專利名稱：生物反應(yīng)器的制作方法
生物反應(yīng)器本發(fā)明涉及生物反應(yīng)器、生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物的用途以及用于培養(yǎng)微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。在培養(yǎng)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物尤其是動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和人類細(xì)胞時(shí)，使用不同類型的生物反應(yīng)器。除攪拌式生物反應(yīng)器，尤其可以建立氣升式生物反應(yīng)器 (Air-Lift-Bioreaktor)。在氣升式生物反應(yīng)器中，氣體如空氣被通入生物反應(yīng)器的向上朝向的部分(在本技術(shù)領(lǐng)域中也稱為提升管(Riser))。優(yōu)選發(fā)生微小氣泡曝氣。提升管在其上端和下端與生物反應(yīng)器的另一個(gè)向上朝向部分的上端和下端相連，其在本技術(shù)領(lǐng)域中被稱為下降管(Downcomer)?；境蕡A柱形的氣升式生物反應(yīng)器的一個(gè)廣泛流傳的變型方案包括居中的圓柱形導(dǎo)管，導(dǎo)管將氣升式生物反應(yīng)器分為在導(dǎo)管內(nèi)的浮升部分(提升管)和在氣升式生物反應(yīng)器的導(dǎo)管和容器外壁之間的環(huán)形間隙內(nèi)的下降部分(下降管)。浮升部分位于導(dǎo)管和容器外壁之間的環(huán)形間隙中且下降部分位于導(dǎo)管內(nèi)可能是完全一樣好的。在提升管下端供應(yīng)例如富氧氣體減小了提升管內(nèi)的懸浮培養(yǎng)物的平均密度，這導(dǎo)致在提升管內(nèi)的液體向上游流動(dòng)，結(jié)果，它替換下降管所盛納的液體，所盛納的液體進(jìn)而流向提升管下端。通過(guò)這種方式，產(chǎn)生液體循環(huán)，該液體循環(huán)使懸浮培養(yǎng)物充分混合并且細(xì)胞保持懸浮， 即保持在自由懸浮體中。對(duì)于需氧細(xì)胞，例如氧氣溶解在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中并且懸浮培養(yǎng)物所含的細(xì)胞呼出二氧化碳。這種“攪拌式”生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于，在給細(xì)胞充分供應(yīng)溶解在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中的氧和充分排出在呼吸時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳時(shí)，不需要活動(dòng)部件如機(jī)械攪拌器。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所公開(kāi)的氣升式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)呈細(xì)長(zhǎng)形，就是說(shuō)，高度H與直徑D的比例H/D對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)中已知的氣升式生物反應(yīng)器為6至14。[1]Varley J. ,Birch J. ,Reactor design for large scale suspension animal cell culture, Cytotechnology,29, (1999) :177_205o[2]Petrossian A. , Cortessis G. P., Large-scale production of monoclonal antibodies in defined serum-free media in airlift bioreactors,BioTechniques,8, (1990) :414-422o[3]Hesse F. ，Ebel Μ. ，Konisch N. ，Sterlinski R. ，Kessler W.，禾口 Wagner R. , Comparison of a production process in a membrane-aerated stirred tank and up to 1000-L airlift bioreactors using BHK-21 cells and chemically defined protein-free medium,Biotechnol.Prog. ,19,3(2003) :833_843。[4] Chisti, Y. , Animal-cell damage in sparged bioreactors, Trends Biotechnol. ,18,10(2000) :420_432。在生產(chǎn)規(guī)模中，細(xì)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致氣升式生物反應(yīng)器在從幾百升到多個(gè)立方米的常規(guī)工作容積下達(dá)到數(shù)米高的結(jié)構(gòu)高度。