專利名稱：源自成人腎小球的分離的多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)、其制備方法及其在腎臟再生醫(yī) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多潛能的人類間充質(zhì)干細(xì)胞，其源自成人腎臟的脫被膜的腎小球并且顯示出分化成多種細(xì)胞類型尤其是腎小球細(xì)胞類型的能力，同時(shí)，其特征在于顯著的自我更新和克隆生成能力。此外，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的多潛能人類間充質(zhì)干細(xì)胞的方法和此類干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)尤其是腎損傷和疾病的治療性處理中的用途。
背景技術(shù)：
已知干細(xì)胞移植具有修復(fù)和再生受損的或損傷的組織和器官的潛力。因此，近年來已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，以便從人類和動(dòng)物來源鑒定并分離新的多潛能干細(xì)胞，并研究干細(xì)胞在臨床應(yīng)用尤其是再生醫(yī)學(xué)中的有效性。例如，基于BrdU保留，Oliver等人[3]在成年嚙齒類動(dòng)物的腎乳頭中鑒定出緩慢循環(huán)的干細(xì)胞。使用相同的方法，Maeshima等人[4]在成年大鼠的腎小管中鑒定出BrdU標(biāo)記的細(xì)胞并顯示出此類干細(xì)胞生成鄰近的腎小管的潛力，以及當(dāng)被移植進(jìn)入后腎時(shí)收集管細(xì)胞或纖維母細(xì)胞的潛力。Kitamura等人建立并表征了來自成年大鼠腎臟的腎單位的S3 部分的腎祖細(xì)胞的獨(dú)特群體[37]。這些細(xì)胞顯示為具有自我更新能力并表達(dá)腎胚胎標(biāo)志物，例如Pax2、Wtn4和Wtnl。基于擠出Hoechst染料的能力，在小鼠胚胎和成人腎臟中鑒定出了具有多潛能潛力的所謂的“邊緣群體(side population” [38]。最近，Gupta等人證明在成年大鼠腎臟中存在多潛能腎祖細(xì)胞的常駐于腎臟中的群體，其表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，例如Oct-4和Ι^χ-2[5]。然而，鑒于它們的來源是動(dòng)物，這些多潛能腎臟干細(xì)胞不能用于與人類組織或器官的再生相關(guān)的臨床應(yīng)用。在參考文獻(xiàn)[39]中已經(jīng)公開了從胚胎性人類腎臟中鑒定出的多潛能的 CD133+CD24+干細(xì)胞群。然而，這些胚胎干細(xì)胞不是解決提供用于再生醫(yī)學(xué)的人類干細(xì)胞這一問題的最佳方案，尤其是考慮到與胚胎干細(xì)胞系以及從人類胚胎來制備它們相關(guān)的倫理學(xué)問題。本發(fā)明人之前公開在成人腎臟中存在CD133+祖細(xì)胞/干細(xì)胞的常駐群體[1]。 發(fā)現(xiàn)這些CD133+細(xì)胞是在靠近近側(cè)腎小管和腎小球的間質(zhì)中或腎小管內(nèi)的稀少細(xì)胞，并且顯示它們?cè)隗w外和體內(nèi)經(jīng)歷腎上皮和內(nèi)皮分化。最近，Mgrinati等人從成年腎臟的鮑曼氏囊中分離并表征了多潛能⑶133+⑶M+細(xì)胞群[2]。然而，在人類腎臟中鑒定的⑶133+祖細(xì)胞/干細(xì)胞的特征在于自我更新能力差。此外，沒有證明此類干細(xì)胞具有分化成存在于腎小球中的多種細(xì)胞類型即足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的能力。Schwab 等人，Human Reproduction (Oxford)，vol. 22，no. 11,2007 年 11 月，第 2903-2911頁公開了子宮內(nèi)膜的⑶146+PDGF-R0 +⑶34+間充質(zhì)干細(xì)胞，其顯示出MSC的經(jīng)典分化能力，即分化為成脂肪、成骨、成軟骨和成肌譜系。該論文沒有提及進(jìn)一步的分化能力。然而，這些細(xì)胞的子宮內(nèi)膜來源強(qiáng)烈說明，它們不具有產(chǎn)生腎小球細(xì)胞類型例如足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力。
WO 2008/045498公開了源自腎臟的CD;34+CD133-CD105-細(xì)胞群，其能夠分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。然而，沒有公開其分化成腎小球細(xì)胞類型。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的特征在于它們分化成間充質(zhì)來源的不同細(xì)胞系的能力 [7]。間充質(zhì)干細(xì)胞的主要貯庫是骨髓(BM) [8]。然而，最近在鼠模型中獲得的數(shù)據(jù)證明了 MSC區(qū)室的更廣泛的分布。事實(shí)上，已經(jīng)在幾乎所有的鼠成年組織(脾、肌肉、腎、肺、肝、腦、 胸腺)以及血管壁中檢測(cè)到了 MSCM。在人類中，已經(jīng)從循環(huán)的血液以及從數(shù)種組織例如滑膜、脂肪組織、骨小梁、牙髓、真皮和肺中分離了 MSC[9-16]。然而，目前為止尚未研究過人類腎小球中MSC的存在。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上所述，需要源自成人腎臟的間充質(zhì)干細(xì)胞，其能夠分化為存在于腎小球中的多種細(xì)胞類型并且能夠自我更新，從而成功應(yīng)用于腎的再生醫(yī)學(xué)，尤其是作為藥物用于影響人類腎臟的損傷和/或疾病、更具體而言是影響腎小球的損傷和/或疾病的治療性處理。通過分離的多潛能人類間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了這些和其它目標(biāo)，所述細(xì)胞是由本發(fā)明人在成人腎臟的脫被膜的腎小球中鑒定并分離的。