專利名稱：用于誘導(dǎo)病毒生長的組合物、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)的實(shí)施方式總體上報(bào)道用于加速或增加的病毒生長的方法、組合物和用途。在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)報(bào)道用于誘導(dǎo)病毒加速生長和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。在其他實(shí)施方式中，報(bào)道了能加速黃病毒生長，減少黃病毒滯后時(shí)間和/或增加黃病毒噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。
背景技術(shù)：
抵御傳染性疾病的疫苗已用于增進(jìn)人和動(dòng)物健康。一種用于病毒疫苗的成功技術(shù)是用該病毒的減弱或減毒的毒株(“活減毒病毒”)免疫動(dòng)物或人。由于免疫后有限的復(fù)制， 該減毒的毒株不引起疾病。然而，該有限的病毒復(fù)制足以表達(dá)病毒抗原的所有組成成分，并產(chǎn)生對(duì)該病毒潛在和持久的免疫應(yīng)答。因此，在隨后暴露于該病毒的致病毒株時(shí)，免疫的個(gè)體受到保護(hù)不得病。最近的技術(shù)進(jìn)步，例如重配，反向遺傳學(xué)和寒冷適應(yīng)，已引起了用于流感病毒和輪狀病毒的活減毒病毒的發(fā)展。許多用重組DNA技術(shù)制備的活病毒疫苗正處于人類臨床試驗(yàn)中，包括用于西尼羅河病(West Nile disease)、登革熱、瘧疾、肺結(jié)核和HIV的疫苗。這些重組病毒疫苗依賴于對(duì)充分鑒定的減毒病毒疫苗，例如腺病毒、痘苗病毒、黃熱病17D或登革熱病毒、DEN-2 PDK-53的操作。整體而言，活減毒病毒疫苗是人類歷史上最成功的醫(yī)學(xué)干預(yù)之一，僅次于抗生素的出現(xiàn)，具有增進(jìn)全世界公共健康的前景。其他疫苗已通過在細(xì)胞培養(yǎng)中生長之后滅活病毒而開發(fā)。由于高濃度抗原的存在，這些“滅活病毒”疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。有效的滅活病毒疫苗的實(shí)例包括但不限于狂犬病疫苗、流感疫苗、甲型肝炎疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。黃病毒引起多種具有顯著影響的人和動(dòng)物疾病。它們是有包膜的病毒，具有大約 11000個(gè)堿基的RNA基因組。大多數(shù)黃病毒是通過節(jié)肢動(dòng)物媒介傳播的，通常是蚊子。存在超過70種不同的黃病毒，基于血清學(xué)將其分成三個(gè)主要類型登革熱型、日本腦炎型和黃熱型。日益擴(kuò)張的城市化、全球旅行和環(huán)境的改變(例如砍伐森林或雨帶分布)已導(dǎo)致了幾種威脅人類公共健康的黃病毒的出現(xiàn)。這樣的病毒包括但不限于黃熱病毒、登革熱病毒、 西尼羅河病毒、日本腦炎病毒和蜱媒腦炎病毒。已制備了活減毒疫苗和滅活病毒疫苗，其是安全的并能抵御黃病毒疾病，例如黃熱病和日本腦炎。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方式總體上涉及用于誘導(dǎo)、增加和加速病毒生長的方法、組合物和用途。在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)報(bào)道了用于誘導(dǎo)加速病毒生長和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。在其他實(shí)施方式中，報(bào)道了用于加速黃病毒生長、減少黃病毒滯后時(shí)間和/或增加黃病毒噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。生產(chǎn)疫苗的一個(gè)限制因素是大規(guī)模制造和體外培養(yǎng)病毒，以滿足對(duì)疫苗的需求。 因此，本領(lǐng)域存在的需求之一是增加和加速病毒生長。本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及增加和加速病毒生長的方法和組合物。這些組合物對(duì)，例如，生產(chǎn)在其他技術(shù)，例如制造病毒相關(guān)的基因治療和其他病毒產(chǎn)品中使用的病毒疫苗和病毒副產(chǎn)品是有用的。此外，本文的實(shí)施方式對(duì)增加或加速在滅活病毒疫苗中使用的病毒培養(yǎng)物的生長可以是有用的。本文公開的某些組合物可以包括單獨(dú)的共聚物或共聚物與其他用于增加和加速病毒生長的藥劑或化合物的組合。本文的其他實(shí)施方式涉及增加活減毒病毒生長的賦形劑的組合。本文所用的共聚物包括但不限于聚氧丙烯(Plur0niC)F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P123、聚氧丙烯P85、其他分子量大于3000至4000的聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷(EO-PO) 嵌段共聚物或其組合。