例如在H/D比例為14時(shí)，12立方米工作容積對(duì)應(yīng)14. 4 米結(jié)構(gòu)高度。這樣的氣升式生物反應(yīng)器因此必須安放在屋頂相當(dāng)高的或多個(gè)樓層打通的房間中。這需要高昂的鋼架結(jié)構(gòu)。此外，氣升式生物反應(yīng)器必須現(xiàn)場(chǎng)蒸氣滅菌并可能無(wú)法再作為整體連同細(xì)胞培養(yǎng)所需的周?chē)O(shè)備在壓熱釜中被蒸氣滅菌。與此不同，具有約為2的常用H/D比例的傳統(tǒng)生物反應(yīng)器能夠被輸送到壓熱釜中并在那里被蒸氣滅菌。
通常，高的反應(yīng)器難以操作。因此，從現(xiàn)有技術(shù)出發(fā)，提出了以下任務(wù)，提供生物反應(yīng)器，它在從幾百升到若干立方米的工作容積下具有對(duì)應(yīng)于常規(guī)房間高度的結(jié)構(gòu)尺寸，從而無(wú)需用于裝設(shè)的改裝措施。此時(shí)，所需要的生物反應(yīng)器像根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所公開(kāi)的氣升式生物反應(yīng)器一樣給細(xì)胞充分供應(yīng)氣體如氧氣并充分排出氣體例如在呼吸時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳，不需要活動(dòng)部件如機(jī)械攪拌器。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高度與直徑的比例明顯低于6時(shí)，氣升式生物反應(yīng)器可被用在細(xì)胞培養(yǎng)中。本發(fā)明的主題因此是高度H與直徑D的比例H/D小于6的氣升式生物反應(yīng)器。優(yōu)選H/D比例為1至6，尤其優(yōu)選為2至6。氣升式生物反應(yīng)器是指這樣的反應(yīng)器，其具有提升管、下降管和曝氣單元。提升管和下降管優(yōu)選通過(guò)其中設(shè)有圓柱形管的圓柱形容器構(gòu)成(參見(jiàn)例如

圖1)。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提升管橫截面積和下降管橫截面積相差最多10%，特別優(yōu)選它們同樣大小(參見(jiàn)例如圖2)。圓柱形容器和圓柱形管優(yōu)選具有相同的橫截面形狀。它們優(yōu)選呈橢圓形或者圓形。曝氣單元或是安置在圓柱形導(dǎo)管內(nèi)，或是安置在導(dǎo)管外壁和容器內(nèi)壁之間。在第一種情況下，提升管位于導(dǎo)管內(nèi)，下降管位于導(dǎo)管外壁和容器內(nèi)壁之間；在第二種情況下， 下降管在導(dǎo)管內(nèi)，提升管在導(dǎo)管外壁和容器內(nèi)壁之間。除了給細(xì)胞或生物體供應(yīng)氣體如氧和排出氣態(tài)代謝產(chǎn)物如二氧化碳外，曝氣單元用于在提升管和下降管之間的循環(huán)流動(dòng)。優(yōu)選使用這樣的曝氣單元，它產(chǎn)生直徑小于2毫米的氣泡。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，曝氣單元呈微氣泡曝氣器形式構(gòu)造。微氣泡曝氣器是指這樣的物體，其能夠?qū)⒊饰⑿馀菪问降臍怏w尤其是氧氣送入液體。“微小氣泡”是指這樣的氣泡，其在所加入的培養(yǎng)物中不太易于聚結(jié)。例如過(guò)濾板、激光打孔板或由金屬材料或陶瓷材料制成的特殊燒結(jié)體適合作為微氣泡曝氣器，它們具有直徑一般小于100微米且優(yōu)選15微米的孔或洞。曝氣單元優(yōu)選為空心體例如呈管狀，氣體可以流過(guò)其中。在低于 0. Smh-1的低氣體空管速度時(shí)，產(chǎn)生很微小的氣泡，該氣泡在通常細(xì)胞培養(yǎng)中所用的介質(zhì)中不太易于聚結(jié)。此外，薄膜軟管適合作為微氣泡曝氣器。薄膜軟管是指柔軟的管形織物，其允許氣體如氧氣和二氧化碳透過(guò)。例如公開(kāi)了由微孔聚丙烯構(gòu)成的薄膜空心絲，如同例如在 H. Buntemeyer 等人的 Chem. -Ing. -Tech. 62(1990)，Nr. 5，第 393-395 頁(yè)所述的那樣。曝氣單元優(yōu)選安置在導(dǎo)管下邊緣的附近。曝氣單元優(yōu)選呈環(huán)形或螺旋形，以便其僅僅不明顯縮小流動(dòng)橫截面積。板狀曝氣單元導(dǎo)致增大的流動(dòng)阻力。由此出現(xiàn)的壓力損失必須通過(guò)更高的氣體體積流來(lái)補(bǔ)償，以保持提升管和下降管之間的循環(huán)流動(dòng)。但是，較高的氣體體積流導(dǎo)致升高的剪切率，高剪切率可能對(duì)敏感細(xì)胞是破壞性的，因此應(yīng)加以避免。此外，優(yōu)選為環(huán)形或螺旋形的曝氣單元的直徑應(yīng)如此針對(duì)提升管橫截面匹配構(gòu)造，使得該橫截面盡可能均勻承受氣泡。