專利名稱：利用化學反應性非天然氨基酸產(chǎn)生載體-肽偶聯(lián)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學領域。本文描述了產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的方法， 其中摻入所述載體多肽變體的第一非天然氨基酸與摻入所述靶多肽變體的第二非天然氨基酸反應。還描述了這些方法產(chǎn)生的組合物。
背景技術：
各種限制條件妨礙肽的開發(fā)以供治療應用。例如，治療性肽通常顯示體內(nèi)穩(wěn)定性低，常在給予對象后通過化學或酶促降解而快速清除，例如在數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)，即，在達到任何療效之前。因此，生物利用度低要求頻繁給予肽，常通過相當高劑量的注射以維持活性。此類高劑量可導致不良副作用。此外，膜屏障(例如，腸和血腦屏障)的選擇性透過限制了治療性肽的遞送。為促進遞送入細胞、延長它們的半衰期和/或維持它們的活性，可將感興趣的多肽，例如小的治療性多肽共價偶聯(lián)于載體多肽，例如對特定配體或配體的基團， 如糖、核苷、鹽、氨基酸、脂肪酸或其它分子具有高親和力的各種多肽。載體多肽通常有助于此類配體的轉(zhuǎn)運，例如轉(zhuǎn)運入亞細胞隔室，胞外液體(例如，血液)或穿過細胞膜。因此，載體-靶多肽偶聯(lián)物給予對象后，載體蛋白有利地促進將共價連接的靶多肽遞送入細胞，降低它們的毒性和/或延長它們的穩(wěn)定性和/或活性。將小肽化學偶聯(lián)于載體多肽的現(xiàn)有方法包括利用非特異性試劑，例如戊二醛或碳二亞胺活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯和防止載體多肽_載體多肽或靶多肽_靶多肽偶聯(lián)物形成的高特異性異雙功能交聯(lián)劑。然而，此類試劑僅可用于修飾有限數(shù)量的氨基酸殘基 (例如，包含胺、酮、硫醇、巰基或羧基的氨基酸)。利用此類交聯(lián)劑將載體多肽偶聯(lián)于靶多肽可擾亂載體多肽、靶多肽或得到的載體-靶多肽偶聯(lián)物的構象，因而降低偶聯(lián)物的穩(wěn)定性、生物學活性、藥代動力學活性等。利用這些交聯(lián)劑的偶聯(lián)反應可產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的異質(zhì)群體，從而降低生產(chǎn)效率并使質(zhì)量控制復雜。本領域需要 能有效、成本節(jié)約地大規(guī)模產(chǎn)生載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物的均質(zhì)群體的方法和組合物?？v覽以下內(nèi)容后會明白本發(fā)明提供了這些和其它需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供制備載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的方法和組合物，所述偶聯(lián)物顯示生物利用度提高、藥理學活性增強、生物學活性升高、半衰期延長和/或免疫原性增加。本發(fā)明采用將第一和第二非天然氨基酸分別直接摻入載體多肽和靶多肽。然后存在于載體和靶多肽變體中的所述第一和第二非天然氨基酸反應以產(chǎn)生本發(fā)明的偶聯(lián)物。此類偶聯(lián)物可治療性應用或藥學應用，它們可有利地在低成本表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述系統(tǒng)能產(chǎn)生包含復雜翻譯后修飾的生物學活性異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明一方面提供制備載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的方法。該方法包括在載體多肽的合成或翻譯期間將第一非天然氨基酸殘基摻入載體多肽，在靶多肽的合成或翻譯期間將第二非天然氨基酸殘基摻入靶多肽，以及所述第一和第二殘基反應以產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。所述第一和第二非天然氨基酸可任選通過一種或多種以下機制反應 親電-親核反應、酮與親核試劑反應、肟連接、醛與親核試劑反應、羰基和親核試劑之間的反應、磺酰基和親核試劑之間的反應、酯化反應、位阻酯基和親核試劑之間的反應、硫酯基團和親核試劑之間的反應、穩(wěn)定的亞胺基和親核試劑之間的反應、環(huán)氧基團和親核試劑之間的反應、氮丙啶基團和親核試劑之間的反應、親電試劑和脂族胺或芳族胺之間的反應、親電試劑和酰胼之間的反應、親電試劑和碳酰胼之間的反應、親電試劑和氨基脲之間的反應、 親電試劑和氨基硫脲之間的反應、親電試劑和羰基酰胼之間的反應、親電試劑和硫代羰基酰胼之間的反應、親電試劑和磺?；ｋ葜g的反應、親電試劑和卡巴胼之間的反應、親電試劑和硫卡巴胼之間的反應、親電試劑和羥胺之間的反應、親核試劑或親核試劑，例如羥基或二醇和硼酸或酯之間的反應、過渡金屬催化的反應、鈀催化的反應、銅催化的雜原子烷化反應、環(huán)加成反應、1，3環(huán)加成反應、2，3環(huán)加成反應、炔-疊氮化物反應、狄爾斯-阿德爾 (Diels-Alder)反應或鈴木偶聯(lián)反應。在優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生偶聯(lián)物的反應的效率任選大于50%、大于70%或大于90%。翻譯期間將第一非天然氨基酸摻入載體多肽可任選包括提供翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含所述第一非天然氨基酸、正交tRNA-合成酶(O-RS)、被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特異性氨?；恼籺RNA(Ο-tRNA)，和編碼載體肽的核酸，其中所述核酸包含所述 Ο-tRNA識別的選擇者密碼子；和翻譯所述核酸，藉此在翻譯期間將所述第一非天然氨基酸摻入所述載體多肽。任選可在甲基營養(yǎng)酵母細胞，例如假絲酵母(Candida)細胞、漢遜酵母 (Hansenula)細胞、畢赤酵母(Pichia)細胞或球擬酵母菌(Torulopsis)細胞中，在翻譯期間產(chǎn)生所述載體多肽(或靶多肽)。在所述方法的具體實施方式
中，將第一非天然氨基酸摻入載體多肽產(chǎn)生包含該第一非天然氨基酸的HSA變體，例如包含對乙?；奖彼岬腍SA變體?？扇芜x在翻譯期間將第一非天然氨基酸摻入HSA變體。例如，可任選將第一非天然氨基酸摻入HSA變體的氨基酸37位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID N0:1的。然而，第一非天然氨基酸所摻入的載體多肽可任選對于各種多肽是同源的，所述多肽包括但不限于，例如抗體(例如，0KT3 抗體、HER2抗體等)、抗體片段(例如，F(xiàn)c、Fab、scFv等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反應性 蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔賊血藍蛋白(KLH)、離子載體蛋白、 ?；d體蛋白、信號轉(zhuǎn)導銜接蛋白、雄激素結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、血漿銅藍蛋白、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、f_盒蛋白、脂肪酸-結(jié)合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相關蛋白、GTP-結(jié)合蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、鐵-結(jié)合蛋白、潛在TGF-β結(jié)合蛋白、 光-收集蛋白復合物、淋巴細胞抗原、膜轉(zhuǎn)運蛋白、神經(jīng)垂體素運載蛋白、周質(zhì)結(jié)合蛋白、磷酸-結(jié)合蛋白、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、視黃醇-結(jié)合蛋白、RNA-結(jié)合蛋白、 S-期激酶-相關蛋白、性激素_結(jié)合球蛋白、甲狀腺素-結(jié)合蛋白、鈷胺素傳遞蛋白、皮質(zhì)激素傳遞蛋白、運鐵蛋白_結(jié)合蛋白、和/或維生素D-結(jié)合蛋白。在所述方法的某些實施方式中，將第二非天然氨基酸摻入靶多肽產(chǎn)生包含該第二非天然氨基酸的TSP-I變體，例如包含ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸的TSP-I變體?？扇芜x將ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸摻入TSP-I變體的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID Ν0:2的。在所述方法的其它實施方式中， 將第二非天然氨基酸摻入靶多肽產(chǎn)生包含該第二非天然氨基酸的ΑΒΤ-510變體，例如包含 ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L_賴氨酸的ΑΒΤ-510變體?？扇芜x將ε_(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸摻入ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID Ν0:3的。ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸任選在合成期間摻入TSP-I 變體或ΑΒΤ-510變體。然而，摻入第二非天然氨基酸的靶多肽可任選對于以下是同源的，例如，TSP-1、ABT-510、胰高血糖素(glugacon)-樣肽-1 (GLP-I)、甲狀旁腺激素(PTH)、核糖體滅活蛋白(RIP)、血管抑素、艾賽那肽(EXedin)-4、脫輔基蛋白、心房鈉尿因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C 趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、 NAP-4、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白_1、單核細胞趨化蛋白_2、單核細胞趨化蛋白_3、單核細胞炎性蛋白-1 α、單核細胞炎性蛋白-1 β、 RANTES, 1309、R83915、R91733、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40 配體、補體抑制劑、細胞因子、上皮嗜中性粒細胞活化肽-78、GRO α、MGSA、GR0 3、GRO Y、MIPl-α、MIPl-β、MCP_1、 上皮嗜中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝落毒素(exfoliating toxin)、成纖維細胞生長因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生長因子、水蛭素、LFA-1、人胰島素、 人胰島素樣生長因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干擾素、IFN-α、IFN-, IFN-Y、白介素、 IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、白血病抑制因子、神經(jīng)生長因子(neurturinhPDGF、肽激素、多效生長因子(pleiotropin)、熱原性外毒素A、熱原性外毒素B、熱原性外毒素C、松弛素、促生長素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 1、人腫瘤壞死因子(hTNF)、人腫瘤壞死因子α、人腫瘤壞死因子β、Ras, Tat、炎性分子、信號轉(zhuǎn)導分子、牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)和/或BP320抗原，其中所述靶多肽包含第二非天然氨基酸。應該知道以上清單不打算限制本文的實施方式。例如，采用上述方法可在翻譯期間將對-乙?；奖彼釗饺際SA變體的氨基酸 37位，其中HSA中氨基酸位置的編號依照SEQ ID N0:1，可在合成期間將ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入TSP-I變體的氨基酸6位，其中TSP-I中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :2，對-乙?；奖彼崤cε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生HSA-TSP-I偶聯(lián)物。任選采用上述方法可在翻譯期間將對-乙?；奖彼釗饺際SA變體的氨基酸37位，其中HSA中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :1，可在合成期間將ε_(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位，其中ΑΒΤ-510 中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :3，對-乙酰基苯丙氨酸與ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生HSA-ABT-510偶聯(lián)物。 在相關方面，本發(fā)明提供上述方法產(chǎn)生的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。本發(fā)明的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物任選顯示長于靶多肽的血清半衰期。本發(fā)明的偶聯(lián)物可任選包含任何一個或多個上述載體多肽和任何一個或多個上述靶多肽。然而，應該知道本發(fā)明偶聯(lián)物不限于包含所述載體和靶多肽的那些。偶聯(lián)物可任選包含載體多肽和靶多肽，所述載體多肽其是包含至少一個第一非天然氨基酸的HSA變體，所述靶多肽是包含第二非天然氨基酸的TSP-I變體或ΑΒΤ-510變體。所述第一非天然氨基酸可任選是，例如在翻譯期間摻入，例如HSA變體的氨基酸37位的對-乙?；奖彼?，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID Ν0:1的。所述第二非天然氨基酸可任選是，例如在合成期間摻入，例如TSP-I變體的氨基酸6位的ε -(2-(氨基氧基) 乙酰基)-L-賴氨酸，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID Ν0:2的。所述第二非天然氨基酸可任選是，例如在合成期間摻入，例如ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位的ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID Ν0:3的。例如，本發(fā)明的偶聯(lián)物可包含載體多肽和靶多肽，所述載體多肽是在氨基酸37位包含對-乙?；奖彼岬腍SA變體，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸的TSP-I變體，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :2的?；蛘撸景l(fā)明的偶聯(lián)物可包含載體多肽和靶多肽，所述載體多肽是在氨基酸37位包含對-乙?；奖彼岬腍SA變體，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε -(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸的ΑΒΤ-510變體，其中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :3的。在這些實施方式中， 對-乙?；奖彼崤cε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸通過肟連接反應產(chǎn)生偶聯(lián)物。相關地，本發(fā)明提供包含載體多肽結(jié)構域和靶多肽結(jié)構域的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，所述載體多肽結(jié)構域包含第一非天然氨基酸殘基，所述靶多肽結(jié)構域包含第二氨基酸殘基，其中所述載體多肽結(jié)構域和所述靶多肽結(jié)構域通過第一和第二非天然氨基酸殘基偶聯(lián)在一起。所述偶聯(lián)物的載體多肽結(jié)構域可任選包含本文所述的任何載體多肽，所述偶聯(lián)物的靶多肽可任選包含任一(或多個)本文所述的靶多肽變體。在具體的實施方式中，載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物的載體多肽結(jié)構域包含HSA，第一非天然氨基酸殘基是對-乙酰基苯丙氨酸，靶多肽結(jié)構域包含TSP-I，第二非天然氨基酸殘基是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸。在其它實施方式中，載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的載體多肽結(jié)構域包含HSA，第一非天然氨基酸殘基是對-乙?；奖彼幔卸嚯慕Y(jié)構域包含ΑΒΤ-510，第二非天然氨基酸殘基是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?_L_賴氨酸。任選可在甲基營養(yǎng)酵母細胞，例如假絲酵母細胞、漢遜酵母細胞、畢赤酵母細胞或球擬酵母菌細胞中，在翻譯期間將第一非天然氨基酸殘基摻入載體多肽結(jié)構域?？扇芜x在本文所述任一或多個反應中，通過第一和第二非天然氨基酸的反應而共價偶聯(lián)載體多肽和靶多肽。本發(fā)明還提供包含本文所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的細胞。例如，此類細胞可任選包含多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物的載體多肽結(jié)構域包含HSA變體，其包含第一非天然氨基酸，例如對-乙酰基苯丙氨酸。本發(fā)明細胞可包含多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物的靶多肽結(jié)構域包含TSP-I變體，其包含第二非天然氨基酸，例如ε _(2-(氨基氧基)乙酰基)_L-賴氨酸。在其它實施方式中，本發(fā)明細胞可包含多肽 -靶多肽偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物的靶多肽結(jié)構域包含ABT-510變體，其包含第二非天然氨基酸，例如 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸。試劑盒也是本發(fā)明的特征之一。例如，試劑盒可任選裝有本文提供的任一或多種組合物?