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其特征在于其為CD133 (陰性)、CD146 (陽性)、⑶34 (陰性)和⑶105 (陽性)。有利地，源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)能夠分化成腎小球細(xì)胞類型，即足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，hGL-MSC的特征還在于，其是⑶對(duì)(陽性)和 Ι^χ-2(陽性)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，hGL-MSC的特征還在于，其是α -SMA(陰性)和 0ct-4(陰性)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是制備本發(fā)明的hGL-MSC的方法，其包括以下步驟-在不存在特定生長(zhǎng)因子的情況下，在包含含有血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基并且在生理PH緩沖的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自成人腎臟的脫被膜的腎小球，從而獲得從培養(yǎng)的脫被膜的腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞的混合群體，所述細(xì)胞的混合群體包含紡錘形的CD133(陰性)、 CD146 (陽性)細(xì)胞和CD133 (陽性)、CD146 (陽性)細(xì)胞；和-從所述混合群體中分離紡錘形的⑶133(陰性)、⑶146(陽性)細(xì)胞，所述紡錘形的⑶133 (陰性)、⑶146 (陽性)細(xì)胞即代表本發(fā)明的hGL-MSC。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述增殖培養(yǎng)基在6. 8至7. 4、更優(yōu)選7. 2至7. 4的pH范圍內(nèi)緩沖。可以使用能夠?qū)H維持在生理范圍內(nèi)的任意緩沖劑，例如H印es、PBS等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述代表本發(fā)明的hGL-MSC的紡錘形的CD133(陰性)、CD146 (陽性)細(xì)胞分離自細(xì)胞培養(yǎng)物的至少第3次傳代，或分離自細(xì)胞培養(yǎng)物的后續(xù)傳代，例如，第4次傳代、第5次傳代、第6次傳代等。該實(shí)施方式是基于以下事實(shí)紡錘形的CD133 (陰性)、CD146 (陽性)細(xì)胞是在上述培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)物第3次傳代后發(fā)現(xiàn)存活的混合群體中的唯一細(xì)胞類型。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述紡錘形的⑶133(陰性)、⑶146(陽性)細(xì)胞是通過例如FACS的細(xì)胞分選方法從混合群體中分離的?；蛘?，可以基于它們的紡錘形狀的形態(tài)進(jìn)行分離。有利地，本發(fā)明的hGL-MSC的特征在于顯著的自我更新和克隆生成能力，以及分化成多種腎小球細(xì)胞類型的能力，所述腎小球細(xì)胞類型包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和足細(xì)胞。這些特征使本發(fā)明的hGL-MSC特別適合用于腎再生。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明的分離的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)作為藥物用于腎臟損傷或疾病、尤其是影響腎小球的損傷或疾病的治療性處理的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含本發(fā)明的分離的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC) 和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或介質(zhì)的藥物組合物。包含本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)的藥物組合物特別適合用于治療腎臟損傷或疾病、尤其是影響腎小球的損傷或疾病。


本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特征將通過以下詳細(xì)描述并參考附圖而變得明顯，其中圖1顯示了從腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)速率。顯示了培養(yǎng)M小時(shí)㈧、 7天(B)、2周(C)和3周(D)后以膠原酶I處理而除掉鮑曼氏囊，培養(yǎng)物中的成人腎小球的代表性顯微圖像(放大200倍)。顯示了 5種不同制備物(稱作R136、R140、R141、R147 和R148)的生長(zhǎng)曲線。圖2涉及本發(fā)明的hGL-MSC的表征。A)代表性的FACS分析，其顯示hGL_MSC對(duì)于MSC的特征性表面標(biāo)志物(⑶四、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166)是陽性的，對(duì)于⑶133 和特異性造血標(biāo)志物(⑶45和⑶34)是陰性的，并且對(duì)于內(nèi)皮標(biāo)志物(⑶31)是陰性的。虛線是同種型對(duì)照。B)以針對(duì)波形蛋白、巢蛋白、Nanog和Musashi的抗體染色的hGL-MSC的代表性的免疫熒光顯微圖像(放大600倍)。產(chǎn)生的所有的hGL-MSC系都顯示出相同的表型。