專利名稱：從臍帶血有效增殖和分化自然殺傷細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從臍帶血有效增殖和分化自然殺傷細胞的方法，更確切地，本發(fā)明涉及從臍帶血有效增殖和分化自然殺傷細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將CD3 陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備CD3陰性細胞；和2、在用多種細胞因子處理后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。
背景技術(shù)：
在形成免疫系統(tǒng)的細胞中，已知自然殺傷細胞(下文稱“NK細胞”)能夠非特異性殺死癌細胞。NK細胞的這種抗腫瘤細胞毒性已被用于通過使用淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)來治療實體瘤，或已被用于細胞療法的新嘗試，所述新嘗試借助基于供體淋巴細胞輸注的免疫療法，避免骨髓移植或器官移植后發(fā)生的排斥反應(yīng) (Tilden. A. B.等人，J. Immunol.，136 :3910-3915,1986 ；Bordignon C 等人，Hematologia 84 :1110-1149，1999)。另已報道，NK細胞分化和活化的缺陷與不同種類的癌癥密切相關(guān)， 所述癌癥諸如乳腺癌(Konjevic G 等人，Breast Cancer Res. Treat. , 66 :255-263, 2001), 黑素瘤(Ryuke Y等人，Melanoma Res. , 13 :349-356,2003)和肺癌(Villegas FR等人，Lung Cancer, 35 =23-28,2002)等。因而，為了治療所述疾病，使用NK細胞的新型細胞療法手段引起了我們的注意。在細胞因子受體Y。缺失的小鼠中，仍能發(fā)現(xiàn)B細胞和T細胞，但在所述小鼠中未發(fā)現(xiàn)NK細胞。因此，認為具有Y。的那些受體在NK細胞分化中起重要作用(Singer，B等 K, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92，377-381，1995)。受體 Y。的類型為 IL-2、IL-4、IL-7、 IL-9、IL-15和IL-21，其中，據(jù)報道，IL-2在提高成熟NK細胞的增殖和活化中發(fā)揮功能 (Shibuya, A.等人，Blood 85，3538-3546，1995)。IL-2缺失的人和小鼠表現(xiàn)出顯著減少的 NK 細胞群(DiSanto, J. P.等人，J. Exp. Med. 171，1697-1704，1990)。同時，研究證明，IL-2 和IL-2Ra缺失間接影響NK細胞的活性和群。另已知，IL-2R鏈參與IL-15受體的形成。IL-15參與NK細胞的分化。在IL-15生成所需的轉(zhuǎn)錄因子干擾素(IFN)-調(diào)節(jié)因子1不足的小鼠中，觀察到NK細胞的缺失(Kouetsu等人，Nature 391,700-703,1998), 已為表明IL-15或IL-15Ra缺失小鼠中未發(fā)現(xiàn)NK細胞的研究所支持。已報道，IL-15借助NK細胞中表達的IL-15受體直接增強NK細胞的生長和分化(MrozekE等人，Blood 87， 2632-2640，1996)。IL-21是由活化的CD4+T細胞分泌的細胞因子(Nature，5 =688-697, 2005)。 IL-21R在樹突細胞、NK細胞和諸如T細胞和B細胞的淋巴細胞中表達(Rayna Takaki等人，J. Immonol 175 :2167-2173,2005)。IL-21 的結(jié)構(gòu)與 IL-2 和 IL-15 的結(jié)構(gòu)非常相似。 IL-21R 與 IL-2R、IL-15、IL-7R 和 IL-4R 等共享它的鏈(Asao 等人，J. Immunol, 167 :1_5， 2001)。根據(jù)在先的報道，IL-21誘導(dǎo)來自骨髓的NK細胞前體的成熟(Parrish-Novak等人， Nature,408 =57-63,2000)。特別地，已報道IL-21增強NK細胞的效應(yīng)子功能(如細胞因子生成和細胞毒性)(M. Strengell 等人，J Immunol, 170 :5464-5469,2003 J. Brady 等人，J Immunol, 172 =2048-2058, 2004)。它還增強⑶8+T細胞的效應(yīng)子功能，從而促進適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抗癌反應(yīng)(Rayna Takaki 等人，J Immunol 175 :2167-2173,2005 ；A. Moroz 等人， J Immunol，173 :900-909，2004)。