專利名稱：用以蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑固定作為抗原的微生物制造包羅性抗表面抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備抗體的方法以及一種制備針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)的包羅性抗體(comprehensive antibodies)的方法。
背景技術(shù)：
許多蛋白質(zhì)在例如細(xì)菌細(xì)胞和病毒的微生物中進(jìn)行表達(dá)。常規(guī)地，已經(jīng)嘗試從這些蛋白質(zhì)中挑選認(rèn)為有用的特定抗原蛋白質(zhì)分子，多數(shù)情況下制備單克隆抗體，然后將該抗體應(yīng)用到醫(yī)學(xué)實(shí)踐中等。然而，在用識(shí)別在細(xì)菌等的表面上表達(dá)的單個(gè)抗原分子的抗體對(duì)作為目標(biāo)的細(xì)胞本身進(jìn)行特異性識(shí)別方面卻存在限制。常規(guī)地，主要使用抗生素來(lái)預(yù)防或治療細(xì)菌或病毒感染疾病等。另外，以用減毒病毒制備的疫苗給藥，以導(dǎo)致在體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)病毒的抗體，之后，該抗體用來(lái)預(yù)防或治療相關(guān)的病毒感染疾病。然而，抗生素存在的問(wèn)題是，必須要根據(jù)細(xì)菌來(lái)選擇合適的抗生素，并會(huì)形成有抗性的微生物。另外，必須要考慮疫苗的安全性，因此疫苗所適用的感染性疾病就受到了限制。此外，已經(jīng)報(bào)道了使用通過(guò)將腸出血性大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞作為抗原使雞免疫而得到的對(duì)vero細(xì)胞毒素(verotoxin)具有特異性的抗體來(lái)治療大腸桿菌感染疾病(見專利文件1)。然而，該方法的目的是在使用微生物細(xì)胞作為抗原的同時(shí)，生產(chǎn)針對(duì)由腸出血性大腸桿菌分泌的vero細(xì)胞毒素的抗體。尚沒(méi)有得到針對(duì)在細(xì)菌表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的包羅性抗體。另外，由此獲得的抗體用于使分泌的vero細(xì)胞毒素失效， 大腸桿菌本身不會(huì)通過(guò)該方法而消除。專利文件1日本專利公開(Kokai)第H10-298105A號(hào)(1998)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)的包羅性抗體的方法，以及用該方法得到的包羅性抗體。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用甲醛固定例如病毒或細(xì)菌等的微生物細(xì)胞的表面， 然后用得到的產(chǎn)物作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，可以寬泛且包羅性地制備針對(duì)固定的全部抗原蛋白質(zhì)分子的抗體。包括該包羅性抗體的抗體組合物具有傳統(tǒng)的抗體制備方法所不可能得到的高特異性和敏感性。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，該抗體組合特異性地并強(qiáng)烈地識(shí)別個(gè)體細(xì)菌本身，對(duì)例如抗菌療法等的治療有效，并且他們已經(jīng)完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下所示。[1] 一種制備包羅性抗體的方法，該包羅性抗體包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體，該方法包括(a)用蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑處理微生物，從而通過(guò)分子內(nèi)交聯(lián)來(lái)固定在所述微生物表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；