據(jù)此要避免這樣的曝氣單元，其以小的環(huán)形直徑安置在提升管中央，其中，其余的(外側(cè))提升管橫截面沒(méi)有充分接受所出現(xiàn)的氣泡。也可以考慮，曝氣單元蜿蜒曲折形成。可以考慮其它形狀。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明生物反應(yīng)器中的所有邊角都被倒圓，尤其是導(dǎo)管的邊緣，以避免同樣導(dǎo)致壓力損失和更高剪切作用的渦流。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有流動(dòng)導(dǎo)向機(jī)構(gòu)，其有利于在提升管和下降管之間的環(huán)流以及保持小的壓力損失和剪切作用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器底部具有突出部，突出部使流向反應(yīng)器底部的液體向上轉(zhuǎn)向。流動(dòng)橫截面優(yōu)選在生物反應(yīng)器的發(fā)生流向轉(zhuǎn)向且介質(zhì)從提升管轉(zhuǎn)入下降管或從下降管轉(zhuǎn)入提升管的上部和下部中是相同大小的并且其尺寸對(duì)應(yīng)于提升管和下降管的流動(dòng)橫截面。在生物技術(shù)中常用于微生物和細(xì)胞培養(yǎng)的材料適合作為導(dǎo)管和容器的材料，例如 VA鋼或玻璃。導(dǎo)管通過(guò)支架保持在容器內(nèi)。支架可以安裝在容器底部上、容器蓋子上或者容器內(nèi)壁上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，導(dǎo)管吊掛在支架上，支架安裝在容器蓋子上。通常通過(guò)蓋子向生物反應(yīng)器供給介質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、添加物質(zhì)(如例如消泡劑和緩沖劑)和氣體。本發(fā)明的生物反應(yīng)器適合培養(yǎng)所有類型的微生物和細(xì)胞(植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和人類細(xì)胞)。將本發(fā)明的生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)微生物或植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或人類細(xì)胞是本發(fā)明的主題。本發(fā)明的主題還在于一種培養(yǎng)微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。該方法的特征在于， 在高度H與直徑D的比例H/D小于6且優(yōu)選為2至6的生物反應(yīng)器中，在內(nèi)部導(dǎo)管和在導(dǎo)管外壁和生物反應(yīng)器內(nèi)壁之間區(qū)域之間借助曝氣單元產(chǎn)生環(huán)流(循環(huán)流動(dòng))。曝氣單元優(yōu)選是這樣的單元，其產(chǎn)生直徑小于2mm的氣泡，特別優(yōu)選的是，該單元是微氣泡曝氣器。此時(shí)如此選擇該氣體體積流，保持環(huán)流并且給細(xì)胞充分供應(yīng)氣體如氧氣，并且不含不希望的氣體如二氧化碳，但保持最小的剪切率，以免敏感細(xì)胞受損。此外如此選擇氣體體積流，以保證細(xì)胞懸浮，就是說(shuō)阻止沉淀。其它(次要)準(zhǔn)則是混合時(shí)間足夠短和形成盡量少的泡沫。氣泡可能導(dǎo)致形成泡沫。但是要避免形成泡沫，因?yàn)榧?xì)胞易于隨著泡沫浮起來(lái) (flotieren) 0在泡沫層中，它們遇到不充分的培養(yǎng)條件。使用消泡劑在這里可以提供眾所周知的幫助。本發(fā)明方法優(yōu)選如此運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)管上方外殼面積和導(dǎo)管下方外殼面積相差最多 10%，它們優(yōu)選一樣大小。此外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，導(dǎo)管和液體表面之間外殼面積的大小和/或?qū)Ч芎蜕锓磻?yīng)器底部之間的外殼面積與提升管和/或下降管的橫截面積大小相差最多10%。在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于循環(huán)流動(dòng)的流動(dòng)橫截面積在反應(yīng)器的所有區(qū)域內(nèi)幾乎同樣大小或者同樣大小，以減少壓力損失。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在導(dǎo)管和生物反應(yīng)器底部之間的外殼面積小于提升管和下降管的橫截面積。這樣，在底部區(qū)域中產(chǎn)生更高的流動(dòng)阻力，其有效防止細(xì)胞或微生物沉淀。導(dǎo)管和生物反應(yīng)器底部之間外殼面積優(yōu)選小最少5%和小最多50%，特別優(yōu)選的是，小最少5%和小最多30%。