；蛘撸噭┖锌裳b有合成載體多肽和/或靶多肽，例如治療性小肽的試劑，所述載體多肽包含第一化學反應性非天然氨基酸，所述靶多肽包含第二化學反應性非天然氨基酸。此類試劑可包括，例如反應性非天然氨基酸，包含適合產(chǎn)生含非天然氨基酸的載體多肽和/或靶多肽的正交翻譯系統(tǒng)組分的宿主細胞，例如甲基營養(yǎng)酵母細胞，進行連接反應產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的溶液，產(chǎn)生包含一種或多種本發(fā)明偶聯(lián)物的治療性制劑的試劑、培養(yǎng)基等。本發(fā)明試劑盒可裝有附加組分，例如使用說明書以構建能表達包含非天然氨基酸的載體多肽和/或靶多肽的甲基營養(yǎng)酵母菌株，進行化學連接反應從而產(chǎn)生載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，等等。試劑盒裝有容納試劑盒組分的容器，實施本文的任何方法或任何方法組合的使用說明材料，利用試劑盒提供的細胞(例如，甲基營養(yǎng)酵母細胞)產(chǎn)生在所選氨基酸位置包含化學反應性非天然氨基酸的感興趣載體和/或靶多肽的使用說明書。本領域技術人員應知道可單用或聯(lián)用本發(fā)明提供的方法、試劑盒和組合物。例如， 可采用本發(fā)明方法產(chǎn)生本發(fā)明的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。技術人員應知道本文所述本發(fā)明特征的其它組合。定義在詳細描述本發(fā)明之前，應理解，本發(fā)明不限于具體的生物學系統(tǒng)，因為它們當然可能變化。還應理解本文所用的術語僅為了描述特定實施方式而非限制性的。在本說明書和隨附權利要求書中所用的單數(shù)形式“一個”，“一種”和“該”包括多個指示物，除非上下文中另有明確表示。因此，例如述及“氨酰tRNA合成酶(RS) ”任選包括兩個或更多個RS分子的組合；述及“載體多肽”或“甲基營養(yǎng)酵母細胞”實際上任選包括多個載體多肽或許多甲基營養(yǎng)酵母細胞。除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本發(fā)明所屬領域普通技術人員的通常理解一致。雖然也可采用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本發(fā)明，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。描述和要求保護本發(fā)明時，依據(jù)以下定義使用下列術語。載體多肽術語“載體多肽”指可采用，例如本文提供的方法偶聯(lián)于靶多肽的各種多肽中的任何一種。利用載體多肽可有利于，例如在載體-靶標偶聯(lián)物給予對象后促進共價連接的靶多肽遞送入細胞，降低它們的毒性和/或延長它們的穩(wěn)定性和/或活性。載體蛋白質(zhì)的優(yōu)選特征可包括溶解度高和半衰期長，然而，并不打算根據(jù)是否具有任何特定的生物學活性來限制載體多肽。常規(guī)使用的載體蛋白質(zhì)包括人血清白蛋白(HSA ； 66kDa)、牛血清白蛋白(BSA ;67kDa)、抗體片段，如Fc(45kDa)，和匙孔賊血藍蛋白(KLH ； 4. 5xl05-l. 3xl07Da)。在下述一個有用的實例中，將治療肽ABT-510共價連接于載體多肽 HSA可增加肽的血清半衰期。
載體多肽可任選是此類多肽的修飾形式，例如通過包含非天然氨基酸作修飾。摻入非天然氨基酸的載體多肽在本文稱為“載體多肽變體”。術語“相關”指共同起作用或彼此具有一定特異性的組分，例如正交 tRNA(O-tRNA)和正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，其中該O-RS用非天然氨基酸特異性氨酰化該0-tRNA。本文所用術語“衍生自”指組分從特定分子或生物分離或制備、或者根據(jù)該特定分子或生物的序列信息分離或制備。例如，衍生自第二多肽的多肽可包含與該第二多肽的氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列。以多肽為例，可通過例如天然產(chǎn)生的誘變、人工定點誘變或人工隨機誘變獲得衍生種類。用來衍生多肽的誘變可以是有意定點的或是有意隨機的，或混用這兩者。誘變多肽以產(chǎn)生衍生自第一多肽的不同多肽可以是隨機事件，例如聚合酶失真(infidelity)所致，而鑒定衍生的多肽可通過例如本文引用的參考文獻所述的合適篩選方法完成。多肽的誘變通常需要操作編碼該多肽的多核苷酸。編遇:本文所用的術語“編碼”指用多聚大分子或序列鏈中的信息來指導不同于該第一分子或序列鏈的第二分子或序列鏈產(chǎn)生的任何過程。本文所用的該術語應用廣泛，可用于各領域。在一些方面，術語“編碼”描述了半保留DNA復制的過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈用作模板，借助依賴DNA的DNA合成酶來編碼新合成的互補姊妹鏈。在另一方面， 術語“編碼”指用一種分子的信息來指導化學性質(zhì)不同于該第一分子的第二分子產(chǎn)生的任何過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子，例如，通過包括依賴DNA的RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程。RNA分子也可編碼多肽，例如在翻譯過程中。當術語“編碼”用于描述翻譯過程時，其含義也延伸至編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在一些方面，RNA分子可編碼DNA分子，例如通過包括依賴RNA的DNA合成酶的逆轉(zhuǎn)錄過程。在另一方面，DNA分子可編碼多肽，應該知道該情況中用“編碼”同時包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。摻入非天然氨基酸本文所用的“摻入非天然氨基酸”，例如摻入載體或靶多肽指在載體過靶多肽的一級構建中，例如通過翻譯或化學合成將非天然氨基酸直接加入延伸中的多肽鏈。 起反應本文所用的術語“起反應”指本發(fā)明的Ο-tRNA識別選擇者密碼子并介導與該tRNA偶聯(lián)的非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈的過程。非_真核牛物本文所用的術語“非_真核生物”指屬于原核生物界(也稱為原核生物(Procarya))的生物。非-真核生物，例如原核生物通常因其以下特征而區(qū)別于真核生物單細胞組織，通過出芽或分裂的無性生殖，缺乏膜結(jié)合的核與其它膜結(jié)合的細胞器， 環(huán)狀染色體，存在操縱子，不存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和聚-A mRNA,以及其它生物化學特征，如不同的核糖體結(jié)構。原核生物包括真細菌和古細菌(Archaea)(有時稱為“古細菌 (Archaebacteria)")亞界。在原核生物界有時將藍細菌(藍綠藻)與支原體分為不同類另O。然而，真細菌、古細菌、藍細菌和支原體均理解為非-真核生物。^ 本文所用的術語“正交，，指與某細胞或翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性相應分子相比，某分子(例如，正交tRNA (Ο-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))與該細胞內(nèi)源性組分起作用的效率降低，或不能與該細胞的內(nèi)源性組分起作用。就tRNA和氨?；?tRNA合成酶而言，正交指與和內(nèi)源性tRNA合成酶起作用的內(nèi)源性tRNA相比，正交tRNA不能與內(nèi)源性tRNA合成酶起作用或起作用的效率降低；或者與和內(nèi)源性tRNA起作用的內(nèi)源性tRNA合成酶相比，正交氨酰tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效率降低例如，小于20%的效率，小于10%的效率，小于5%的效率，或小于的效率。正交分子缺乏細胞中功能正常的內(nèi)源性互補分子。例如，與內(nèi)源性RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA相比，細胞的任何內(nèi)源性RS氨?；毎姓籺RNA的效率降低或者甚至為0。在另一例子中，與內(nèi)源性RS氨酰化內(nèi)源性tRNA相比，正交RS氨?；信d趣細胞中任何內(nèi)源性tRNA的效率降低或者甚至為0?？蓪⒌诙环肿右肱c第一正交分子起作用的細胞。例如，正交tRNA/RS配對包括在細胞中共同起作用的所引入互補組分，且與對照相比，其效率是，例如45%效率、 50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80%效率、90%效率、95%效率或99%效率，或更高，所述對照例如相應的tRNA/RS內(nèi)源性配對或活性正交配對。ιΗ交氨酰tRNA合成酶本文所用的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)是在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)用氨基酸優(yōu)先氨?；?tRNA的酶。O-RS加載到Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然、非天然或是人工的，并且不限于本文所述的。該合成酶任選與 天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與稱為O-RS的合成酶相同或同源。