圖3顯示了 hGL-MSC的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)及其克隆效率。A)代表性的FACS分析，其顯示hGL-MSC對(duì)于II類抗原和粘附分子⑶154以及共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40 (黑線) 是陰性的。虛線是同種型對(duì)照。B)加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)或本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)抑制了 PHA誘導(dǎo)的PBMC增殖。在存在2. 5 μ g/m PHA的情況下， 在含有或不含^dO3AilBM-MSC或hGL-MSC的情況下，培養(yǎng)PBMC (5xl04/ml) 48小時(shí)。數(shù)據(jù)表示為平均值士一式三份的4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SD。*p < 0. 05 (Student t檢驗(yàn))。C)克隆生成效率表示為在每次培養(yǎng)傳代中獲得的克隆的百分率(％ )。圖4是代表性的共聚焦顯微圖像，其顯示了 A)⑶146和⑶對(duì)在腎小球中的共表達(dá)(箭頭)；B)CD133在鮑曼氏囊的壁細(xì)胞中的表達(dá)(箭頭)以及在近側(cè)腎小管的上皮細(xì)胞中的表達(dá)(星號(hào))；(C)在腎小球⑶146(陽性)和⑶M (陽性)細(xì)胞中不存在⑶133的表達(dá)(箭頭)。原始放大630倍。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人進(jìn)行的研究旨在探究在成人脫被膜的腎小球中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞，以及此類干細(xì)胞是否是常駐群體。此外，本發(fā)明人評(píng)估了源自腎小球的MSC的分化潛力，尤其是分化為腎小球細(xì)胞類型例如足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的潛力。如在說明書的實(shí)驗(yàn)部分更詳細(xì)地公開的那樣，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC) 獲自通過手術(shù)方式切除的人類腎臟的皮層的正常部分。分離皮層并通過分級(jí)的連續(xù)網(wǎng)孔之后，收集腎小球懸浮液，洗滌并通過機(jī)械和酶處理除掉鮑曼氏囊。將脫被膜的腎小球(圖 1A)在含有血清的緩沖的增殖培養(yǎng)基中在非分化條件下培養(yǎng)，也就是說，在不存在能夠引導(dǎo)干細(xì)胞分化的特定生長(zhǎng)因子的條件下培養(yǎng)。在7天內(nèi)，觀察到腎小球中長(zhǎng)出粘附細(xì)胞(圖1B)。到第12-14天時(shí)達(dá)到匯合時(shí)，通過胰蛋白酶-EDTA處理剝離細(xì)胞單層。通過低速離心除掉腎小球殘留物，將細(xì)胞在相同的增殖培養(yǎng)基中增殖。在最初的培養(yǎng)階段，細(xì)胞培養(yǎng)物中具有形態(tài)上的異質(zhì)性(圖1C)，但是在大約3周(即大約第4次傳代)后，培養(yǎng)物變成單一形態(tài)的具有紡錘形的細(xì)胞(圖1D)。 圖IE顯示了 5種不同的細(xì)胞制備物的生長(zhǎng)曲線。在前5次傳代過程中，生長(zhǎng)速率低，但是隨著連續(xù)的亞培養(yǎng)而增加，直至第20次傳代(培養(yǎng)大約100天)，此時(shí)細(xì)胞不能再增殖。傳代之間的間隔是大約3至7天，直至第4次傳代，在第4次傳代之后，傳代之間的間隔設(shè)定為大約7天。從脫被膜的腎小球中長(zhǎng)出的紡錘形的細(xì)胞是本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)。因此，可以基于它們的形態(tài)學(xué)特征從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離這些干細(xì)胞，優(yōu)選從細(xì)胞培養(yǎng)物的至少第3次傳代或細(xì)胞培養(yǎng)物的后續(xù)傳代，例如，第4次傳代、第5次傳代、第6 次傳代分離。本發(fā)明人還觀察到，從脫被膜的腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞是混合的群體，其在早期細(xì)胞傳代(1-3)時(shí)包含31 士 11% CD133(陽性)和74 士洸％ CD133 (陰性)細(xì)胞(n = 15個(gè)制備物)，如通過流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)。兩種細(xì)胞群體都表達(dá)CD146。因此，作為形態(tài)學(xué)方法的替代，可以通過細(xì)胞分選方法，例如熒光激活的細(xì)胞分選 (FACS)來分離本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。優(yōu)選地，通過FACS從第2次、 第3次或第4次傳代分離⑶133 (陽性)、⑶146 (陽性)細(xì)胞和⑶133 (陰性)、⑶146 (陽性)細(xì)胞；然而，也可以從任意細(xì)胞傳代甚至在亞傳代之前分離它們。表征并克隆FACS分選的群體。發(fā)現(xiàn)⑶133+⑶146+細(xì)胞共表達(dá)標(biāo)志物⑶31和vWF，這表明其為內(nèi)皮細(xì)胞表型。