專(zhuān)利名稱(chēng)：無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)化學(xué)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述用于從碳源生產(chǎn)化學(xué)品的酶促法。根據(jù)一個(gè)方面，具體公開(kāi)了通過(guò)無(wú)細(xì)胞的酶系統(tǒng)從碳源生產(chǎn)目標(biāo)有機(jī)化合物的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及通過(guò)酶促法，優(yōu)選在沒(méi)有生產(chǎn)性活細(xì)胞的條件下，將碳源，優(yōu)選為碳水化合物或另一種含碳化合物生物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)有機(jī)化合物的方法。所述目標(biāo)有機(jī)化合物優(yōu)選為疏水性的、親水性的或中間的化合物。根據(jù)本發(fā)明的疏水性化學(xué)物包括但不限于C4醇類(lèi)，如正丁醇、2- 丁醇和異丁醇， 以及其它具有有限的水混溶性的化學(xué)品。有限的混溶性指在室溫下不超過(guò)20% (w/w)可與水混合沒(méi)有相分離。根據(jù)本發(fā)明的親水性的和中間的化學(xué)品包括但不限于乙醇和其它化學(xué)
P
ΡΠ O正丁醇是無(wú)色、具有中等揮發(fā)性和在水中有限混溶性(室溫下約7-8% )的中性液體。正丁醇在化學(xué)品生產(chǎn)中用作中間體，在配方產(chǎn)品如化妝品中用作溶劑和用作原料。正丁醇用于丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯、乙二醇醚、乙酸正丁酯、氨基樹(shù)脂和正丁胺的合成。正丁醇因低蒸氣壓、高能量含量以及能與汽油高濃度混合，還可用作內(nèi)燃機(jī)的燃料。2-丁醇是無(wú)色、具有中等揮發(fā)性和在水中有限混溶性(室溫下約12% )的中性液體。2-丁醇用作油漆和涂料以及食品配料的溶劑或用于1-丁烯生產(chǎn)。異丁醇是無(wú)色、具有中等揮發(fā)性和在水中有限混溶性(室溫下約9-10% )的中性液體。異丁醇用作溶劑或增塑劑。它還用于生產(chǎn)MTBE或ETBE生產(chǎn)用的前體異丁烯。正丁醇可用產(chǎn)溶劑性梭菌(solventogenic Clostridia)，如丙酮丁醇梭菌 (C. acetobuylicum)或拜氏梭菌(C. beijerinckii)生產(chǎn)，通常產(chǎn)出正丁醇、丙酮和乙醇的混合物。用產(chǎn)溶劑性梭菌生產(chǎn)丁醇有幾個(gè)缺點(diǎn)(i)從稀水溶液中分離產(chǎn)物非常昂貴，因其要么復(fù)雜(如采用膜法)要么耗能(如采用蒸餾)。(ii)產(chǎn)量低，因?yàn)榇蟛糠值牡孜飬⑴c副產(chǎn)物如丙酮、乙醇、氫氣和生物量的形成。(iii)因有限的細(xì)胞滴度，丁醇生產(chǎn)的產(chǎn)率低。 (iv)復(fù)雜的代謝限制了更高產(chǎn)率和產(chǎn)量的代謝工程。(ν)有限的方法穩(wěn)定性常常導(dǎo)致生產(chǎn)損失且難以維持無(wú)菌。(vi)梭菌生長(zhǎng)的兩相性質(zhì)限制了方法的靈活性和產(chǎn)率。有多種方法來(lái)克服傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的局限性。例如，W02008/052596描述了梭菌的重組改良以提高產(chǎn)量。例如，WO 2008/006038描述了篩選或設(shè)計(jì)較高的丁醇抗性的突變體。早在1897年，Eduard Buchner采用酵母細(xì)胞的裂解液將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇時(shí)，已呈現(xiàn)無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)化學(xué)品。之后Welch和kopes于1985年證實(shí)乙醇的無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)，但該方法在技術(shù)上無(wú)用。該系統(tǒng)缺乏特異性(酶的副反應(yīng)、裂解液中不需要的活性)，且最高獲得 9%的乙醇。已描述了許多用分離的酶來(lái)生產(chǎn)化學(xué)品的技術(shù)方法。例如，將醇脫氫酶用于從酮生產(chǎn)手性醇。這些方法需要輔因子(NAD)再生，其可通過(guò)例如添加葡萄糖和葡萄糖脫氫酶實(shí)現(xiàn)。已設(shè)計(jì)這些方法來(lái)生產(chǎn)高價(jià)值的化學(xué)品，但不提供含有多個(gè)酶反應(yīng)的酶系統(tǒng)，該酶反應(yīng)以高能量和碳效率將碳水化合物轉(zhuǎn)化為化學(xué)品。張等人于2008年描述了將葡萄糖無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為正丁醇的構(gòu)想。