ιΗ交-tRNA 本文所用的正交tRNA (Ο-tRNA)是與感興趣翻譯系統(tǒng)正交的tRNA，其中所述tRNA是，例如(1)與天然產(chǎn)生的tRNA相同或基本類似；(2)通過天然或人工誘變衍生自天然產(chǎn)生的tRNA; (3)由考慮了(1)或(2)的野生型或突變型tRNA序列的任何方法產(chǎn)生；(4)與野生型或突變型tRNA同源；(5)與稱為正交tRNA合成酶底物的任何示例性 tRNA同源；或(6)稱為正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA的保守變體。Ο-tRNA可加載有氨基酸，或處于非負載狀態(tài)。還應知道“Ο-tRNA”任選被相關合成酶用非天然氨基酸加載(氨酰化)。應該知道，實際上優(yōu)選利用本發(fā)明的Ο-tRNA在翻譯期間對選擇者密碼子起反應而將基本上任何非天然氨基酸摻入延伸的多肽。多肽多肽是仵何長度的氨基酸殘基(天然或非天然的，或其組合)的任何寡聚物，通常但不絕對是由共價肽鍵連接在一起的。多肽可以是任何來源的，例如，天然多肽、通過重組分子基因技術制備的多肽、來自細胞和翻譯系統(tǒng)的多肽、或者以無細胞合成方式制備的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列決定，例如，其組成氨基酸殘基的一級結(jié)構。在本文中，多肽的氨基酸序列不限于全長序列，也可能是部分序列或完整序列。另外，這并不意味著根據(jù)是否擁有任何特定生物活性來限制多肽。在本文中，術語“蛋白質(zhì)”是多肽的同義詞。 術語“肽”是指小的多肽，例如但不限于長2-25個氨基酸的多肽。優(yōu)先氨酰化對于本文所用正交翻譯系統(tǒng)，當某表達系統(tǒng)中O-RS使Ο-tRNA加載氨基酸的效率高于其使任何內(nèi)源性tRNA加載氨基酸的效率時，該O-RS “優(yōu)先氨?；毕嚓P 0-tRNA。即，當翻譯系統(tǒng)中存在摩爾比大致相等的Ο-tRNA與任何給定的內(nèi)源性tRNA時， O-RS加載Ο-tRNA的頻率高于它加載內(nèi)源性tRNA的頻率。當翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的 Ο-tRNA與內(nèi)源性tRNA時，由O-RS加載的Ο-tRNA與由O-RS加載的內(nèi)源性tRNA的相對比例優(yōu)選較高，最好導致O-RS僅加載或幾乎僅加載Ο-tRNA。當存在等摩爾濃度的Ο-tRNA與 O-RS時，O-RS加載的Ο-tRNA與內(nèi)源性tRNA的相對比例大于1 1，優(yōu)選至少約2 1，更優(yōu)選5 1，更優(yōu)選10 1，更優(yōu)選20 1，更優(yōu)選50 1，更優(yōu)選75 1，更優(yōu)選95 1、 98 1、99 UlOO 1,500 1,1,000 1,5,000 1 或更高。當(a)與內(nèi)源性tRNA相比，O-RS優(yōu)先氨?；?_tRNA，和(b)與O-RS用任何天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA相比，氨?；瘜Ψ翘烊话被崽禺悤r，稱O-RS “優(yōu)先用非天然氨基酸氨?；疧-tRNA”。即，當包含O-RS和Ο-tRNA的翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾量的非天然和天然氨基酸時，O-RS用非天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率高于用天然氨基酸加載的頻率。加載有非天然氨基酸的Ο-tRNA與加載有天然氨基酸的Ο-tRNA的相對比例優(yōu)選較高。O-RS最好使 Ο-tRNA僅加載，或者幾乎僅加載有非天然氨基酸。當翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的天然和非天然氨基酸時，使Ο-tRNA加載非天然氨基酸與使Ο-tRNA加載天然氨基酸的相對比例大于1 1，優(yōu)選至少約2 1，更優(yōu)選5 1，更優(yōu)選10 1，更優(yōu)選20 1，更優(yōu)選50 1， 更優(yōu)選 75 1，更優(yōu)選 95 1、98 1、99 UlOO 1,500 1,1,000 1,5,000 1 或更高。詵擇者密碼子術語“選擇者密碼子”指翻譯過程中Ο-tRNA識別而內(nèi)源性tRNA不識別的密碼子。Ο-tRNA反密碼子環(huán)識別mRNA上的選擇者密碼子并在多肽的此位置摻入其氨基酸，例如非天然氨 基酸。選擇者密碼子可包括，例如無義密碼子，如終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)；四堿基或四堿基以上密碼子；罕用密碼子；衍生自天然或非天然堿基對的密碼子，等等。抑制活件本文所用的術語“抑制活性”通常指tRNA (例如，抑制型tRNA)能翻譯連讀在其它情況中可導致翻譯終止或錯譯(例如，移碼)的密碼子(例如，作為琥珀密碼子或四個或以上個堿基密碼子的選擇者密碼子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示為與第二抑制型tRNA，或與對照系統(tǒng)，例如缺乏O-RS的對照系統(tǒng)相比，觀察到的翻譯連讀活性百分比。可通過本領域已知的許多試驗測定抑制效率。例如，可采用β-半乳糖苷酶報道試驗，如可將衍生的IacZ質(zhì)粒(該構建物在IacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)連同含有本發(fā)明Ο-tRNA的質(zhì)粒引入合適生物(例如，可利用正交組分的生物)的細胞。還可引入相關合成酶(可以是多肽或表達時能編碼該相關合成酶的多核苷酸)。細胞在培養(yǎng)基中生長至所需密度，例如至OD6tltl約為0.5，進行β-半乳糖苷酶試驗，例如用諾瓦金公司(Novagen) 的BetaFluor β -半乳糖苷酶試驗試劑盒?？蓪⒁种瓢俜直扔嬎銥闃悠废鄬τ诳杀容^對照，例如，衍生的IacZ構建物的觀察值的活性百分比，該構建物在所需位置具有相應的有義密碼子而非選擇者密碼子。抑制型tRNA 抑制型tRNA是在多肽翻譯期間通常對終止密碼子起反應而摻入氨基酸(即，“連讀”)來改變給定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)閱讀的tRNA。在一些方面，本發(fā)明的選擇者密碼子是抑制型密碼子，例如，終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)、四堿基密碼子、罕用密碼子等。靶多肽術語“靶多肽”指感興趣的任何多肽，在共價連接于載體多肽時，其生物利用度、藥理學活性、生物學活性、半衰期、免疫原性等得到維持或提高。靶多肽可任選是治療性小肽，例如TSP-I或ABT-510?；蛘?，靶多肽可以是免疫原性的、衍生自外來生物的、 自身蛋白質(zhì)或合成多肽。并不打算根據(jù)是否具有任何特定生物學活性來限制靶多肽。本發(fā)明可用的治療性小肽的例子包括，例如TSP-I多肽或其衍生物、ABT-510、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)、甲狀旁腺激素(PTH)、艾賽那肽_4和許多其它肽，例如本文所述的。靶多肽可任選是此類多肽的修飾形式，例如通過插入非天然氨基酸作修飾。本文將摻入了非天然氨基酸的靶多肽稱為“靶多肽變體”。翻譯系統(tǒng)術語“翻譯系統(tǒng)”指將氨基酸摻入延伸中的多肽鏈(蛋白質(zhì))的各組分。翻譯系統(tǒng)的組分可包括，例如核糖 體、tRNA、合成酶、mRNA、O-RS, 0-tRNA等。非天然氨某酸本文所用的術語“非天然氨基酸”指不在20種常見天然氨基酸或罕見的天然氨基酸之列的任何氨基酸，修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物，例如硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸(pyrrolysine)。M 本文所用的術語“變體”指包含至少一個化學反應性非天然氨基酸的多肽， 其通常衍生自不含非天然氨基酸的相應“天然”多肽。例如，載體多肽變體(或靶多肽變體) 是“天然”載體多肽(或“天然”靶多肽)的突變體，該突變體包化學反應性非天然氨基酸。 載體多肽變體和/或靶多肽變體中的化學反應性非天然氨基酸可任選替代載體和/或靶多肽的一級序列中的天然氨基酸。或者，可將一個(或多個)非天然氨基酸加入載體或靶多肽的一級序列。摻入載體或靶多肽變體的化學反應性非天然氨基酸可以是保守性或非保守性替代(與不含非天然氨基酸的“天然”載體或靶多肽中的相應天然氨基酸相比)。附圖簡述

