專(zhuān)利名稱(chēng)：制備能夠形成包含體的蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備一種表達(dá)于原核細(xì)胞時(shí)形成包含體的蛋白(下文稱(chēng)作“包含體形成蛋白”)的方法和用于該方法的核酸片段。更具體地，本發(fā)明涉及制備包含體形成蛋白的方法，包括步驟(1)制備一種包含核酸片段的表達(dá)載體，該核酸片段由編碼修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列和結(jié)合于其下游的編碼目的蛋白的核苷酸序列組成，( 制備所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主細(xì)胞和( 從培養(yǎng)產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主細(xì)胞獲得的培養(yǎng)物純化包含體形成蛋白；本發(fā)明還涉及上述(1)的核酸片段。目的蛋白最好優(yōu)選基質(zhì)金屬蛋白酶7(下文稱(chēng)作“MMP-7”)。因此，本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含編碼修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列和編碼原基質(zhì)蛋白酶7(下文稱(chēng)作 "proMMP-7")的核苷酸序列的核酸片段，以及一種通過(guò)使用所述核酸片段制備MMP-7的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)?shù)鞍自诟锾m氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(E. coli)中產(chǎn)生時(shí)，目的蛋白常會(huì)因?yàn)樵谠摰鞍椎腘端連接有信號(hào)序列而分泌入內(nèi)膜(細(xì)胞膜)和細(xì)胞壁之間的間隙(稱(chēng)作外周胞質(zhì))中。但是，穿過(guò)內(nèi)膜傳送目的蛋白進(jìn)入外周胞質(zhì)的效率根據(jù)信號(hào)序列和目的蛋白組合而不同，而且沒(méi)有始終高傳送的已知方法。已知蛋白水解酶(蛋白酶)也分泌入大腸桿菌的外周胞質(zhì)，因此分泌進(jìn)入外周胞質(zhì)的目的蛋白可能會(huì)被水解。另一方面，當(dāng)目的蛋白在變性的情況下分泌進(jìn)入外周胞質(zhì)時(shí)，蛋白有時(shí)會(huì)形成一種叫做包含體的結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為包入包含體的目的蛋白不會(huì)被蛋白酶水解。此外，由于包含體包入了高濃度的目的蛋白，因此從純化效率和高得率回收來(lái)看它是有優(yōu)勢(shì)的。不過(guò)，已知目前沒(méi)有在革蘭氏陰性細(xì)菌如^MM里表達(dá)目的蛋白并通過(guò)例如修飾信號(hào)肽高效形成包含體的方法。Ibrahim等表明利用的壽芽無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，用脯氨酸置換大腸桿菌內(nèi)毒素亞單位B信號(hào)序列的疏水性核心區(qū)域P8位的亮氨酸，切割信號(hào)序列被阻止，而且合成效率增加了 2倍(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。不過(guò)，因?yàn)樵摲椒ǖ慕Y(jié)果來(lái)自簡(jiǎn)化的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)，所以不一定適用于活細(xì)胞例如^KEM的表達(dá)系統(tǒng)。另外，用此方法合成的蛋白是可溶性的，不會(huì)形成包含體。另外一篇研究報(bào)道了當(dāng)^MfEM的核糖體結(jié)合蛋白的信號(hào)序列自然地發(fā)生突變 (P17位的亮氨酸突變成脯氨酸)時(shí)，切割信號(hào)序列被阻止，可溶的核糖體結(jié)合蛋白前體積累于細(xì)胞質(zhì)，但它的表達(dá)量非常低以至于需要利用同位素標(biāo)記來(lái)檢測(cè)，等于突變前的野生型的蛋白表達(dá)水平(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。因此，原核細(xì)胞信號(hào)序列的突變對(duì)于太· 直表達(dá)包含體的影響還不是非常清楚，特別是，突變對(duì)于表達(dá)真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因的影響完全未知。當(dāng)整合了外源基因的重組細(xì)胞用于產(chǎn)生蛋白時(shí)，如果不用含有抗生素的選擇性培養(yǎng)基，重組細(xì)胞在繁殖時(shí)會(huì)排斥該整合的基因，從而丟失該基因的特征，此種細(xì)胞壓倒性的繁殖后導(dǎo)致產(chǎn)生蛋白的效率降低。因此，當(dāng)基因(例如表達(dá)質(zhì)粒)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，通過(guò)降解或者修飾抗生素用于選擇的提供抗生素抗性的基因也會(huì)同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)采用含有對(duì)沒(méi)有攜帶所述基因的宿主細(xì)胞有毒的抗生素(例如氨芐青霉素和四環(huán)素)的選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)而允許選擇那些攜帶了該基因的重組細(xì)胞，抑制那些排斥導(dǎo)入基因的重組細(xì)胞的繁殖。