根據(jù)這些實(shí)施方式，病毒可以包括但不限于黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、線狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、鼠疫病毒、小RNA病毒、萼狀病毒、呼腸病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒和痘病毒。一些涉及病毒培養(yǎng)中使用的組合物的實(shí)施方式可以包括但不限于具有一種或多種病毒的培養(yǎng)物，例如多種病毒的混合物或單種病毒，或一種或多種活減毒病毒，這些病毒在單獨(dú)的一種或多種共聚物組合物中生長，或與其他藥劑組合中生長。在其他實(shí)施方式中，與不含公開的組合物的對(duì)照培養(yǎng)物相比，本文涉及的組合物可以在減少的或相似的生長時(shí)期內(nèi)增加在滴定(tittering)、制造或測(cè)量病毒制劑的活性中使用的噬菌斑大小。在本發(fā)明的一些方面，可以在減少的時(shí)期里得到較高的病毒滴度?？蛇x地，與沒有使用本文涉及的組合物的對(duì)照病毒培養(yǎng)物相比，本文涉及的組合物可以減少滯后時(shí)間或者加速生長時(shí)間直到幾天。其他實(shí)施方式涉及用于制劑的病毒群體和涉及能減少或預(yù)防由本文涉及的一種或多種病毒引起的醫(yī)學(xué)狀況開始的疫苗制劑的方法。根據(jù)這些實(shí)施方式，醫(yī)學(xué)狀況可以包括但不限于包括西尼羅河熱、登革熱、日本腦炎、庫阿撒魯爾森林病、澳大利亞和新幾內(nèi)亞墨萊溪谷腦炎、庫寧病毒(Kimjin virus)(西尼羅河病毒的近支)、Alkhurma出血熱、圣路易斯腦炎、丙型肝炎病毒感染、蜱媒腦炎、黃熱、非洲的尤蘇圖病毒、科坦戈病毒和Yaonde 病毒(Usutu，Koutango,Yaonde viruses)、以及南非的Cacipacore病毒的狀況禾口感染。在某些實(shí)施方式中，產(chǎn)生疫苗制劑的生產(chǎn)時(shí)間可以通過使用本文考慮的用于加速病毒生長生產(chǎn)和制備、減少滯后時(shí)間和/或增大病毒群體的噬菌斑大小的組合物而被縮短。在某些實(shí)施方式中，本文考慮的用于生產(chǎn)的病毒培養(yǎng)物可用于組合物，該組合物包括但不限于部分或完全脫水的或水合的疫苗制劑或其他病毒制劑。在某些實(shí)施方式中，用于本文考慮的疫苗組合物中的活減毒病毒可以包括但不限于一種或多種活減毒黃病毒疫苗，該減毒黃病毒疫苗包括但不限于減毒黃熱病毒(例如17D)、減毒日本腦炎病毒(例如SA 14-14-2)、減毒登革熱病毒(例如DEN-2/PDK-53或 DEN-4 Δ 30)、減毒嵌合型西尼羅河疫苗或重組嵌合黃病毒。其他實(shí)施方式涉及用于培養(yǎng)本文考慮的病毒培養(yǎng)物的試劑盒。考慮試劑盒可以包括部分或完全脫水的病毒培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物在產(chǎn)生用于疫苗生產(chǎn)或其他病毒組合物用途的活減毒病毒群體中使用。還考慮試劑盒可以包括一種或多種本文公開的生長誘導(dǎo)組合物。附圖簡述以下附圖形成本說明的一部分，它們被包含以進(jìn)一步說明本文的某些實(shí)施方式。 通過單獨(dú)參考一幅或多幅附圖或與給出的特定實(shí)施方式的詳細(xì)描述結(jié)合，可以更好地理解這些實(shí)施方式。

圖1表示在細(xì)胞感染和在病毒吸附過程中引入對(duì)照藥劑或共聚物組合物后，聚氧丙烯對(duì)病毒生長的效果的示例性曲線圖。圖2表示說明病毒吸附和/或生長過程中存在共聚物時(shí)病毒培養(yǎng)物生長的示例性曲線圖。圖3表示說明在病毒吸附和生長過程中存在增加量的含共聚物的組合物時(shí)病毒培養(yǎng)物生長的示例性曲線圖。圖4表示說明在病毒吸附過程中存在或不存在特定的共聚物時(shí)病毒培養(yǎng)物生長的示例性曲線圖。圖5表示說明存在或不存在多種濃度的共聚物時(shí)示例性病毒培養(yǎng)物的噬菌斑大小變化的示例性表格。定義如本文所用，“一 (a) ”或“一 (an) ”可以指一個(gè)或多于一個(gè)的物品。如本文所用，容器可以包括但不限于試管、小型或微量離心管、平板、組織培養(yǎng)瓶、 細(xì)胞工廠、通道、小瓶、微量滴定板或容器。如本說明書所用，“對(duì)象(subject) ”或“多個(gè)對(duì)象(subjects) ”可以包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如人或者馴化的或野生的哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、雪貂、兔、豬、馬、?；騽?dòng)物園動(dòng)物。如本文所用，“約”可以指正負(fù)10%。如本文所用，“高分子量表面活性劑”可以指具有表面活性的兩性分子，其分子量大于1500。如本文所用，“Ε0-Ρ0嵌段共聚物”可以指由聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷嵌段組成的共聚物。此外，如本文所用，“聚氧丙烯”可以指以EOx-POy-EOx形式的EO-PO嵌段共聚物。 EO-PO嵌段共聚物的這種結(jié)構(gòu)也稱為“泊洛沙姆”或“Synperonic”。