該構(gòu)思包括最少 18種酶，幾種不同的輔因子和輔酶(如々1 、々0 、織0!1、織0、鐵氧還蛋白和輔酶4)。此外， 該假定的方法引起ATP的凈產(chǎn)生(net-production)從而另外需要三磷酸腺苷酶(ATPase) 除去ATP。在實(shí)際條件下控制三磷酸腺苷酶添加的同時(shí)維持平衡的ATP水平很難實(shí)現(xiàn)?？偠灾龅姆椒ò嘿F、技術(shù)上不穩(wěn)定且僅提供低丁醇產(chǎn)量。概言之，需要有成本效益的方法用于從可再生資源生產(chǎn)化學(xué)品，特別是乙醇和C4 醇類(lèi)如正丁醇和它的異構(gòu)體。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明通過(guò)無(wú)細(xì)胞的酶系統(tǒng)，僅用有限數(shù)量的酶和有限組的輔因子應(yīng)對(duì)這個(gè)需求。具體地，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)明的方法不會(huì)引起ATP凈產(chǎn)生，并/或不使用磷酸化酶反應(yīng)，并/或僅使用耐受所生產(chǎn)的化學(xué)品的失活性存在的酶。疏水性化學(xué)品是僅部分溶于水且在大氣壓和溫度下以固體或液體狀態(tài)存在的化學(xué)品。疏水性化學(xué)品具有不高于20% (w/w)的有限的水混溶性，且無(wú)相分離。根據(jù)本發(fā)明的疏水性化學(xué)品的具體實(shí)例包括正丁醇、2-丁二醇和異丁醇。碳源可以是能為微生物生長(zhǎng)或生產(chǎn)化學(xué)品所利用的任意物質(zhì)。這些包括碳水化合物及其衍生物聚糖如纖維素、半纖維素、淀粉；二糖如蔗糖、麥芽糖、乳糖；己糖如葡萄糖、 甘露糖、半乳糖；戊糖如木糖、阿拉伯糖；糖醛酸、葡糖胺等；多元醇如山梨糖醇、甘油；脂類(lèi)及其衍生物、木質(zhì)素及其衍生物。特別優(yōu)選的碳源為葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、 非葡萄糖的單體己糖、或聚合的糖衍生物、或其混合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于從碳源生物技術(shù)生產(chǎn)化學(xué)品的無(wú)細(xì)胞方法，該化學(xué)品具體為疏水性化學(xué)品如C4醇類(lèi)，包括正丁醇、異丁醇或2- 丁醇，以及親水性和中間的化學(xué)品如乙醇。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明公開(kāi)并要求保護(hù)通過(guò)無(wú)細(xì)胞的酶系統(tǒng)從碳源生產(chǎn)目標(biāo)有機(jī)化合物的方法，其包括葡萄糖到作為中間產(chǎn)物的丙酮酸的轉(zhuǎn)化，其中不發(fā)生ATP凈產(chǎn)生。優(yōu)選在葡萄糖到作為中間產(chǎn)物的丙酮酸的轉(zhuǎn)化中沒(méi)有ATP凈產(chǎn)生發(fā)生。更優(yōu)選在碳源到目標(biāo)有機(jī)化合物的總體轉(zhuǎn)化中沒(méi)有ATP凈產(chǎn)生發(fā)生。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方面，所述碳源化合物為葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、非葡萄糖的單體己糖或聚合的糖衍生物。根據(jù)又一個(gè)優(yōu)選的方面，所述目標(biāo)有機(jī)化合物為乙醇、四碳單醇，特別是正丁醇、 異丁醇、2-丁醇，或別的可從丙酮酸，優(yōu)選通過(guò)酶催化途徑衍生的有機(jī)化合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，葡萄糖到作為中間產(chǎn)物的丙酮酸的轉(zhuǎn)化在完全沒(méi)有ATP和/或ADP作為輔因子的條件下進(jìn)行。更優(yōu)選從碳源到目標(biāo)有機(jī)化合物的總體轉(zhuǎn)化(反應(yīng)途徑)在完全沒(méi)有ATP和/或ADP作為輔因子的條件下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，所述生產(chǎn)方法在包括兩分離相的液態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行，且所述目標(biāo)有機(jī)化合物主要存在于或形成分離相之一，且所述目標(biāo)有機(jī)化合物從分離相中收集。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，添加有機(jī)溶劑以建立兩個(gè)分離的相。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，工藝中連續(xù)添加所述碳源化合物并不斷移出目標(biāo)有機(jī)化合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，所述酶系統(tǒng)包括以下的酶或酶活性，優(yōu)選用于葡萄糖到丙酮酸的轉(zhuǎn)化·葡萄糖脫氫酶(EC 1. 