不過(guò)，抗生素可能對(duì)活體生物有毒和引起藥物超敏感性(過(guò)敏)。相應(yīng)地，對(duì)于制造和銷(xiāo)售使用重組細(xì)胞的藥物、動(dòng)物藥或者食品，其抗生素的污染都應(yīng)該受到嚴(yán)格的控制。 因此，業(yè)界需求無(wú)需抗生素選擇的保持導(dǎo)入基因的規(guī)則(constitution)和方法。MMP-7是基質(zhì)金屬蛋白酶(下文稱(chēng)作“MMP”)，屬于鋅分子位于活性位點(diǎn)的鋅型金屬蛋白酶家族(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。MMP以前體產(chǎn)生。當(dāng)分泌到細(xì)胞外時(shí)，前體加工切除信號(hào)序列，然后加工切除原序列而產(chǎn)生活性形式。據(jù)報(bào)道胞外分泌的MMP參與胞外基質(zhì)的代謝，而MMP-7主要由癌細(xì)胞分泌，參與癌癥的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。 和其他MMP不同，MMP-7不具有鉸鏈域和血紅素結(jié)合蛋白樣域，在MMP中間其由最少分子單位組成，其底物為膠原和構(gòu)成胞外基質(zhì)的組分例如纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白和聚集蛋白聚糖。鑒于其底物為軟骨主要組分的聚集蛋白聚糖，以及來(lái)自椎間盤(pán)突出外科手術(shù)的樣品中的巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-7，推測(cè)MMP-7或許參與突出的椎間盤(pán)的自然再吸收(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。隨后，Haro等觀察到給有椎間盤(pán)突出的狗的椎間盤(pán)里施用MMP-7，椎間盤(pán)里髓核體積減小，表明MMP-7可能作為藥物用于椎間盤(pán)突出(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。業(yè)界希望開(kāi)發(fā)MMP-7作為醫(yī)藥用。但是，MMP-7只以痕量存在于活體內(nèi)，因此從活體內(nèi)分離和純化就極其困難。另外，當(dāng)使用活體材料時(shí)，會(huì)有安全問(wèn)題例如潛在的病毒污染。雖然MMP-7 可以從癌細(xì)胞中獲得，但并不優(yōu)選癌細(xì)胞作為制備的來(lái)源(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。為了解決上述問(wèn)題，有人嘗試了由遺傳重組技術(shù)來(lái)獲得MMP-7。對(duì)于使用動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，Barnett等報(bào)道了 MMP-7在CHO中表達(dá)(參考例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。但是MMP-7的表達(dá)水平低到只有幾mg/L，因此該報(bào)道的系統(tǒng)實(shí)際上并不適于藥物生產(chǎn)。也有報(bào)道一種核酸片段，其中編碼堿性磷酸酶信號(hào)序列的核苷酸序列和針對(duì)太MM密碼子使用優(yōu)化的編碼proMMP-7的基因序列結(jié)合在一起，用以在34°C表達(dá)可溶的MMP-7和42°C表達(dá)不溶的 MMP-7 (參考例如專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本專(zhuān)利號(hào)四3852非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 Jbrahim et al.，J. Biol. Chem.，1987，vol. 262，p. 10189-10194非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Groarke et al.，EMBO J.，1985，vol. 4，p. 1875-1880非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 Soler et al. , Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol. 201, ρ·917-923非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :Ii et al. , Exp Biol Med(Maywood), 2006, vol. 231, p. 20-27非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 =Haro et al.，J. Spinal Disord, 1999，vol. 13，p. 245-249非專(zhuān)利文獻(xiàn) 6 =Haro et al.，J Orthop Res, 2005，vol. 23，p. 412—419非專(zhuān)利文獻(xiàn) 7 =Miyazaki et al.，Cancer Research, 1990，vol. 50，p. 7758—7764非專(zhuān)利文獻(xiàn) 8 =Barnett et al.，Protein Exp. Purif.，1994，vol. 5，p. 27—36