(b)將使用所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑固定的所述微生物作為免疫原給予動(dòng)物；和(c)從所述動(dòng)物獲得抗體。[2]根據(jù)[1]所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑選自甲醛、多聚甲醛和戊二醛。[3]根據(jù)[1]所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑是 (ν/ν)到38% (ν/ν)的福爾馬林。[4]根據(jù)[1]到[3]中任一項(xiàng)所述的制備包羅性抗體的方法，其中使用蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑的固定化進(jìn)行10分鐘到48小時(shí)。[5]根據(jù)[1]到[3]中任一項(xiàng)所述的制備包羅性抗體的方法，其中給予免疫原的所述動(dòng)物是雞。[6]根據(jù)[5]所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述抗體從已經(jīng)給予免疫原的雞所下的雞蛋中獲得。[7]根據(jù)[1]- ]中任一項(xiàng)所述的方法得到的包羅性抗體，其包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體。[8] 一種用于微生物感染疾病的預(yù)防或治療劑，其包括根據(jù)[1]到[6]中任一項(xiàng)所述的方法得到的包羅性抗體，所述包羅性抗體包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體。[9] 一種食物，其包括根據(jù)[6]所述的方法從雞蛋中獲得的包羅性抗體。[10] 一種飼料，其包括根據(jù)[6]所述的方法從雞蛋中獲得的包羅性抗體。[11] 一種用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物，其包括根據(jù)[6]所述的方法從雞蛋中獲得的包羅性抗體。[12]根據(jù)[11]所述的用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物，其用于施用于水生動(dòng)物棲息的環(huán)境水。本說(shuō)明書包括日本專利申請(qǐng)第2008-3M257號(hào)的說(shuō)明書和附圖的公開內(nèi)容，而且本發(fā)明要求其優(yōu)先權(quán)。


圖1示出水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的概要圖，在其中使用包羅性抗體進(jìn)行鲇魚(ayu)(香魚 (sweetfish) ；Plecoglossus altivelis altivelis) 7令水病的預(yù)防測(cè)試。圖2示出用包羅性抗體進(jìn)行的鲇魚冷水病預(yù)防測(cè)試1的結(jié)果(在各個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘使用雞蛋抗體進(jìn)行的測(cè)試1的冷水病測(cè)試結(jié)果)。圖3示出用包羅性抗體進(jìn)行的鲇魚冷水病預(yù)防測(cè)試2的結(jié)果(在各個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘使用雞蛋抗體進(jìn)行的測(cè)試2的冷水病測(cè)試結(jié)果)。圖4示出被冷水病細(xì)菌感染的鲇魚的照片。圖5是通過(guò)給予鯰魚包括含有包羅性抗體的雞蛋粉末(雞蛋抗體)的飼料而避免被冷水病細(xì)菌感染的鲇魚的照片。
具體實(shí)施例方式在下文中，將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
可以通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)包羅性地制備針對(duì)微生物的抗體。此處，“…可以包羅性地制備針對(duì)微生物的抗體”的表述是指同時(shí)制備針對(duì)在微生物的表面上表達(dá)的全部眾多抗原蛋白質(zhì)分子的抗體。由此得到的抗體稱作包羅性抗-表面抗體。包羅性抗-表面抗體是多克隆抗體，包括針對(duì)許多種在微生物的表面上表達(dá)的抗原蛋白質(zhì)的單個(gè)抗體。根據(jù)本發(fā)明的方法，包括針對(duì)全表面蛋白質(zhì)分子的抗體的包羅性抗-表面抗體可以僅通過(guò)給予動(dòng)物固定的微生物而獲得。此處，并不要求這種針對(duì)全表面蛋白質(zhì)分子的抗體要包括針對(duì)在微生物的表面上表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的抗體，但是希望包括針對(duì)大部分大量存在的表面蛋白質(zhì)的抗體。在本發(fā)明中，用于制備包羅性抗體的微生物使用蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和固定用的試劑來(lái)固定。在該情況下，微生物體可以用作微生物，例如細(xì)胞。這種蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和固定用試劑的例子包括醛，例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛。優(yōu)選地，使用福爾馬林即 35% -38%、優(yōu)選37%的甲醛水溶液進(jìn)行固定。