1. 1. 47)，·葡糖酸內(nèi)酯酶(EC 3. 1. 1. 17)，·葡糖酸脫水酶(EC 4. 2. 1. 39)，· 2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶(EC 4. 1. 2. 14)，·醛脫氫酶(EC 1.2. 1.3),·甘油酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 29)或羥基丙酮酸還原酶(EC 1. 1. 1. 81)，·絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2. 6. 1. 51)，· L-絲氨酸解氨酶(EC 4. 3. 1. 17)禾口·丙氨酸脫氫酶(EC 1. 4. 1. 1)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，所述酶系統(tǒng)包括以下的酶或酶活性，優(yōu)選用于葡萄糖到丙酮酸的轉(zhuǎn)化·葡萄糖脫氫酶(EC 1. 1. 1. 47)，·葡糖酸內(nèi)酯酶(EC 3. 1. 1. 17)，·葡糖酸脫水酶(EC 4. 2. 1. 39)，· 2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶(EC 4. 1. 2. 14)，·醛脫氫酶(EC 1.2. 1. 3)和·甘油酸脫水酶(EC 4. 2. 1.)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，通過(guò)含有11、10、9、 8、7或更少的酶的酶系統(tǒng)從葡萄糖生產(chǎn)乙醇。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，通過(guò)含有17、16、15 或更少的酶的酶系統(tǒng)從葡萄糖生產(chǎn)正丁醇。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，通過(guò)含有14、13或更少的酶的酶系統(tǒng)生產(chǎn)異丁醇。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式以及如文中進(jìn)一步說(shuō)明，通過(guò)含有13或更少的酶的酶系統(tǒng)生產(chǎn)2- 丁醇。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)明的生產(chǎn)方法包括以下4步I.用微生物細(xì)胞生產(chǎn)用于將碳源轉(zhuǎn)化為化學(xué)品(文中也稱(chēng)為“目標(biāo)化學(xué)品”或“目標(biāo)有機(jī)化合物”)的酶(“目標(biāo)酶”)；II.從步驟I所用的微生物細(xì)胞釋放目標(biāo)酶，優(yōu)選與輔因子的釋放和另外的非目標(biāo)酶活性的失活相結(jié)合；III.在適合將碳源轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化學(xué)品的條件下使步驟II的目標(biāo)酶與碳源接觸。IV.從反應(yīng)混合物中分離目標(biāo)化學(xué)品。


圖1進(jìn)一步圖示了根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式的發(fā)明構(gòu)思的可能實(shí)施。
具體實(shí)施例方式步驟I 步驟I中用微生物細(xì)胞生產(chǎn)目標(biāo)酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，酶生產(chǎn)在兩個(gè)或更多的不同微生物細(xì)胞系中完成， 以使整個(gè)生產(chǎn)路線或它的主要部分不在一種微生物中重組。這樣避免了不需要的底物向化學(xué)品轉(zhuǎn)化的起始并導(dǎo)致更有效的酶生產(chǎn)。酶生產(chǎn)可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的，重組體或非重組體。如果酶生產(chǎn)是重組體，其可以是同源或異源的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)酶對(duì)于某一底物和某一反應(yīng)是選擇性的。優(yōu)選目標(biāo)酶具有至少10倍于任意其它天然存在的物質(zhì)的底物選擇性(kcat/kM)和至少90% 的反應(yīng)選擇性。更優(yōu)選目標(biāo)酶具有至少20倍的底物選擇性和至少95%的反應(yīng)選擇性。甚至更優(yōu)選目標(biāo)酶具有至少100倍的底物選擇性和至少99%的反應(yīng)選擇性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)酶表現(xiàn)出不受多步反應(yīng)的底物或產(chǎn)物或其它中間體的抑制作用或抑制作用低(無(wú)或低反饋抑制)。