專利名稱：用于轉(zhuǎn)化植物的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌和其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌(Agrobacterium)和農(nóng)桿菌營養(yǎng)缺陷體在植物細(xì)胞穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化中的用途。
背景技術(shù)：
農(nóng)桿菌是土壤革蘭氏陰性細(xì)菌的一個屬，其廣泛用于將外源DNA引入植物中。農(nóng)桿菌種類用于DNA轉(zhuǎn)移的用途基于它們將DNA序列轉(zhuǎn)移到植物基因組的天然能力。最廣泛使用的農(nóng)桿菌種類是根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)，其是植物中腫瘤疾病冠癭病的病原體。 密切相關(guān)的種類即發(fā)根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes)誘發(fā)毛根病，也用于將DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組，但是程度較小。這些細(xì)菌將DNA轉(zhuǎn)移到植物的能力取決于細(xì)胞中大質(zhì)粒(> 1001Λ)的存在。這些質(zhì)粒在根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中分別稱為Ti (腫瘤誘發(fā))或Ri (根誘發(fā))。 第三個種類即放射形農(nóng)桿菌(A. radiobacter)的不同在于缺少Ti或Ri質(zhì)粒。DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物基因組的機(jī)制涉及使特定T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)分子從Ti質(zhì)粒移動到宿主細(xì)胞。 T-DNA區(qū)的輪廓為稱為左右邊界的25bp。在致病農(nóng)桿菌細(xì)胞中，用于過量產(chǎn)生表現(xiàn)冠癭病癥狀的生長素和細(xì)胞分裂素的基因位于T-DNA元件內(nèi)。致病農(nóng)桿菌菌株的T-DNA元件還含有用于產(chǎn)生被該細(xì)菌用作氮源的冠癭堿的基因。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向植物基因組的DNA轉(zhuǎn)移通常用“無害的”(將生長素、細(xì)胞分裂素以及冠癭堿基因從T-DNA元件中去除)的菌株進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化研究中，將目的序列引入“無害的”農(nóng)桿菌菌株的T-DNA區(qū)。該嵌合T-DNA元件可以被稱為二元載體的單獨的、較小的、 宿主廣泛的質(zhì)粒攜帶，或者被直接引入固有的“無害的” Ti質(zhì)粒中。在基本的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案中，第一步需要用在嵌合的T-DNA元件中攜帶目的基因的“無害的”農(nóng)桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化結(jié)合子接種植物細(xì)胞。隨后在稱為共培養(yǎng)的該方案的步驟中，將細(xì)胞培養(yǎng)通常范圍為1-7天的時期。共培養(yǎng)期后，在再生培養(yǎng)基中對植物細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使植物進(jìn)一步發(fā)育。植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法的通常實踐是，在共培養(yǎng)后的植物培養(yǎng)基中使用農(nóng)桿菌反選擇劑，如抗生素，作為反選擇農(nóng)桿菌細(xì)胞的策略。反選擇用于治愈植物農(nóng)桿菌組織。如果未治愈，農(nóng)桿菌會快速過量生長并殺死植物組織，由此導(dǎo)致很少的轉(zhuǎn)基因事件或無轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生。此外，不同的反選擇劑差異性地影響不同的農(nóng)桿菌菌株，參閱例如 Ogawa, Y. , et al. , Screening for highly active beta—lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens, Arch Microbiol, 181 (4) :331-6Q004)。有些反選擇劑具有殺生作用，而其他的具有生物抑制作用。同樣，植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物可能對細(xì)菌反選擇劑具有不同的應(yīng)答(例如，Ling, H. Q.，et al.，Effect of ticarcillin/potassium clavulanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium—mediatedtransformation of tomato(Lycopersicon esculentum Mill.)Plant Cell Reports,17 843 (1998.) ；Tang, H.，et al.，An evaluation of antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens from walnut somatic embryos and for the effects on the proliferation of somatic embryos and regeneration of transgenic plants，Plant Cell Reports，19 :881 (2000) ；Alsheikh，M. K.，et al.，Appropriate choice of antibiotic and Agrobacterium strain improves transformation of antibiotic-sensitive Fragaria vesca and F. v. semperflorens, Plant Cell Reports， 20:1173(2002)。盡管有些細(xì)菌抗生素對植物細(xì)胞培養(yǎng)物是毒性的，但其他細(xì)菌抗生素可能具有植物生長調(diào)節(jié)劑活性(例如，Borrelli, G. M.，et al.，Effect of cefotaxime on callus culture and plant regeneration in durum wheat, Journal of Plant Physiology,140 :372(1992) ；Lin, J. J. , et al. , Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissues by Agrobacterium tumefaciens cells, Plant Science (Limerick)，109 :171 (1995)。在經(jīng)由農(nóng)桿菌的任何植物轉(zhuǎn)化方案的研發(fā)中，使用有效殺死農(nóng)桿菌但是對植物組織無不良影響的反選擇劑，都非常重要 (Shackelford，N. J.，et al.，Identification of antibiotics that are effective in eliminating Agrobacterium tumefaciens， Plant Molecular Biology Reporter， 14:50(1996)。這耗時且難以確定這些條件，且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員必須為實現(xiàn)可接受水平的植物轉(zhuǎn)化效率而讓步(Ogawa，Y.，et al. , Screening for highly active beta—lactam antibiotics against Agrobacterium tumefaciens, Arch Microbiol, 181(4) :331-6 (2004) ；Ogawa, Y. , et al. , Evaluation of 12 beta-lactam antibiotics for Agrobacterium-mediated transformation through in planta antibacterial activities and phytotoxicities, Plant Cell R 印，23(10-11) :736-43 O005)。出于這些和其他原因，需要本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了不需要農(nóng)桿菌反選擇劑來治愈植物農(nóng)桿菌組織的轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了有效轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的還一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了不及傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法昂貴的轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了不使用農(nóng)桿菌反選擇劑同時保持轉(zhuǎn)化頻率和效率的轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了對植物細(xì)胞培養(yǎng)物不具有不良影響的轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了有效殺死農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和再生植物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了以生物學(xué)的方式防范植物的轉(zhuǎn)化和再生中所用的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌的方法。