圖1是本發(fā)明所用各種質(zhì)粒的示意圖。圖2顯示為測定對選擇者密碼子起反應將非天然氨基酸對_乙?；奖彼釗饺?HSA氨基酸37位的保真度和特異性而進行的實驗結(jié)果。圖3顯示為比較啟動子以優(yōu)化pApaRS表達和琥珀型抑制而進行的實驗結(jié)果。圖4顯示為測定Paqx2、Pypti、Picli、Pfldi、Pgap或Paqxi驅(qū)動的aaRS的琥珀型抑制水平而進行的實驗結(jié)果，通過培養(yǎng)基中rHSAE37pApa水平檢驗。圖5a顯示ABT-510肽肟連接于rHSAE37pApa的示意圖。圖5b顯示為測定偶聯(lián)程度而進行的MALDI質(zhì)譜法的結(jié)果。圖6描述了為證明在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中，可利用本發(fā)明的正交翻譯系統(tǒng)將除PApa以外的非天然氨基酸(例如，結(jié)構3-9)摻入rHSAE37X而進行的實驗。圖7描述了為測定pPIC3. 5k和pREAV盒(cassette)是否成功摻入 GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS 而對 4 個轉(zhuǎn)化子進行 PCR 的結(jié)果。圖8描述了一次轉(zhuǎn)化的GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的四個不同克隆中 pApaRS-His6x的蛋白質(zhì)印跡。圖9描述了為測定rHSAE37X在巴斯德畢赤酵母Mut+突變株中是否更強效表達的實驗結(jié)果。圖10描述了為擴增各種巴斯德畢赤酵母基因啟動子而進行PCR的結(jié)果。圖11是圖4結(jié)果的柱狀圖，顯示rHSAE37pApa的琥珀型抑制與啟動子驅(qū)動pApaRS產(chǎn)生的函數(shù)關系。圖12顯示對25 μ 1 BSA標準品或測試蛋白質(zhì)表達的未純化rHSAH生型( )培養(yǎng)基作電泳的蛋白質(zhì)凝膠。圖13顯示圖6f的泳道2的胰凝乳蛋白酶消化的rHSAE37__c蛋白的LC-MS/MS。圖14提供用于實施例1中菌株和質(zhì)粒構建的寡核苷酸引物的序列。發(fā)明詳述MM本發(fā)明為利用目前可用的交聯(lián)劑產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物提供有益的備選方案。本文提供的方法包括將已直接摻入載體多肽變體的第一化學反應性非天然氨基酸殘基與已直接摻入靶多肽變體的第二化學反應性非天然氨基酸殘基反應以產(chǎn)生穩(wěn)定的充分確定的偶聯(lián)物。此類偶聯(lián)物可任選用作具有新穎或改善的生物學特性、毒性降低、活性增強和/或半衰期延長的治療劑。這些方法通過持續(xù)產(chǎn)生均質(zhì)偶聯(lián)物群體(例如各偶聯(lián)物包含相同的化學計量和連接位點)而有利于最大程度提高產(chǎn)率和降低成本。從本說明書可知，本發(fā) 明的各種實施方式可包括含有第一反應性非天然氨基酸的各種載體多肽變體和含有第二反應性非天然氨基酸的各種靶多肽，其中所述第一和第二非天然氨基酸經(jīng)反應形成穩(wěn)定的、共價連接的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物。載體多肽和/或靶多肽可任選是治療性的、免疫原性的、衍生自外來生物、自身蛋白質(zhì)、合成的，等等。下文詳述了感興趣的特定載體多肽。本發(fā)明可用的靶多肽包括但不限于治療性小肽，如TSP-1、 ABT-510、GLP-1、艾賽那肽-4、前述物質(zhì)的肽衍生物和其它物質(zhì)，本文它處將進一步描述。在本文所述的某些實施方式中，可以在例如，甲基營養(yǎng)酵母菌，如巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、甲醇畢赤酵母(P. methanolica)、安格斯畢赤酵母(P. angusta)(也稱為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)和球擬酵母菌(Torulopsis spp)中利用正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配對將非天然氨基酸高效和高保真度地位點特異性地摻入載體或靶多肽變體。甲基營養(yǎng)酵母菌是用作異源、治療上有用的蛋白質(zhì)的重組表達系統(tǒng)的有吸引力的候選對象(Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中表達異源蛋白質(zhì)(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. )，，F(xiàn)EMS Microbiol Rev 24 45~66 ；2008 年12月10日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2008/013568，名為“甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤 —巾白勺(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)，，；和 2008 年 12 月 10 日提交的美國專利申請公布2009/0197339，名為“甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中的體內(nèi)非天然氨基酸表達(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)”)。 甲基營養(yǎng)酵母菌的真核亞細胞組織使得它們能進行合成衍生自哺乳動物的生物學活性載體多肽和/或靶多肽所需的許多翻譯后折疊、加工和修飾。與釀酒酵母(S. cerevisiae) 表達的蛋白質(zhì)不同，甲基營養(yǎng)酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不大可能含有能妨礙異源表達的糖蛋白下游加工的高甘露糖聚糖結(jié)構。此外，甲基營養(yǎng)酵母菌中合成的載體和/或靶多肽優(yōu)選不含熱原性和抗原性化合物，而這常是大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)的特征。最有意義的是，甲基營養(yǎng)酵母菌表達系統(tǒng)尤其可用于大規(guī)模合成。例如，甲基營養(yǎng)酵母菌中的正交翻譯系統(tǒng)表達的含非天然氨基酸的重組載體和/或靶多肽的水平比釀酒酵母、 細菌、昆蟲或哺乳動物系統(tǒng)中高10-100倍。此外，不難在簡單的、成分明確的鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母菌，從而無需桿狀病毒表達系統(tǒng)所需的昂貴培養(yǎng)基添加劑和設備。在甲基營養(yǎng)酵母菌中利用正交翻譯系統(tǒng)的進一步細節(jié)見2008年12月10日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2008/013568，名為“甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中的體內(nèi)非天然氨基酸表達”和 2008年12月10日提交的美國專利申請公布2009/0197339，名為“甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中的體內(nèi)非天然氨基酸表達”。可采用本領域已知的多種方法將第一和第二非天然氨基酸分別直接摻入載體和靶多肽。雖然許多實施方式利用，例如巴斯德畢赤酵母(見下文)或其它甲基營養(yǎng)酵母菌(例如，甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌)中的正交翻譯系統(tǒng)作為直接摻入非天然氨基酸的途徑，但也任選采用其它直接摻入方法(例如，體外翻譯系統(tǒng)、固相合成等)。應該知道在本文的典型實施方式中，非天然氨基酸在多肽的構建期間摻入載體和/或靶多肽，而不是通過翻譯后化學衍生加入的。 在一個說明性實例中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生HSA-ABT-510偶聯(lián)物的方法和組合物。ABT-510是衍生自人血小板反應蛋白的抗血管原性肽模擬物，其在人中顯示強效的抗腫瘤活性，但在靜脈內(nèi)給予時其通過腎臟快速清除(Hoekstra等.，(2005) “血小板反應蛋白-1-模擬性抗血管原性抑制劑ABT-510在晚期癌癥患者的I期安全性、藥代動力學禾口藥效學石if究(Phase I safety, pharmacokinetic，and pharmacodynamic study of the thrombospondin-l-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients with advanced cancer). ”J Clin Oncol 23 :5188_5197 ；Yang 等.，(2007) “血小板反應蛋白 _1 肽ABT-510與丙戊酸的組合是成神經(jīng)細胞瘤的有效抗血管原性方案(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is an effective antiangiogenesis strategy in neuroblastoma). "Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher ^ . , (2002) “用小板反應蛋白-1肽模擬物全身性治療來抑制腫瘤生長(Inhibition of tumor growth by systemic treatment with thrombospondin-1 peptide mimetics). ” Int J Cancer 98:682-689)。HSA是定性清楚的可溶性血清蛋白，半衰期為19天，其功能主要是作為類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白。HSA在，例如在線孟德爾遺傳人數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man database)條目 103600 中有描述(也參見GenBank登錄號 AAA98797. 1)。已摻入HSA變體氨基酸37位的對-乙?；奖彼釟埢鸵褤饺階BT-510 變體氨基酸6位的ε _(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸殘基通過選擇性肟連接反應產(chǎn)生HSA-ABT-510偶聯(lián)物。與HSA偶聯(lián)可延長偶聯(lián)肽的半衰期，因此增加其治療應用。已摻入HSA變體氨基酸37位的對-乙?