本發(fā)明公開(kāi)(本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題)如上所述，當(dāng)proMMP-7基因?qū)氪竽c桿菌時(shí),由于其對(duì)大腸桿菌的強(qiáng)毒件，所以并不會(huì)被表達(dá)。在DroMMP-7的N端加卜.一段信號(hào)妝會(huì)俥可在大腸桿菌中表汰。不過(guò)，只加上一段信號(hào)肽，proMMP-7的表達(dá)水平低且部分表達(dá)的proMMP-7可能被蛋白酶水解。該蛋白酶解由于會(huì)導(dǎo)致太KEM表達(dá)產(chǎn)物的減少、或者導(dǎo)致從包含體重折疊的蛋白的收率降低，最終可以影響有效制備proMMP-7的方法的建立。相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供一個(gè)允許表達(dá)水平增高和抑制蛋白酶酶解的基因片段的新穎組合、一種用所述組合的基因片段在原核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的方法和一種制備目的蛋白的方法。(解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)手段)本發(fā)明者們?yōu)榱诉_(dá)到上述目標(biāo)，進(jìn)行了刻苦的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)在大腸桿菌表達(dá)的核酸片段包含編碼修飾的WioA-堿性磷酸酶信號(hào)肽(下文稱(chēng)作“修飾的APSP”)核苷酸序列，所述信號(hào)肽連接于proMMP-7的5’端，抑制蛋白酶對(duì)proMMP-7的降解，其中所述的修飾的APSP如下獲得用任意氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸置換WioA-堿性磷酸酶信號(hào)肽(下文稱(chēng)作“APSP”)氨基酸序列(序列示于SEQ ID NO 1)的第21位的丙氨酸(信號(hào)肽酶結(jié)合位點(diǎn))；(2)使用脯氨酸置換了第13位亮氨酸的修飾的APSP，既可增高proMMP-7的表達(dá)水平，又可抑制蛋白酶對(duì)proMMP-7的降解；和 (3)當(dāng)用異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，相較于第13位或者第21位的氨基酸被置換修飾的APSP，使用同時(shí)用脯氨酸置換第13位的亮氨酸和上述任意氨基酸置換第21位的丙氨酸的修飾的APSP，proMMP-7的表達(dá)水平增高。另外，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)上述修飾的信號(hào)肽也可以同樣用于其他包含體形成蛋白例如C型副雞禽桿菌(Avikicterium paragallinarum)的HMTp210，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括以下[1] 一種由編碼表達(dá)于原核細(xì)胞時(shí)形成包含體的蛋白(包含體形成蛋白)的核苷酸序列組成的核酸片段，所述核酸片段包含編碼修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列和編碼目的蛋白的核苷酸序列。[2]上述[1]的核酸片段，其中所述原核細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌。[3]上述[1]或者[2]的核酸片段，其中所述原核細(xì)胞是太Mfi直。[4]上述[1]到[3]中任一項(xiàng)的核酸片段，其中所述目的蛋白是原基質(zhì)金屬蛋白酶 7 (proMMP-7)或C型副雞禽桿菌的HMTp210。[5]上述[1]到[4]中任一項(xiàng)的核酸片段，其中所述修飾的信號(hào)肽是修飾的來(lái)自原核生物穿越內(nèi)膜的蛋白的信號(hào)肽。[6]上述[5]的核酸片段，其中所述蛋白選自堿性磷酸酶、0mpA、PelB、0mpT、LamB、 OmpF和β -內(nèi)酰胺酶。[7]上述[5]的核酸片段，其中所述修飾的信號(hào)肽是修飾的Wio-堿性磷酸酶的信號(hào)肽(修飾的APSP)。[8]上述[7]的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1， 其第13位的亮氨酸由選自脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的任一氨基酸置換。
[9]上述[7]的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1， 其第21位的丙氨酸由選自天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的任一氨基酸置換。[10]上述[7]的核酸片段，其中所述修飾的APSP的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1，其第13位的亮氨酸由選自脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的任一氨基酸置換，第21位的丙氨酸由選自天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的任一氨基酸置換。[11]上述[1]到[10]任一項(xiàng)的核酸片段，其中編碼目的蛋白的核苷酸序列置于編碼所述修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列的下游。[12] 一種表達(dá)載體，其中摻入了上述[1]到[11]任一項(xiàng)的核酸片段。