本發(fā)明的另一目標(biāo)、特征或優(yōu)勢是，提供了營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌。根據(jù)說明書和其后的權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他目標(biāo)、特征或優(yōu)勢中的一個或多個，會變得顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的一方面，在缺少農(nóng)桿菌反選擇劑的情況下，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法包括，在存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖和生長所需的化合物的情況下，使植物細(xì)胞與胸苷營養(yǎng)缺陷體農(nóng)桿菌接觸。該營養(yǎng)缺陷體在不存在所述化合物的情況下會表現(xiàn)出不能存活、增殖或生長。合適的化合物包括但不限于胸苷或胸腺嘧啶或其在胸腺嘧啶生物合成途徑中的衍生物。營養(yǎng)缺陷體可以在例如二元載體中容納轉(zhuǎn)基因，以便能夠?qū)⒃撧D(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。對于一個或多個參于胸腺嘧啶的生物合成或該途徑的調(diào)節(jié)的基因而言，胸苷營養(yǎng)缺陷體可以是缺陷的或無效的。一方面，胸苷營養(yǎng)缺陷體具有例如由于缺失、部分缺失、敲除、 插入和/或突變而受到破壞的胸苷酸合酶基因。營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌可以來自根癌農(nóng)桿菌、 發(fā)根農(nóng)桿菌或放射形農(nóng)桿菌中。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)生農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體的方法。有利的是，本發(fā)明允許在不使用諸如抗生素或除草劑的農(nóng)桿菌反選擇劑的情況下，再生植物細(xì)胞、植物部分或植物。常見的反選擇劑包括但不限于羧芐青霉素、頭孢噻肟、 萬古霉素、氧哌嗪青霉素、羥基噻吩青霉素、頭孢他啶、頭孢布宗、頭孢米諾、拉氧頭孢、氟氧頭孢、氨曲南、卡蘆莫南或美羅培南。轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)移可以通過在存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖或生長所需的化合物的情況下共培養(yǎng)植物細(xì)胞與胸苷營養(yǎng)缺陷體而促進(jìn)?？梢栽谌鄙俎r(nóng)桿菌反選擇劑和缺少營養(yǎng)缺陷體生長所需的化合物的情況下，選擇并再生表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。在缺少營養(yǎng)缺陷體存活所需的化合物的情況下，營養(yǎng)缺陷體死亡且不需要反選擇抗生素來治愈植物污染性農(nóng)桿菌材料。另外，營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌和其在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的用途允許攜帶轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌的生物防范。營養(yǎng)缺陷體顯著地使基因工程生物偶然釋放的可能性最小化或甚至將其消除。根據(jù)下述描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)勢以及方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員將會變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，下述描述和具體實施例，盡管表示本發(fā)明的優(yōu)選方面，但是僅以說明的方式給出。通過閱讀下述描述和通過閱讀本公開的其他部分，在所公開的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾，會毫無困難地對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。附圖簡要說明根據(jù)下述詳細(xì)描述和附圖，可對本發(fā)明獲得更全面的理解。

圖1表示根癌農(nóng)桿菌C58 (LBA4404) (SEQ ID NO 11) ThyA基因缺失突變體的核苷酸序列，還參閱Genbank登錄號NC003062和AE007869。加下劃線的序列是HiyA基因的5， 末端。加粗的序列是3'序列(缺失后)。突出的序列表示編碼序列。雙細(xì)線標(biāo)記(//) 表示ThyA基因受到破壞的位置。圖2是表示ThyA缺失克隆向根癌農(nóng)桿菌ThyA區(qū)可能的整合的概括圖解，具有所示的分析PCR引物結(jié)合位點的位置。圖3是農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體和野生型農(nóng)桿菌在非補(bǔ)充條件(imsupplemented condition)下的比較生長。如圖3所證明和如實施例3所述，在缺少胸苷的情況下，農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體與非營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型農(nóng)桿菌菌株LBA4404相比，具有有限的生長。圖4是本發(fā)明方法的一實施方案所用步驟與標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生方法所用步驟的示意性比較。圖5是比較在具有胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌和不具有胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的情況下，利用轉(zhuǎn)化和再生方法所獲得的轉(zhuǎn)化頻率的圖表。在本文的其他地方，如實施例4中， 進(jìn)一步描述了方法。發(fā)明的詳細(xì)描述現(xiàn)在，在下文，參考附加的實施例，對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述，其中，顯示了本發(fā)明的一些但并不是所有的方面。實際上，本發(fā)明可以以許多不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)當(dāng)解釋為限于本文所闡述的方面；而是，為了使公開滿足可應(yīng)用的法律要求而提供了這些方面。 同樣的編號在全文中表示同樣的元件。本申請所引用的所有出版物、專利、專利申請和其他參考文獻(xiàn)在此通過援引整體并入，如同特意和單獨指出每一出版物、專利、專利申請或其他參考文獻(xiàn)通過援引并入。在獲得本文描述和附圖所呈現(xiàn)的教導(dǎo)的益處后，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會想到本文所闡述的本發(fā)明的許多修飾和其他方面。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非限于所公開的具體方面，且修飾和其他方面包括于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。盡管本文使用了特定術(shù)語，但是它們僅以一般性和描述性意義使用，不是出于限制目的而使用。冠詞“a (—個)”和“an (—個)”在本文中用于表示一個或多個(即至少一個) 該冠詞的語法對象。作為實例，“元件(an element)”表示一個或多個元件。定義如本文所用，術(shù)語“選擇劑”表示包括作用是可以允許區(qū)分用異源序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與在轉(zhuǎn)化過程中未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何化合物，所述異源序列是，如在轉(zhuǎn)化過程中引入的賦予對該選擇劑的抗性的基因。細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。示例性的選擇劑包括但不限于卡那霉素、潮霉素、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、紅霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、雙丙氨磷、草甘膦、草銨膦、利福平或麥草畏等。如本文所用，術(shù)語“反選擇劑”表示包括作用是殺死植物、植物細(xì)胞或植物組織中的農(nóng)桿菌細(xì)胞或降低農(nóng)桿菌生長、增殖或存活的任何化合物。示例性的反選擇劑包括但不限于羧芐青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、氧哌嗪青霉素、羥基噻吩青霉素、頭孢他啶、頭孢布宗、頭孢米諾、拉氧頭孢、氟氧頭孢、氨曲南、卡蘆莫南、美羅培南等。如本文所用，術(shù)語“植物”包括提到未成熟或成熟的完整植物，包括已經(jīng)去雄或者已經(jīng)除去種子或谷粒的植物。