如本文所用，“減毒病毒”可以指當(dāng)給予對(duì)象例如哺乳動(dòng)物(例如人或動(dòng)物)時(shí)，顯示出減少的或沒有病毒相關(guān)疾病的臨床征象的病毒。如本文所用，“加速”可以指在病毒生產(chǎn)開始前減少滯后時(shí)間或增加病毒生產(chǎn)速率，以至于在較短的時(shí)間里產(chǎn)生較高濃度的病毒，或者在一些實(shí)施方式中相對(duì)于對(duì)照，噬菌斑大小增加。如本文所用，“滅活病毒疫苗”可以指通過本領(lǐng)域已知的許多種物理或化學(xué)方法中的任意方法滅活病毒而制備的疫苗。發(fā)明詳述在以下部分，為詳述多種實(shí)施方式，描述了多種示例性組合物和方法。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，實(shí)施上述多種實(shí)施方式不需要使用本文列出的全部或甚至一些細(xì)節(jié)，而濃度，時(shí)間和其他細(xì)節(jié)可以通過日常實(shí)驗(yàn)修改。在一些情況下，熟知的方法或組分沒有包括在本說明書中。本文的實(shí)施方式涉及使用多種組合物以增加培養(yǎng)物中病毒生長的生長速率或減少滯后時(shí)間。根據(jù)這些實(shí)施方式，組合物可以包括共聚物藥劑。本申請(qǐng)的實(shí)施方式總體上涉及用于誘導(dǎo)和加速病毒生長的方法、組合物和用途。在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)總體上涉及用于加速病毒生長和/或增加噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。在其他實(shí)施方式中，涉及用于加速黃病毒生長、減少生長停滯和/或增加噬菌斑大小的共聚物組合物的方法、組合物和用途。本文考慮的某些共聚物組合物包括但不限于聚氧丙烯F127、 聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000至4000的EO-PO嵌段共聚物或其組合。共聚物在某些實(shí)施方式中，組合物可以包括共聚物，例如，聚氧丙烯F127。聚氧丙烯 F127(本文也稱為F127)是一種非離子聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。聚氧丙烯嵌段共聚物以其非專有名稱泊洛沙姆為人所知。它們最初被開發(fā)用作表面活性劑。這些化合物由親水性環(huán)氧乙烷(EO)和疏水性環(huán)氧丙烷(PO)嵌段組成。該EO-PO嵌段共聚物可以包括聚環(huán)氧乙烷(-CH2CH20-表示的E0)和聚環(huán)氧丙烷(-CH2CHCH30-表示的P0)嵌段。兩個(gè)EO嵌段可以位于該P(yáng)O嵌段兩側(cè)，以EOx-POy-EOx排列。由于PO組分是親水的而EO嵌段是疏水的， 所以總親水性、分子量和表面活性劑性質(zhì)可通過改變EOx-POy-EOx嵌段結(jié)構(gòu)中的χ和y來調(diào)整。根據(jù)制造商(例如BASF、Lutrol F127)，F(xiàn)127可以在乳劑和液體乳膠中用作增稠劑和共乳化劑。F127進(jìn)行一種稱為逆向熱凝膠作用的過程，因?yàn)樗谶_(dá)到生理溫度之后進(jìn)行從液體向膠體的相變。較高的溫度促進(jìn)該嵌段聚合物的環(huán)氧烷單元的脫水，這可以導(dǎo)致溶解度降低。具體地，在高濃度下(例如約10% W/V)，某些類型的較高分子量的Ε0-Ρ0嵌段共聚物會(huì)進(jìn)行逆向凝膠化，當(dāng)溫度增加時(shí)形成膠體。此外，當(dāng)這些嵌段共聚物位于臨界膠束濃度 (CMC)之上時(shí)，它們自組裝成膠束。在水溶液中，該Ε0-Ρ0嵌段共聚物會(huì)自組裝成具有PO核心和親水性EO基團(tuán)冠的膠束。在某些研究中，Ε0-Ρ0嵌段共聚物制劑已被研究作為潛在的用于多種疏水性藥物和用于蛋白質(zhì)、DNA或滅活疫苗的藥物遞送劑。目前還不清楚這些聚氧丙烯嵌段共聚物活性的機(jī)制。然而，聚氧丙烯F127已被研究作為結(jié)合殼聚糖的疫苗遞送系統(tǒng)的緩釋組分。用含有F127的破傷風(fēng)類毒素接種小鼠，增加了對(duì)鼻內(nèi)遞送和全身遞送的破傷風(fēng)抗原的抗體應(yīng)答。在某些方法中，聚氧丙烯已顯示誘導(dǎo)細(xì)胞膜微粘度和流動(dòng)性的改變，這些改變可以有助于其多能性。聚氧丙烯F127已在包括牙齒、口和緩瀉藥物的多種人類制藥應(yīng)用中使用。疫苗制劑也已使用表面活性劑作為穩(wěn)定劑以防止物質(zhì)損失。用某些濃度的F127 (0.01% w/v)遞送DNA疫苗的研究已顯示增加的藥物遞送，可能是通過增加細(xì)胞攝取和招募成熟的樹突細(xì)胞。在體溫時(shí)的凝膠形成允許使用該Ε0-Ρ0嵌段共聚物凝膠作為疫苗和藥物遞送應(yīng)用中的藥物貯存庫。本文公開的某些組合物可以包括單獨(dú)的共聚物或共聚物與其他藥劑或化合物的組合。此外，本文公開的組合物可以包括培養(yǎng)基組合物，除了其他的培養(yǎng)基添加物外，該培養(yǎng)基組合物具有一種或多種被加入到培養(yǎng)基中的共聚物藥劑(或多個(gè))。