此外，它活化分離自人外周血的NK細胞(Parrish-Novak 等人，Nature, 408 :57，2000)，并在誘導(dǎo)來自于從臍帶血中分離的造血干細胞的NK細胞的成熟中起重要作用(J. Brady 等人，J Immunol, 172 =2048,2004)。為將NK細胞有效地用于抗癌免疫細胞療法，重要的是獲得足夠數(shù)量的NK細胞。然而，NK細胞僅占血液中淋巴細胞的10% -15%，并且癌癥患者中NK細胞的群、分化和功能均下降。因此，事實上很難獲得足夠數(shù)量的NK細胞。因而，迫切需要開發(fā)借助NK細胞增殖或分化獲得大量NK細胞的方法。NK細胞來源于骨髓的造血干細胞(HSC)。此前的體外誘導(dǎo)NK細胞分化的方法是基于對分離自臍帶血并用適當(dāng)細胞因子預(yù)處理的造血干細胞的培養(yǎng)(Galy等人，Immunity 3 :459-473,1995 ；Mrozek E 等人，Blood 87 :2632-2640,1996 ；Sivori, S.等人，Eur J Immunol. 33 :3439-3447,2003 ；B. Grzywacz 等人，Blood 108 :3824-3833,2006)。也就是說，將Flt-3L、IL-7、SCF和IL-15添加至CD34+ HSC,隨后培養(yǎng)5周以誘導(dǎo)分化為CD3TD56+ NK細胞。然而，很難獲得用于治療的足夠數(shù)量的細胞，并且誘導(dǎo)該分化需要長時間和高成本，這使其難以進行臨床應(yīng)用。迄今已知NK細胞源自⑶34+ HSC。然而，它們通過多個前體步驟被分化。盡管尚未鑒定出所有前體，最具代表性的前體是CD122+細胞。尚無CD3—細胞是NK前體的報道。本發(fā)明人等試圖開發(fā)用于獲得NK細胞的更為有效且經(jīng)濟的方法。結(jié)果，本發(fā)明人等通過確認由如下步驟組成的新方法而完成了本發(fā)明，所述新方法能夠有效促進NK細胞生長和分化并提高NK細胞的細胞毒性，所述步驟為通過將CD3陽性細胞從分離自臍帶血的單核細胞中清除，來制備CD3陰性細胞，并培養(yǎng)已用諸如IL-15和IL-21的細胞因子預(yù)處理后的⑶3陰性細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供從臍帶血有效增殖和分化NK細胞的方法，所述方法由如下步驟組成1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞； 和2)在用多種細胞因子預(yù)處理所述細胞后，培養(yǎng)CD3陰性細胞，并由此優(yōu)化NK細胞的增殖和分化條件。本發(fā)明另一目的在于提供用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物，所述組合物包含由本發(fā)明所述方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞，本發(fā)明另一目的還在于提供用于癌癥的預(yù)防性和治療性方法，所述方法使用具有提高的細胞毒性的NK細胞。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供增殖NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。本發(fā)明還提供分化NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。本發(fā)明還提供制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。本發(fā)明還提供用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物，所述組合物包含由所述方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞。本發(fā)明還提供用于治療癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的所述組合物給予患有癌癥的受試者的步驟。本發(fā)明還提供預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的所述組合物給予受試者的步驟。此外，本發(fā)明提供由本發(fā)明所述方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞在用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物的生產(chǎn)中的用途。與使用常規(guī)造血干細胞的方法相比，本發(fā)明的增殖和分化NK細胞的方法通過從 CD3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞的分化，可以產(chǎn)生具有更高純度的NK細胞，本發(fā)明的增殖和分化 NK細胞的方法通過用不同細胞因子IL-15和IL-21共處理細胞而有利于NK細胞的增殖和分化。結(jié)果，所述方法可以產(chǎn)生具有提高的細胞毒性的NK細胞，所述NK細胞因而可以有效地用于抗癌治療。