當(dāng)使用蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和固定用試劑作為固定劑時(shí)，該試劑滲透到微生物細(xì)胞內(nèi)，分子內(nèi)醛基與微生物表面蛋白質(zhì)的氨基(賴氨酸殘基的α-氨基或ε-氨基)或SH基結(jié)合，從而形成分子間的交聯(lián)。因此，蛋白質(zhì)凝結(jié)并發(fā)生變化。交聯(lián)削弱蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而抑制各種生物活性，例如酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌。用于蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和固定的試劑的作用是蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)反應(yīng)，使得固定作用不施加于例如脂類的物質(zhì)，脂類等會(huì)流出來(lái)。當(dāng)使用福爾馬林即市售的35% -38%的甲醛水溶液時(shí)，固定化可以通過(guò)使用 1% -38% (ν/ν)的福爾馬林、優(yōu)選為2% -20% (ν/ν)的福爾馬林、更優(yōu)選為5% -10% (ν/ ν)的福爾馬林來(lái)進(jìn)行。在本文中使用的福爾馬林可以用蒸餾水、鹽水、緩沖液等進(jìn)行制備。將例如細(xì)胞的微生物進(jìn)行均化。每克由此均化的球粒中加入5到20ml福爾馬林。 通過(guò)將福爾馬林加入到均化的微生物中進(jìn)行固定，并攪拌生成物，然后在4°C -30°C下將生成物靜置30分鐘到48小時(shí)或更久。存活下來(lái)的微生物通過(guò)短時(shí)間的福爾馬林處理進(jìn)行滅活。本發(fā)明的方法不僅需要對(duì)微生物進(jìn)行滅活，而且福爾馬林的處理需要達(dá)到使微生物表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)分子形成分子內(nèi)交聯(lián)的程度。將由此得到的經(jīng)固定的均化微生物用鹽水或緩沖液稀釋(如果需要的話)，懸浮， 之后與已知的賦形劑混合。然后，得到的產(chǎn)物可以作為免疫原給予動(dòng)物。本文中用到的動(dòng)物的例子包括例如小鼠、大鼠、海貍鼠、兔、羊、山羊、馬、牛等的哺乳動(dòng)物，以及例如雞和鴕鳥等的鳥類。特別地，優(yōu)選例如雞的鳥類，因?yàn)榭梢缘玫胶蠭gY抗體的雞蛋。可以根據(jù)已知的方法，用免疫原使動(dòng)物免疫。例如，作為常用的方法，通過(guò)將免疫原腹膜內(nèi)或皮下注射給動(dòng)物進(jìn)行免疫。免疫可以進(jìn)行一次，或者合意地每2到10天通過(guò)數(shù)次給藥進(jìn)行多次。另外，強(qiáng)化免疫可以在初次給藥后每5到10天多次進(jìn)行。制備細(xì)菌免疫原的方法的例子如下所示。下列方法作為例子，但本文中的例子不限制于以下方法。在細(xì)菌的情況下，將其通過(guò)離心收集，然后造粒。將球粒加入到福爾馬林中，通過(guò)攪拌進(jìn)行分散，然后將生成物靜置30分鐘。隨后，使用粗濾紙進(jìn)行過(guò)濾并棄除殘留物。收集濾液，然后進(jìn)行離心。將磷酸緩沖液加入到球粒中，然后使用生成物作為免疫原。本發(fā)明的包羅性抗-表面抗體組合物可以從經(jīng)免疫的動(dòng)物的血清中得到。另外， 當(dāng)要免疫的動(dòng)物是雞時(shí)，該包羅性抗-表面抗體組合物可以從雞所下的雞蛋中得到。在最終免疫后的大約3個(gè)月內(nèi)，可以得到含有具有高抗體效價(jià)的抗體的雞蛋。這種雞蛋的蛋黃含有IgY，蛋清含有IgA和IgM。當(dāng)從全蛋收集抗體時(shí)，包羅性抗體組合物含有IgY、IgA和 IgM。當(dāng)從蛋黃收集抗體時(shí)，包羅性抗體組合物含有IgY。當(dāng)使用雞蛋制備本發(fā)明的抗體組合物時(shí)，可以使用全蛋，或者也可以單獨(dú)使用蛋黃。打破由此得到的雞蛋，將蛋黃和蛋清一起攪拌，或者將蛋黃單獨(dú)攪拌，之后進(jìn)行粉化。此時(shí)，抗體是蛋白質(zhì)，因此對(duì)熱很敏感，所以在70°C或更高溫度下失去活性。粉化優(yōu)選在60°C或更低溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，干燥在60°C或更低溫度下通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥或熱風(fēng)干燥進(jìn)行，用以進(jìn)行粉化。根據(jù)需要，對(duì)由此粉化的雞蛋進(jìn)一步進(jìn)行粉碎機(jī)粉碎，從而制造細(xì)粉。通過(guò)該方法得到的粉末含有蛋黃的油成分，因此具有濕氣。這種脂肪含量可以使用超冷臨界法(ultracold critical method)經(jīng)由完全去脂化來(lái)除去。