這種 ⑶133+群體不共表達(dá)巢蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)，也不共表達(dá)MSC標(biāo)志物，例如波形蛋白、⑶73、 CD29或CD166(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)從經(jīng)消化的脫被膜的腎小球的細(xì)胞懸浮液中通過免疫磁性分選CD133+細(xì)胞群體時(shí)，觀察到相同的表型(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在存在增殖培養(yǎng)基的條件下在第4次傳代后表征從腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞時(shí)，無法再檢測(cè)到CD133+細(xì)胞。分選的⑶133XD146+細(xì)胞對(duì)于MSC的特征性表面標(biāo)志物(包括⑶四、⑶44、⑶73、 ⑶90、⑶105和⑶166) [25]是陽性的，并且對(duì)于⑶133和特定的造血標(biāo)志物(⑶45和⑶34) 以及對(duì)于內(nèi)皮標(biāo)志物(CD31)是陰性的(圖2A)。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞表達(dá)MSC特異性標(biāo)志物波形蛋白和神經(jīng)及肝臟常駐干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白[沈，27，觀]，顯示出細(xì)胞質(zhì)絲狀模式(圖2B)。該細(xì)胞群體不表達(dá)上皮標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白和E-鈣粘附蛋白。它也不表達(dá)通常由特化的腎小球細(xì)胞表達(dá)的其它標(biāo)志物，例如α SMA(但是系膜細(xì)胞表達(dá)α SMA)或 Mphrin (但是足細(xì)胞表達(dá)η印hrin)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些特征表明不存在污染性的腎小球細(xì)胞。還評(píng)估了標(biāo)志物NanOg、0ct-4和Musashi的表達(dá)。這些分子是已知的參與胚胎和成體干細(xì)胞的自我更新和多能性的轉(zhuǎn)錄因子[29-33]。本發(fā)明的干細(xì)胞群顯示出Nanog和 Musashi 二者的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)表達(dá)(圖2B)，而它不表達(dá)0ct_4 (未顯示)。還顯示hGL-MSC組成型表達(dá)I類MHC抗原(圖2A)，但是它們對(duì)于II類抗原、對(duì)于粘附分子⑶154以及對(duì)于共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40是陰性的(圖3A)，如對(duì)于BM-MSC 所描述的那樣[34]。此外，類似于BM-MSC (已知其抑制PHA誘導(dǎo)的PBMC增殖)，hGL-MSC使 PHA誘導(dǎo)的PBMC增殖顯著減少(圖:3B)。然而，不同于BM-MSC的是，hGL-MSC是⑶對(duì)(陽性)和Pax-2(陽性)的。此外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的hGL-MSC對(duì)于α -SMA和Oct-4都是陰性的， 這不同于分離自小鼠腎臟的腎干細(xì)胞。為了證明從腎小球獲得的hGL-MSC群體的自我更新能力，本發(fā)明人在分選的 ⑶133+CD146+和⑶133TD146+細(xì)胞上進(jìn)行了克隆生成測(cè)定。將單細(xì)胞懸浮液接種于96孔板中，分選在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物的第3次傳代時(shí)從腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞。CD133—CD146+ 細(xì)胞的克隆生成效率是25.3士5.1%，而^133+00146+細(xì)胞不是克隆生成性的(圖3C)。從 CD133XD146+細(xì)胞的原代克隆產(chǎn)生的單細(xì)胞懸浮液的接種提供了次級(jí)克隆，從次級(jí)克隆產(chǎn)生的單細(xì)胞的接種產(chǎn)生三級(jí)克隆(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明腎小球的⑶133TD146+細(xì)胞是克隆生成性的并且在體外顯示出自我更新能力，而⑶133+CD146+細(xì)胞在這些培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生克隆。通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化方法分析了⑶133TD146+克隆，其顯示出與源自未克隆的群體的hGL-MSC相同的間充質(zhì)表型(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在存在增殖培養(yǎng)基的條件下在第4次傳代后表征從腎小球長(zhǎng)出的未分選的細(xì)胞時(shí)，它們都顯示出間充質(zhì)表型，這表明所用的培養(yǎng)條件對(duì)于hGL-MSC的增殖是選擇性的。本發(fā)明人還進(jìn)行了旨在研究本發(fā)明的GL-MSC是否是常駐于腎的群體而非定位于腎小球的源自BM的MSC群體的實(shí)驗(yàn)。為此目的，首先檢測(cè)了由常駐干細(xì)胞和源自BM的干細(xì)胞差別化表達(dá)的標(biāo)志物的存在。hGL-MSC表達(dá)⑶M，但是⑶對(duì)在源自BM的MSC中是陰性的并且被認(rèn)為是常駐于腎的干細(xì)胞的標(biāo)志物[2，35]。器官特異性胚胎1^皿-2蛋白和基因的表達(dá)也說明hGL-MSC的起源是腎。BM-MSC不表達(dá)I^ax-2。Pax-2是由后腎間充質(zhì)的干細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[36]，是由分離自成年大鼠和人類腎臟的干細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[1，5]。 