優(yōu)選多步反應(yīng)的任意底物、產(chǎn)物或中間體的抑制常數(shù)(Ki)為至少10倍高于各酶和底物的Km值。更優(yōu)選該抑制常數(shù)100倍高于各KM。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)酶在多步反應(yīng)的任意底物、中間體或產(chǎn)物的濃度為IOOmM或更高的條件下仍具有其最大活性的50%。優(yōu)選目標(biāo)酶具有適應(yīng)于酶促路線的多步性質(zhì)的K。at和Km值。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述目標(biāo)酶耐受水平提高的目標(biāo)化學(xué)品，并任選地耐受任選添加以促進(jìn)目標(biāo)化學(xué)品分離到分離相中的其它有機(jī)溶劑。優(yōu)選所述目標(biāo)酶耐受目標(biāo)化學(xué)品的濃度高于2wt%，更優(yōu)選高于6wt%，且最優(yōu)選高于12wt%。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述目標(biāo)酶耐受目標(biāo)化學(xué)品的濃度高達(dá)其在水中的最大溶解度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述目標(biāo)酶耐受水平提高的離液序列高的 (chaotropic)物質(zhì)和增高的溫度。目標(biāo)酶優(yōu)選耐受鹽酸胍的濃度高于1M，更優(yōu)選高于3M， 且最優(yōu)選高于6M?？蛇x擇地或者結(jié)合地，所述目標(biāo)酶優(yōu)選耐受高于50°C的溫度，更優(yōu)選高于70°C，且最優(yōu)選高于90°C。在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，目標(biāo)酶生產(chǎn)在宿主生物體中完成， 所述宿主生物體的內(nèi)源酶活性在提高水平的離液序列高的物質(zhì)和/或增高的溫度條件下大部分失活。目標(biāo)酶生產(chǎn)優(yōu)選使用以下微生物種類(lèi)進(jìn)行大腸桿菌(Escherichia coli)； 焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence)；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)乳酸克魯維斯酵母(Klyuveromyces lactis)；里氏木霉 (Trichoderma reesei)；黑曲霉(Aspergillus niger)。更優(yōu)選使用大腸桿菌作為宿主生物體進(jìn)行目標(biāo)酶生產(chǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述目標(biāo)酶耐受提高水平的氧。目標(biāo)酶優(yōu)選耐受氧氣濃度高于lppm，更優(yōu)選高于7ppm。最優(yōu)選目標(biāo)酶在需氧條件下有活性并且穩(wěn)定。優(yōu)選多步反應(yīng)不需要氧且不受氧氣抑制。從而不需要采取特殊預(yù)防措施排除氧氣，以對(duì)生產(chǎn)環(huán)境和/或設(shè)備的更少精力使工藝更穩(wěn)定。
優(yōu)選將酶生產(chǎn)和細(xì)胞生長(zhǎng)分成不同的階段。由此，沒(méi)有底物用于總代謝活動(dòng)。步驟II:在步驟二中從細(xì)胞中釋放出目標(biāo)酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)酶耐受高溫和離液序列高的條件，而來(lái)源于生產(chǎn)微生物的背景酶不耐受這些條件。根據(jù)此實(shí)施方式，目標(biāo)酶在微生物細(xì)胞的胞內(nèi)生產(chǎn)，用高溫和/或離液序列高的條件裂解細(xì)胞，從而釋放出活性狀態(tài)的目標(biāo)酶，任選地與輔因子一起，而不需要的背景酶活性則失活。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶生產(chǎn)是胞外的，目標(biāo)酶耐受高溫和離液序列高的條件，且背景酶活性(非目標(biāo)酶)不耐受這些條件。根據(jù)此實(shí)施方式，在例如高溫和/或離液序列高的條件下處理來(lái)源于胞外生產(chǎn)的上清。此處理導(dǎo)致不需要的背景酶活性(非目標(biāo)酶)失活而目標(biāo)酶保持活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)酶促轉(zhuǎn)化步驟中的一個(gè)或多個(gè)需要輔因子。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將這些輔因子添加到酶混合物中。在該實(shí)施方式的另一個(gè)特別優(yōu)選的方面，微生物細(xì)胞在胞內(nèi)也產(chǎn)生這些輔因子并經(jīng)過(guò)與釋放目標(biāo)酶相同的處理而釋放。