會產(chǎn)生植物的種子或胚也認(rèn)為是植物。如本文所用，術(shù)語“植物部分”包括葉、莖、根、種子、谷粒、胚、花粉、胚珠、花、穗、玉米穗軸、外殼、柄、根尖、花粉囊、果皮、穗絲、組織、細(xì)胞等?！皩φ铡被颉皩φ辙r(nóng)桿菌”提供了測量營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、生長或增殖中或利用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌所獲得的轉(zhuǎn)化頻率中的變化的參照點。對照農(nóng)桿菌可以包括例如(a)野生型原養(yǎng)型農(nóng)桿菌，即與作為導(dǎo)致候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的用于基因改變的起始材料的基因型相同的農(nóng)桿菌；(b)在原養(yǎng)型條件下的候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌自身，其中缺少營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌存活、生長或增殖所需的化合物； 或(c)在營養(yǎng)缺陷條件下的候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌自身，其中存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、生長或增殖所需的化合物。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指將期望的DNA序列引入植物細(xì)胞的基因組中，包括但不限于通常不存在于植物細(xì)胞中的基因或DNA序列、存在于給定的基因組中但通常不轉(zhuǎn)錄和翻譯(“表達(dá)”)的基因或期望引入基因組的任何其他基因或DNA序列。這可以包括通常存在于非轉(zhuǎn)基因基因組中但期望其表達(dá)改變或期望其以改變的形式或變體形式引入的基因。 術(shù)語轉(zhuǎn)基因還用于描述已經(jīng)或即將被人工插入植物或植物細(xì)胞的基因組的遺傳材料。本發(fā)明涉及營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的用途。本文描述了新農(nóng)桿菌營養(yǎng)缺陷體和轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。特別是，可用本發(fā)明的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌在植物或植物組織中的存在受到調(diào)節(jié)。因此，如果未被除去，則與對照例如原養(yǎng)型、非營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌相比，植物、植物細(xì)胞或植物組織中可存活的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的水平降低。本發(fā)明還提供了利用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌以生物學(xué)的方式防范包含轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌的方法。本發(fā)明的另一方面部分基于使用本發(fā)明的農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體轉(zhuǎn)化玉米未成熟的胚不需要使用諸如抗生素的反選擇劑。因此，本發(fā)明還提供了，通過使用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌在無抗生素反選擇的情況下轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。該方法還具有降低植物或植物組織中由于利用轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)而產(chǎn)生的可存活的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌的存在的優(yōu)勢。利用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌產(chǎn)生的其他優(yōu)勢、利益或作用在本文的其他地方做了描述。本發(fā)明的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌包括不能合成一種或多種其生長、增殖或存活所需的化合物或合成其生長、增殖或存活所需的化合物的量的能力受到削弱的農(nóng)桿菌。營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的實例包括但不限于氨基酸、核酸、碳水化合物或維生素代謝或其組合缺陷的農(nóng)桿菌。因此，對于參與代謝途徑中維生素、DNA、RNA、氨基酸或碳水化合物的生物合成或此類生物合成途徑的調(diào)節(jié)的一個或多個基因而言，營養(yǎng)缺陷體是無效的或缺陷的。還包括具有一個或多個不能產(chǎn)生活性蛋白或活性充分的蛋白以致使得農(nóng)桿菌對于特定化合物而言是營養(yǎng)缺陷體的編碼蛋白的基因的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌，所述蛋白調(diào)節(jié)代謝途徑或參與生物合成途徑。這類基因的實例包括但不限于間接或直接產(chǎn)生或調(diào)節(jié)以下的基因任何氨基酸， 如異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、色氨酸；任何核酸，如嘌呤堿或嘧啶堿，如胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胸苷、腺嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤，以及2-氨基嘌呤，或其任何前體，核苷，如胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷和肌苷；任何維生素，如硫胺和泛酸鹽/酯。一方面，農(nóng)桿菌營養(yǎng)缺陷體是胸苷營養(yǎng)缺陷體。如本文所用，術(shù)語“胸苷營養(yǎng)缺陷體”、“農(nóng)桿菌的胸苷營養(yǎng)缺陷體”、“農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體”和/或“胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌”在本文中互換使用并包括但不限于所公開的實例以及基因受到破壞以致通過本文所述測定證明農(nóng)桿菌對于胸腺嘧啶或胸苷或其衍生物而言是營養(yǎng)缺陷體的營養(yǎng)缺陷體，所述基因調(diào)節(jié)或參與胸腺嘧啶合成途徑，例如導(dǎo)致胸腺嘧啶合成的代謝途徑。一種這類基因的實例是thyA，其是編碼胸苷酸核酶的基因，胸苷酸核酶是將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP的蛋白。一方面，農(nóng)桿菌營養(yǎng)缺陷體是屬于農(nóng)桿菌屬的任何細(xì)菌，其對于至少一種特定化合物而言是營養(yǎng)缺陷型的，并且能將一種或多種轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌屬的任何合適的種類或菌株都可以用于本發(fā)明中。一方面，農(nóng)桿菌是屬于發(fā)根農(nóng)桿菌或根癌農(nóng)桿菌的種類的農(nóng)桿菌。一方面，農(nóng)桿菌是菌株LBA4404、EHA101、C58、EHA105、AGL1或GV3101等。 本發(fā)明的根癌農(nóng)桿菌LBA4404thy-于2009年12月15日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的專利保藏處(Patent Depository of American Type Culture Collection,ATCC)，其位于
910801 University Blvd. ,Manassas, Va.，20110-2209，并且指定專利保藏號為 PTA-10531。 因此，包含ThyA敲除的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的組合物，即LBA4404thy-，其作為專利保藏號 PTA-10531而保藏。該保藏物會依據(jù)布達(dá)佩斯條約有關(guān)為專利程序的取得國際承認(rèn)的微生物保藏的規(guī)定而維持。進(jìn)行該保藏僅僅是為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員，而不是承認(rèn)是依據(jù) 35U. S. C. § 112要求的保藏。2009年12月15日保藏于ATCC的LBA4404thy-采集自先鋒國際良禾中公司(Pioneer Hi-Bred International, Inc. ,7250 NW 62nd Avenue, Johnston, Iowa 50131-1000)所維持的保藏物。在本申請懸而未決階段，專利和商標(biāo)委員和經(jīng)請求而被所述委員決定授權(quán)的人對該保藏物有使用權(quán)。與本發(fā)明的方法一起使用的合適的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌包括但不限于天然存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌即自發(fā)的營養(yǎng)缺陷體，和產(chǎn)生的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌。候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌可以通過任何數(shù)量的合適的技術(shù)和方法產(chǎn)生，包括例如化學(xué)誘導(dǎo)突變，例如通過用亞硝基胍或紫外線照射化學(xué)處理農(nóng)桿菌以誘導(dǎo)突變或利用重組DNA技術(shù)的基因工程。這類技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、結(jié)合、定點誘變和其他技術(shù)，通過所述其他技術(shù)可以將外源核酸分子引入農(nóng)桿菌并且“敲除”或破壞靶基因或基因產(chǎn)物，例如通過靶基因或部分基因序列的缺失、插入和取代，以便破壞表達(dá)。優(yōu)選農(nóng)桿菌基因組中靶序列或基因的缺失降低回復(fù)突變的發(fā)生。缺失、插入或取代靶基因的一方法是，通過使用包含靶基因或其片段敲除的核酸構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法產(chǎn)生，所述方法可見于諸如例如 Sambrook et al. Molecular Cloning (分子克隆)，2nd edition (第二版)·，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 禾口 Ausubel, et al.Short Protocols in Molecular Biology (精編分子生物學(xué)指南)，3rd ed.(第三版)，Wiley&Sons，1995的標(biāo)準(zhǔn)教材中。一方面，核酸構(gòu)建體包含與全部或部分野生型靶基因同源的至少兩個序列，以便能通過同源重組整合。一方面，序列位于所有或部分靶基因的側(cè)翼。一方面，在允許核酸構(gòu)建體與野生型靶基因之間同源重組的條件下，核酸構(gòu)建體接觸包含靶基因的農(nóng)桿菌的染色體DNA。取決于所用的同源序列，核酸構(gòu)建體與野生型靶基因之間的同源重組可以導(dǎo)致核酸構(gòu)建體整合到鄰近或位于野生型基因或基因座內(nèi)的農(nóng)桿菌染色體中。作為同源重組和整合的結(jié)果，可以從農(nóng)桿菌染色體中除去所有或部分農(nóng)桿菌野生型靶基因。破壞LBA4404的ThyA基因的方法詳細(xì)描述于本文的實施例1中。這些技術(shù)很容易地用于破壞其他農(nóng)桿菌種類和菌株的 ThyA基因?？蛇x地，一方面，整合到農(nóng)桿菌染色體DNA中的核酸構(gòu)建體包含連接于多核苷酸序列的選擇標(biāo)記基因，所述多核苷酸序列靶向參與代謝途徑中維生素、DNA、RNA、氨基酸或碳水化合物的生物合成或這類生物合成途徑調(diào)節(jié)的一個或多個基因。合適的選擇標(biāo)記基因包括賦予農(nóng)桿菌表型以致可以鑒定具有整合到其DNA中的選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的任何基因。示例性的選擇標(biāo)記基因包括但不限于報道基因，諸如綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶、分泌的堿性磷酸酶(SEAP)、半乳糖苷酶等的可視標(biāo)記基因，抗生素抗性基因， 如卡那霉素、鏈霉素、羧芐青霉素、氯霉素、氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素或壯觀霉素抗性基因。除了篩選以外，選擇標(biāo)記基因還允許維持對轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌群的選擇壓力，以確保引入的核酸構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌保留。因此，候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌可以經(jīng)歷允許選擇具有整合到農(nóng)桿菌染色體DNA的選擇標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌的條件。例如，如果選擇標(biāo)記基因編碼賦予特定抗生素抗性的肽，則可以使候選農(nóng)桿菌經(jīng)歷該抗生素。一方面，可以使農(nóng)桿菌經(jīng)歷允許選擇營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌可以利用常規(guī)技術(shù)評估，包括在支持原養(yǎng)型生長的環(huán)境如培養(yǎng)基或土壤中培養(yǎng)候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌，并給所述環(huán)境補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷體存活、生長或增殖所需的化合物。經(jīng)歷了原養(yǎng)型條件的候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、生長或增殖， 可以在存在和/或缺少所述化合物的情況下進(jìn)行測定。參閱例如實施例3，其描述了，檢測胸苷酸核酶基因敲除的候選農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體在存在或缺少胸苷的情況下的生長能力?？梢允?fàn)I養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌生長于任何合適的培養(yǎng)基中，如但不限于營養(yǎng)肉湯、AB基本培養(yǎng)液(AB minimal broth)等?？捎糜跈z測農(nóng)桿菌生長的測定包括但不限于細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞活性、細(xì)胞質(zhì)量(cell mass)，例如通過利用光密度或濁度。參閱例如，Pelczar，J. , et al.， Microorganisms-Bacteria, Quantitative Measurement of Growth, in Microbiology. McGraw-Hill Book Company =New York(1986)，通過援引整體并入。在缺少所述化合物的情況下，候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、生長或增殖降低或無，但在存在所述化合物的情況下，所述候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、生長或增殖存在或增加，表示候選者是營養(yǎng)缺陷型的。將抗生素用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法中以治愈殘留農(nóng)桿菌的靶植物組織培養(yǎng)物。因為細(xì)菌比植物細(xì)胞生長的更迅速，因此植物材料會快速地被農(nóng)桿菌殺死。盡管最有效的抗生素殺死或阻止農(nóng)桿菌生長，但是它們常常對植物生長是毒性的，因此在有效殺死農(nóng)桿菌的量與對植物組織引起最小量損害的量之間保持根據(jù)經(jīng)驗決定的平衡。這經(jīng)常導(dǎo)致農(nóng)桿菌的較不完全殺死，從而導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化的植物組織和由轉(zhuǎn)化的植物組織再生的植物中存在小量殘留的可存活的農(nóng)桿菌(Mogilner，N.，et al.，The persistence of engineered Agrobacterium tumefaciens in agroinfected plants, Molecular Plant Microbe Interactions,6 (5) :673-675 (1993) ；Landsmann, J. , et al. , Elimination of agrobacteria from transgenic plants, in Methods for risk assessment of transgenic plants :3. Ecological risks and prospects of transgenic plants, where do we go from here ？ A dialogue between biotech industry and science, K. Ammann, Jacot, Y. , Kjellsson, G. , Simonsen, V. , Editor. Birkhauser Verlag AG Basel. 63-67 (1999)。不知道殘留的農(nóng)桿菌被傳遞給后代(Landsmann，J.，et al.， Elimination of agrobacteria from transgenic plants, in Methods for risk assessment of transgenic plants :3. Ecological risks and prospects of transgenic plants, where do we go from here ？ A dialogue between biotech industry and science, K. Ammann, Jacot, Y. , Kjellsson, G. , Simonsen, V. , Editor. Birkhauser Verlag AG =Basel. 63-67(1999)。據(jù)推測，植物組織中殘留的農(nóng)桿菌細(xì)胞可以來自幸免于所應(yīng)用的反選擇劑或通過圍繞在轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞而受到免于所應(yīng)用的反選擇劑的保護(hù)的農(nóng)桿菌。 如果直接釋放再生的植物，則農(nóng)桿菌的存在提出了基因工程生物偶然釋放到環(huán)境中的可能性的憂慮。有利的是，一方面，本發(fā)明提供了以生物學(xué)方式防范容納一個或多個目的轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌的方法。