[13] 一種通過(guò)上述[12]的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主得到的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主。[14]上述[13]的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主是原核細(xì)胞。[15]上述[13]或者[14]的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主是革蘭氏陰性細(xì)菌。[16]上述[13]到[15]任一項(xiàng)的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主，其中所述宿主是太腸桿菌。[17] 一種制備表達(dá)于原核細(xì)胞時(shí)形成包含體的蛋白(包含體形成蛋白)的方法， 其包括以下步驟(1)到⑶(1)制備包含其中摻入了上述[1]到[11]任一項(xiàng)的核酸片段的表達(dá)載體，(2)制備上面步驟(1)的所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主細(xì)胞， 禾口(3)從培養(yǎng)上面步驟O)的產(chǎn)生所述包含體形成蛋白的所述宿主細(xì)胞獲得的培養(yǎng)物中純化所述的包含體形成蛋白。[18]上述[17]的方法，其中所述表達(dá)載體是上述[1]到[11]任何一項(xiàng)的核酸片段摻入到T7啟動(dòng)子下游的表達(dá)載體。[19]上述[17]或者[18]的方法，其中所述宿主是原核細(xì)胞。[20]上述[17]到[19]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是革蘭氏陰性細(xì)菌。[21]上述[17]到[20]任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主是太Mfi直。[22]上述[17]到[21]任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生所述包含體形成蛋白的所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種核酸片段，其由編碼當(dāng)在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)形成包含體(包含體形成蛋白)的核苷酸序列組成，該片段由編碼修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列和編碼目的蛋白的核苷酸序列組成；提供摻入所述核酸片段的表達(dá)載體；提供利用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主；和一種用產(chǎn)生包含體形成蛋白的所述宿主制備包含體形成蛋白的方法。通過(guò)利用本發(fā)明的方法，保留表達(dá)質(zhì)粒的比例可以提高，從而無(wú)需在培養(yǎng)基中添加保留質(zhì)粒用的抗生素如氨芐青霉素。同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明，可獲得在不同的誘導(dǎo)系統(tǒng)中表達(dá)目的蛋白的較好的反應(yīng)，而且目的蛋白的表達(dá)水平也會(huì)增加。除此之外，根據(jù)本發(fā)明，蛋白酶對(duì)包入包含體的目的蛋白的降解降低，重折疊的效率可因此提高，最終回收目的功能活性蛋白的效率增加。因此，本發(fā)明的方法允許更容易地制備目的蛋白。例如，利用一種包含了編碼修飾的APSP的核苷酸序列的核酸片段，其下游結(jié)合了編碼原基質(zhì)金屬蛋白酶7 (proMMP-7)的基因的核苷酸序列，在培養(yǎng)所述產(chǎn)proMMP-7的太臉桿菌和從所沭培養(yǎng)物中純化蛋白時(shí),proMMP-7在產(chǎn)生proMMP-7的大腸桿菌里的表汰水平會(huì)增加，而目.大腸桿菌蛋白酶對(duì)DroMMP-7的降解可以受到抑制。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的方法，例如，使純化proMMP-7和轉(zhuǎn)化proMMP-7到MMP-7而更容易，從而允許MMP-7的高效產(chǎn)生。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示SDS-PAGE的結(jié)果，凝膠用考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色，樣品為溶解的產(chǎn)生 proMMP-7的大腸桿菌，其中大腸桿菌用包含修飾的APSP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到，在修飾的 APSP中SEQ ID NO 1氨基酸序列的第21位的丙氨酸(信號(hào)肽酶的結(jié)合位點(diǎn))被其他所述氨基酸置換。泳道1 :MMP7A21D菌株，泳道2 :MMP7A21D菌株，泳道3 :MMP7A21E菌株，泳道 4 :MMP7A21E菌株，泳道5 :MMP7A21K菌株，泳道6 :MMP7A21K菌株，泳道7 :MMP7菌株，泳道 8 :MMP7 菌株。圖2顯示SDS-PAGE的結(jié)果，凝膠用CBB染色，樣品用溶解的產(chǎn)生proMMP-7的太腸桿菌,其中大腸桿菌用包含修飾的APSP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到，在修飾的APSP中示于SEQ ID NO 1氨基酸序列的第13位的亮氨酸被脯氨酸置換。