此外，本發(fā)明人從由男性供體移植進(jìn)入女性接受者的移植的腎臟的腎小球分離了 hGL-MSC。 源自移植的腎臟的hGL-MSC顯示出與源自正常腎臟的hGL-MSC相同的表型(數(shù)據(jù)未顯示)。 為了測(cè)定hGL-MSC是源自接受者骨髓還是源自移植的腎臟，在第2次和第6次傳代時(shí)分析了 hGL-MSC中的Y染色體的存在情況。在第2次傳代078個(gè)細(xì)胞核；23個(gè)中期)和第6 次傳代G36個(gè)細(xì)胞核；25個(gè)中期)時(shí)分析了總共914個(gè)細(xì)胞核和48個(gè)中期。雙色X(綠色)/Y(紅色)著絲粒探針的雜交模式的FISH分析顯示90%的細(xì)胞核具有男性紅色/綠色模式，10%的細(xì)胞核僅具有1個(gè)綠色斑點(diǎn)。具有1個(gè)綠色斑點(diǎn)的細(xì)胞核可能源自丟失了 Y染色體的男性細(xì)胞核，Y染色體的丟失是培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生的事件。沒有觀察到女性細(xì)胞核 O個(gè)綠色斑點(diǎn))。hGL-MSC的所有48個(gè)中期中檢測(cè)到的核型都是男性的。以用于FISH負(fù)染的DAPI觀察到的中期染色體顯示為正常的。這些數(shù)據(jù)說明hGL-MSC不是來源于接受者的骨髓。相反，它們是供體腎臟的腎小球中的常駐群體。由于間充質(zhì)干細(xì)胞的最主要的特征之一是它們的分化成多種間充質(zhì)譜系的能力，本發(fā)明人測(cè)評(píng)了本發(fā)明的hGL-MSC分化成特定的結(jié)締組織細(xì)胞的能力。在確定的培養(yǎng)條件下，顯示了在第2個(gè)或第3個(gè)傳代分選的CD133+CD146+群體不能分化為成脂肪、成骨和成軟骨譜系(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，顯示了獲自15位患者的最初的⑶133TD146+hGL-MSC系(在第4-10次傳代)和隨后獲得的4個(gè)克隆具有多譜系分化能力。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，hGL-MSC有效地進(jìn)行成骨分化，如鈣沉淀物的 Alizarin Red染色所顯示。當(dāng)在脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天時(shí)，hGL-MSC產(chǎn)生含有脂滴的細(xì)胞。在未分化的對(duì)照中，未觀察到礦化或脂滴的跡象。使用軟骨細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基[7]獲得了 hGL-MSC向軟骨細(xì)胞的分化。在處理的第 28天收獲的分化的沉淀物被Mfranin 0和Alcian藍(lán)染色，這是軟骨細(xì)胞分化的典型特征 [7]。綜上所述，這些結(jié)果證明了本發(fā)明的hGL-MSC的多譜系分化能力。值得注意的是， 以最初分離的15個(gè)hGL-MSC系和隨后獲自最初的細(xì)胞系的4個(gè)克隆獲得了非常相似的結(jié)^ ο還評(píng)估了 hGL-MSC在合適的培養(yǎng)條件下分化為特定的腎小球細(xì)胞群體例如內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和系膜細(xì)胞的能力。為了獲得內(nèi)皮的分化，將hGL-MSC在EBM中在存在VEGF的情況下培養(yǎng)3周。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示出特定的內(nèi)皮標(biāo)志物例如⑶105、KDR、⑶34和⑶31 的表達(dá)。此外，當(dāng)在Matrigel中培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮分化的hGL-MSC和非分化的細(xì)胞形成特征性的毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)。在存在PDGFlA和TGF β 1的情況下，hGL-MSC獲得了系膜樣表型。特別地，它們獲得了 α-SMA和血管緊張素2受體I(ATl)的表達(dá)。當(dāng)在存在20 μ M/ L ATRA的情況下培養(yǎng)3周時(shí)，hGL-MSC獲得了特定的上皮標(biāo)志物的表達(dá)，所述上皮標(biāo)志物是足細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志物例如細(xì)胞角蛋白、podocin、nephrin和突觸極蛋白。通過實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)了 Mphrin的表達(dá)，其顯示在分化成足細(xì)胞后的hGL-MSC中存在η印hrin轉(zhuǎn)錄物，但在維持在阻止分化的增殖培養(yǎng)基中的hGL-MSC中不存在。測(cè)試的3個(gè)克隆的細(xì)胞系獲得了相似的結(jié)果。在所有的實(shí)驗(yàn)條件下，分化的細(xì)胞喪失了干細(xì)胞性質(zhì)相關(guān)的標(biāo)志物，例如Nanog、 Musashi、波形蛋白、巢蛋白、⑶90、⑶146、⑶73，系膜和內(nèi)皮分化的細(xì)胞除外，它們保持了通常由成熟細(xì)胞表達(dá)的CD90和CD146(數(shù)據(jù)未顯示)。所有的hGL-MSC細(xì)胞系和克隆都顯示出相同的分化能力。源自BM的MSC在相同培養(yǎng)條件下能夠分化成內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉樣細(xì)胞， 但是不分化成足細(xì)胞樣細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。