作為培養(yǎng)物，在本發(fā)明方法中可使用微生物以及動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和人類細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是-具有例如為2的高度與直徑的比例的已有的生物反應(yīng)器可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式被改裝以作為氣升式生物反應(yīng)器工作。消除昂貴的新投資。-高度與直徑比低的氣升式生物反應(yīng)器也因?yàn)椴惶怀龅囊红o壓力變化過(guò)程而具有較高的關(guān)于溶解氧、溶解二氧化碳和PH值的一致性(因此，高而細(xì)長(zhǎng)的生物反應(yīng)器易于受到局部的(取決于高度)總是影響到PH值的二氧化碳分壓的影響)。給細(xì)胞不充分供應(yīng)溶解氧的概率在氣升式生物反應(yīng)器的下降管中降低?？傮w更好地軸向混合還導(dǎo)致底物濃縮時(shí)更高的一致性。-通常，給氣升式生物反應(yīng)器通入大氣泡。以微氣泡曝氣導(dǎo)致高比體積的相界面并因此允許明顯減少驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)所需要的氣體體積流。隨之出現(xiàn)與大氣泡曝氣相比明顯降低的細(xì)胞剪切應(yīng)力。-消除了在根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所公開(kāi)的氣升式生物反應(yīng)器中已知的缺陷。以下，將結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于此。圖1示意性表示本發(fā)明的生物反應(yīng)器，圖1(a)以側(cè)橫截面視圖，圖1(b)以上方橫截面視圖。本發(fā)明的生物反應(yīng)器包括圓柱形的容器(1)，在該容器中，優(yōu)選居中安裝了同樣為圓柱形的導(dǎo)管O)。在本實(shí)施例中，在導(dǎo)管中靠近導(dǎo)管下邊緣地裝入環(huán)形的曝氣單元 ⑶。高度H與直徑D的比例H/D為1至6，優(yōu)選為2至6。圖2以上方橫截面視圖示意表示本發(fā)明生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方案，其中，在導(dǎo)管內(nèi)的橫截面積A和在導(dǎo)管( 外側(cè)與容器(1)內(nèi)壁之間的面積B同樣大小，就是說(shuō)，提升管和下降管優(yōu)選具有同樣大小的流動(dòng)橫截面。圖3以側(cè)視橫截面圖示意表示本發(fā)明生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。容器(1) 優(yōu)選在反應(yīng)器底部上具有轉(zhuǎn)向機(jī)構(gòu)(9)。導(dǎo)管O)以支架(5)固定在生物反應(yīng)器的蓋子(4) 上。它具有倒圓的邊緣，以避免由渦流和剪切作用引起的壓力損失。優(yōu)選呈環(huán)形的曝氣單元在圖3的例子中安置在導(dǎo)管內(nèi)，在導(dǎo)管的下邊緣附近，從而提升管位于導(dǎo)管內(nèi)，下降管在導(dǎo)管和容器之間。而且，在反應(yīng)器蓋子上安裝有氣體供應(yīng)通路(6)和供應(yīng)介質(zhì)和/或緩沖劑和/或添加物質(zhì)(例如消泡劑)的通路(7)。通常，生物反應(yīng)器具有加熱和/或冷卻用機(jī)構(gòu)和在此情況下未標(biāo)出的測(cè)量例如溫度、PH值、溶解氧濃度、溶解二氧化碳濃度等的傳感器。在反應(yīng)器內(nèi)的液面(8)優(yōu)選處于這樣的高度，在轉(zhuǎn)向區(qū)域中和在提升管和下降管內(nèi)的流動(dòng)橫截面一樣大小。圖4表示本發(fā)明生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的拍攝照片。所示出的生物反應(yīng)器包括帶有雙壁、蓋子、底部閥門(mén)和導(dǎo)管的玻璃容器，導(dǎo)管可固定在蓋子上。圖5示意性表示面積等同原理提升管和下降管的橫截面以及在導(dǎo)管之上和之下的外殼面積優(yōu)選一樣大小。圖6舉例表示用于本發(fā)明生物反應(yīng)器的呈環(huán)狀微型布?xì)馄?Mikrosparger)形式的曝氣單元。圖7以曲線圖表示來(lái)自實(shí)施例2的BHK-21細(xì)胞在來(lái)自實(shí)施例1的生物反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵結(jié)果。分別畫(huà)出了活細(xì)胞密度Xv (左坐標(biāo)，方框)，單位是[IO5細(xì)胞mL—1]，和活力V (右坐標(biāo)，圓圈)，單位是百分比，與時(shí)間t小時(shí)(橫坐標(biāo))的關(guān)系。時(shí)刻t = 0表示接種時(shí)刻。此外，在曲線圖中示出了曝氣速率。首先，以曝氣速率Fl = 15L/h開(kāi)始，第二天，曝氣速率提高到 F2 = 17. 5L/h。