；奖彼釟埢鸵褤饺階BT-510變體氨基酸1位的 ε _ (2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸殘基也可通過選擇性肟連接反應產(chǎn)生有用的偶聯(lián)物。詳述的組成是首先闡明可利用本發(fā)明提供的方法和組合物化學連接的各種載體多肽和靶多肽。隨后描述了產(chǎn)生分別包含第一和第二反應性非天然氨基酸的載體多肽變體和/或靶多肽變體的方法的細節(jié)。然后闡明了可用于偶聯(lián)載體多肽變體與靶多肽變體的化學偶聯(lián)反應。此后描述了包含本發(fā)明偶聯(lián)物的藥物組合物和它們的給藥細節(jié)。最后，描述了包含本發(fā)明偶聯(lián)物的試劑盒和/或它們的產(chǎn)生方法。感興趣的載體多肽和靶多肽如上所述，本發(fā)明提供產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的方法和組合物，其中分別直接摻入載體多肽和靶多肽的具有獨特化學功能的第一和第二非天然氨基酸殘基經(jīng)反應產(chǎn)生指定偶聯(lián)物的均質(zhì)群體。載體和靶多肽變體的反應性非天然氨基酸可任選在多肽內(nèi)的任何位置。載體和靶多肽變體中非天然氨基酸位置的選擇任選根據(jù)，例如相對于衍生其的 “天然”多肽，置于該位置是否會改變載體和/或靶多肽變體的，例如構象、生物學活性、藥理學活性或其它相關特性。任意選擇載體和靶多肽中化學反應性非天然氨基酸的位置的另一標準是位置是否使得反應性非天然氨基酸可接近(例如，兩個非天然氨基酸能參與連接反應以產(chǎn)生穩(wěn)定偶聯(lián)物)，等等。
摻入載體和靶多肽變體的第一和第二氨基酸分別可以是保守性或非保守性替代 (與不含非天然氨基酸的“天然”載體和靶多肽中的相應天然氨基酸相比)。載體多肽和/ 或靶多肽中的化學反應性非天然氨基酸可任選替代該載體多肽和/或靶多肽的一級序列中的天然氨基酸。或者，可將一個(或多個)反應性非天然氨基酸加入載體或靶多肽的一級序列。可采用許多方法分別構建包含第一和第二反應性非天然氨基酸的載體和靶多肽， 所述方法能將非天然氨基酸直接摻入延伸中的多肽鏈。雖然許多實施方式利用，例如巴斯德畢赤酵母(見下文)或其它甲基營養(yǎng)酵母菌(例如，甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌)中的正交翻譯系統(tǒng)作為直接摻入非天然氨基酸 的途徑，但也任選采用其它直接摻入方法(例如，體外翻譯系統(tǒng)、固相合成等)， 或可聯(lián)用這些方法。然而，在甲基營養(yǎng)酵母菌中表達的優(yōu)點包括它們便于遺傳操作、它們對于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的經(jīng)濟性和它們能進行真核生物蛋白通常相關的復雜翻譯后修飾。下文進一步解釋在甲基營養(yǎng)酵母菌中重組蛋白表達的這些和其它優(yōu)點。在某些實施方式中，可采用本文所述的一種或多種連接化學反應將載體多肽偶聯(lián)于多個靶多肽以產(chǎn)生，例如治療上有用的載體-靶偶聯(lián)物，例如多抗原肽(MAP)。相反，靶多肽可任選偶聯(lián)于多個載體多肽。分別選擇HSA和ABT-510作為載體多肽和靶多肽以說明本發(fā)明的諸方面。HSA是定性清楚的血清蛋白，血清半衰期為19天，ABT-510是天然血管原性抑制劑血小板反應蛋白-1的衍生物，其在人中顯示強效的抗腫瘤活性，但在靜脈內(nèi)給予時其通過腎臟快速清除 (Hoekstra等.，(2005) “血小板反應蛋白-1-模擬性抗血管原性抑制劑ABT-510在晚期癌癥患者的I期安全性、藥代動力學和藥效學研究”J Clin Oncol 23 :5188_5197 ；Yang等·， (2007) “血小板反應蛋白-1肽ABT-510與丙戊酸的組合是成神經(jīng)細胞瘤的有效抗血管原性方案”Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher等·，(2002) “用血小板反應蛋白_1肽模擬物全身性治療來抑制腫瘤生長”Int J Cancer 98:682-689)。如以下實施例所述，已摻入HSA 或HSA變體的對-乙酰基苯丙氨酸殘基和已摻入ABT-510或ABT-510變體的ε _(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸殘基通過，例如肟連接反應。應該知道以下實施例并不是本發(fā)明僅有的實施方式。從本文的描述可以明白，本發(fā)明的各種實施方式可包括含有第一反應性非天然氨基酸的各種載體多肽變體和含有第二反應性非天然氨基酸的各種靶多肽變體，其中所述第一和第二非天然氨基酸經(jīng)反應形成穩(wěn)定的共價連接的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物。 因此，在各種實施方式中，所述載體多肽和/或靶多肽可任選是治療性的、免疫原性的、衍生自外來生物、自身蛋白、合成的，等等。下文描述了感興趣的具體載體和靶多肽。感興趣的載體多肽如本文它處所述，可采用本發(fā)明提供的方法將載體蛋白有利地連接于靶多肽，例如治療性肽，如ΑΒΤ-510，以便例如在給予對象后促進靶多肽遞送入細胞、增加其血清半衰期、維持穩(wěn)定其活性、防止其聚集，等等。載體蛋白的優(yōu)選特征可包括溶解度高和半衰期長； 然而，并不打算根據(jù)是否具有任何特定生物學活性來限制靶多肽。載體多肽可任選包含以下物質(zhì)、是以下物質(zhì)或與以下物質(zhì)同源，例如抗體(例如， 0ΚΤ3抗體、HER2抗體等)、抗體片段(例如，SCFV、Fab、FC等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反應性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔賊血藍蛋白(KLH)、離子載體蛋白、?；d體蛋白、信號轉(zhuǎn)導銜接蛋白、雄激素結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、血漿銅藍蛋白、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、f-盒蛋白、脂肪酸-結(jié)合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相關蛋白、GTP-結(jié)合蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、鐵-結(jié)合蛋白、潛在TGF- β結(jié)合蛋白、光-收集蛋白復合物、淋巴細胞抗原、膜轉(zhuǎn)運蛋白、神經(jīng)垂體素運載蛋白、周質(zhì)結(jié)合蛋白、磷酸-結(jié)合蛋白、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、視黃醇_結(jié)合蛋白、RNA-結(jié)合蛋白、S-期激酶-相關蛋白、性激素-結(jié)合球蛋白、甲狀腺素_結(jié)合蛋白、鈷胺素傳遞蛋白、皮質(zhì)激素傳遞蛋白、運鐵蛋白-結(jié)合蛋白、和/或維生素D-結(jié)合蛋白。然而，應該知道本發(fā)明方法和組合物不限于以上所列多肽。本發(fā)明的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物可任選包含本領域熟知的任何載體多肽。感興趣的靶多肽

靶多肽可包含感興趣的任何多肽，通過將靶多肽化學連接于載體蛋白可穩(wěn)定或改善其半衰期、藥理學活性、生物學活性、生物利用度。靶多肽可任選是治療性的、免疫原性的、衍生自外來生物、自身蛋白、合成的，等等。在尤其有用的實施方式中，靶多肽可以是治療性小肽(參見下文)。然而，并不打算根據(jù)是否具有任何特定生物學活性來限制靶多肽。 在本文的實施方式中，靶多肽可包含以下物質(zhì)、是以下物質(zhì)的變體或與以下物質(zhì)同源，例如 TSP-U ΑΒΤ-510、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)、甲狀旁腺激素(PTH)、艾賽那肽_4、核糖體滅活蛋白(RIP)、血管抑素、脫輔基蛋白、心房鈉尿因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降鈣素、 c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1 α、單核細胞炎性蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、 R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配體、補體抑制劑、細胞因子、上皮嗜中性粒細胞活化肽-78、GR0a、MGSA、GRO0 ,GROy ,MIPl-α、ΜΙΡ1_β、MCP_1、上皮嗜中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝落毒素(exfoliating toxin)、成纖維細胞生長因子(FGF)、FGF21、 G-CSF、促性腺激素、生長因子、水蛭素、LFA-1、人胰島素、人胰島素樣生長因子(hIGF)、 hIGF-I、hIGF-II、人干擾素、IFN-α、IFN-, IFN-γ、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL_9、IL-10、IL-11、IL-12、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、白血病抑制因子、神經(jīng)生長因子、PDGF、肽激素、多效生長因子、熱原性外毒素Α、熱原性外毒素B、熱原性外毒素C、松弛素、促生長素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 、人腫瘤壞死因子(hTNF)、 人腫瘤壞死因子α、人腫瘤壞死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信號轉(zhuǎn)導分子、牛胰胰蛋白酶抑制劑(BPTI)或BP320抗原。