泳道1 :MMP7L13P菌株，泳道2 MMP7L13P菌株，泳道3 :MMP7菌株，泳道4 :MMP7菌株。圖3顯示SDS-PAGE的結(jié)果，凝膠用CBB染色，樣品用溶解的產(chǎn)生proMMP-7的大腸桿菌，其中大腸桿菌用包含修飾的APSP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到，在修飾的APSP中示于SEQ ID NO 1氨基酸序列第13位的亮氨酸由脯氨酸置換，和示于SEQ ID NO=I氨基酸序列的第21 位的丙氨酸由其他所述氨基酸置換。泳道1 :MMP7L13P-A21D菌株，泳道2 :MMP7L13P_A21E 菌株，泳道 3 :MMP7L13P-A21K 菌株，泳道 4 :MMP7L13P-A21H 菌株，泳道 5 :MMP7L13P_A21F 菌株，泳道6 :MMP7L13P-A21Y菌株，泳道7 :MMP7菌株。圖4顯示SDS-PAGE的結(jié)果，凝膠用CBB染色，樣品用溶解的產(chǎn)生proMMP-7的大腸桿菌，其中大腸桿菌用包含修飾的APSP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到，在修飾的APSP中示于SEQ ID NO 1氨基酸序列的第13位的亮氨酸由脯氨酸置換，示于SEQ ID NO 1氨基酸序列的第21 位的丙氨酸由谷氨酸置換，和兩種修飾都有的情況。泳道1 :MMP7菌株，泳道2 :MMP7L13P菌株，泳道 3 :MMP7A21E 菌株，泳道 4 :MMP7L13P_A21E 菌株。圖5顯示SDS-PAGE的結(jié)果，凝膠用CBB染餼，樣品用部分的大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞碎片，其中導(dǎo)入了表達(dá)質(zhì)粒 pET-CorC4000，pET-nALP_CorC4000，或者 pET-ALP_CorC4000 中的任一個(gè)。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明的特征在于可產(chǎn)生包含體形成蛋白的宿主，其通過(guò)利用包含編碼修飾的信號(hào)肽的核苷酸序列和結(jié)合于其下游的編碼目的蛋白的核苷酸序列的核酸片段制備；以及包含體形成蛋白或目的蛋白通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生包含體形成蛋白的所述的宿主制備。在一個(gè)利用大腸桿菌的表汰系統(tǒng)里，修飾的信號(hào)肽可以來(lái)自仵何蛋白的信號(hào)肽, 只要他能從細(xì)胞里轉(zhuǎn)運(yùn)目的蛋白進(jìn)入外周胞質(zhì)或者通過(guò)穿越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外。任何來(lái)自細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)肽都可以是候選肽，包括特別是原核生物的能夠穿越內(nèi)膜的蛋白的信號(hào)肽，例如堿性磷酸酶(DA et al.，Nature, vol. 321，706-708)、PhoA-堿性磷酸酶(Oka et al.，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82，7212-7216)、OmpA (Ghrayeb et al.，1984， EMBO J.，vol.3，2437-2442)、PelB (Better et al.，1988，Science, vol.240，1041—1043)、 OmpT(Johnson et al.,1990, Protein Expression Purif, vol. 7,104-113)> LamB 禾口 OmpF (Hoffman et al. , 1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82,5107-5111), β -內(nèi)酰胺酶 (Villa-komaroff et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , vol. 75, 3727-3731)等?？蓛?yōu)選使用堿性磷酸酶的信號(hào)肽，更優(yōu)選使用PhoA-堿性磷酸酶的信號(hào)肽。原核細(xì)胞的堿性磷酸酶有不同同工酶，任何同工酶的信號(hào)肽都可以選用。本發(fā)明的方法可用于真核細(xì)胞的包含體形成蛋白。特別地，本發(fā)明的方法可于下列情況有效使用直接表達(dá)目的蛋白可能對(duì)原核細(xì)胞有毒性，因此而降低細(xì)胞的生長(zhǎng)或者降低目的蛋白的表達(dá)水平；或者是目的蛋白被降解而導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生水平的減少。這樣的目的蛋白包括proMMP-7、C型副雞禽桿菌的HMTp210、HIV_l蛋白酶、T細(xì)胞受體、抗菌肽、人凋亡調(diào)控蛋白BOX等。這些目的蛋白的基因序列可以是原始的也可以是針對(duì)^KE直的密碼子使用優(yōu)化過(guò)的。下文介紹的是包含修飾的APSP和結(jié)合在其下游的proMMP-7的包含體形成蛋白的實(shí)施方案。編碼proMMP-7的基因可用PCR擴(kuò)增商業(yè)可用的源于腎臟的cDNA文庫(kù)(HumanMTC Panell, Catalog number :K1420-1, BD)獲得。PCR引物的設(shè)計(jì)可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的 proMMP-7的核苷酸序列，數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào)NM002423 ；proMMP-7。