用于本文公開的組合物的培養(yǎng)基可以包括本領(lǐng)域已知的已知培養(yǎng)本文考慮的病毒生物的任意培養(yǎng)基，或者對(duì)特定病毒生物特異的培養(yǎng)基。本文的其他實(shí)施方式涉及極大地增加活病毒(例如減毒病毒)生長的賦形劑的組合。而本文的其他組合物和方法涉及減少與病毒生物生長有關(guān)的滯后時(shí)間。一些實(shí)施方式涉及調(diào)整病毒生物的噬菌斑大小。本文所用的共聚物包括但不限于聚氧丙烯F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000至4000 的EO-PO嵌段共聚物或其組合。本文考慮的組合物可以在病毒培養(yǎng)物被引入宿主培養(yǎng)物之前、期間或之后單獨(dú)使用或者與培養(yǎng)基結(jié)合使用。本文所公開的組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基可以是液體、固體或半固體液體。在某些實(shí)施方式中，補(bǔ)充組合物可以在整個(gè)病毒生長期間加入，以監(jiān)測(cè)、調(diào)節(jié)或促進(jìn)病毒生長過程。在其他實(shí)施方式中，可以加入一種或多種補(bǔ)充共聚物組合物，以減少滯后時(shí)間，加速病毒生長和/或增加病毒噬菌斑大小。本文考慮的組合物可以單獨(dú)使用，與其他補(bǔ)充物(例如維生素、金屬離子和氨基酸)組合使用，或當(dāng)將培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)物時(shí)作為培養(yǎng)基補(bǔ)充物。其他實(shí)施方式包括用于培養(yǎng)病毒培養(yǎng)物例如活減毒病毒的原液，這些活減毒病毒包括但不限于小RNA病毒(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、口蹄疫病毒)、萼狀病毒(例如SARS病毒、 貓傳染性腹膜炎病毒)、披膜病毒(例如辛德比斯病毒、馬腦炎病毒、基孔肯亞病毒、風(fēng)疹病毒、羅斯河病毒、牛腹瀉病毒、豬霍亂病毒)、黃病毒(例如登革熱病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、蜱媒腦炎病毒)、冠狀病毒(例如人冠狀病毒(普通感冒)、豬腸胃炎病毒)、彈狀病毒(例如狂犬病病毒、水皰性口炎病毒)、線狀病毒(例如馬爾堡病毒、埃博拉病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒、犬瘟熱病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、新城疫病毒、牛瘟病毒)、正粘病毒(例如人流感病毒、禽流感病毒、馬流感病毒)、布尼亞病毒(例如漢坦病毒、拉克羅斯病毒(LaCrosse virus)、山谷熱病毒)、 沙粒病毒(例如拉沙病毒、馬丘坡病毒)、呼腸病毒(例如人呼腸病毒、人輪狀病毒)、雙RNA 病毒(例如傳染性粘液囊病病毒(infectious bursal virus)、魚胰腺壞死病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIVl、HIV2、HTLV-I、HTLV-2、牛白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、細(xì)小病毒(人細(xì)小病毒B、犬細(xì)小病毒、貓白細(xì)胞減少癥病毒)、乳多空病毒(例如人乳頭瘤病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒)、腺病毒 (例如人腺病毒、犬腺病毒、牛腺病毒、豬腺病毒)、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、人巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒6)、和痘病毒(例如牛痘、禽痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、猴痘病毒、牛痘病毒、傳染性軟疣病毒 (muscuIum contagiosum virus))。根據(jù)這些實(shí)施方式，某些活減毒病毒包括但不限于活減毒黃病毒。一些涉及組合物的實(shí)施方式可以包括但不限于一種或多種活減毒病毒，例如一種或多種活減毒黃病毒， 這些病毒在一種或多種共聚物組合物中單獨(dú)培養(yǎng)或與其他藥劑組合培養(yǎng)。根據(jù)這些實(shí)施方式，黃病毒可以包括但不限于登革熱病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、蜱媒腦炎病毒或其他已知的黃病毒。在其他實(shí)施方式中，與沒有在本文公開的組合物中培養(yǎng)的對(duì)照相比，本文考慮的組合物可以在減少的或相似的生長時(shí)期內(nèi)增加噬菌斑大小，用于評(píng)估病毒活性或滴定病毒制備物。可選地，本文考慮的組合物可以減少滯后時(shí)間或加速生長時(shí)間，多達(dá)比沒有使用本文考慮的組合物的對(duì)照病毒培養(yǎng)物早數(shù)日。在某些實(shí)施方式中，預(yù)先確定的病毒滴度能比在本領(lǐng)域已知的其他培養(yǎng)基或提供給不含共聚物的培養(yǎng)物的補(bǔ)充組合物中培養(yǎng)的病毒制備物早數(shù)小時(shí)、半天、1天、2天、3天、4天或甚至多達(dá)10天出現(xiàn)。