參照以下附圖，可以最好地理解對本發(fā)明優(yōu)選實施方式的應(yīng)用，其中圖1是示出雙色流式細胞術(shù)(two-color flow cytometry)結(jié)果的一組圖。單核細胞(MNC)分離自人臍帶血。隨后，通過將其中的CD3陽性T細胞清除來獲得CD3陰性細胞。進行雙色流式細胞術(shù)以研究CD3陰性細胞和單核細胞的純度。圖2是示出在用細胞因子(IL-2、IL_15和IL-21)處理⑶3陰性細胞后，⑶3陰性細胞群隨時間的變化圖，觀察所述變化以研究細胞因子對CD3陰性細胞生長的作用。圖3是示出由FACS分析到的NK細胞(⑶3_CD56+)比例的一組圖，用以研究細胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)對NK細胞分化的作用。用不同組合的所述細胞因子處理⑶3陰性細胞，隨后進行培養(yǎng)。隨后，進行FACS以分析NK細胞比例。圖4是示出NK細胞(CD3XD56+)比例的統(tǒng)計學(xué)分析的圖，進行該分析是為了研究細胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)對NK細胞分化的直接作用。用不同組合的細胞因子處 CD3陰性細胞，隨后進行培養(yǎng)。隨后，研究NK細胞比例。圖5是示出FACS結(jié)果的一組圖，所述結(jié)果顯示了以兩種組合的細胞因子 (IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)處理的組中所培養(yǎng)的NK細胞比例，所述組合被認為是在誘導(dǎo)分化和增殖中最為有效的組合。圖6是示出NK細胞組的51Cr分泌測定法結(jié)果的圖，用所述兩種在誘導(dǎo)分化和增殖中最為有效的細胞因子(IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)組合處理所述NK細胞組后再進行培養(yǎng)，所述測定法的進行是為研究細胞因子對NK細胞細胞毒性的直接作用。圖7是示出NK細胞組的LDH活性測定法結(jié)果的圖，用所述兩種在誘導(dǎo)分化和增殖中最為有效的細胞因子(IL-15+IL-21，IL-2+IL-15+IL-21)組合處理所述NK細胞組后再進行培養(yǎng)，所述測定法的進行是為研究細胞因子對NK細胞細胞毒性的直接作用。
具體實施例方式下文描述了本發(fā)明中所使用的術(shù)語。本發(fā)明所使用的術(shù)語“預(yù)防”表示通過給予本發(fā)明組合物而能抑制癌癥發(fā)作或轉(zhuǎn)移、或者延緩癌癥進程的各種行為。本發(fā)明所使用的術(shù)語“治療，，和“改善，，表示通過給予本發(fā)明所述組合物能有利地改變癌癥癥狀或轉(zhuǎn)移的各種行為。本發(fā)明所使用的術(shù)語“給予”表示根據(jù)適當(dāng)方法向受試者提供所需量的本發(fā)明組合物的行為。本發(fā)明所使用的術(shù)語“受試者”表示人或包括猴、狗、山羊、豬和大鼠在內(nèi)的任何動物，在這些動物中，通過給予本發(fā)明的組合物可抑制癌癥進展或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所使用的術(shù)語“藥學(xué)上有效的劑量”表示為臨床治療合理接受的組合物的量，或足以抑制癌癥進展或轉(zhuǎn)移的量?？梢愿鶕?jù)疾病種類、疾病嚴(yán)重程度、藥物活性、敏感性、給予期限和途徑、排泄速率、治療周期、會一起使用的其它藥物以及醫(yī)藥領(lǐng)域公知的其它因素來確定所述劑量。下文詳細描述了本發(fā)明。本發(fā)明提供增殖NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。在上述方法中，可以通過但并非總限于下述方法來完成步驟1)中CD3陰性細胞的制備利用CD3微珠使CD3陽性細胞具有磁性，從而能夠被MACS柱過濾，以分離其中的CD3 陰性細胞的方法；或者用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞的方法，通過使用細胞分選儀分離所述 CD3陰性T細胞。為制備本發(fā)明的CD3陰性細胞，首先從臍帶血分離單核細胞層(MNC層)。隨后，通過從MNC層清除紅細胞來獲得單核細胞。向其中添加⑶3微珠(Miltenyi Biotech)以使 ⑶3+細胞具有磁性，使其通過MACS柱以將⑶3_細胞和⑶3+細胞分開。