PCR引物可從DNA合成公司獲得(例如QIAGEN)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，必要時(shí)可以在5’端和3’端加上合適的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列。下文的實(shí)施例中，用到的引物包含核苷酸序列P1(SEQ ID NO 2) 和P2(SEQ ID NO :3)，其中加入的限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)為NdeI和BamHI。PCR擴(kuò)增的核酸片段可以克隆入克隆載體例如？0 11-1~(^0(^“廿08611)，和用DNA測(cè)序儀(ABI Prism 377Applied Biosystems)測(cè)序。獲得的proMMP-7基因可以通過(guò)比較獲得的核苷酸序列和已知的proMMP-7的核苷酸序列得以證實(shí)。因此，可以獲得編碼proMMP-7的核酸片段(下文稱(chēng)作“proMMP-7基因”)。編碼人proMMP-7的核苷酸序列示于SEQ ID NO :21，編碼人MMP-7 的氨基酸序列示于SEQ ID NO :22ο接下來(lái)，利用proMMP-7基因作為PCR擴(kuò)增的模板，使APSP或者修飾的APSP加到proMMP-7基因的5’端。在制備修飾的APSP時(shí)可以用定點(diǎn)導(dǎo)向的突變的方法在氨基酸序列中導(dǎo)入突變。實(shí)踐中，定點(diǎn)導(dǎo)向的突變可以根據(jù)應(yīng)用了這種技術(shù)的商業(yè)可用的試劑盒及其附帶操作說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，例如 Invitrogen 的 GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System、 Takara 白勺 Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km、 Mutan-Express Km、Mutan-K 等)、Stratagene 的 QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit 等。本申請(qǐng)的實(shí)施例中使用了 GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System。本領(lǐng)域已知^MfiM的信號(hào)肽酶識(shí)別P3-P1位點(diǎn)，該處信號(hào)序列很保守，而該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致不會(huì)出現(xiàn)信號(hào)肽的切割(Shen et al.，Biochemistry，1991，vol. 30， 11775-11781)。已知典型的信號(hào)肽有一個(gè)疏水核心區(qū)域，其中具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率相對(duì)較高?？梢酝ㄟ^(guò)突變信號(hào)序列中氨基酸成為不同極性的氨基酸來(lái)抑制信號(hào)肽的功能(PUZISS et al.，J. Bacteriol.，1989，2303-2311)?？梢栽贏PSP的任何位點(diǎn)導(dǎo)入突變，只要蛋白酶對(duì)proMMP-7的降解可以被抑制。優(yōu)選導(dǎo)入突變于信號(hào)肽酶結(jié)合位點(diǎn)，更優(yōu)選的是第21位的丙氨酸。導(dǎo)入的突變可以是置換、 刪除、或者加入氨基酸的任何一種。優(yōu)選第21位的丙氨酸被其他氨基酸置換，優(yōu)選由選自天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸置換。另外，導(dǎo)致APSP空間結(jié)構(gòu)改變的氨基酸置換也可以用來(lái)既提高proMMP-7的表達(dá)水平(加速融合蛋白的翻譯和增高保留質(zhì)粒的比例)又抑制蛋白酶的降解作用?？赡苷T導(dǎo)空間結(jié)構(gòu)改變的氨基酸包括脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，優(yōu)選脯氨酸。除了脯氨酸，此種氨基酸的置換位點(diǎn)也可以是在非脯氨酸的任何氨基酸位置，優(yōu)選第13位的亮氨酸。另外，當(dāng)?shù)?3位的亮氨酸由脯氨酸置換、第21位的丙氨酸由上述的任何氨基酸置換的修飾的APSP結(jié)合到proMMP-7的N端時(shí)，IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平比單獨(dú)突變上述兩個(gè)點(diǎn)的表達(dá)水平增加。因此，最優(yōu)選的修飾的APSP的實(shí)施方案是同時(shí)導(dǎo)入脯氨酸對(duì)第13位亮氨酸的置換和上述的任何氨基酸對(duì)第21位的丙氨酸的置換。如上所述，除了脯氨酸，也可以使用苯丙氨酸和色氨酸。根據(jù)其來(lái)源，APSP的氨基酸序列比示于SEQ ID NO 1的APSP氨基酸序列或者在 N端增加了1個(gè)或多個(gè)的氨基酸或者在上述序列的N端多了1個(gè)或多個(gè)的氨基酸但是去除了 N端的蛋氨酸。通過(guò)進(jìn)行上述的針對(duì)置換SEQ ID NO 1中第13位的亮氨酸和/或第21 位的丙氨酸的修飾，這樣的APSP也可以用作本發(fā)明的修飾的APSP。