一些實(shí)施方式的最優(yōu)病毒滴度可以是約lX106pfu/ml至約lX108pfu/ml。在一些實(shí)施方式中，在含F(xiàn)127的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約4天，黃病毒的滴度可以達(dá)到約lX107pfu/ml的濃度，與之相比，在不含F(xiàn)127的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黃病毒需要約6天。本文的一些實(shí)施方式涉及用于調(diào)整病毒培養(yǎng)物生長以達(dá)到預(yù)定濃度的時(shí)間的組合物和方法。根據(jù)這些實(shí)施方式，生長時(shí)間可以減少約5%、約10%、約15%、約20%、約 25 %、約30 %、約35 %、約40 %或更多。在多種實(shí)施方式中，與本領(lǐng)域已知的其他組合物相比，使用本文公開的組合物，可以在約80%、或約70%、或約60的時(shí)間內(nèi)達(dá)到預(yù)定的病毒培養(yǎng)物密度。在某些實(shí)施方式中，本文考慮的用于生產(chǎn)的病毒培養(yǎng)物可在組合物中使用，該組合物包括但不限于部分或完全脫水的或水合的疫苗制劑。在其他實(shí)施方式中，本文考慮的用于生產(chǎn)疫苗制劑的病毒培養(yǎng)物可以用減少的時(shí)間和成本培養(yǎng)。另外，生產(chǎn)這些疫苗制劑可以減少勞動(dòng)量、時(shí)間和成本，例如，當(dāng)發(fā)生黃病毒相關(guān)疾病流行或爆發(fā)，在短時(shí)間內(nèi)需要疫苗制劑時(shí)。在一些實(shí)施方式中，本文考慮的用于疫苗組合物的活減毒病毒可以包括但不限于一種或多種活減毒黃病毒疫苗，該活減毒黃病毒疫苗包括但不限于減毒黃熱病毒(例如17D)、減毒日本腦炎病毒(例如SA 14-14-2)、減毒登革熱病毒(例如DEN-2/PDK-53或 DEN-4A 30)、減毒嵌合西尼羅河病毒或重組嵌合黃病毒。在某些實(shí)施方式中，用于疫苗組合物的黃病毒培養(yǎng)物可以在含有一種或多種本文公開的共聚物的培養(yǎng)基組合物中培養(yǎng)。其他實(shí)施方式涉及用于制劑的病毒群體和涉及能減少或預(yù)防由一種或多種本文考慮的黃病毒引起的醫(yī)學(xué)狀況發(fā)生的疫苗制劑的方法。根據(jù)這些實(shí)施方式，醫(yī)學(xué)狀況可以包括但不限于西尼羅河病毒感染、登革熱、日本腦炎、庫阿撒魯爾森林病、墨萊溪谷腦炎、 Alkhurma出血熱、圣路易斯腦炎、蜱媒腦炎、黃熱病和丙型肝炎病毒感染。因此，使用本文考慮的用于增加生長、減少滯后時(shí)間和/或增加公開的制劑中使用的病毒群體的噬菌斑大小的組合物，可以縮短產(chǎn)生這些制劑的生產(chǎn)時(shí)間。其他實(shí)施方式涉及用于治療應(yīng)用的病毒組合物。這樣的用途可以包括但不限于基因治療應(yīng)用。在基因治療應(yīng)用中使用的將基因遞送到細(xì)胞的病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和皰疹病毒。病毒組合物的其他用途可以包括但不限于癌癥病毒治療(例如“溶瘤” 病毒)或癌癥免疫治療。本文考慮用于培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物(例如宿主細(xì)胞)的任意培養(yǎng)基可以用于本文。例如，常用的用于細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基被考慮。根據(jù)這些實(shí)施方式，培養(yǎng)基可以包括但不限于 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium，高葡萄糖，含有L谷氨酰胺，含有鹽酸吡哆醇， 不含丙酮酸鈉，含有 3. 7g/ 升的碳酸氫鈉)、MEM、BBS/YE-LAH、F-IO (Ham，s)、F-12、M-199、 RPMI、Agars、LB Broth和基于PBS的培養(yǎng)基。另外，考慮細(xì)胞可以用本領(lǐng)域已知的任意方法培養(yǎng)。例如，細(xì)胞可以以匯合層培養(yǎng)，作為懸浮液，在滾瓶中、在孔中或在管中以多層培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以用于培養(yǎng)本文公開的病毒?？紤]對(duì)本文公開的宿主病毒已知的任何細(xì)胞。一些用于培養(yǎng)本文公開的病毒的宿主細(xì)胞包括但不限于 Vero (非洲綠猴Vero細(xì)胞)、LLC-MK2細(xì)胞、C6/36蚊細(xì)胞或本領(lǐng)域已知的其他細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方式報(bào)道了含有一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物化合物的組合物，該組合物用于培養(yǎng)多種病毒培養(yǎng)物的方法，其中與不含共聚物組合物的組合物相比，本文公開的一些組合物能調(diào)整病毒生長的多個(gè)方面(例如，較大的噬菌斑大小、 減少的停滯期)達(dá)約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%或更多。