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞以?xún)?yōu)化生產(chǎn)的輔因子水平。優(yōu)選微生物細(xì)胞在步驟II中失活。由此，工藝中將細(xì)胞生長(zhǎng)和酶活性分開(kāi)，且沒(méi)有碳源被不需要的細(xì)胞生長(zhǎng)消耗。步驟III:步驟III中碳源在多步酶促反應(yīng)中被酶的混合物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化學(xué)品。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述酶在目標(biāo)化學(xué)品的變性作用下具有活性。優(yōu)選步驟I所用的微生物細(xì)胞是失活的并/或在步驟III的反應(yīng)條件下失活。優(yōu)選在工藝條件下將目標(biāo)酶混合物中各酶的濃度調(diào)整至最適水平。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，將一種或多種酶的濃度提高到通常的細(xì)胞內(nèi)濃度以上，以提高該方法的產(chǎn)量(不為傳統(tǒng)方法中微生物的最大密度所限)。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)一種或多種酶以達(dá)最大催化效率(相比傳統(tǒng)方法，導(dǎo)致更低的反應(yīng)器規(guī)模和運(yùn)行成本)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟III中將目標(biāo)化學(xué)品加到反應(yīng)混合物中至略高于能在工藝條件下與水混合成單一相的最大水平的濃度。根據(jù)此實(shí)施方式，工藝中將目標(biāo)化學(xué)品不斷分離到第二相中。在此實(shí)施方式的一個(gè)具體變型中，將水溶性物質(zhì)加到反應(yīng)混合物中，引起目標(biāo)化學(xué)品在與沒(méi)有該添加物質(zhì)時(shí)的相分離濃度相比更低的相分離濃度下相分離。這些物質(zhì)的實(shí)例為鹽并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知。在該實(shí)施方式的一個(gè)特別優(yōu)選的變型中，加入氯化鈉以降低目標(biāo)化學(xué)品在水相中的溶解度。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，向工藝中加入額外的有機(jī)溶劑形成其自身的相并從水相中提取出生產(chǎn)的疏水性化學(xué)品。此額外的溶劑的優(yōu)選實(shí)例包括正己烷、環(huán)己烷、辛醇、 乙酸乙酯、甲基丁基酮或其組合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，由于通過(guò)采用對(duì)所需反應(yīng)特異的目標(biāo)酶，副產(chǎn)物的形成降低，產(chǎn)量提高。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可催化副反應(yīng)的宿主酶在步驟II中失活并/或在步驟III的反應(yīng)條件下失活。在本發(fā)明的又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)調(diào)節(jié)步驟III中對(duì)典型的微生物污染物有毒的反應(yīng)條件避免工藝被微生物污染。這些條件包括升高的溫度、極端PH、添加有機(jī)化學(xué)品。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)化學(xué)品自身在工藝中達(dá)到的濃度條件下是有毒的(更穩(wěn)定的工藝，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境和/或設(shè)備用更少的精力)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，除步驟I所用的微生物所生產(chǎn)的以及步驟 II所產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物中所含的輔因子外，無(wú)額外的輔因子添加到反應(yīng)混合物中。此輔因子的實(shí)例為NAD/NADH、NADP/NADPH、ATP/ADP。根據(jù)此實(shí)施方式，所需的輔因子為步驟I中的微生物細(xì)胞所生產(chǎn)，并在工藝中再生(NADH到NAD及反之；NADPH到NADP及反之；ADP到ATP 及反之)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，過(guò)量的還原當(dāng)量(NADH、NADPH)或能量當(dāng)量(ATP) 通過(guò)額外的酶再生(NADH氧化酶對(duì)NADH ；NADPH氧化酶對(duì)NADPH ；三磷酸腺苷酶對(duì)ATP)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在多步反應(yīng)方法的至少大部分中，均不含有ATP和ADP作輔因子。