從雞蛋得到的包羅性抗-表面抗體組合物也可以稱作雞蛋抗體。由此得到的抗體的抗體效價(jià)可以通過(guò)ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、EIA (酶免疫分析)、RIA(放射免疫測(cè)定)、熒光抗體技術(shù)等進(jìn)行測(cè)定?？贵w效價(jià)可以使用收集自動(dòng)物的血清來(lái)測(cè)定。而且，當(dāng)使用雞蛋時(shí)，抗體從雞蛋中提取，然后測(cè)定提取物中的抗體效價(jià)。本發(fā)明的針對(duì)微生物的包羅性抗體可以用于預(yù)防或治療微生物感染疾病。本發(fā)明的包羅性抗體包括針對(duì)在例如細(xì)菌或病毒的微生物的表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體。 因此，包羅性抗體具有很強(qiáng)的針對(duì)于例如細(xì)菌和病毒的微生物的進(jìn)攻力，能夠殺滅、減少或控制例如細(xì)菌或病毒的微生物。微生物的例子包括細(xì)菌、病毒、真菌、立克次氏體(rickettsiae)和寄生蟲如纖毛蟲，它們是優(yōu)選感染動(dòng)物且對(duì)動(dòng)物有致病性的致病微生物。這些微生物的例子如下所示，但下列微生物僅出于示例的目的而給出，實(shí)例并不限于此。感染水生動(dòng)物的微生物水生動(dòng)物的例子包括魚、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物。魚的例子包括養(yǎng)殖魚和觀賞魚， 例如鲇魚(香魚；Plecoglossus altivelis altivelis)、鰻魚、鱒魚、鮭魚、金槍魚、鯡魚 (yellow tail)、紅海魴魚(red sea bream)和比目魚、例如金魚的水族箱魚、鯉魚和熱帶魚。甲殼動(dòng)物的例子包括螃蟹和蝦。軟體動(dòng)物的例子包括貝殼。這些微生物的例子包括鲇魚冷水病的致病細(xì)菌——鲇魚冷水病病菌
(Flavobacterium psychrophilun)^ ^ -tt^jffi^ff ‘ (Flexibacter
columnaris)、穿孔病的病原體-殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、氣單胞菌傳
染病的致病細(xì)菌——嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、結(jié)合真菌病(wed fungal disease)的真菌病原體——mizukabi (生活在水里的真菌-或霉菌類微生物)、白點(diǎn)病的致
病性寄生蟲-例如 Ichfhyophfhirius multifiliis 禾口 Cryptocaryon irritans 的纖毛
蟲、鯉魚皰疹病毒癥的致病病毒——鯉魚皰疹病毒(KHV)等。這些微生物的其他例子包括對(duì)魚致病的微生物，例如遲緩愛(ài)德華菌(Edwardsiella tarda) >Enterococcus seriolicida、 Flavobacterium branchiophilum、Flexibacter maritimus、Listonella anguillarum、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、Nocardia seriolae、Pasteurella piscicida、病鯖 Μ單胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)、蠻光^段單胞菌(Pseudomonas fluorescens) > 惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、Renibacterium salmoninarum、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus iniae)禾口弧菌(Vibrio) 屬微生物。感染其他動(dòng)物的微生物其他動(dòng)物的例子包括兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物。這種微生物的例子包括革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌的例子包括綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和致病性大腸桿菌(Escherichia coli)。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的例子包括金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。另外的例子包括腳癬、甲癬的真菌致病原——發(fā)癬菌等、造成竇炎等的綠膿假單胞菌O^eudomonas aeruginosa)，以及腸道感染疾病的致病