有利的是，在一實施方案中，本發(fā)明包括基因有缺陷且在感染和共培養(yǎng)后無需抗生素就能被除去的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌。實現(xiàn)這一點的一種方式使通過使用農(nóng)桿菌的胸苷營養(yǎng)缺陷體。因為胸苷通常不包括于用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)基制劑中，因此感染和共培養(yǎng)過程的培養(yǎng)基必須補(bǔ)充有胸苷，以便允許農(nóng)桿菌進(jìn)行其基因轉(zhuǎn)移過程。然而，在 T-DNA送遞后，可以省略植物培養(yǎng)基中的胸苷，并將剩余的農(nóng)桿菌排除。因此，如圖4的步驟3所示，標(biāo)準(zhǔn)方法需要添加反選擇劑如抗生素，以便治愈殘存農(nóng)桿菌的植物組織。相反，如圖4的步驟3所示，改良的方法，即本發(fā)明方法的一實施方案不包括反選擇劑如抗生素，因為農(nóng)桿菌營養(yǎng)缺陷體由于營養(yǎng)缺陷而死亡。在某些實施方案中，營養(yǎng)缺陷體含有賦予植物細(xì)胞期望的表型的轉(zhuǎn)基因。這類轉(zhuǎn)基因包括但不限于賦予以下性狀的轉(zhuǎn)基因非生物應(yīng)激耐受，動物飼料所需的性狀，昆蟲、疾病或除草劑抗性所需的性狀，加工、加工產(chǎn)物所需的形狀如高油(如U. S. Intent No. 6，232，529)、修飾的油(如脂肪酸去飽和酶基因(U. S. Patent No. 5，952，544 ；WO 94/11516)、修飾的淀粉(如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，以及諸如雄性不育、柄強(qiáng)度、開花時間的農(nóng)藝學(xué)性狀，或諸如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因?qū)虻淖儜B(tài)技術(shù)性狀(如WO 99/61619.W0 00/17364、WO 99/25821)。因此，一方面，所述方法包括利用包含一個或多個目的轉(zhuǎn)基因的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。一方面，所述方法包括，在存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活所需的化合物的情況下，利用包含一個或多個目的轉(zhuǎn)基因的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。利用營養(yǎng)缺陷體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，通常進(jìn)行足以將T-DNA從營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的時間。適合與本發(fā)明的方法一起使用的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的構(gòu)建，描述于本文的其他地方。一方面，植物細(xì)胞是未成熟的胚，如玉米的未成熟胚。利用本發(fā)明的方法和 LBA4404Thy-營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化玉米雜交系和自交系的未成熟的胚，且在利用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌和原養(yǎng)型LBA4404農(nóng)桿菌對照的轉(zhuǎn)化實驗之間的轉(zhuǎn)化頻率未觀察到顯著差異。待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以是雙子葉的或單子葉的，包括但不限于高粱、玉米、水稻、小麥、 大豆、向日葵、卡諾拉(canola)、苜蓿、大麥或粟細(xì)胞。因此，一方面，所述方法包括，在存在營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活所需的化合物的情況下，使植物細(xì)胞與營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌接觸足以發(fā)生T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的時間。在不希望受限于該理論的情況下， 認(rèn)為該化合物的存在會允許營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌進(jìn)行其基因轉(zhuǎn)移過程。在經(jīng)常通過T-DNA載體的轉(zhuǎn)基因送遞后，可以將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的混合物暴露于缺少營養(yǎng)缺陷體的生長、增殖和/或存活所需的化合物或缺少足夠水平的這樣的化合物的環(huán)境。例如，可以將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌暴露于植物培養(yǎng)基中，其中營養(yǎng)缺陷體的生長、增殖和/或存活所需的化合物已經(jīng)被省略。一方面，所述方法不包括利用農(nóng)桿菌反選擇劑殺死或減少植物組織中容納一種或多種轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活，這通常在感染和/或共轉(zhuǎn)染步驟之后所使用，例如，在再生階段。相反，在其方法的一方面，本發(fā)明包括將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞暴露于缺少足夠數(shù)量的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活所需的化合物的環(huán)境。這允許轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因和基本不含轉(zhuǎn)化過程中所用的可存活的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的植物組織或植物。例如，胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌在缺少外源胸腺嘧啶或胸苷的環(huán)境中不可存活。如本文所用，當(dāng)利用光密度測量時，如果在植物組織或植物中檢測不到可存活的農(nóng)桿菌生長、 增殖或存活，則通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化和再生的植物組織或植物基本不含可存活的營養(yǎng)缺
12陷型農(nóng)桿菌，參閱，例如，Pelczar, J. , et al. , Microorganisms-Bacteria, Quantitative Measurement of Growth,in Microbiology. 1986, McGraw-Hill Book Company :New York, 通過引用將其整體并入。有利的是，本發(fā)明的方法允許以生物學(xué)方式防范包含轉(zhuǎn)基因的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌。一方面，所述方法包括使植物細(xì)胞與選擇劑接觸，以便選擇含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其是通常在共培養(yǎng)后進(jìn)行的步驟。一方面，如本文所討論的，轉(zhuǎn)基因是選擇標(biāo)記基因， 或連接于允許通過選擇劑選擇的選擇標(biāo)記基因。合適的選擇標(biāo)記基因包括，賦予植物細(xì)胞表型以便具有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以得到鑒定的任何基因。示例性的選擇標(biāo)記基因包括但不限于報道基因，諸如綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶、分泌的堿性磷酸酶 (SEAP)、半乳糖苷酶等的可視的標(biāo)記基因，以及抗生素抗性基因，如卡那霉素、鏈霉素、 羧芐青霉素、氯霉素、氨芐青霉素、紅霉素、四環(huán)素或壯觀霉素抗性基因。除了篩選以外，選擇標(biāo)記基因還允許維持對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群的選擇壓力，以便確保引入的轉(zhuǎn)基因和任何控制性啟動子和/或增強(qiáng)子被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞保留。因此，可以使植物細(xì)胞經(jīng)歷允許選擇具有選擇標(biāo)記基因的植物細(xì)胞的條件。例如，如果選擇標(biāo)記基因編碼賦予特定抗生素抗性的肽，則可以使植物細(xì)胞經(jīng)歷該抗生素。將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞暴露于缺少營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活所需的足夠數(shù)量的特定化合物的環(huán)境中達(dá)足夠的時間量，其結(jié)果是營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長或增殖降低或死亡。營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長或增殖降低或死亡可以利用任何數(shù)量的測定或技術(shù)測定，包括但不限于光密度，參閱，例如，Pelczar, J.，et al.，Microorganisms-Bacteria, Quantitative Measurement of Growth, in Microbiology.1986, McGraw-Hill Book Company :New York。在另一方面，所述方法包括，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的植物。 可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或瞬時轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。利用任何熟知的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，可以使植物細(xì)胞生成植物組織或愈傷組織。有利的是，本發(fā)明的方法不及傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法昂貴，因為諸如抗生素的反選擇劑經(jīng)常是轉(zhuǎn)化所用的培養(yǎng)基中最昂貴的成分之一。因為除去了抗生素對植物細(xì)胞的作用，因此預(yù)計更高的轉(zhuǎn)化效率。在不期望受限于該理論的情況下，據(jù)信，轉(zhuǎn)化效率的增加來自除去了選擇劑對植物細(xì)胞生存力的不利影響。