多步反應(yīng)途徑的大部分優(yōu)選包括至少20%的酶活性，并更優(yōu)選至少50%的酶活性。最優(yōu)選目標(biāo)酶混合物(步驟I產(chǎn)生的酶混合物)中的酶活性均不含有磷酸化步驟(非磷酸化的反應(yīng)途徑)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)途徑包括從葡萄糖到丙酮酸的轉(zhuǎn)化且此轉(zhuǎn)化中包含的目標(biāo)酶均不包括磷酸化步驟(無(wú)磷酸化的丙酮酸生產(chǎn))。步驟IV 步驟IV中，從反應(yīng)混合物中分離出一種或多種目標(biāo)化學(xué)品。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，一種或多種目標(biāo)化學(xué)品是疏水性的并形成分離相，其優(yōu)選包含所生產(chǎn)的化學(xué)品的至少大部分。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種或多種目標(biāo)化學(xué)品連續(xù)不斷地從反應(yīng)混合物中移出。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，向待轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化學(xué)品的反應(yīng)混合物中連續(xù)添加碳源。同樣地，目標(biāo)化學(xué)品優(yōu)選以分離相連續(xù)不斷地排出并通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步純化。由此，由于產(chǎn)物在可進(jìn)一步純化的分離相中收集，產(chǎn)物分離簡(jiǎn)化。由此，產(chǎn)量提高且產(chǎn)物純化簡(jiǎn)化。所述的無(wú)細(xì)胞酶促方法(張等人，2008 Jelch和kopes，1985)的主要問(wèn)題是ATP 積累。在所述的方法中，通過(guò)添加三磷酸腺苷酶防止此問(wèn)題。但難于找到合適的三磷酸腺苷酶濃度，因?yàn)槠淙Q于底物和不同的中間體的濃度以及酶的活性。過(guò)多或過(guò)少的三磷酸腺苷酶均使該轉(zhuǎn)化完全終止(Welch和義叩⑶，198 。相反，根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞方法將碳源如葡萄糖及其聚合物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化學(xué)品例如乙醇、丁醇和/或異丁醇而無(wú)ATP凈產(chǎn)生且不使用三磷酸腺苷酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法不需要ADP或ATP作為輔因子。其它方法(Welch 和 kopes，1985 ；Algar 和 kopes，1985)需要輔因子如 ADP/ATP 和 NAD+/NADH。 假定的葡萄糖到丁醇的轉(zhuǎn)化(張等人，2008)需要輔因子ADP/ATP、NAD+/NADH、鐵氧還蛋白和輔酶A。本文所用的術(shù)語(yǔ)“酶”還包括術(shù)語(yǔ)“酶活性”并可互換使用。以下描述關(guān)于正丁醇、異丁醇、乙醇和2-丁二醇生產(chǎn)的一些優(yōu)選實(shí)施方式。生產(chǎn)ιΗ丁醇在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)化學(xué)品是正丁醇且生產(chǎn)正丁醇的目標(biāo)酶混合物包括少于19種不同的酶活性。優(yōu)選目標(biāo)酶混合物包括17種或更少的不同的酶活性，更優(yōu)選16種或更少的酶活性，甚至更優(yōu)選15種或更少的酶活性，且最優(yōu)選僅12種不同的酶活性。因?yàn)槊干a(chǎn)是方法中的主要成本因素，其提供相對(duì)于其它方法的主要優(yōu)勢(shì)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，從葡萄糖通過(guò)中間體丙酮酸和乙酰CoA生產(chǎn)正丁醇。從葡萄糖生產(chǎn)正丁醇可任意細(xì)分成三步(A)將一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為兩分子丙酮酸。 (B)將兩分子丙酮酸轉(zhuǎn)化為兩分子乙酰CoA。(C)將兩分子乙酰CoA轉(zhuǎn)化為一分子正丁醇。步驟(A)葡萄糖至丙酮酸的轉(zhuǎn)化。該步驟在大多數(shù)如果不是所有的微生物中普遍，盡管存在不同的代謝途徑(如 Embden-Meyerhof-I^arnas 途徑、Entner-DoudorofT-途徑)。步驟(A)的一個(gè)具體變型利用 Embden-Meyerhof-Parnas途徑的酶，包括表1所列出的10種酶活性(酶組合Α. 1)。