試劑盒另外的實(shí)施方式涉及用于本文所述方法和組合物的試劑盒。試劑盒中可提供包括但不限于共聚物組合物的組合物和活病毒制劑。試劑盒還包括但不限于適當(dāng)?shù)娜萜?、共聚物組合物、本文詳述的活病毒組合物以及任選地，一種或多種另外的藥劑例如其他抗病毒藥劑、抗真菌藥劑或抗菌劑，例如以調(diào)節(jié)非期望的物種的生長。該試劑盒還可包含用于病毒培養(yǎng)物的適當(dāng)分裝的共聚物組合物。此外，本文的組合物可以是部分或全部脫水的或者水性的病毒培養(yǎng)物和/或用于增殖該病毒的宿主細(xì)胞以及液體或部分或全部脫水的培養(yǎng)基。本文考慮的試劑盒可以在室溫、冷凍或冷藏溫度下儲(chǔ)存，如本文所公開地取決于具體的制劑和組分。該試劑盒的容器裝置將通常包括至少一個(gè)管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置，組合物可以放入該容器中，并優(yōu)選地，適當(dāng)?shù)胤盅b。當(dāng)提供額外的組分時(shí)，該試劑盒還會(huì)通常包含一個(gè)或多個(gè)額外的容器，該藥劑或組分可以放于其中。本文的試劑盒還將典型地包含將藥劑、組合物和任意其他試劑容器密封包裝，以供商業(yè)銷售的方法。這樣的容器可以包括注射或者吹塑成型的塑料容器，期望的管形瓶保留在其中。包括了以下實(shí)施例以說明本文所述的某些實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 接下來的這些實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了在本文公開的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的運(yùn)轉(zhuǎn)良好的技術(shù)，因而可以考慮用于其實(shí)踐。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)，根據(jù)本公開內(nèi)容，理解可以對(duì)公開的具體實(shí)施方式
進(jìn)行許多改變，仍然獲得同樣或相似的結(jié)果，而不背離本文的精神和范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1在一個(gè)示例性方法中，如圖1所示，在一個(gè)示例性細(xì)胞系——Vero細(xì)胞(非洲綠猴Vero細(xì)胞)中測(cè)試了聚氧丙烯對(duì)黃病毒生長的效果。將Vero細(xì)胞培養(yǎng)到匯合，例如在 T-75cm2燒瓶中培養(yǎng)2天，然后用黃病毒(如指明的)以0. 001的MOI感染。在存在或不存在聚氧丙烯(P123或F127)時(shí)在2mL PBS中評(píng)價(jià)180分鐘的病毒吸附。對(duì)照樣品包含沒有共聚物的PBS中的病毒吸附。在吸附后加入生長培養(yǎng)基(18mL無血清DMEM)。每天取等分試樣，并在單層Vero細(xì)胞上進(jìn)行滴定。測(cè)量的病毒滴度如圖1所示。在另一個(gè)實(shí)施例中，如圖2所示，測(cè)定了不存在或存在不斷變化濃度的共聚物—— 聚氧丙烯F127時(shí)，嵌合黃病毒DEN2/4在Vero細(xì)胞中的生長。將Vero細(xì)胞培養(yǎng)到匯合，例如在T-75cm2燒瓶中培養(yǎng)2天，然后用DEN2/4以0. 001的MOI感染。將病毒在2mL含有或不含F(xiàn)127的DMEM中吸附120分。用PBS將病毒接種物從細(xì)胞單層上沖洗掉，然后加入 25mL指定的生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有5% PBS,含有或不含F(xiàn)127，培養(yǎng)14天。每天取等分試樣，并在Vero細(xì)胞單層上測(cè)滴度。測(cè)量的病毒滴度如圖2所示。實(shí)施例2
在另一個(gè)示例性方法中，檢測(cè)了在吸附和生長期間含有不斷增加量的F127的 Vero細(xì)胞中的DEN 2/4 (登革熱2/4)嵌合病毒的生長(參見例如圖3)。在T75cm2燒瓶中， 在25mL含10% PBS和對(duì)照或不斷增加濃度的F127的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero細(xì)胞的匯合單層。在該實(shí)驗(yàn)中使用的示例性F127濃度包括0. 063%,0. 125%,0. 25%,0. 5%、1· 0%和 2. 0% F127。用DEN 2/4在MOI = 0. 001時(shí)感染細(xì)胞。參數(shù)包括在ImL DMEM/F127中吸附 1.5小時(shí)。每兩天取等分試樣，并在Vero細(xì)胞單層上進(jìn)行滴定。測(cè)量的病毒滴度如圖3中所示。此外，另一個(gè)實(shí)驗(yàn)分析了嵌合黃病毒DEN2/1的病毒吸附期間共聚物F127的效果。 在該實(shí)施例中，DEN2/1以0. 001的MOI吸附到Vero細(xì)胞的匯合燒瓶上90分鐘。