來(lái)自不同物種的這種 APSP的例子包括大腸桿菌UTI89菌株(Acc. No. YP 539434)，大腸桿菌CFT073菌株(Acc. No. NP 752424)和 Shigella flexneri 2a Str301 (Acc. No. NP 706185)。本發(fā)明介紹的來(lái)自不同物種的APSP包含氨基酸序列(SEQ ID NO :20)，其中保留了 SEQ ID NO :1中APSP的對(duì)應(yīng)NO. 2到NO. 21的序列，但在其N(xiāo)端增加了 M個(gè)氨基酸殘基。在其起APSP作用的范圍內(nèi)，可以采用不同物種的APSP。附加有上述得到的APSP或者通過(guò)導(dǎo)入不同氨基酸置換得到的修飾的APSP 的proMMP-7基因可以導(dǎo)入合適的表達(dá)載體，可用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以表達(dá) proMMP-7蛋白。因?yàn)橛糜诒景l(fā)明的APSP來(lái)自原核細(xì)胞，優(yōu)選使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞。 當(dāng)大腸桿菌用作宿主細(xì)胞時(shí),可在合適時(shí)使用R經(jīng)被開(kāi)發(fā)商用的用于大腸桿菌的具有trp 啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、cspA啟動(dòng)子等不同的表達(dá)載體。根據(jù)表達(dá)載體，可以選用合適的太通桿菌例如BL21、HMS174、DH5 α、HBlOU JM109等為宿主。轉(zhuǎn)化大腸桿菌可以通過(guò)商業(yè)可用的感受態(tài)細(xì)胞和其附帶的操作說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。因此可以獲得產(chǎn)牛希望多肽的重組大腸桿菌。 對(duì)于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基(例如LB、S0C、S0B等)、用于選擇轉(zhuǎn)化子的試劑(例如氨芐青霉素)和用于誘導(dǎo)表達(dá)的試劑(例如吲哚乙酸、IPTG等)，都可選用商業(yè)可用的。培養(yǎng)基的 PH可以在適合大腸桿菌生長(zhǎng)的范圍內(nèi)(pH 7. 2到7. 6)。對(duì)于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可使用本領(lǐng)域的已知方法。例如磷酸鈣、DEAE葡聚糖、方法可以使用Iipofectin的脂質(zhì)體、聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合、電擊穿孔等，根據(jù)使用的宿主細(xì)胞均可適當(dāng)選用。下文介紹的實(shí)施例中，表達(dá)載體使用pET22b (Merck， manufacture code :69744-3)、宿主細(xì)胞為 BL21 (DE3)和使用表達(dá)系統(tǒng) Overnight Express Autoinduction System 1 (Merck,manufacture code :71300-3)用于表達(dá)proMMP—7,其中乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。
篩選表達(dá)proMMP-7的重組大腸桿菌可按照以下介紹的方法進(jìn)行。檢測(cè)在表達(dá)誘導(dǎo)物(本發(fā)明用Overnight Express Autoinduction System 1作為表達(dá)系統(tǒng))存在下培養(yǎng)和生長(zhǎng)的細(xì)胞的渾濁度(OD 600nm)，高速離心固定量細(xì)胞的培養(yǎng)物從而收集細(xì)胞。細(xì)胞用固定體積的蒸餾水重懸，超聲或者勻漿器(French press或者M(jìn)anton Golin)破碎細(xì)胞， 高速離心(15，OOOrpm，15min)收集沉淀。可適當(dāng)往蒸餾水中加入表面活性劑(例如Triton χ 100，BugBuster(Merck))、螯合劑(例如EDTA)、溶菌酶等。SDS-PAGE的樣品緩沖液溶解收集沉淀中的proMMP-7 (形成包含體)，用其固定量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，CBB染色凝膠后，proMMP-7蛋白的表達(dá)和表達(dá)的程度可以用分子大小和染色圖來(lái)證實(shí)。對(duì)于證實(shí) (檢測(cè))proMMP-7，除了上述基于分子大小的方法，還可以用基于抗原_抗體反應(yīng)的方法例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)雜交印跡法(dot blot)等。所有這些方法常規(guī)用于檢測(cè)^MM表達(dá)的異源蛋白或者多肽，可以根據(jù)情況選用。從得到的產(chǎn)牛DroMMP-7的大腸桿菌中回收MMP-7可根據(jù)下沭的方法講行。首先， 培養(yǎng)產(chǎn)生proMMP-7的大腸桿菌，用合適的操作破碎增殖細(xì)胞,從而讓由proMMP-7組成的包含體釋放出細(xì)胞。在傳統(tǒng)利用的基因重組技術(shù)中，抗生素例如氨芐青霉素的抗性基因用作篩選基因重組體的選擇性標(biāo)記基因。但是，鑒于其擴(kuò)散到環(huán)境中或者出于對(duì)醫(yī)療產(chǎn)品安全性的考慮，抗生素的使用阻礙了工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展。