由該酶組合催化的反應(yīng)途徑包括磷酸化酶且導(dǎo)致凈ATP生產(chǎn)(每分子葡萄糖產(chǎn)出2分子ATP)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)無(wú)細(xì)胞的酶系統(tǒng)從碳源生產(chǎn)目標(biāo)有機(jī)化合物的方法，包括葡萄糖到作為中間產(chǎn)物的丙酮酸的轉(zhuǎn)化，其中無(wú)ATP的凈產(chǎn)生發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碳源化合物為葡萄糖、含葡萄糖的低聚物或聚合物、非葡萄糖單體己糖或聚合的糖衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述目標(biāo)有機(jī)化合物為乙醇，四碳單醇，具體為正丁醇、異丁醇、2-丁醇，或優(yōu)選通過(guò)酶促途徑可從丙酮酸獲得的其它有機(jī)化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)途徑在完全沒(méi)有ATP和/或ADP 作輔因子的條件下運(yùn)轉(zhuǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生產(chǎn)方法在包括兩個(gè)分離相的液態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行，且所述目標(biāo)有機(jī)化合物主要存在于或形成所述分離相之一，且所述目標(biāo)有機(jī)化合物從所述分離相中收集。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中添加有機(jī)溶劑以建立所述的兩個(gè)分離相。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述方法中連續(xù)添加所述碳源化合物并不斷移出所述目標(biāo)有機(jī)化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶系統(tǒng)包括以下酶，優(yōu)選用于從葡萄糖到丙酮酸的轉(zhuǎn)化 葡萄糖脫氫酶(EC 1. 1. 1. 47)、 葡糖酸內(nèi)酯酶(EC 3. 1. 1. 17)、 葡糖酸脫水酶(EC 4. 2. 1. 39)、 2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶(EC 4. 1. 2. 14)、 醛脫氫酶(EC 1. 2. 1. 3)、 甘油酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 29)或羥基丙酮酸還原酶(EC 1. 1. 1. 81)、 絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2. 6. 1. 51)、 L-絲氨酸解氨酶(EC 4. 3. 1. 17)和 丙氨酸脫氫酶(EC 1. 4. 1. 1)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶系統(tǒng)包括以下酶活性，優(yōu)選用于從葡萄糖到丙酮酸的轉(zhuǎn)化 葡萄糖脫氫酶(EC 1. 1. 1. 47)、 葡糖酸內(nèi)酯酶(EC 3. 1. 1. 17)、 葡糖酸脫水酶(EC 4. 2. 1. 39)、 2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶(EC 4. 1. 2. 14)、 醛脫氫酶(EC 1.2. 1. 3)和 甘油酸脫水酶(EC 4. 2. 1.)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)包括11、10、9、8、7種或更少的酶的酶系統(tǒng)從葡萄糖生產(chǎn)乙醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)包括17、16、15種或更少的酶的酶系統(tǒng)從葡萄糖生產(chǎn)正丁醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)包括14、13種或更少的酶的酶系統(tǒng)生產(chǎn)異丁醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)包括13種或更少的酶的酶系統(tǒng)生產(chǎn)2-丁醇。
全文摘要
本發(fā)明描述用于從碳源生產(chǎn)化學(xué)品的酶促法。根據(jù)一個(gè)方面，具體公開(kāi)了通過(guò)無(wú)細(xì)胞的酶系統(tǒng)從碳源生產(chǎn)目標(biāo)有機(jī)化合物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/06GK102272314SQ200980153487
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者A·科爾特曼, U·克特林, V·西貝爾 申請(qǐng)人:南方化學(xué)公司