吸附是在 ImL含有或不含F(xiàn)127的生長培養(yǎng)基(BA-I)中進(jìn)行的。在病毒吸附后，向培養(yǎng)物中加入 20mL含2% FBS,不含F(xiàn)127的DMEM。每兩天取等分試樣，并在Vero細(xì)胞單層上進(jìn)行滴定。 測(cè)定的病毒滴度如圖4中所示。實(shí)施例3另一個(gè)示例性方法分析了示例性共聚物F127存在時(shí)噬菌斑大小是否增加。圖5表示一個(gè)示例性表格——表1。該實(shí)驗(yàn)證明生長期間存在不斷增加濃度的聚氧丙烯F127時(shí)， 黃病毒噬菌斑大小增加。在此，在T75cm2燒瓶中，在20mL含有或不含F(xiàn)127的DMEM2% FBS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero細(xì)胞的匯合單層，其中將Vero細(xì)胞用DEN2/4在MOI = 0. 001時(shí)感染。 吸附1. 5小時(shí)，是在ImL存在(0.1%或1.0%)或不存在F127的DMEM中進(jìn)行的。將噬菌斑(例如8)在光盒上可視化，并測(cè)量其直徑。表1顯示了在不存在F127或存在不斷增加濃度的F127時(shí)，DENVax 2/4生長噬菌斑大小(mm)差異的單因素方差分析(one wayANOVA) 的結(jié)果。材料與方法考慮本領(lǐng)域已知的任意方法可用于本文描述的任意組合物、方法和/或用途。在某些實(shí)施方式中，考慮某些方法會(huì)比其他方法更適于病毒生長，例如用于黃病毒生長的材料和方法。在其他實(shí)施方式中，考慮某些方法對(duì)登革熱病毒的生長將比對(duì)其他黃病毒更合適。下文提供關(guān)于在存在F127時(shí)培養(yǎng)高滴度嵌合登革熱疫苗或任意活減毒黃病毒的方法的簡要說明。例如，使用T-75cm2燒瓶，在病毒感染/吸附2天之前以每個(gè)燒瓶5X 10~6個(gè)細(xì)胞的密度接種Vero細(xì)胞。該病毒生長可以“按比例增加”以包括從T-25cm2到10套細(xì)胞工廠的組織培養(yǎng)容器。在細(xì)胞接種2天后，將病毒在ImL含F(xiàn)127 (0. 1%)的DMEM中吸附到Vero細(xì)胞的匯合單層上。將該培養(yǎng)容器在37°C溫育1.5小時(shí)，每10分鐘搖動(dòng)容器。在病毒吸附后，用IOmL PBS沖洗細(xì)胞單層3次。然后將生長培養(yǎng)基(IOmL DMEM，pH = 7. 2， 含有3. 7g/L NaHCOjnO. 1 % F127，不含F(xiàn)BS)加入到該單層，并在通風(fēng)或不通風(fēng)的條件下在 37°C溫育4天。在病毒生長的第4天，如病毒吸附后所做的，更換生長培養(yǎng)基。從第6天開始，直到第12天，將感染培養(yǎng)基從培養(yǎng)室中完全移除，并離心澄清。將該病毒培養(yǎng)物穩(wěn)定并儲(chǔ)存在_80°C，直到其滴度能通過在Vero細(xì)胞單層上的噬菌斑分析而測(cè)定。在每天的收獲后，如第4天所做的，更換組織培養(yǎng)容器上的生長培養(yǎng)基。每天的收獲持續(xù)到第12天。每天的收獲物分別在Vero細(xì)胞上滴定，可以將高滴度的收獲物混合以獲得均勻樣品。通常， 不包括第一天的收獲物(第6天)，以避免高水平的宿主細(xì)胞(Vero) DNA。表1. DMEM-F12的例子F_12營養(yǎng)混合物(Ham)、含有L-谷氨酰胺的粉末(21700)。每1OL的添加物11. 76g碳酸氫鈉、1OOml青霉素鏈霉素，調(diào)整將pH調(diào)到7. 2
權(quán)利要求
1.用于培養(yǎng)病毒培養(yǎng)物的組合物，其包括一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物；以及任選地，培養(yǎng)基，其中所述高分子量表面活性劑或共聚物加速病毒培養(yǎng)物的生長。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述高分子量表面活性劑或共聚物包含聚氧丙烯 F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000-4000的EO-PO嵌段共聚物或其組合。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述病毒培養(yǎng)物選自黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、 彈狀病毒、線狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、鼠疫病毒、小RNA病毒、萼狀病毒、呼腸病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒和痘病毒。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述病毒培養(yǎng)物是黃病毒培養(yǎng)物。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述病毒培養(yǎng)物是痘病毒培養(yǎng)物。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述高分子量表面活性劑包含EO-PO嵌段共聚物聚氧丙烯F127、聚氧丙烯P123或其組合。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一種所述高分子量表面活性劑具有1500或更大的分子量。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一種所述高分子量表面活性劑還包含一種或多種共聚物，其中至少一種高分子量表面活性劑的分子量是3000或更大。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一種所述高分子量表面活性劑濃度是約 0. 001%至約 3. 0%o