應該知道本發(fā)明的方法和組合物也不限于以上所列的那些靶多肽。產(chǎn)牛in本多肽變體和/mp^mm^i可采用能將非天然氨基酸直接摻入延伸中的多肽鏈的各種方法產(chǎn)生，例如經(jīng)反應產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的載體多肽變體和/或靶多肽變體。因此，雖然說明書和實施例主要集中在利用甲基營養(yǎng)酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母(見下文)、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌中的正交翻譯系統(tǒng)分別將化學反應性第一和第二非天然氨基酸摻入載體多肽變體和靶多肽變體，但可任選采用其它正交翻譯系統(tǒng)和/或其它非正交直接摻入方法產(chǎn)生包含此類非天然氨基酸的靶和載體多肽變體。在幾個實施方式中，可將化學反應性非天然氨基酸摻入載體多肽變體或靶多肽變體，例如治療性小肽，而所述多肽在，例如利用O-tRNA/O-RS配對的翻譯期間、利用化學合成方法等的體外合成期間產(chǎn)生。因此，雖然本文詳述了構建包含非天然氨基酸的載體和/或靶多肽變體的具體方法，例如在甲基營養(yǎng)酵母菌中利用正交翻譯系統(tǒng)，但不應將它們視作限制性的。本發(fā)明的許多實施方式還包括在一級裝配期間將非天然氨基酸直接摻入載體和/或多肽的其它方法。 采用，例如下文所述的任何方法將反應性第一和第二非天然氨基酸分別摻入載體多肽和靶多肽之后，載體多肽變體中存在的第一非天然氨基酸可經(jīng)，例如本文它處所述任一種連接化學反應與靶多肽變體中存在的第二非天然氨基酸反應形成穩(wěn)定的指定偶聯(lián)物。應該知道，在一些實施方式中，先將非天然氨基酸遺傳摻入載體多肽和靶多肽 (例如，通過正交翻譯系統(tǒng)，如本文所述和引用的那些)，再形成穩(wěn)定的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物優(yōu)于采用目前可用的方法產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。例如，目前將靶多肽偶聯(lián)于載體HSA的一種方法包括通過馬來酰亞胺連接鍵利用其單游離半胱氨酸(殘基34)。該方案有數(shù)個缺點，包括馬來酰亞胺的抗原性和內(nèi)源性一氧化氮、游離半胱氨酸、谷胱甘肽或糖造成半胱氨酸34的頻繁修飾，從而導致偶聯(lián)效率不定。利用體內(nèi)正交翻譯系統(tǒng)將非天然氨基酸遺傳摻入載體多肽和/或靶多肽可產(chǎn)生生物學和/或藥理學活性的載體多肽變體和/或靶多肽變體，但含有通過非天然氨基酸的直接摻入而添加的活性/官能基團，官能基團可反應以便產(chǎn)生穩(wěn)定的載體-靶多肽偶聯(lián)物。 此外，利用體內(nèi)摻入非天然氨基酸的新穎生物技術工具可有助于高收率、低成本地產(chǎn)生天然構象合適的包含非天然氨基酸的載體和/或靶多肽。此外，可根據(jù)，例如分子接頭長度、 反應條件、所得接頭是否可切割等標準精心選擇分別摻入載體和靶多肽變體的第一和第二非天然氨基酸的反應性。相反，在一些實施方式中，采用例如固相肽合成等其它體外方法，全合成含非天然氨基酸的載體或靶多肽變體產(chǎn)生較短的分子(例如，約60-100個氨基酸)以及產(chǎn)生變性的蛋白質(zhì)，產(chǎn)率較低。在某些實施方式中，利用甲基營養(yǎng)酵母菌中的正交翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生包含非天然氨基酸，例如對_乙酰基苯丙氨酸的載體多肽變體，例如HSA，該非天然氨基酸可與靶多肽變體， 例如TSP-I或ABT-510中的第二非天然氨基酸，例如ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸反應以形成穩(wěn)定的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。對于產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)，利用甲基營養(yǎng)酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母(見下文)、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌中的0-RS/0-tRNA配對的特征在于優(yōu)于其它正交系統(tǒng)， 例如大腸桿菌、釀酒酵母或哺乳動物細胞中那些系統(tǒng)的數(shù)個優(yōu)點。如下文進一步描述的，它們便于遺傳操作、它們對于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的經(jīng)濟性和它們能進行真核生物蛋白通常相關的翻譯后修飾使得甲基營養(yǎng)酵母菌成為表達含非天然氨基酸的異源蛋白質(zhì)，例如載體多肽變體和/或靶多肽變體的有利系統(tǒng)。ιΗ交tRNA/ ιΗ交氨酰t-RNA合成酶技術在某些實施方式中，先將可參與化學連接反應的化學反應性第一和第二非天然氨基酸(例如本文它處所述那些)分別摻入載體多肽和/或靶多肽，再通過正交 tRNA(Ο-tRNA)/氨?；?tRNA合成酶(O-RS)系統(tǒng)進行化學連接反應。因此，通過對0_tRNA/ O-RS配對相關活性的理解，而進一步加深對本發(fā)明提供的組合物和方法的理解。通常，為在遺傳編碼中加入非天然氨基酸，需要包含氨?；?tRNA合成酶和合適tRNA的新正交配對， 該配對在宿主翻譯機器中有效起作用，但與所述翻譯系統(tǒng)“正交”。因此，正交部分起作用不依賴于翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性合成酶和tRNA。正交配對所需的特征包括，僅解碼或識別特定密碼子，例如選擇者密碼子，如琥珀終止密碼子的tRNA，所述密碼子不被任何內(nèi)源性tRNA 解碼，以及氨?；?tRNA合成酶，該合成酶僅用一種特定的非天然氨基酸優(yōu)先氨?；颉凹虞d”其相關tRNA。O-tRNA通常不被或很少被內(nèi)源性合成酶氨酰化，即，加載。
本領域已知適合產(chǎn)生包含一個或多個非天然氨基酸的本發(fā)明蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)的一般原理，它們是產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的一般方法。例如參見名為“生產(chǎn)正交tRNA-酰胺-tRNA 合成酶對的方法和組合物”(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)的國際公布號 WO 2002/086075 ； 名為“體內(nèi)摻入非天然氨基酸”(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)的國際公布號WO 2002/085923 ；名為“擴展真核遺傳編碼”的國際公布號WO 2004/094593 ； 2004 年7月 7 日提交的 WO 2005/019415 ；2004 年7 月 7 日提交的WO 2005/007870 ； 2004 年 7 月 7 日提交的 WO 2005/007624 ;2005 年 10 月 27 日提交的 WO 2006/110182，名為“體內(nèi)非天然氨基酸摻入所用正交翻譯組分”(ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)；以及 2007 年 3 月 7 日提交的WO 2007/103490，名 為“在真核宿主細胞中表達正交翻譯組分的系統(tǒng)”(SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS)；和2008年12月10日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2008/013568，名為“甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中的體內(nèi)非天然氨基酸表達(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris) ”。還可參見如 Liu 等(2007)《在哺乳動物細胞中使用遺傳學方法將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)》“Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells"Nat Methods 4 :239_244 ；2008 年 10 月 30 日提交的國際申請?zhí)?PCT/US2008/081868，名為“遺傳學編碼的硼酸氨基酸”(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid) ；2006 年 10 月11日提交的W02007/047301 “對噬菌體展示多肽進行選擇性翻譯后修飾”(Selective Posttranslational Modification of Phage-Displayed Polypeptides)；以及 2005 年10月27日提交的W02006/110182，名為“體內(nèi)非天然氨基酸摻入所用正交翻譯組分，，(Orthogonal Translation Components for the In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids)。