實施例下述實施例對本發(fā)明做了進(jìn)一步限定，其中，除非另有說明，部分和百分比按重量計，度數(shù)按攝氏度計。本文所述每一參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此通過援弓丨整體并入。實施例1 胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌LBA4404thy_的構(gòu)建胸苷營養(yǎng)缺陷型根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404 (LBA4404thy_)，通過天然ThyA區(qū)和包含工程ThyA缺失的區(qū)的PCR產(chǎn)生的克隆之間兩次連續(xù)同源重組產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以通過這種方法和相關(guān)方法產(chǎn)生許多可能的缺失、變體等，且突變的準(zhǔn)確說明和所述方案的細(xì)節(jié)，并非意圖限制。寡核苷酸(本文其他地方所述的SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 4)獲得自htegrated DNA ^Technologies，Coralville，IA，其用于PCR擴(kuò)增預(yù)測的989堿基對(bp)區(qū)，所述區(qū)從根癌農(nóng)桿菌C58的公開的264個氨基酸的ThyA編碼基因的第20個密碼子的第2個堿基對的上游開始延伸；并用于擴(kuò)增從第2 個密碼子的第一個堿基對的下游開始延伸的預(yù)測的 883bp區(qū)。這兩個待擴(kuò)增的區(qū)包括密碼子8-20區(qū)，融合于密碼子2沈-234區(qū)，包括于跨越每次擴(kuò)增的共有區(qū)的寡核苷酸中。根癌農(nóng)桿菌C58 ThyA CDS的密碼子17-19包括用于將兩個擴(kuò)增的區(qū)克隆在一起的KspI位點。將每個片段中的共有融合序列添加于分別產(chǎn)生了大小為1013bp和921bp的預(yù)測的PCR產(chǎn)物的預(yù)測的上游和下游區(qū)。PCR反應(yīng)利用LBA4404(pSBl) (Komari et al，The Plant Journal (1996) 10 (1) : 165-174)總基因組 DNA 作模板并利用 Platinum Pfx DNA聚合酶Qnvitrogen, Carlskid，CA)，產(chǎn)生了通過瓊脂糖凝膠電泳與預(yù)測的大小一致的PCR產(chǎn)物。最初將上游和下游PCR產(chǎn)物克隆到pBluescript SK+(Stratagene， Cedar Creek, TX)中，分別作為KspI/EcoRI和KspI/PCR鈍末端片段，并測序。與公開的根癌農(nóng)桿菌C58序列相比，在ThyA附近，上游和下游克隆的測序揭示了許多小差異(包括在上游區(qū)的55bp缺失)，但總的同源性分別為約84%和88%。將下游克隆在其共有的KspI位點連接于上游克隆，并將所得的ThyA缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到在農(nóng)桿菌中賦予壯觀霉素抗性(SpcK)的pSBll(Japan Tobacco, Iwata, Japan)的衍生物中。通過電穿孔和在YEM瓊脂培養(yǎng)基(0. 4g/L酵母提取物、10g/L甘露醇、0. lg/L NaCl, 0. 2g/L MgS04 七水混合物、0. 5g/L KH2PO4 pH 7. 0+25 μ g/mL 壯觀霉素)中選擇，將 ThyA 缺失Spcl^建體引入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。用SEQ ID NO :5_SEQ ID NO :8的寡核苷酸作為PCR引物，來檢測位于ThyA上游和下游的非破壞區(qū)的存在。ThyA編碼區(qū)中與引物圖譜的同源性來自根癌農(nóng)桿菌LBA4404ThyA⑶S的該部分，所述部分從ThyA缺失克隆中缺失(通過PCR，單獨克隆該區(qū))，且與來自側(cè)翼區(qū)的引物的同源性是與C58序列的同源性，所述C58 序列位于克隆的上游和下游區(qū)外，以致PCR擴(kuò)增不會進(jìn)行到已經(jīng)通過同源重組插入ThyA缺失衍生物的地方。這是由于伴隨ThyA缺失衍生物整合的大載體插入導(dǎo)致的，從而以幾千個堿基DNA分隔引物結(jié)合位點。檢測來自LBA4404轉(zhuǎn)化體候選者中每一個候選者的DNA，并用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 DNA作為對照模板。在每一反應(yīng)中，對照產(chǎn)生大約期望大小的PCR 產(chǎn)物。對于融合構(gòu)建體整合而言，僅上游PCR反應(yīng)起作用，這表明融合構(gòu)建體整合事件發(fā)生于ThyA下游。將根癌農(nóng)桿菌LBA4404 Thy缺失共合體菌株從含有50 μ g/mL胸苷的培養(yǎng)基中的新鮮劃線的單一菌落(streaked single colony)接種于3mL AB基本培養(yǎng)液+50 μ g/mL胸苷+/-甲氧芐氨嘧啶(在平行培養(yǎng)物中0，500和1000 μ g/mL)，并于^°C、250RPM孵育4 天。通過用10μ L穩(wěn)定培養(yǎng)物接種3mL相同類型的新鮮培養(yǎng)液，對所得的可視的渾濁培養(yǎng)物 (大約穩(wěn)定期)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。和以前一樣，震蕩孵育稀釋的培養(yǎng)物，從而允許培養(yǎng)物在每次稀釋后(通常3天)變得明顯渾濁。在10次稀釋中，重復(fù)稀釋和再培養(yǎng)過程。IOOOyg/ mL甲氧芐氨嘧啶的培養(yǎng)物恒定地產(chǎn)生一些表示脅迫應(yīng)答和細(xì)胞裂解的凝集材料。將75 μ L 的500 μ g/mL甲氧芐氨嘧啶的最終穩(wěn)定培養(yǎng)物和150 μ L的1000 μ g/mL甲氧芐氨嘧啶的培養(yǎng)物的等分試樣，接種于ΑΒ+50 μ g/mL胸苷中，用于影印接種，并于28C下孵育3天。影印接種在AB基本培養(yǎng)基、ΑΒ+25 μ g/mL壯觀霉素和ΑΒ+50 μ g/mL胸苷上進(jìn)行。Thy缺失共合體菌株的5個菌落被鑒定為，不能在缺少胸苷的情況下生長，并因此是Thy缺失候選者。在培養(yǎng)基中存在壯觀霉素與缺少胸苷結(jié)合，產(chǎn)生了更清晰的結(jié)果。通過重復(fù)懸浮于無菌水并在ΑΒ+50 μ g/mL胸苷上劃線，純化候選ThyA缺失營養(yǎng)缺陷體，以便獲得單一菌落。
對于ThyA缺失候選者中的2個而言，利用SEQ ID NOS 9和10作為引物對基因組DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)僅僅展現(xiàn)出一種約508bp的PCR的產(chǎn)物，這在缺少任何野生型ThyA 基因DNA的情況下表示純化的ThyA缺失構(gòu)建體，而其他候選者產(chǎn)生約IlMbp和約508bp 的PCR產(chǎn)物，這表示存在天然ThyA序列和缺失ThyA序列兩者。與SEQ ID NOS 9和10的同源性位于ThyA周圍的上游和下游區(qū)，且對于ThyA缺失衍生物而言，預(yù)測PCR反應(yīng)產(chǎn)生約508bp的PCR產(chǎn)物，相比之下，對于根癌農(nóng)桿菌LBA4404的天然ThyA基因而言，產(chǎn)生約 IlMbp的PCR產(chǎn)物。證實ThyA缺失候選者不能生長于缺少胸苷的AB基本培養(yǎng)基以及補(bǔ)充有50μg/mL胸苷+25μg/mL壯觀霉素的平板上。當(dāng)將候選者培養(yǎng)于乳糖瓊脂并暴露于班氏試劑(Benedict’ s reagent)時，產(chǎn)生酮乳糖的陽性測試也證實了候選者，這是強(qiáng)烈指示農(nóng)桿菌的檢測。引物GGGGCTAACCGTAAGGACTTAGAGCGG(SEQ ID NO 1)引物GGGTTGAGGCGCATGGTCGGCAAGTCTCCGCGGTCGGAGCCGGTTTCCATCACATGCCGG(SEQ ID NO 2)引物CCGGCATGTGATGGAAACCGGCTCCGACCGCGGAGAGCCTTGCCGACCATGCGCCTCAACCC(SEQ ID NO 3)引物CCCCTGCCCCCATGGGCCGCCACCGCCGCCC(SEQ ID NO 4)引物GCCGATGCCGTTTGCAAGTCAGC (SEQ引物 CATGGATGATCGAGCGCAGATGC (SEQ引物TTGGTGACGCGCATATCTACGCC (SEQ引物ATGATCTCTTCCAGATCGGGCGG (SEQ引物TGCGGCAAGAAGCTTGGCGTGACCGATGACAG(SEQ ID NO 9)引物GTCAGTGGAAAGCTTCCAAGGCATATCGAGGTCG(SEQ ID NO :10)實施例2 用于營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌菌株的載體利用電穿孔，用超二元載體pSBl(Komari et al，The Plant Journal (1996) 10 (1) 165-174)轉(zhuǎn)化胸苷營養(yǎng)缺陷型根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404。將電穿孔的農(nóng)桿菌細(xì)胞接種于補(bǔ)充有50yg/ml胸苷(以支持營養(yǎng)缺陷體)和2. 5 μ g/ml四環(huán)素(以選擇引入的pSBl質(zhì)粒)的基本培養(yǎng)基。維持經(jīng)證實的轉(zhuǎn)化體，作為植物轉(zhuǎn)化載體的靶菌株。再次利用電穿孔，將一種此類載體(PHP1530;3)引入LBA4404(thy_) (pSBl)中，該載體攜帶泛素啟動子驅(qū)動的GFP篩選標(biāo)記基因盒和CaMV 35S啟動子驅(qū)動的BAR基因作為選擇標(biāo)記。通過接種于