結(jié)果，從單核細胞中回收到了⑶3_細胞(產(chǎn)率32%)。⑶3陰性細胞的平均純度為88% (參見表1、表2和圖 1)。在上述方法中，步驟2)的細胞因子優(yōu)選為選自于由IL2、IL-15和IL-21組成的組中的至少2種，并且更優(yōu)選的是用IL-15和IL-21 —起共處理或IL_2、IL_15和IL-21 — 起共處理，然而并不總限于此。本發(fā)明還研究了細胞因子對NK細胞增殖的作用。為此，分別培養(yǎng)了未用細胞因子處理的⑶3陰性細胞組、IL-2處理的⑶3陰性細胞組、IL-2和IL-15共處理的⑶3陰性細胞組、IL-15和IL-21共處理的CD3陰性細胞組以及IL_2、IL_15和IL-21共處理的CD3陰性細胞組。隨后，利用FACS分析⑶3TD56+ NK細胞的比例。結(jié)果，在未用細胞因子處理的組和僅用IL-2處理的組中，NK細胞群略有減少。同時，在余下的組中，細胞群持續(xù)增加至第18天。自第18天起，所述細胞群開始減少。在這些組中，用IL-2、IL-15和IL-21三者處理的細胞組和用IL-15及IL-21共處理的組表現(xiàn)出良好的細胞生長速率(見圖2)。因此，已確認，在用IL-15和IL-21共處理時或在用IL-2、IL-15和IL-21三者一起處理時，可以加速CD3陰性細胞生長。在本發(fā)明中，將來自造血干細胞的NK細胞分化與來自CD3陰性細胞的NK細胞的分化進行比較。為此，分別從臍帶血來源的造血干細胞和⑶3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞分化。 隨后，通過FACS研究NK細胞群率。結(jié)果，在短時間段內(nèi)，使用CD3陰性細胞而非使用造血干細胞，獲得了具有高純度的增加的NK細胞群。特別地，大規(guī)模地獲得了原代CD3陰性細胞， 所述原代CD3陰性細胞可進一步增殖多達15倍。因而，最終獲得大量NK細胞(見表3-表 6)。相比通過使用造血干細胞誘導(dǎo)NK細胞增殖的方法，已證明通過使用⑶3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞增殖的方法更有效地在短時間段內(nèi)獲得大量NK細胞。本發(fā)明還提供分化NK細胞的方法，所述方法包括以下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。在上述方法中，可以通過但并不總限于下述方法來完成步驟1)中⑶3陰性細胞的制備利用CD3微珠使CD3陽性細胞具有磁性，從而能夠被MACS柱過濾，以分離其中的 CD3陰性細胞的方法；或者用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞的方法，通過使用細胞分選儀分離所述⑶3陰性T細胞。在上述方法的步驟幻中，優(yōu)選用兩種或更多種細胞因子一起處理，所述細胞因子選自于由IL-2、IL-15和IL-21組成的組。特別地，優(yōu)選用IL-15和IL-21共處理或更優(yōu)選用IL-2、IL-15和IL-21三者共處理，但并非總限于此。為研究細胞因子對NK細胞分化的作用，在本發(fā)明中，用不同組合的細胞因子處理 ⑶3陰性細胞，隨后通過使用FACS分析NK細胞群率。結(jié)果，與僅用IL-2處理或未用任何細胞因子處理的其它組相比，用兩種或更多種細胞因子處理的組表現(xiàn)出高分化率。用兩種或更多種細胞因子共處理的細胞組表現(xiàn)出高分化率，自第8天起達到至少90%。用兩種細胞因子IL-15和IL-21處理以及用IL-2、IL-15和IL-21全部三種處理的那兩組表現(xiàn)出相似的高分化率(見圖3和圖4)。因此，已確認，在從⑶3陰性細胞誘導(dǎo)的NK細胞的分化中，用IL-15和IL-21共處理或用IL-2、IL-15和IL-21共處理更有效。在本發(fā)明中，將來自造血干細胞的NK細胞分化與來自CD3陰性細胞的NK細胞分化進行比較。為此，分別從臍帶血來源的造血干細胞和CD3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞分化。隨后，通過FACS研究NK細胞群率。結(jié)果，在短時間段內(nèi)，使用⑶3陰性細胞而非使用造血干細胞，獲得了具有高純度的增加的NK細胞群。特別地，大規(guī)模地獲得了原代CD3陰性細胞， 所述原代CD3陰性細胞可進一步增殖多達15倍。因而，最終獲得大量NK細胞(見表3-表 6)。相比通過使用造血干細胞誘導(dǎo)NK細胞增殖的方法，已證明通過使用⑶3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞增殖的方法更有效地在短時間段內(nèi)獲得大量NK細胞。本發(fā)明還提供制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞； 和