總之，本發(fā)明人研究了預(yù)先脫被膜的人類腎小球中干細(xì)胞的存在，脫被膜是為了避免與鮑曼氏囊相關(guān)的干細(xì)胞的存在。發(fā)現(xiàn)在早期傳代時(shí)從脫被膜的腎小球長(zhǎng)出的細(xì)胞由 2個(gè)不同群體組成⑶133+CD146+群體和⑶133XD146+群體。⑶133+細(xì)胞很可能是內(nèi)皮定向的細(xì)胞群體，因?yàn)樗鼈児脖磉_(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物。此外，CD133+CD146+細(xì)胞在第3次傳代后不存活。另外，當(dāng)分選CD133+CD146+群體時(shí)，其不能夠自我更新并且不是克隆生成性的。相反，發(fā)現(xiàn)從脫被膜的人類腎小球分離和克隆的⑶133TD146+群體是能夠產(chǎn)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物的間充質(zhì)干細(xì)胞的多潛能群體。有趣的是，它們是從腎小球中長(zhǎng)出的在第4次細(xì)胞傳代培養(yǎng)后唯一存活的細(xì)胞。這些細(xì)胞被稱作hGL-MSC。hGL-MSC與源自BM的MSC以及源自其它成體組織的MSC[9-16，26-28]共有下列特征表達(dá)Q^9、CD44、CD166、CD73、CD90、⑶105、⑶146、波形蛋白和巢蛋白；無⑶34和⑶45 ；進(jìn)行中胚層分化的能力(骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)。此外，hGL-MSC表達(dá)參與細(xì)胞維持的Nanog和Musashi胚胎標(biāo)志物。類似于源自BM的MSC，hGL-MSC能夠抑制PHA誘導(dǎo)的PBMC的增殖。來自成年小鼠的非腎小管 ka-1+lin-多潛能干細(xì)胞/祖細(xì)胞WO]和源自心臟、脾和外周脂肪的人類MSC[41]顯示出類似的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。成體器官中的MSC的起源是有爭(zhēng)議的。在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)分離的 hGL-MSC具有常駐于腎的干細(xì)胞的表型特征。事實(shí)上，與BM-MSC不同的是，hGL-MSC表達(dá) ⑶24，⑶對(duì)被認(rèn)為是常駐于腎的祖細(xì)胞的標(biāo)志物[2，35]，還表達(dá)1^擬-2胚胎器官特異性轉(zhuǎn)錄因子[1，5，36]。以前已經(jīng)證明，Pax-2的表達(dá)是常駐于腎的干細(xì)胞群體的標(biāo)志物[1，5， 36]。此外，具有供體的性別特征的hGL-MSC在腎同種移植物中的存在提供了證據(jù)證明了局部常駐于成人腎小球中的MSC群體的存在。該結(jié)果與之前來自于肺移植研究的關(guān)于在人類肺中提供的常駐于組織的MSC的證據(jù)是一致的[16]。hGL-MSC在合適的培養(yǎng)條件下分化成內(nèi)皮細(xì)胞和分化成特定的腎小球譜系例如足細(xì)胞和系膜樣細(xì)胞的能力顯示出它的腎定向。事實(shí)上，當(dāng)在存在ATRA和IV型膠原的情況下培養(yǎng)時(shí)，hGL-MSC能夠分化成表達(dá)特異于足細(xì)胞的裂孔隔膜的標(biāo)志物例如η印hrin、突觸極蛋白和podocin的上皮細(xì)胞。這與BM-MSC不同。通過在存在TGF β 1和PDGF-bb (已經(jīng)報(bào)道TGF β 1和PDGF_bb誘導(dǎo)源自BM的多潛能成年祖細(xì)胞中的平滑肌細(xì)胞分化[20])的混合物的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，獲得了 hGL-MSC 向腎小球系膜細(xì)胞的分化。此外，hGL-MSC顯示出免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，因?yàn)樗鼈円种芇HA刺激的 PBMC的增殖，類似于BM-MSC[23-25]。hGL-MSC的免疫調(diào)節(jié)活性與炎性腎小球疾病相關(guān)?？傊狙芯康慕Y(jié)果證明在成人脫被膜的腎小球中存在常駐的多潛能干細(xì)胞的群體，其表達(dá)間充質(zhì)表型，具有促成不同的腎小球特異性細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)變的潛力。在以下的實(shí)驗(yàn)部分更詳細(xì)地描述了從成人腎小球中分離本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞以及它們的特征性特征，其僅是通過解釋的方式提供，不是意在限制如隨附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)部分材料和方法 i Kmn^mmmmmifM^mm^Mmim來自腎小球的人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)獲自通過手術(shù)切除的腎臟(15例不同的制備物)的皮質(zhì)的正常部分。分離皮質(zhì)并通過分級(jí)的連續(xù)網(wǎng)孔(60和120孔)之后，收集腎小球懸浮液，以Hans Balanced Salt Solution(GIBCO,Grand Island，NY)洗滌并通過機(jī)械方式和酶學(xué)方式除掉鮑曼氏囊，所述機(jī)械方式為使用IOml的吸液管進(jìn)行數(shù)輪的吸液/ 排液，所述酶學(xué)方式為以膠原酶I (Sigma，St. Louis, MO)消化2分鐘。將脫被膜的腎小球轉(zhuǎn)移至纖連蛋白包被的 T25 培養(yǎng)瓶(Falcon, BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA) 中。比較了數(shù)種培養(yǎng)基。在存在IX ITS(Sigma)和H印es (游離的酸，IOmM) (Sigma) 的情況下，含有 10% FCS(Euroclone, ffetherby, UK)的 RPMI (Sigma)(增殖培養(yǎng)基)允許 hGL-MSC的最佳擴(kuò)增，因此其被用于以下的實(shí)驗(yàn)。按照以前的描述從BM中分離人類MSC并進(jìn)行培養(yǎng)[7]。
