃度。在含有IOml培養(yǎng)基的試管中在37°C和150rpm下完成2天的孵育。氨基酸測(cè)定對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行氨基酸測(cè)定，因?yàn)榘被岱置谥僚囵B(yǎng)基中。樣品經(jīng)過濾滅菌并保持在-20°C直至進(jìn)行分析。試劑試劑1 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液。正纈氨酸ImM :0. 0172g正纈氨酸+IOOmlMQW試劑2 甲醇 / 吡啶 32/8 (v/v)(催化劑(Catalysator))試劑3 分析用(p. a.)氯甲酸甲酯(MCF)(衍生化試劑)試劑4 :1%MCF/CHC13(v/v)(萃取)1ml分析用氯甲酸甲酯+氯仿補(bǔ)充至1000ml。樣品制劑·將150 μ 1(25 μ 1+125 μ MQff)樣品吸移至2ml注射瓶中。·加入 150 μ 1 IS。·加入200 μ 1 1-甲醇/吡啶32/8% (ν/ν)。充分混合。·加入25 μ 1 MCF (氯甲酸甲酯)。充分混合直至出現(xiàn)氣體產(chǎn)生。
加入500μ 1 1%MCF/CHC13(V/V)，蓋帽并劇烈混合。在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)相分離。如果相分離太慢，則將該瓶離心(500rpm/10min)。如果使用正纈氨酸作為抗代謝物，則應(yīng)當(dāng)更換使用外標(biāo)準(zhǔn)或另一種合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，并且用MQW或樣品代替150 μ 1 IS。樣品在GC-MS上運(yùn)行，使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸柱和試驗(yàn)方案。實(shí)施例3 耐膽汁枯草芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467的選擇起始芽孢桿菌細(xì)胞為枯草芽孢桿菌細(xì)胞GalliPro 。GalliPro 被誘變以得到新的單個(gè)芽孢桿菌細(xì)胞的集合體。制備并選擇如上面實(shí)施例1中所述在包含4和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速出芽和生長為營養(yǎng)細(xì)胞的孢子。選擇出枯草芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467。下面的表1顯示了出芽和生長數(shù)據(jù)。從對(duì)應(yīng)于l(fCFU/ml的OD 0. 2-0. 3達(dá)到OD 0. 4的時(shí)間(小時(shí))(3次重復(fù)的均數(shù))。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌組合物，包含105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌組合物的特征在于(i)所述芽孢桿菌孢子在包含4mM和6mM膽汁鹽的膽汁鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速地出芽和生長為營養(yǎng)細(xì)胞，所述快速出芽和生長定義為所述芽孢桿菌孢子分別在小于18 小時(shí)和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到0. 40D630的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，其中所述營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是生長曲線中 OD值開始以連續(xù)的方式增加(由所述營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)并達(dá)到0D630為0. 4的點(diǎn)；(I)其中所述膽汁鹽培養(yǎng)基是補(bǔ)充了膽汁鹽混合物的本文實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養(yǎng)基，所述膽汁鹽混合物包含結(jié)合型膽汁鹽?；敲撗跄懰猁}和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結(jié)合型膽汁鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60%的?；敲撗跄懰猁}、 30%的甘氨脫氧膽酸鹽和10%的脫氧膽酸鹽；以及其中OD測(cè)定分析通過下列步驟進(jìn)行(a)在微量滴定板的孔內(nèi)填充0.150ml的每ml培養(yǎng)基含有IO8個(gè)芽孢桿菌孢子的膽汁鹽培養(yǎng)基(即，此為零時(shí)刻)；以及(b)將所述滴定板在37°C下在大氣條件下孵育，并使用分光光度計(jì)并在每次讀數(shù)之前攪動(dòng)測(cè)定OD63tl值，從而獲得代表性的隨時(shí)間推移的生長曲線；以及( )所述芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生更高量的至少一種必需氨基酸，其中產(chǎn)生的必需氨基酸的量在本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)已知低鹽生長培養(yǎng)基中在 37°C下生長2天后通過本文實(shí)施例2的基于標(biāo)準(zhǔn)GC-MS法的氨基酸測(cè)定法來測(cè)定。
2.如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌組合物，其中所述組合物的芽孢桿菌孢子細(xì)胞作為干燥的(例如，噴霧干燥的)孢子細(xì)胞存在。
3.如權(quán)利要求1或2所述的芽孢桿菌組合物，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物，其中在權(quán)利要求1所述的第(i) 項(xiàng)的條件下，所述芽孢桿菌孢子比以DSM 17231保藏的參照枯草芽孢桿菌(“GalliPro ”) 孢子細(xì)胞提前至少3小時(shí)達(dá)到所述營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需氨基酸是選自由下列組成的組的必需氨基酸苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、 賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸。
6.如權(quán)利要求5所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需氨基酸是選自由下列組成的組的至少一種必需氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。
7.如權(quán)利要求6所述的芽孢桿菌組合物，其中所述必需氨基酸是亮氨酸。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物，其中在權(quán)利要求1所述的第(ii) 項(xiàng)的條件下，所述芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生至少多4倍量的至少一種必需氨基酸。
9.一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物連同其他動(dòng)物飼料成分施用于動(dòng)物。
10.如權(quán)利要求9所述的飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，其中所述的動(dòng)物是選自家禽、反芻動(dòng)物、牛、 豬、兔、馬、魚和寵物的動(dòng)物。
11.一種篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a)從單個(gè)芽孢桿菌孢子細(xì)胞的集合體內(nèi)篩選并分離出新芽孢桿菌孢子細(xì)胞，該新芽孢桿菌孢子細(xì)胞能夠在權(quán)利要求1所述的第(i)項(xiàng)的條件下快速地出芽和生長，使得其在小于18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)；(b)從步驟(a)分離的孢子細(xì)胞制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，并且將所述選擇和分離的新細(xì)胞突變以得到新芽孢桿菌單個(gè)營養(yǎng)細(xì)胞的集合體；(c)從步驟(b)的新芽孢桿菌單營養(yǎng)細(xì)胞的集合體中選擇和分離能夠在權(quán)利要求1所述的第(ii)項(xiàng)的條件下比參照芽孢桿菌細(xì)胞DSM 19467產(chǎn)生更高量的至少一種必需氨基酸的新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞；以及(d)分析步驟(c)的高產(chǎn)芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞以確認(rèn)其保持了步驟(a)的快速的出芽和生長，并分離所述被選擇的芽孢桿菌細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
全文摘要
一種芽孢桿菌組合物，其特征在于在膽汁鹽(模擬的腸道環(huán)境)中快速出芽和生長以及高水平地分泌必需氨基酸。該芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑，在飼料中其具有益生(健康促進(jìn))作用并增加動(dòng)物飼料中營養(yǎng)的消化和可利用度。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102300981SQ200980151423
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者帕特里克·德克斯, 托馬斯·達(dá)爾曼·萊澤, 本特·隆德, 梅泰·戴尼斯·康托, 艾恩·納萊伯格, 英吉·奈普 申請(qǐng)人:科. 漢森有限公司