2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。在上述方法中，可以通過但并不總限于下述方法來完成步驟1)中CD3陰性細胞的制備利用CD3微珠使CD3陽性細胞具有磁性，從而能夠被MACS柱過濾，以分離其中的CD3 陰性細胞的方法；或者用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞的方法，通過使用細胞分選儀分離所述 CD3陰性T細胞。在上述方法的步驟幻中，優(yōu)選用兩種或更多種細胞因子一起處理，所述細胞因子選自于由IL-2、IL-15和IL-21組成的組。特別地，優(yōu)選用IL-15和IL-21共處理或更優(yōu)選用IL-2、IL-15和IL-21三者共處理，但并非總限于此。為研究細胞因子對NK細胞活性的作用，用不同組合的細胞因子處理CD3陰性細胞，所述CD3陰性細胞將被分化成NK細胞。隨后，通過使用、-計數(shù)器研究51Cr的分泌，并使用試劑盒測量乳酸脫氫酶(LDH)的活性。結(jié)果，與僅用IL-21處理或未用任何細胞因子處理的組相比，在用至少兩種不同細胞因子處理的組中觀察到更高的細胞毒性。并且，與用 IL-2、IL-15和IL-21這全部三種細胞因子處理的組相比，用IL-15和IL-21 —起處理的組表現(xiàn)相對高的細胞毒性(見圖5-圖7)。以上結(jié)果提示，在從⑶3陰性細胞誘導(dǎo)的NK細胞的分化上，使用IL-15和IL-21 的共處理更為有效，并且所得NK細胞具有更高的細胞毒性。本發(fā)明還提供用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物，所述組合物包含由所述方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞。本文中的癌癥優(yōu)選選自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組， 但并非總限于此。本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種具有與以上NK細胞相同或相似功能的活性成分。本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述藥學(xué)上可接受的載體選自于由鹽水、滅菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、 乙醇、脂質(zhì)體及包含所述組分中的一種或多種的混合物組成的組。如有必要，可以另外添加諸如抗氧化劑和緩沖劑等的普通添加劑。本發(fā)明的組合物可以通過與稀釋劑、分散劑、 表面活性劑、粘合劑和潤滑劑混合而制劑成不同的形式，所述不同的形式包括注射用的水性溶液劑、懸浮劑和乳劑；以及丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。還可以按照Remington’ s Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company,Easton PA, 18th, 1990)中提出的如下方法，根據(jù)成分將所述組合物制備成合適的形式。本發(fā)明的組合物可以通過腸胃外給予(例如，靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腹膜注射或局部注射)?？梢愿鶕?jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄和疾病嚴(yán)重程度來確定所述組合物的有效劑量。所述劑量為每日0. 0001 500mg/kg，優(yōu)選為每日 0.01 10mg/kg，給藥頻率為每日一次，或優(yōu)選地為每日數(shù)次。本發(fā)明人等確認，具有提高的細胞毒性的NK細胞可以由CD3陰性細胞誘導(dǎo)而來， 因而具有抗癌細胞毒性的NK細胞可以由此分化，暗示本發(fā)明的細胞可以有效用于抗癌治療。本發(fā)明還提供治療癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的所述組合物給予患有癌癥的受試者的步驟。