牛長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)按照之前的描述生成描述培養(yǎng)物動(dòng)力學(xué)的生長(zhǎng)曲線W]。為了簡(jiǎn)化起見，將原代 hGL-MSC培養(yǎng)物占據(jù)的生長(zhǎng)面積(對(duì)應(yīng)于25cm2)假設(shè)為1。當(dāng)發(fā)生第2次傳代時(shí)，將第1 次傳代時(shí)的分傳比(1 幻乘以該數(shù)值，也就是說，在第1次傳代結(jié)束時(shí)，累積生長(zhǎng)面積是 3(即，原代培養(yǎng)物的占據(jù)的生長(zhǎng)的3倍)。在第2次傳代結(jié)束時(shí)，第2次傳代時(shí)的分傳比 (1 3)乘以第1次傳代時(shí)的累積生長(zhǎng)面積(3x3 = 9)。對(duì)于每次傳代都重復(fù)該程序，從而提供與細(xì)胞數(shù)目成正比的理論生長(zhǎng)曲線。在5例不同的腎小球制備物中評(píng)測(cè)生長(zhǎng)情況。源自腎小球的間充質(zhì)干細(xì)胞的表征按照之前的描述進(jìn)行細(xì)胞熒光測(cè)定分析[1]，使用下列抗體，其全部是藻紅蛋白(PE)或熒光素異硫氰酸鹽(FITC)綴合的抗-⑶105、抗-⑶四、抗-⑶31、抗-⑶146、 抗-CD44> 抗-CD24> 抗-CD90(Dakocytomation, Copenhagen, Denmark)；抗-CD73> 抗-CD34、抗-CD45、抗-CD80、抗-CD86、抗-CD166、抗-HLA-I(Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Jose, CA)； 抗-CD133(Miltenyi Biotec, Auburn)； KDR(R&D Systems, Abington, U. K.)；抗-HLA-II(Chemicon International Temecula, CA)，抗-CD40(Immunotech，Beckman Coulter)，抗-CD154 (Serotec，Raleigh, NC USA)單克隆抗體。小鼠IgG同種型對(duì)照來自Dakocytomation。所有的溫育在含有0. 牛血清白蛋白和0.1%疊氮化鈉的ΙΟΟμΙ磷酸鹽緩沖液(PBS)中在4°C進(jìn)行。對(duì)于每個(gè)樣品，在 FACSCalibur細(xì)胞儀(BD Biosciences Pharmingen)上分析10，000個(gè)細(xì)胞?；陉幮詫?duì)照構(gòu)建閘門，在所進(jìn)行的所有分析中都包括補(bǔ)償對(duì)照。使用Cell Quest軟件(BD Biosciences Pharmingen)對(duì)來自每次實(shí)驗(yàn)的設(shè)閘門的群體產(chǎn)生群體百分率和數(shù)目。在未分化的或分化的hGL-MSC上進(jìn)行間接免疫熒光分析，所述hGL_MS培養(yǎng)于腔室玻片(Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA)上，以含有 2%蔗糖的 4%多聚甲醛固定，如果需要，以ifepes-Triton X 100緩沖液(Sigma)進(jìn)行通透化處理。使用下列單克隆抗體抗-波形蛋白(Sigma)、抗-細(xì)胞角蛋白(Biomeda，F(xiàn)oster City CA)、 抗-E-鈣粘附蛋白(Dakocytomation)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α SMA) (Dakocytomation)、 抗-突角蟲極蛋白(Progen Biotechnik, Heidelberg)。使用了抗-von Willebrand 因子 (vffF) (Dakocytomation) > Jfl - M ^ [=| (Chemicon International)、Jfi -Pax~2 (Covance, Princeton, NJ)、抗-Nanog> 抗-0ct_4、抗-Musashi (AbCam, Cambridge, Science Park Cambridge UK)、抗-podocin、抗-血管緊張素 II 受體 1 (ATI) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)兔多克隆抗體和豬多克隆抗-N印hrin (Progen Biotechnik)。視需要使用下列對(duì)照不加初級(jí)抗體；或?qū)⒊跫?jí)抗體替換為非免疫兔、大鼠或小鼠IgG。Alexa Fluor 488 抗-兔子或抗-豬 IgG 和 Texas Red 抗-小鼠 IgG (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)用作次級(jí)抗體。使用 Zeiss LSM 5 Paseal Model Confocal Microscope (Carl Zeiss hternational，Germany)進(jìn)行共聚焦顯微鏡分析。加入Hoechst 33258染料 (Sigma)進(jìn)行細(xì)胞核染色。標(biāo)志物表達(dá)特征譜的總結(jié)下面的表1提供了本發(fā)明的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)的標(biāo)志物表達(dá)特征譜的總結(jié)
權(quán)利要求