10.權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一種所述高分子量表面活性劑包含聚氧丙烯 F127，所述培養(yǎng)基包含 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM)。
11.增加病毒生長速度的方法，包括給予用病毒感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的組合物，其中所述組合物增加病毒生長速度。
12.增加病毒生長速度的方法，包括在病毒感染宿主細(xì)胞培養(yǎng)物之前、期間或之給予所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的組合物。
13.增加病毒培養(yǎng)物噬菌斑大小的方法，包括給予用病毒感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的組合物，其中與沒有給予一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的對(duì)照病毒培養(yǎng)物相比，所述組合物增加病毒噬菌斑大小。
14.減少病毒培養(yǎng)物生長滯后時(shí)間的方法，包括給予用病毒感染的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的組合物，其中與沒有給予一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的對(duì)照病毒培養(yǎng)物相比，所述組合物減少所述病毒培養(yǎng)物的滯后時(shí)間。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述病毒培養(yǎng)物選自黃病毒培養(yǎng)物。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述病毒培養(yǎng)物包含用于產(chǎn)生活減毒疫苗的病毒培養(yǎng)物。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述滯后時(shí)間的減少包含與沒有給予一種或多種高分子量表面活性劑或共聚物的病毒培養(yǎng)物相比，至少10%的滯后時(shí)間減少。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述至少一種高分子量表面活性劑包含聚氧丙烯 F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000-4000的EO-PO嵌段共聚物或其組合。
19.用于培養(yǎng)病毒的試劑盒，包括 至少一個(gè)容器；包含一種或多種高分子量表面活性劑的組合物；和任選地，一種或多種病毒培養(yǎng)物。
20.權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中至少一種所述高分子量表面活性劑包含聚氧丙烯 F127、聚氧丙烯F68、聚氧丙烯P85、聚氧丙烯P123、其他分子量大于3000-4000的EO-PO嵌段共聚物或其組合。
21.權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述EO-PO嵌段共聚物聚氧丙烯F127濃度是從 0. 001%至約 3. 0%o
22.權(quán)利要求19所述的試劑 監(jiān)，其中所述病毒培養(yǎng)物包含一種或多種黃病
23.權(quán)利要求19所述的試劑 監(jiān)，還包含培養(yǎng)基。
24.權(quán)利要求19所述的試劑 監(jiān)，還包含宿主細(xì)胞儲(chǔ)備培養(yǎng)物。
全文摘要
本文的實(shí)施方式報(bào)道用于誘導(dǎo)和/或加速病毒生長的方法、組合物和用途。在某些實(shí)施方式中，方法、組合物和用途總體上涉及用于誘導(dǎo)病毒生長、減少滯后時(shí)間和/或增加病毒噬菌斑大小的共聚物組合物。在其他實(shí)施方式中，共聚物組合物的方法、組合物和用途能用于誘導(dǎo)黃病毒生長，減少生長滯后和/或增加噬菌斑大小。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102272294SQ200980154016
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者D·T·斯廷什科姆, J·A·萊文古德, J·奧索里奧, O’N·維根, R·金尼 申請(qǐng)人:伊維拉根公司