本發(fā)明還提供預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的所述組合物給予受試者的步驟。本文中的癌癥優(yōu)選選自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組， 但并非總限于此。本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種具有與以上NK細胞相同或相似功能的活性成分。除上述有效成分外，所述組合物還可以包括一種或多種用于給藥的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的組合物可以通過腸胃外給予(例如，靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腹膜注射或局部注射)。可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄和疾病嚴(yán)重程度來確定所述組合物的有效劑量。所述劑量為每日0.01 5000mg/kg，優(yōu)選為每日 0.01 10mg/kg，給藥頻率為每日一次，或優(yōu)選地為每日數(shù)次。本發(fā)明人等確認，具有提高的細胞毒性的NK細胞可以由CD3陰性細胞誘導(dǎo)而來， 因而具有抗癌細胞毒性的NK細胞可以由此分化，暗示本發(fā)明的細胞可以有效用于抗癌治療。此外，本發(fā)明提供由本發(fā)明方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞在用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物的生產(chǎn)中的用途。本文中的癌癥優(yōu)選選自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組， 但并非總限于此。本發(fā)明人等確認，具有提高的細胞毒性的NK細胞可以由CD3陰性細胞誘導(dǎo)而來， 因而具有抗癌細胞毒性的NK細胞可以由此分化，暗示本發(fā)明的細胞可以有效用于抗癌治療。如以下實施例(實驗實施例和制備實施例)所示，本發(fā)明的實用的實施方式和當(dāng)前優(yōu)選的實施方式是示例性的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮本公開內(nèi)容的情況下，可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行修改和改進。實施例1 從臍帶血來源的單核細胞制備CD3陰性細胞用RPMI 1640，以2 1的比例對用于研究目的而提供的臍帶血進行稀釋，所述的臍帶血來源于醫(yī)院(韓國建陽大學(xué)醫(yī)院(Konyang University Hospital)產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)部和忠南國立大學(xué)醫(yī)院(Chungnam National University Hospital)產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)部， 各醫(yī)院都通過了 IRB測試)。將所制備的臍帶血小心地上樣至Ficoll-Paque的上部，隨后在20，OOOrpm下離心30分鐘以獲得單核細胞層(MNC層)。從由單核細胞層獲得的細胞中清除紅細胞，以獲得單核細胞。將⑶3微珠(Miltenyi Biotech)添加至所得單核細胞，隨后進行標(biāo)記。通過使用CS柱和Vario MACS清除⑶3陽性細胞，以獲得⑶3陰性細胞。特別地，⑶3微珠(Miltenyi Biotech)識別⑶3 ε鏈，從而將磁性提供給來自單核細胞的⑶3 陽性細胞。隨后，使單核細胞中連有微珠的CD3陽性細胞通過與該磁性反應(yīng)的MACS柱。結(jié)果，CD3陽性細胞留在柱中，而CD3陰性細胞通過該柱，借此完成分離。借助流式細胞術(shù) (FACS)研究所得CD3陰性細胞的純度。結(jié)果，如表1和表2所示，來自單核細胞的CD3陰性細胞的產(chǎn)率為32% (表1)，⑶3陰性細胞的平均純度為88% (表2和圖1)。表 權(quán)利要求
1.增殖NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的增殖NK細胞的方法，其中，通過如下工藝進行步驟1)的制備通過使用⑶3微珠，使⑶3陽性細胞具有磁性；和通過使用MACS柱分離CD3陰性細胞；或者在用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞后，通過使用細胞分選儀分離CD3陰性細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的增殖NK細胞的方法，其中，使用選自于由IL-2、IL-15和IL-21 組成的組中的至少兩種細胞因子一起進行步驟幻的細胞因子的處理。
4.如權(quán)利要求1所述的增殖NK細胞的方法，其中，步驟2)的細胞因子的處理是IL-15 和IL-21的共處理。
5.分化NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的分化NK細胞的方法，其中，通過如下工藝進行步驟1)的制備通過使用⑶3微珠，使⑶3陽性細胞具有磁性；和通過使用MACS柱分離CD3陰性細胞；或者在用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞后，通過使用細胞分選儀分離CD3陰性細胞。