ID NO 5) ID NO 6) ID NO 7) ID NO 8)補(bǔ)充有50 μ g/ml胸苷和50 μ g/ml壯觀霉素(以選擇ΡΗΡ1530!3)的基本培養(yǎng)基，鑒定攜帶 PHP15303/pSBl共合體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞。利用三次診斷限制消化的最小值，證實共合體質(zhì)粒(ΡΗΡ30894)。還將ΡΗΡ15303引入非營養(yǎng)缺陷型LBA4404(pSBl)，作為對照。如上文，證實作為結(jié)果而發(fā)生的共合體質(zhì)粒并稱為PHP15325。實施例3 在非補(bǔ)充條件下野生型和胸苷營養(yǎng)缺陷體的比較生長采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌方案，使LBA4404 (PHP15325)和 LBA4404(thyO (PHP30894)細(xì)胞于生長于液體基本AB培養(yǎng)基中。以5mg/l，向基本AB添加胸苷，供營養(yǎng)缺陷體生長。當(dāng)細(xì)
菌培養(yǎng)物達(dá)到對數(shù)中期時，通過離心收集它們，用非補(bǔ)充的基本AB洗滌兩次，并以IO5CFU/ ml重懸浮于具有不同胸苷補(bǔ)充的液體基本AB中。通過550nm的光密度，測量細(xì)胞隨時間的生長。結(jié)果顯示于圖3中，并表明在未補(bǔ)充胸苷的情況下，LBA4404thy_不能生長。實施例4 利用胸苷營養(yǎng)缺陷體的轉(zhuǎn)化實驗如 Zhao and Ranch, Transformation of Maize Via Agrobacterium tumefaciens Using a Binary Co-Integrate Vector System, in Plant Cell Culture Protocols (利用二元共合體載體系統(tǒng)，通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米)，V. Loyola-Vargas and F. Vazquez-Flota,Editors,Humana Press =Totowa NJ. p. 315-324(2005)所詳述，實施玉米轉(zhuǎn)化。使用兩種不同的農(nóng)桿菌菌株；即野生型原養(yǎng)型LBA4404(PHP1532O和相同菌株的胸苷營養(yǎng)缺陷體 LBA4404thf (PHP30894)。如圖5所示，用PHWffE胚源材料的10個穗，進(jìn)行該實驗，同時將來自個體穗的胚分配于三個處理中。處理1 (Treatment 1)是野生型LBA4404，處理2是沒有補(bǔ)充胸苷的 LBA4404thy-，處理3是以5mg/l補(bǔ)充了胸苷的LBA4404thy_。如本實驗所示，在缺少胸苷的情況下，營養(yǎng)缺陷體不支持轉(zhuǎn)化。當(dāng)補(bǔ)充胸苷時，用營養(yǎng)缺陷體的轉(zhuǎn)化的頻率等同于原養(yǎng)型 LBA4404。不管哪一種農(nóng)桿菌用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件，單拷貝轉(zhuǎn)基因事件的頻率都是相同的， 并且由野生型或營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌所產(chǎn)生的事件的平均種子產(chǎn)量沒有區(qū)別。實施例5 胸苷營養(yǎng)缺陷體不是植物組織的明顯污染物如Zhao,Z. ,et al. ,Transformation of Maize Via Agrobacterium tumefaciens Using a Binary Co-Integrate Vector System(利用二元共合體載體系統(tǒng)，通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米)，in Plant Cell Culture Protocols, V. Loyola-Vargas and F. Vazquez-Flota,Editors,Humana Press =Totowa NJ. p. 315-324(2005)所詳述，實施玉米轉(zhuǎn)化，除了使用專有的自交系基因型PHWffE外，并且在感染后不使用反選擇抗生素治愈植物組織。野生型根癌農(nóng)桿菌LBA4404(PHP1532O和根癌農(nóng)桿菌LBA4404thy-(PHP38094)的胸苷營養(yǎng)缺陷體用于轉(zhuǎn)化。實驗方案顯示于圖4中。在用野生型農(nóng)桿菌的試驗中，在最初暴露于農(nóng)桿菌后的10天內(nèi)，通過污染性、無限制的農(nóng)桿菌的過量生長，吞噬所有處理過的胚。 相反，在用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌感染未成熟的胚后46天，不存在任何剩余的可存活的營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的細(xì)菌生長的證據(jù)。在允許野生型農(nóng)桿菌快速生長的培養(yǎng)基中，且在存在植物組織的情況下，營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌不能增殖并污染植物組織。實施例6 利用胸苷營養(yǎng)缺陷體與自交系PHR03玉米未成熟胚的轉(zhuǎn)化實驗用兩種不同的農(nóng)桿菌菌株，即野生型原養(yǎng)型LBA4404(PHP32^9)和相同菌株的胸苷營養(yǎng)缺陷體LBA4404thf (PHP38332)，每一菌株都含有T-DNA盒UBI-UBI 5UTR-UBI內(nèi)含子 1:標(biāo)記PINII-UBI-UBI 5UTR-UBI 內(nèi)含子 1: :M0_PAT: ZS-黃色 1 Ni:PINII，轉(zhuǎn)化玉米自交系PHR03未成熟的胚。用PHR03胚源材料的8個穗，進(jìn)行該實驗，同時將來自每個個體穗的胚分配到兩個處理中。處理1用原養(yǎng)型LBA4404(PHP32^9)轉(zhuǎn)化，處理2用胸苷營養(yǎng)缺陷體 LBA4404thy-(PHP38332)轉(zhuǎn)化，同時僅在感染和共培養(yǎng)過程中以50mg/l補(bǔ)充胸苷。通過用從每個處理回收的愈傷組織集落的數(shù)量除以所處理的未成熟胚的總數(shù)量而測量的轉(zhuǎn)化頻率，利用 LBA4404 時為 37. 9% (91/240)，且利用 LBA4404thyA_ 時為 36. 3% (87/240)。卡方檢驗(Chi-square)表明，這些頻率不能分辨為不同。當(dāng)僅在感染和共培養(yǎng)時補(bǔ)充胸苷，用營養(yǎng)缺陷體轉(zhuǎn)化的頻率等同于原養(yǎng)型LBA4404與自交系PHR03未成熟玉米胚的轉(zhuǎn)化頻率。
權(quán)利要求
1.在無農(nóng)桿菌(Agrobacterium)反選擇劑的情況下轉(zhuǎn)化并再生表達(dá)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞的方法，包括在存在胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖或生長所需的化合物的情況下，使植物細(xì)胞與所述胸苷營養(yǎng)缺陷體農(nóng)桿菌接觸，其中所述營養(yǎng)缺陷體包含轉(zhuǎn)基因；在存在所述胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖或生長所需的化合物的情況下，共培養(yǎng)所述植物細(xì)胞和所述胸苷營養(yǎng)缺陷體；在缺少農(nóng)桿菌反選擇劑的情況下，選擇表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；以及再生表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的植物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌包含由于缺失、部分缺失、敲除、插入或在thyA基因中引入一個或多個突變而受到破壞的thyA基因。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中通過移碼突變、同源重組或其任何組合的方式破壞所述thyA基因。
4.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌，其中所述農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)或放身寸形農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacter)。