1.源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)，其特征在于標(biāo)志物 CD133 (陰性)、CD146 (陽性)、CD34 (陰性)和CD105 (陽性)，其特征還在于分化成至少下列細(xì)胞類型的能力足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)，其還能夠進(jìn)行成骨、成脂肪和成軟骨分化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)，其對(duì)于標(biāo)志物⑶對(duì)和Pax-2是陽性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于標(biāo)志物α -SMA和0ct_4是陰性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于標(biāo)志物CD45是陰性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于標(biāo)志物CD31是陰性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于選自下列的間充質(zhì)干細(xì)胞特征性的表面標(biāo)志物是陽性的CD29、CD44、 ⑶73、⑶90、⑶166或其任意組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于標(biāo)志物Nanog和Musashi是陽性的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其對(duì)于波形蛋白和巢蛋白是陽性的，并且對(duì)于細(xì)胞角蛋白是陰性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞 (hGL-MSC)，其組成型表達(dá)I類MHC抗原并且對(duì)于II類MHC抗原是陰性的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的源自成人腎臟的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)，其對(duì)于共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40是陰性的。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)的方法，其包括下列步驟-在不存在特定生長(zhǎng)因子的情況下，在包含含有血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基并且在生理 PH緩沖的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自成人腎臟的脫被膜的腎小球，從而獲得從培養(yǎng)的脫被膜的腎小球中長(zhǎng)出的細(xì)胞的混合群體，所述細(xì)胞的混合群體包含紡錘形的CD133(陰性)、 CD146 (陽性)細(xì)胞和CD133 (陽性)、CD146 (陽性)細(xì)胞；和-從所述混合群體中分離紡錘形的CD133(陰性)、CD146(陽性)細(xì)胞，所述紡錘形的 CD133(陰性)、CD146(陽性)細(xì)胞即代表所需的源自成人腎臟的人類多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述紡錘形CD133(陰性)、CD146(陽性)細(xì)胞分離自細(xì)胞培養(yǎng)物的至少第3次傳代。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述CD133(陰性)、CD146(陽性)細(xì)胞是根據(jù)它們的紡錘形狀的形態(tài)分離的。
15.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述⑶133(陰性)、⑶146 (陽性)細(xì)胞是通過細(xì)胞分選方法分離的。
16.用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意項(xiàng)的源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。
17.用作再生醫(yī)學(xué)的藥物的根據(jù)權(quán)利要求16的源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。
18.用作腎損傷或疾病的治療性處理的藥物的根據(jù)權(quán)利要求17的源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。
19.用作腎小球損傷或疾病的治療性處理的藥物的根據(jù)權(quán)利要求18的源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)。
20.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意項(xiàng)的分離的人類腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及源自成人腎臟的分離的多潛能腎小球間充質(zhì)干細(xì)胞(hGL-MSC)，其特征在于標(biāo)志物特征譜CD133-、CD146+、CD34-和CD105+。還公開了從脫被膜的腎小球制備本發(fā)明的hGL-MSC的方法，以及本發(fā)明的hGL-MSC用于腎臟的再生性治療，尤其是用于治療影響腎小球的損傷或疾病的用途。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102292434SQ200980154241
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者B·布索拉蒂, G·卡姆西, S·布魯諾 申請(qǐng)人:弗雷森紐斯醫(yī)療護(hù)理德國(guó)有限責(zé)任公司