細(xì)菌-致病性大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)屬細(xì)菌、梭菌
(Clostridium)屬細(xì)菌、彎曲桿菌(Campylobacter)屬細(xì)菌。其他的例子包括食物中毒的致病性細(xì)菌——Welchii屬細(xì)菌、造成機(jī)會(huì)感染疾病的沙雷氏菌(Serratia)屬細(xì)菌、腸桿菌 (Enterobacter)屬細(xì)菌禾口產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬細(xì)菌。另外，病毒的例子包括流行性感冒病毒、HIV、痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、細(xì)小病毒、桿狀病毒、小核糖核酸病毒、外衣病毒(togavirus)、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、正黏病毒、副黏病毒、桿狀病毒、呼吸道腸道病毒、冠狀病毒、SARS冠狀病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯Y病毒 (potyvirus)、豆工豆花葉病毒(comovirus)、禾口花椰菜花葉病毒(caulimovirus)。例如，用于預(yù)防或治療微生物感染疾病的抗體組合物通過(guò)給予動(dòng)物來(lái)使用?？贵w組合物可以通過(guò)口服途徑、鼻腔途徑以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射或非腸道途徑的給藥。對(duì)于治療鼻腔炎癥等，抗體組合物可以以通過(guò)與已知的穿透劑混合而制備的液體形式或氣霧劑形式給藥，或者在某些情況下以糊劑的形式給藥。另外，對(duì)于皮膚感染等的治療，抗體組合物可以通過(guò)將其以擦劑例如糊劑的形式涂敷于受感染的皮膚部分而局部給藥，或者可以通過(guò)向受感染的皮膚部分噴射溶液而局部給藥。糊劑含有脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蠟、plastibase、蠟、石膏、樹脂、塑料、glucols、高級(jí)醇、甘油、水或乳化劑、或懸浮劑作為載體。本發(fā)明的藥物組合物的劑量依據(jù)癥狀、年齡、體重等而不同。通常在口服給藥的情況下，對(duì)于成人劑量范圍可以在每天大約0. Olmg到lOOOOmg，可以一次或分別多次給藥。用于預(yù)防或治療微生物感染疾病的抗體組合物可以含有通常用于藥物制劑領(lǐng)域的載體、稀釋劑和賦形劑。例如，使用乳糖、硬脂酸鎂等作為片劑的載體和賦形劑。而且，動(dòng)物的微生物感染疾病可以通過(guò)將本發(fā)明的針對(duì)微生物的包羅性抗體混合到動(dòng)物飼料中、然后將飼料給予動(dòng)物來(lái)預(yù)防或治療。另外，在水生動(dòng)物的感染性疾病的情況下，可以將本發(fā)明的針對(duì)微生物的抗體組合物加入到水生動(dòng)物棲息的水族館、水產(chǎn)養(yǎng)殖塘、用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的保護(hù)區(qū)等的環(huán)境水中。在這種情況下，該治療抗體通過(guò)口服途徑結(jié)合到水生動(dòng)物體內(nèi)，從而能夠發(fā)揮其在體內(nèi)的作用。而且，該治療抗體與環(huán)境水中存在的微生物結(jié)合，從而使微生物滅活。另外，治療抗體與微生物結(jié)合，從而形成不溶于水的抗體和微生物的聚集體，該聚集體隨后沉淀，從而將聚集體從諸如水產(chǎn)養(yǎng)殖塘的排水溝渠排除，特別地聚集體從環(huán)境水中除去。用于養(yǎng)殖魚類或甲殼類感染性疾病的治療方法的具體例子如下所述。養(yǎng)殖魚的感染性疾病的例子包括，但不限于，由黃質(zhì)菌(冷水病細(xì)菌)作為致病細(xì)菌引起的鲇魚冷水病等、由假單胞菌作為致病細(xì)菌引起的穿孔病。對(duì)于魚類感染性疾病的預(yù)防或治療，固定在致病細(xì)菌的細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)，制備免疫原，用該免疫原使雞免疫，從而得到雞蛋抗體。將由此得到的雞蛋抗體與魚飼料混合，然后將魚飼料通過(guò)喂養(yǎng)而給藥。另外，可以將由此得到的雞蛋抗體加入到養(yǎng)殖魚類棲息的環(huán)境水中。將雞蛋抗體與飼料一起通過(guò)飼喂給藥，從而使雞蛋抗體結(jié)合到魚體的消化道中， 并且一些抗體溶解或懸浮在飼喂用水中(在其中飼喂魚)而沒(méi)有結(jié)合到魚體內(nèi)。溶解在飼喂用水中的抗體與懸浮在飼喂用水中的細(xì)菌反應(yīng)，以結(jié)合細(xì)胞，從而殺滅微生物細(xì)胞。本發(fā)明涵蓋了包括從雞蛋得到的包羅性抗體的食物或飼料。而且，本發(fā)明涵蓋了包括從雞蛋得到的包羅性抗體的用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物。