同時(shí)，對(duì)于利用基因重組制造和銷(xiāo)售藥物或者用于動(dòng)物的藥物，為了避免其污染需要嚴(yán)格的管理。這些背景下，出于充分的安全性考慮，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)用的培養(yǎng)基優(yōu)選無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。對(duì)于破碎細(xì)胞，可利用任何傳統(tǒng)的方法，包括利用化學(xué)物質(zhì)、表面活性劑、酶等溶解，或者物理處理例如Frech press勻漿器勻漿或者超聲處理。通過(guò)組合應(yīng)用這些方法中幾個(gè)方法能夠更有效的破碎細(xì)胞。重復(fù)離心和洗滌包含包含體的破碎細(xì)胞的溶液可以去掉絕大多數(shù)的細(xì)胞碎片。洗滌可用普通的緩沖液進(jìn)行，例如Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液等。 通過(guò)離心包含包含體的溶液，包含體以沉淀的形式回收回來(lái)?；厥盏陌w可以用包含還原劑和變性劑的溶液溶解。對(duì)于這樣的還原劑，可使用半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇等。也可組合使用這些中的幾種試劑。根據(jù)將要溶解的包含體的量，還原劑的濃度范圍可以在IOmM到200mM。變性劑可以使用尿素、 鹽酸胍等。尿素和鹽酸胍的使用濃度范圍可以分別在4M到8M和2M到6M。緩沖液可以是回收包含體用的緩沖液。如果溫度在40°C以下，溶解溫度并沒(méi)有特別的限制。溶解時(shí)間可以通過(guò)觀察包含體溶解的程度來(lái)設(shè)定，通常連續(xù)攪拌30分鐘到1個(gè)小時(shí)。接下來(lái)，包含表面活性劑和金屬離子的重折疊緩沖液可以加入包含體溶液，以便進(jìn)行重折疊，即構(gòu)建proMMP-7正常的空間結(jié)構(gòu)。為此所用的表面活性劑Brij 35和金屬離子乙酸鋅或者氯化鈷的濃度范圍分別在0. 5到2%和0. 05mM到0. 2mM。用于重折疊的緩沖液的類(lèi)型和濃度可以和用于溶解包含體的一致。使用的緩沖液的PH值的范圍在7. O到 9.0?？梢酝ㄟ^(guò)讓溶液放置1天或更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行重折疊。 對(duì)于從重折疊溶液中純化proMMP-7，可以使用常用于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的方法的組合，例如離心、鹽析、超濾、等電聚焦、電泳、離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法、親和色譜法、疏水層析、羥基磷灰石層析等。得到的蛋白或者多肽的量可以通過(guò)使用蛋白檢測(cè)試劑檢測(cè)，例如 BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology. Inc)、Protein Assay kit(BI0-RAD, Inc)等。例如純化proMMP-7可以使proMMP-7吸附于陽(yáng)離子柱，洗滌后，用高濃度的鹽溶液洗脫(Oneda et al.，J. Biochem.，1999，vol. 126,906-911)。之后，可以進(jìn)行proMMP-7到MMP-7的轉(zhuǎn)化。對(duì)于轉(zhuǎn)化，將包含proMMP-7的溶液在 ImM(4-氨基苯基)乙酸汞(APMA)或者0. 2 μ M胰蛋白酶存在下于37°C溫度，或者于53°C溫育(Crabbe et al. ,Biochemistry, 1992, vol. 31,8500-8507) 溫育時(shí)間可以在 1 到 48 小時(shí)，但是可以根據(jù)試劑和proMMP-7的濃度和將要處理的蛋白量進(jìn)行合適地調(diào)整。用N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)處理后可以使用胰蛋白酶。對(duì)于測(cè)量MMP-7的活性，可用熒光計(jì)測(cè)量MMP-7對(duì)其熒光底物(Dnp-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-色氨酸-丙氨酸-D-精氨酸-NH2 SEQ ID NO 23)的切割(Crabbe et al.，Biochemistry, 1992, vol. 31，8500-8507)。實(shí)踐中，使用了這種技術(shù)的測(cè)量 MMP-7 活性的試劑盒(ANASPEC)已經(jīng)可以商業(yè)購(gòu)，可根據(jù)附帶的操作說(shuō)明書(shū)用于檢測(cè)活性。對(duì)于分離和純化得到的MMP-7與proMMP-7，上述純化蛋白的方法也適用。對(duì)于獲得C型副雞禽桿菌的HMTp210基因，PCR擴(kuò)增的起始材料可以使用提取自細(xì)胞的總RNA、mRNA或者基因組DNA。用于PCR的引物可以根據(jù)Tokunaga等公開(kāi)的HPG-C 型細(xì)菌的HMTp210基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)(日本專(zhuān)利
發(fā)明者中武博, 前田浩明, 平島正樹(shù), 末永清剛, 米田明廣 申請(qǐng)人:一般財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所, 帝人制藥株式會(huì)社