圖8用于說(shuō)明表1的報(bào)告。附圖標(biāo)記列表1 容器2 導(dǎo)管3曝氣單元4 蓋子5 支架6氣體供應(yīng)通路7 通路8 液面9流體導(dǎo)向機(jī)構(gòu)；轉(zhuǎn)向機(jī)構(gòu)A提升管/下降管的橫截面；B下降管/提升管的橫截面；C導(dǎo)管上方外殼面積；D導(dǎo)管下方外殼面積。實(shí)施例實(shí)施例1 生物反應(yīng)器圖4示出本發(fā)明生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。所示的生物反應(yīng)器包括玻璃容器，其具有雙壁、蓋子、底部閥門(mén)和可固定在蓋子上的導(dǎo)管。多個(gè)蓋孔適用于標(biāo)準(zhǔn)配件。因此，對(duì)隨后的發(fā)酵重要的所有組成部件可以安裝就位。作為曝氣單元((微型)布?xì)馄?的供應(yīng)管路的管可以高度可調(diào)地同樣安裝在蓋子上。 布?xì)馄骶又邪仓迷趯?dǎo)管下部?jī)?nèi)。由此在內(nèi)部發(fā)生液體上升流動(dòng)和在外部發(fā)生液體下降流動(dòng)。導(dǎo)管由空心的雙壁圓柱體構(gòu)成。它不僅用于流動(dòng)導(dǎo)向，導(dǎo)管如此設(shè)計(jì)，可以安裝內(nèi)置的細(xì)胞分離器。由此，將工作容積從15升縮減到10升。雙壁用于在隨后的發(fā)酵工作中熱處理生物反應(yīng)器。液體排出能通過(guò)底部閥門(mén)來(lái)實(shí)現(xiàn)。表1列出主要數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.生物反應(yīng)器，它以氣升式生物反應(yīng)器的形式構(gòu)造，其特征在于，該生物反應(yīng)器高度H 與生物反應(yīng)器直徑D的比例H/D小于6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，該比例H/D為2至6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，為了曝氣和產(chǎn)生循環(huán)流動(dòng)，使用這樣的曝氣單元，該曝氣單元產(chǎn)生直徑小于2毫米的氣泡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，作為曝氣單元使用微泡曝氣器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，該曝氣單元以環(huán)形體或螺旋體的形式構(gòu)造。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，在反應(yīng)器底部上設(shè)有使流動(dòng)轉(zhuǎn)向的機(jī)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，提升管橫截面和下降管橫截面大小相同或者最大相差10%。
8.用于培養(yǎng)微生物或動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞或人類細(xì)胞的方法，其特征在于，在高度H 和直徑D的比例H/D小于6且優(yōu)選為2至6的生物反應(yīng)器中，在內(nèi)部導(dǎo)管與該導(dǎo)管外壁和生物反應(yīng)器內(nèi)壁之間的區(qū)域之間借助曝氣單元產(chǎn)生環(huán)流(循環(huán)流動(dòng))。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，導(dǎo)管和液體表面之間的外殼面積與導(dǎo)管和生物反應(yīng)器底部之間的外殼面積大小相同或者最大相差10%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9之一所述的方法，其特征在于，在導(dǎo)管和液體表面之間的外殼面積的大小和/或在導(dǎo)管和生物反應(yīng)器底部之間的外殼面積與提升管和/或下降管的橫截面積大小相差最大10%。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在導(dǎo)管和生物反應(yīng)器底部之間的外殼面積小于提升管和下降管的橫截面積。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一所述的生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物反應(yīng)器、將生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物的用途以及用于培養(yǎng)微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。
文檔編號(hào)C12M1/04GK102325870SQ200980151661
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月20日
發(fā)明者B·弗拉姆, H·布羅德, J·考林, M·彥內(nèi) 申請(qǐng)人:拜爾技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司