用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物可以以水生動(dòng)物飼料的形式供應(yīng)，或者加入到環(huán)境水中以進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明參考以下實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明。然而，這些例子不限制本發(fā)明。實(shí)施例1使用細(xì)菌作為抗原制備包羅性抗體使用鲇魚冷水病病菌的細(xì)胞作為抗原。在Cytophaga 培養(yǎng)基(或 TYES 培養(yǎng)基[triptone 0. 04%、酵母提取物 0. 005%, MgSO4 · 7H20 0. 005%, CaCl2/2H20 0. 005%, pH 7. 2])中在 18°C下培養(yǎng)鲇魚冷水病病菌 (Flavobacterium psychrophilun)，然后在瓊脂平板培養(yǎng)基上在18°C下培養(yǎng)5天。從而，在證實(shí)形成有具有不規(guī)則波浪形邊緣的黃色群落(照片)后，將培養(yǎng)溶液離心，以使細(xì)胞成球粒狀。將球粒低溫貯藏，直到被作為抗原使用。將大約3mg鲇魚冷水病病菌的融化球粒加入15-ml帶蓋測(cè)試管中，向測(cè)試管中加入5ml 5% (ν/ν)的福爾馬林溶液，然后將測(cè)試管密封。使用測(cè)試管混合器多次攪拌溶液(大約10分鐘)。將球粒完全溶解在5% (ν/ν) 的福爾馬林溶液(Junsei Yakuhin 用水稀釋含有35. 0% -38. 0%甲醛和5% -13%甲醇的福爾馬林溶液)中，直至它們均勻地分散和溶解。孵育15分鐘，從而固定金黃色釀膿葡萄球菌(Maphylococcus aureus)的表面抗原。孵育完成后，將生成物靜置30分鐘。用預(yù)先用少量注射用蒸餾水潤(rùn)濕的粗濾紙過(guò)濾溶液，然后棄除殘留物。此時(shí)，當(dāng)制備量比較小時(shí)，利用重力進(jìn)行自然過(guò)濾，當(dāng)制備量比較高時(shí)，進(jìn)行抽吸過(guò)濾。回收含有細(xì)菌細(xì)胞的濾液，然后高速離心(旋轉(zhuǎn)頻率；15000rpm或更高，30分鐘或更久)。棄去上清液，然后將大約1. 5ml磷酸鹽緩沖液加入到大約!Mg球粒中，從而使球粒分散。使用生成物作為要給藥的抗原。通過(guò)用乳化泵將Iml抗原和Iml白油(Nippon Shinyaku Co，Ltd.)逐漸混合以使其混合制備要給藥的抗原組合物，從而制備乳劑。將由此制備的抗原組合物乳劑(0. 5ml)經(jīng)皮下注射給予每只5周齡雌性雞的腹股溝區(qū)。此時(shí)，為了降低對(duì)雞的侵襲力，預(yù)先將要給藥的抗原組合物加熱至雞的體溫，即37°C。當(dāng)固定之后通過(guò)離心進(jìn)行的福爾馬林分離不充分時(shí)，在給予抗原后大約3天的時(shí)間，一些雞因?yàn)樘弁炊榭s，除喝水外并不表達(dá)進(jìn)食行為。一些雞在此期間死亡。給予抗原的部位變硬，表現(xiàn)出硬化狀態(tài)。初始注射后每5天，給予2次抗原組合物以加強(qiáng)免疫。因此，共進(jìn)行3次免疫?？贵w可以從經(jīng)免疫的雞所下的雞蛋中得到。在最后一次免疫后的大約3個(gè)月內(nèi)，可以獲得含有高抗體效價(jià)的抗體的雞蛋。使用噴霧干燥器(GA22型，Yamato Scientifc Co.，Ltd.)、熱風(fēng)干燥器、和粉粹機(jī)制備干燥的雞蛋粉末。實(shí)施例2使用包羅性抗-表面抗體預(yù)防鲇魚冷水病使用實(shí)施例1制備的含有針對(duì)鲇魚冷水病病菌的抗體的雞蛋粉末。此處，“含有抗體的雞蛋粉末”也可稱作“雞蛋抗體。，，使用了 3個(gè)區(qū)域(區(qū)域1 日本滋賀縣長(zhǎng)濱市；區(qū)域2 日本滋賀縣滋賀町；和區(qū)域 3 日本滋賀縣知內(nèi)川水系)的鲇魚(香魚；Plecoglossus altivelis altivelis)溪流養(yǎng)殖塘。使用大約IOOm2的水產(chǎn)養(yǎng)殖塘。在區(qū)域1和區(qū)域2使用兩個(gè)養(yǎng)殖塘，在區(qū)域3使用一個(gè)。另外，在每個(gè)區(qū)域，建造大約IOOm2的對(duì)照養(yǎng)殖塘，其中，通過(guò)給予傳統(tǒng)的用于預(yù)防鲇魚冷水病的漁用藥物Isran soda(通用名磺胺異惡唑鈉(sulfisozolesodium))和用于預(yù)防弧菌病的漁用藥物新生霉素(novobiocin)飼喂鯰魚，而沒(méi)有投放任何雞蛋抗體。測(cè)試進(jìn)行了 1年3個(gè)月多，其間進(jìn)行了兩次為期4個(gè)月的測(cè)試，一次是測(cè)試1，一次是測(cè)試2。對(duì)于該測(cè)試，使用產(chǎn)于日本滋賀縣琵琶湖并通過(guò)籠捕法(使用稱作“eri”的排網(wǎng)) 抓獲的仔魚，但是沒(méi)有使用海洋鲇魚和孵卵養(yǎng)殖的鲇魚。