專利名稱：使用細(xì)菌細(xì)胞色素p450制備白皮杉醇的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用細(xì)菌細(xì)胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突變體由白藜蘆醇 (resveratrol)制備昂貴的白皮杉醇(piceatannol)的方法。這項工作部分得到韓國教育科技部21世紀(jì)前沿微生物基因組學(xué)以及應(yīng)用中心計劃(21C Frontier Microbial Genomics and Application Center Program of the Ministry of Education，Science & Technology of the Republic of Korea)[計劃編號MG08-0306-2-0，標(biāo)題使用微生物細(xì)胞色素P450酶基因組學(xué)幵發(fā)用于精細(xì)化學(xué)品的人化細(xì)菌單力口氧酶(Development of humanized bacterial monooxygenase for fine chemicals using microbial cytochrome P450 enzyme genomics)]的支持。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(3，4'，5-三羥基芪)為一種植物抗毒素，是由植物組織對外部毒性起反應(yīng)而產(chǎn)生的抗毒物質(zhì)，并且可見于包含葡萄、李子以及花生在內(nèi)的多種膳食來源。其展現(xiàn)有益的作用，包括抗氧化作用、消炎作用、心臟保護(hù)作用以及抗腫瘤活性作用(孔(Kimdu) 以及蘇(Surh)，2008 ；皮羅拉(Pirola)以及弗洛加多(Fr0jd0 )，2008 ；安薩哈(Athar)等人，2007)。目前，多項臨床前研究結(jié)果表明，白藜蘆醇是進(jìn)行癌癥預(yù)防以及治療的頗具前景的天然供應(yīng)(arsenal)。作為一種潛在抗癌劑，經(jīng)顯示白藜蘆醇可抑制或延遲培養(yǎng)物中的各種癌細(xì)胞以及體內(nèi)植入的腫瘤的生長。據(jù)悉，白藜蘆醇的生物活性與其調(diào)節(jié)各種目標(biāo)以及信號傳導(dǎo)路徑的能力有關(guān)。白皮杉醇(3，5，3' ,4'-四羥基芪)是一種在葡萄以及其它植物中發(fā)現(xiàn)的多酚。 其為所知的對數(shù)種細(xì)胞系發(fā)揮免疫抑制以及抗腫瘤發(fā)生活性的蛋白質(zhì)激酶抑制劑，且經(jīng)顯示，其對免疫細(xì)胞以及癌細(xì)胞也發(fā)揮各種藥理學(xué)作用(金(Kim)等人，2008b以及其中的參考文獻(xiàn))。在人體中，白皮杉醇是作為白藜蘆醇在CYPlBl以及CYP1A2作用下代謝的主要代謝物產(chǎn)生(波特(Potter)等人，2002 ；匹維(Piver)等人，2004)。此外，重組人CYP1A1、 CYP1A2以及CYPlBl催化反式白藜蘆醇代謝成兩種主要的代謝物白皮杉醇(3，5，3'， 4'-四羥基芪)以及另一種四羥基芪(匹維(Piver)等人，2004)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其為由白藜蘆醇制備白皮杉醇的反應(yīng)的催化劑，所述組合物包括至少一選自由野生型CYP102A1以及CYP102A1突變體組成的群組者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述CYP102A1突變體是由選自由以下組成的群組中的至少一個制備用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1第47位氨基酸精氨酸(R)；用一個選自由苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第51位氨基酸酪氨酸(Y)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第64位氨基酸谷氨酸(E)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1 的第74位氨基酸丙氨酸(A)；用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第81位氨基酸苯丙氨酸 (F)；用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第86位氨基酸亮氨酸(L)；用一個選自由丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型 CYP102A1的第87位氨基酸苯丙氨酸(F)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、 酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第143位氨基酸谷氨酸(E)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第188位氨基酸亮氨酸(L)；以及用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第267位氨基酸谷氨酸(E)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述CYP102A1突變體是由選自由以下組成的群組中的至少一個制備用亮氨酸(L)取代野生型CYP102A1的第47位氨基酸精氨酸(R)；用苯丙氨酸取代野生型CYP102A1的第51位氨基酸酪氨酸(Y)；用甘氨酸(G)取代野生型CYP102A1的第64位氨基酸谷氨酸(E)；用甘氨酸(G)取代野生型CYP102A1的第 74位氨基酸丙氨酸(A)；用異亮氨酸(I)取代野生型CYP102A1的第81位氨基酸苯丙氨酸 (F)；用異亮氨酸(I)取代野生型CYP102A1的第86位氨基酸亮氨酸(L)；用纈氨酸(V)取代野生型CYP102A1的第87位氨基酸苯丙氨酸(F)；用甘氨酸(G)取代野生型CYP102A1的第143位氨基酸谷氨酸(E)；用谷氨酰胺(Q)取代野生型CYP102A1的第188位氨基酸亮氨酸(L)；以及用纈氨酸(V)取代野生型CYP102A1的第267位氨基酸谷氨酸(E)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述CYP102A1突變體包括選自由以下組成的群組的野生型CYP102A1的氨基酸取代位點F87A、R47L/Y51F、A74G/F87V/L 188Q、 R47L/L86I/L 188Q、R47L/F87V/L188Q、R47L/F87V/L188Q/E267V、R47L/L86I/L 188Q/ E267V、R47L/L86I/F87V/L188Q, R47L/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F87V/E143G/ L188Q/E267V、R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V 以及 R47L/E64G/F81I/F87V/E143G/ L188Q/E267V0