5.如權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌，其中所述農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHAlOl、C58、 EHA105、AGL1 或 GV3101。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖或生長所需的化合物是胸苷或胸腺嘧啶。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是未成熟的胚。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物細(xì)胞包括高粱、玉米、水稻、小麥、大豆、向日葵、卡諾拉、苜蓿、大麥或粟細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反選擇劑是抗生素或除草劑。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反選擇劑包括羧芐青霉素、頭孢噻肟、硝酸銀、 萬古霉素、氧哌嗪青霉素、羥基噻吩青霉素、頭孢他啶、頭孢布宗、頭孢米諾、拉氧頭孢、氟氧頭孢、氨曲南、卡蘆莫南或美羅培南。
11.通過權(quán)利要求1所述的方法轉(zhuǎn)化和再生的植物。
12.在植物再生過程中，以生物學(xué)的方式防范轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的方法， 所述方法包括利用胸苷營養(yǎng)缺陷體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中在存在所述營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的存活、增殖或生長所需的化合物的情況下，轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，并且其中所述營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌包含轉(zhuǎn)基因；在缺少農(nóng)桿菌反選擇劑的情況下，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化的植物，由此以生物學(xué)的方式防范轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌包含由于缺失、部分缺失、敲除、插入或thyA基因中一個或多個突變的引入而受到破壞的thyA基因。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中通過移碼突變、同源重組或其任何組合的方法破壞所述thyA基因。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述化合物是胸苷或胸腺嘧啶。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是未成熟的胚。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是高粱、玉米、水稻、小麥、大豆、向日葵、卡諾拉、苜蓿、大麥或粟細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述反選擇劑是抗生素或除草劑。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述反選擇劑包括羧芐青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、氧哌嗪青霉素、羥基噻吩青霉素、頭孢他啶、頭孢布宗、頭孢米諾、拉氧頭孢、氟氧頭孢、 氨曲南、卡蘆莫南或美羅培南。
20.分離的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)，其中編碼胸苷酸核酶的thyA基因已經(jīng)受到破壞， 且其中所述營養(yǎng)缺陷體在缺少胸腺嘧啶或胸苷的情況下表現(xiàn)出不能存活、增殖或生長。
21.如權(quán)利要求20所述的農(nóng)桿菌，其中所述thyA基因已經(jīng)由于缺失、部分缺失、敲除、 插入或在所述基因中弓I入一個或多個突變而受到破壞。
22.如權(quán)利要求21所述的農(nóng)桿菌，其中通過移碼突變、同源重組或其任何組合的方法破壞所述thyA基因。
23.如權(quán)利要求20所述的農(nóng)桿菌，其中所述農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)或放身寸形農(nóng)桿菌(Agrobacterium ridiobacter)。
24.如權(quán)利要求20所述的農(nóng)桿菌，其中所述農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHAlOU C58、EHA105、AGL1 或GV3101。
25.產(chǎn)生農(nóng)桿菌(Agrobacterium)胸苷營養(yǎng)缺陷體的方法，包括構(gòu)建包含thyA基因或其片段敲除的核酸構(gòu)建體；在允許所述核酸構(gòu)建體與野生型thyA基因間同源重組的條件下，使所述核酸構(gòu)建體與包含所述野生型thyA基因的農(nóng)桿菌染色體DNA接觸；以及在允許選擇具有整合到所述農(nóng)桿菌染色體DNA的所述核苷酸構(gòu)建體的農(nóng)桿菌的條件下，選擇所述農(nóng)桿菌，由此產(chǎn)生在無胸苷或胸腺嘧啶的情況下表現(xiàn)出不能存活、增殖或生長的農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，還包括通過將候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌暴露于缺少胸腺嘧啶或胸苷的環(huán)境，并測定所述候選營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的生長、增殖或存活，選擇為農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體的農(nóng)桿菌。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將所有或部分所述農(nóng)桿菌野生型thyA基因通過同源重組從所述農(nóng)桿菌染色體中除去。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包含與所有或部分所述野生型 thyA基因同源的至少兩個序列，以便能通過同源重組整合。
29.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體的至少兩個序列位于所有或部分所述野生型thyA基因的側(cè)翼。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體的至少兩個序列連接于選擇標(biāo)記。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記賦予抗生素抗性。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述選擇標(biāo)記賦予羧芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、紅霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性。
33.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)或放身寸形農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacter)。
34.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHAlOl、C58、 EHA105、AGL1 或 GV3101。
35.分離的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)胸苷營養(yǎng)缺陷體，其通過權(quán)利要求25所述的方法產(chǎn)生。
全文摘要
提供了營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌和使用營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌的方法。營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌可以用于多種方法中，包括以生物學(xué)方式防范包含轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌并在不使用農(nóng)桿菌反選擇劑的情況下轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。利用胸苷營養(yǎng)缺陷型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚，導(dǎo)致與利用原養(yǎng)型農(nóng)桿菌所獲得的轉(zhuǎn)化相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化效率。公開了產(chǎn)生農(nóng)桿菌胸苷營養(yǎng)缺陷體和在轉(zhuǎn)化方法中利用營養(yǎng)缺陷體的方法。還提供了利用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的組織和植物。
文檔編號C12N15/74GK102282262SQ200980152408
公開日2011年12月14日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者加里·A·胡夫曼, 卡爾·W·加納特, 杰羅姆·P·倫馳, 馬提亞·列伯格賽爾 申請人:先鋒國際良種公司