測(cè)試1中，水產(chǎn)養(yǎng)殖塘中的鲇魚數(shù)量范圍是從532300到833300(總重量從315kg 到450kg)，在測(cè)試2中，數(shù)量范圍是從603773到882352 (總重從320kg到450kg)。將雞蛋抗體粉末以3 100(3% )的重量比與要給予的飼料混合。在每一養(yǎng)殖塘中，基于總的魚體重(=魚體的總重量)，以2 10(K2%)到5 100(5%)的重量比給予含有雞蛋抗體的飼料。每天進(jìn)行5到6次飼喂。由于量的統(tǒng)一上的困難，總的飼喂量沒(méi)有進(jìn)行統(tǒng)一。在測(cè)試中，養(yǎng)殖塘中沒(méi)有應(yīng)用傳統(tǒng)的用于預(yù)防鲇魚冷水病的方法，例如給予抗生素和熱水處理。在測(cè)試期間，每天下午5點(diǎn)收集死魚，并確定死亡原因(因疾病死亡還是因自然原因死亡)。對(duì)于死于疾病的魚，進(jìn)一步確定它們是死于冷水病還是其他疾病(即，因例如氣單胞菌(Aeromonas)或假單胞菌(I^eudomonas)等的細(xì)菌引起的細(xì)菌感染疾病的死亡，或者因寄生蟲引起的死亡)。冷水病可以基于如下癥狀加以確定例如，鰓蓋或內(nèi)臟缺血、鰓蓋下部出血、體表面顏色減退、因體表面形成潰瘍引起的體表面穿孔、肛門擴(kuò)張、膀胱肥大、 下頌骨缺陷和尾鰭缺陷。雞蛋抗體直接與飼料一起投放，因此它們結(jié)合到魚體的消化道內(nèi)，但一些雞蛋抗體溶解在池水中而沒(méi)有結(jié)合到魚體內(nèi)。溶解在池水中的抗體隨后與懸浮在池水中的冷水病病菌進(jìn)行反應(yīng)，從而變得與細(xì)胞結(jié)合。另外，溶解在池水中的抗體在鲇魚鰓呼吸時(shí)結(jié)合到鰓蓋中。由此，抗體強(qiáng)烈地結(jié)合到存在于鰓蓋內(nèi)、存在于魚體表面或感染鲇魚損傷處的冷水病病菌的表面抗原上，從而實(shí)現(xiàn)病癥的改善。所有以這種形式在水中存在的冷水病病菌均被抗體靶向并與其反應(yīng)。與抗體結(jié)合的細(xì)胞沉淀在每個(gè)魚塘的底部，并通過(guò)中央排水溝排出養(yǎng)殖塘之外。圖1示出水產(chǎn)養(yǎng)殖塘的示意圖。圖1顯示了抗體、冷水病病菌，以及抗體和冷水病病菌如何存在。
圖2顯示測(cè)試1的結(jié)果。圖3顯示測(cè)試2的結(jié)果。在圖2和圖3中，3個(gè)區(qū)域的水產(chǎn)養(yǎng)殖塘分別是A-I池和A_2池，B_1池和B_2池， 以及C-I池；在3個(gè)區(qū)域作為對(duì)照池的水產(chǎn)養(yǎng)殖塘分別是對(duì)照A(AC)、對(duì)照B(BC)、和對(duì)照 C (CC)。測(cè)試1和測(cè)試2都進(jìn)行了 4個(gè)月。圖2和圖3顯示了每個(gè)月死于冷水病的魚的數(shù)量和死于其他原因的魚的數(shù)量。養(yǎng)殖開始于前一年的12月底。在圖2中，剩余百分比通過(guò)將引入每個(gè)池塘的魚仔總重除以10條魚的平均重量， 以及將出池時(shí)(at the time of shipping)魚的總重量除以10條魚的平均重量而得到。在測(cè)試1中，1月份100條魚的平均魚體重在A-I池是0. 58g，A_2池中為0. 55g， AC 中為 0. 57g, B-I 池中為 0. 51g, B-2 池中為 0. 59g, BC 中為 0. 55g, C-I 池中為 0. 49g，或 CC中為0. 54go 4月底100條魚的平均魚體重在A-I池中為25. 4g，A_2池中為26. 4g，AC 池中為 24. 8g，B-I 池中為 27. 7g，B-2 池中為 26. 9g，BC 中為 25. 7g，C-I 池中為 26. 3g，CC 中為26. lg。在測(cè)試2中，1月份100條魚的平均魚體重在A-I池中為0. 54g，A_2池中為0. 52g， AC 中為 0. 53g, B-I 池中為 0. 53g, B-2 池中為 0. 55g, BC 中為 0. 53g, C-I 池中為 0. 52g, CC 中為0. 51g。4月底100條魚的平均魚體重在A-I池中為Μ. 8g，A_2池中為25. 3g，AC中為 26. 9g，B-I 池中為 25. lg, B-2 池中為 24. 7g，BC 中為 26. 2g，C-I 池中為 25. 3g，CC 中為 26. 8g0如圖2和圖3所示，在所有3個(gè)區(qū)域中，與對(duì)照池相比，已給予含有雞蛋抗體的飼料的池塘中剩余百分比顯著增加。圖4顯示了被冷水病病菌感染的鲇魚照片。在被冷水病病菌感染的鲇魚中，內(nèi)臟溶解，鰓和心臟由于缺血而變白。圖5顯示了已給予含有雞蛋抗體的飼料的鯰魚照片。內(nèi)臟的顏色和形態(tài)都正常，鰓充滿高氧飽和度血液，呈紅色。