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述白藜蘆醇為反式白藜蘆醇。
6.一種制備白皮杉醇的方法，所述方法包括使至少一種選自由野生型CYP102A1以及CYP102A1突變體組成的群組的酶與白藜蘆醇反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其進(jìn)一步包括添加產(chǎn)生NADPH的系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)生NADPH的系統(tǒng)包括6-磷酸葡萄糖、NADP+以及酵母6-磷酸葡萄糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述白藜蘆醇為反式白藜蘆醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述CYP102A1突變體是由至少一選自由以下組成的群組者制備用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1 第47位氨基酸精氨酸(R)；用一個選自由苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第51位氨基酸酪氨酸 (Y)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第64位氨基酸谷氨酸(E)；用一個選自由甘氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第74位氨基酸丙氨酸(A)；用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第81位氨基酸苯丙氨酸(F)；用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第86位氨基酸亮氨酸(L)；用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第87位氨基酸苯丙氨酸(F)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1 的第143位氨基酸谷氨酸(E)；用一個選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第188位氨基酸亮氨酸 (L)；以及用一個選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸組成的群組的氨基酸取代野生型CYP102A1的第267位氨基酸谷氨酸(E)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述CYP102A1突變體是由選自由以下組成的群組中的至少一個制備用亮氨酸(L)取代野生型CYP102A1的第 47位氨基酸精氨酸(R)；用苯丙氨酸取代野生型CYP102A1的第51位氨基酸酪氨酸(Y)；用甘氨酸(G)取代野生型CYP102A1的第64位氨基酸谷氨酸(E)；用甘氨酸(G)取代野生型 CYP102A1的第74位氨基酸丙氨酸(A)；用異亮氨酸(I)取代野生型CYP102A1的第81位氨基酸苯丙氨酸(F)；用異亮氨酸(I)取代野生型CYP102A1的第86位氨基酸亮氨酸(L)；用纈氨酸(V)取代野生型CYP102A1的第87位氨基酸苯丙氨酸(F)；用甘氨酸(G)取代野生型 CYP102A1的第143位氨基酸谷氨酸(E)；用谷氨酰胺(Q)取代野生型CYP102A1的第188位氨基酸亮氨酸(L)；以及用纈氨酸(V)取代野生型CYP102A1的第267位氨基酸谷氨酸(E)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述CYP102A1突變體包括選自由以下組成的群組的野生型CYP102A1的氨基酸取代位點F87A、R47L/Y51F、 A74G/F87V/L188Q、R47L/L86I/L188Q、R47L/F87V/L188Q、R47L/F87V/L188Q/E267V, R47L/ L86I/L188Q/E267V, R47L/L86I/F87V/L188Q, R47L/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/ F87V/E143G/L188Q/E267V、R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V 以及 R47L/E64G/F81I/ F87V/E143G/L188Q/E267V0
13.一種用于由白藜蘆醇制備白皮杉醇的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種選自由野生型CYP102A1及CYP102A1突變體組成的群組的酶以及產(chǎn)生NADPH的系統(tǒng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述產(chǎn)生NADPH的系統(tǒng)包括6-磷酸葡萄糖、NADP+以及酵母6-磷酸葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備白皮杉醇的方法，且更具體點說，提供一種使用細(xì)菌細(xì)胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突變體由白藜蘆醇制備白皮杉醇的方法，以及由白藜蘆醇制備白皮杉醇的組合物以及試劑盒。
文檔編號C12P7/22GK102300995SQ200980155743
公開日2011年12月28日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者尹喆湖, 金東炫 申請人:Glo生物科技股份有限公司