7.如權(quán)利要求5所述的分化NK細胞的方法，其中，使用選自于由IL-2、IL-15和IL-21 組成的組中的至少兩種細胞因子一起進行步驟幻的細胞因子的處理。
8.如權(quán)利要求5所述的分化NK細胞的方法，其中，步驟2)的細胞因子的處理是IL-15 和IL-21的共處理。
9.制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將⑶3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備⑶3陰性細胞；和2)在用細胞因子處理步驟1)的細胞后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。
10.如權(quán)利要求9所述的制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，其中，通過如下工藝進行步驟1)的制備通過使用⑶3微珠，使⑶3陽性細胞具有磁性；和通過使用MACS柱分離CD3陰性細胞；或者在用熒光標(biāo)記CD3陰性T細胞后，通過使用細胞分選儀分離CD3陰性細胞。
11.如權(quán)利要求9所述的制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，其中，使用選自于由IL-2、IL-15和IL-21組成的組中的至少兩種細胞因子一起進行步驟2)的細胞因子的處理。
12.如權(quán)利要求9所述的制備具有提高的細胞毒性的NK細胞的方法，其中，步驟2)的細胞因子的處理是IL-15和IL-21的共處理。
13.用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物，所述組合物包含由權(quán)利要求9所述方法制備的、具有提高的細胞毒性的NK細胞。
14.如權(quán)利要求13所述的用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物，其中，所述癌癥選自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組。
15.治療癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的權(quán)利要求13所述的組合物給予患有癌癥的受試者的步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的治療癌癥的方法，其中，所述癌癥選自于由乳腺癌、黑素瘤、 胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組。
17.預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將藥學(xué)上有效劑量的權(quán)利要求13所述的組合物給予受試者的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的預(yù)防癌癥的方法，其中，所述癌癥選自于由乳腺癌、黑素瘤、 胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌組成的組。
19.由權(quán)利要求9所述的方法制備的具有提高的細胞毒性的NK細胞在用于癌癥的預(yù)防性和治療性組合物的制備中的用途。
20.如權(quán)利要求19所述的用途，其中，所述癌癥選自于由乳腺癌、黑素瘤、胃癌、肝癌、 結(jié)腸癌和肺癌組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及從臍帶血有效增殖和分化自然殺傷細胞(NK細胞)的方法。更確切地，本發(fā)明涉及從臍帶血有效增殖和分化自然殺傷細胞的方法，所述方法包括如下步驟1)通過將CD3陽性T細胞從臍帶血源的單核細胞中清除，來制備CD3陰性細胞；和2)在用多種細胞因子對其進行處理后，培養(yǎng)所述CD3陰性細胞。本發(fā)明的優(yōu)勢在于，與從造血干細胞誘導(dǎo)NK細胞的常規(guī)方法相比，通過從CD3陰性細胞誘導(dǎo)NK細胞，可在短時間段內(nèi)獲得高純度的NK細胞；本發(fā)明的優(yōu)勢還在于，通過用不同細胞因子一起處理，例如通過IL-15和IL-21共處理，促進NK細胞的增殖和分化。即，本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)具有提高的抗癌細胞毒性的NK細胞，由此該方法可以有效地用于抗癌細胞療法。
文檔編號C12N5/0783GK102356154SQ200980152697
公開日2012年2月15日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者尹錫蘭, 崔仁杓, 李周勇, 李秀然, 林載升 申請人:株式會社美迪賽