工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法，使用蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)劑通過(guò)分子內(nèi)交聯(lián)固定在微生物的表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后將生成物給予動(dòng)物，從而可以獲得包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)的抗體的包羅性抗體。包羅性抗體與微生物的整個(gè)表面結(jié)合，從而能夠滅活或殺滅微生物。特別地，包羅性抗體可以用于預(yù)防或治療微生物感染疾病。本文引用的所有公開、專利和專利申請(qǐng)均全文并入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種制備包羅性抗體的方法，所述包羅性抗體包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體，所述方法包括(a)用蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑處理微生物，從而通過(guò)分子內(nèi)交聯(lián)固定在所述微生物表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)；(b)將使用所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑固定的所述微生物作為免疫原給予動(dòng)物；和(c)從所述動(dòng)物獲得抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑選自甲醛、多聚甲醛和戊二醛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑是 1% (ν/ν)到38% (ν/ν)的福爾馬林。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的制備包羅性抗體的方法，其中使用所述蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑的固定化進(jìn)行10分鐘到48小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的制備包羅性抗體的方法，其中給予所述免疫原的所述動(dòng)物是雞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備包羅性抗體的方法，其中所述抗體從已經(jīng)給予所述免疫原的雞所下的雞蛋中獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法得到的包羅性抗體，其包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體。
8.一種用于微生物感染疾病的預(yù)防或治療劑，其包括根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法得到的包羅性抗體，所述包羅性抗體包括針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)分子的抗體。
9.一種食物，其包括根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法從雞蛋中得到的所述包羅性抗體。
10.一種飼料，其包括根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法從雞蛋中得到的所述包羅性抗體。
11.一種用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法從雞蛋中得到的所述包羅性抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于治療水生動(dòng)物感染性疾病的組合物，其用于施用于水生動(dòng)物棲息的環(huán)境水。
全文摘要
本發(fā)明提供制備針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)的包羅性抗體的方法以及用該方法獲得的包羅性抗體。針對(duì)在微生物表面上表達(dá)的全蛋白質(zhì)的包羅性抗體的制備方法包括(a)用蛋白質(zhì)質(zhì)交聯(lián)和固定劑處理微生物，從而通過(guò)分子內(nèi)交聯(lián)固定在微生物表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)質(zhì)；(b)將使用蛋白質(zhì)交聯(lián)和固定劑固定的微生物作為免疫原給予動(dòng)物；和(c)從動(dòng)物獲取抗體。
文檔編號(hào)A23L1/305GK102307898SQ20098015636
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者七里真義, 井伊康洋 申請(qǐng)人:株式會(huì)社幸福醫(yī)科