這些前述申請各自通過引用全文納入本文。為了討論摻入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)，及其產(chǎn)生和使用方法，還可參見Wang和Schultz，(2005) “擴展遺傳編石馬” (Expanding the Genetic Code) Angewandte Chemie Int Ed 44 :34_66 ；Xie 禾口 Schultz, (2005) “擴展的遺傳編碼” (An Expanding Genetic Code)Methods 36 :227_238 ； Xie 和 Schultz, (2005) “在遺傳庫中加入氨基酸”(Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire) Curr Opinion in Chemical Biology 9 548-554 ；Wang ^ (2006)"擴展遺傳編石馬，，(Expanding the Genetic Code)Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 :225_249 ； Deiters等(2005) “在大腸桿菌體內(nèi)將炔摻入蛋白質(zhì)”(In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 :1521-1524 ;Chin等，(2002) “在大腸桿菌遺傳編碼中加入L_4_疊氮基苯丙氨酸，，(Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli) J Am Chem Soc 124 =9026-9027 ；以及2005年9月20日提交的國際公布號 W02006/034332。這些文件各自的內(nèi)容通過引用全文納入本文。正交翻譯系統(tǒng)的其它細節(jié)參見美國專利號 7, 045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262,040 ；7，183,082 ； 7，199，222 和 7，217，809。本文所用的非天然氨基酸指除20種遺傳編碼的α氨基酸以外的任何氨基酸，修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物。本文所用的硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸可摻入載體多肽和/或靶多肽。參見例如，L. Stryer的《生物化學》，第三版，1988，紐約自由人公司(Freeman and Company, New York)中二十種天然氨基酸的結(jié)構。非天然氨基酸具有區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團，雖然非天然氨基酸可以是除20種蛋白α-氨基酸外的天然產(chǎn)生的化合物。本發(fā)明所用的非天然氨基酸包括對_(炔丙基氧基)苯丙氨酸、對-甲氧基苯丙氨酸、 丹?；彼?、DMNB-絲氨酸、鄰-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、鄰-4-烯丙基-L-酪氨酸、鄰-炔丙基-L-酪氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對-疊氮-L-苯丙氨酸、對-?；?L-苯丙氨酸、對-苯甲酰-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰絲氨酸、膦酰酪氨酸、對-碘-苯丙氨酸、對_溴苯丙氨酸、對_氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然類似物；谷氨酰胺的非天然類似物；苯丙氨酸的非天然類似物；絲氨酸的非天然類似物；蘇氨酸的非天然類似物；烷基、芳基、?；?、疊氮基、氰基、鹵素、胼、酰胼、羥基、烯基、 炔基(alkynl)、醚、硫醇、磺?；?、磺基、硒代、酯、硫代酸、硼酸鹽、硼化物(boronate)、磷、 膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、烷氧基胺、羥胺、酮或氨基取代的氨基酸、或其任何組合； 帶有光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標記的氨基酸；熒光氨基酸；帶有新型官能團的氨基酸； 與另一分子共價或非共價相互作用的氨基酸；結(jié)合金屬的氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光束縛的和/或光敏異構化的氨基酸；含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修飾的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學切割或可光切割的氨基酸；帶有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有毒性基團的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的絲氨酸等；含碳連接的糖的氨基酸；糖取代的半胱氨酸；氧化還原活性的氨基酸；含α “羥基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α、α 二取代氨基酸；β -氨基酸；磺基酪氨酸、4-硼(borono)苯丙氨酸、氨基氧基氨基酸、氨基氧基賴氨酸、 氨基氧基鳥氨酸、氨基氧基酪氨酸，或脯氨酸之外的環(huán)狀氨基酸。可摻入，例如靶多肽和/或載體多肽的其它非天然氨基酸包括但不限于包含任一或多個以下官能團的非天然氨基酸醛部分、酮部分、二酮部分、烷氧基胺部分、酰基酰胼部分、脫氫丙氨酸部分、硫酯部分、酯部分、硼酸酯部分、疊氮化物部分、炔部分、烯部分、 鄰位巰基胺部分等。存在于靶或載體多肽中包含此類官能團的非天然氨基酸可分別與，例如存在于載體或靶多肽中的第二非天然氨基酸反應，其包含反應性親核和/或親電部分， 例如酮部分、醛部分、烷氧基胺部分、酰基酰胼部分、疊氮化物部分、炔部分、烯部分、氨基部分、巰基部分、氨基苯酚部分、碘代苯基部分，等等。ιΗ交翻譯系統(tǒng)正交翻譯系統(tǒng)通常包括細胞，例如原核細胞，如大腸桿菌；和真核細胞，如釀酒酵母、哺乳動物細胞和甲基營養(yǎng)酵母菌細胞(例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(也稱為多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母和球擬酵母菌)等，所述細胞包含正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)和非天然氨基酸，其中O-RS用非天然氨基酸氨?；?tRNA。正交配對可包括0-tRNA，如抑制型tRNA、移框tRNA等，以及相關O-RS?？捎糜诋a(chǎn)生本文的載體多肽和/或靶多肽變體的正交系統(tǒng)(通常包括0-tRNA/0-RS對)可包含細胞或無細胞環(huán)境。通常，當正交配對識別選擇者密碼子并對該選擇者密碼子起反應而加載氨基酸時，該正交配對稱為“抑制”該選擇者密碼子。即，翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性機器不識別的選擇者密碼子通常不加載，從而阻止了多肽的產(chǎn)生，否則多肽就可以從核酸上翻譯出來。在正交配對系統(tǒng)中，O-RS用特定的非天然氨基酸，如本文實施例中所用的對乙?；奖彼岚滨；?Ο-tRNA。加載的Ο- tRNA識別選擇者密碼子，并且抑制該選擇者密碼子引起的翻譯阻斷，例如產(chǎn)生在氨基酸37位包含對-乙酰基苯丙氨酸的HSA變體。翻譯系統(tǒng)利用0-tRNA/0-RS配對將非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈，如通過編碼感興趣多肽(例如載體多肽和/或靶多肽)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含被 Ο-tRNA識別的選擇者密碼子。在某些系統(tǒng)中，細胞可包含一個或多個附加的0-tRNA/0-RS 配對，其中附加的O-RS用不同的非天然氨基酸加載附加的Ο-tRNA。例如，一個Ο-tRNA可以識別4堿基密碼子，其它Ο-tRNA可識別終止密碼子?；蛘?，多個不同的終止密碼子，多個不同的四堿基密碼子，多個不同的罕用密碼子和/或多個不同的非編碼密碼子可用于同一編碼核酸中。因此，單個多肽，如載體多肽和/或靶多肽變體可包含多個非天然氨基酸。或者，系統(tǒng)中產(chǎn)生不同的載體和/或靶多肽或多肽變體可包含不同的非天然氨基酸。關于可用的0-RS/0-tRNA相關配對及其應用的進一步細節(jié)可參見例如本文它處標注的參考文獻。因此，一些翻譯系統(tǒng)可包含多個0-tRNA/0-RS配對，從而能將多于一種非天然氨基酸摻入載體變體和/或靶多肽變體。例如，翻譯系統(tǒng)還可包含其它附加的不同0-tRNA/ O-RS配對和第二種非天然氨基酸，其中該附加的0-tRNA識別第二選擇者密碼子，該附加的 O-RS優(yōu)選使用該第二非天然氨基酸氨?；?tRNA。例如，包含0-tRNA/0-RS配對的細胞 (其中Ο-tRNA識別如琥珀選擇者密碼子)還可包含第二正交配對，其中第二 Ο-tRNA識別不同的選擇者密碼子，如蛋白石密碼子、赭石密碼子、四堿基密碼子、罕用密碼子、非編碼密碼子等。在一些系統(tǒng)中，不同的正交配對衍生自不同來源，這有利于識別不同選擇者密碼子。某些翻譯系統(tǒng)可包含細胞，如大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞、釀酒酵母細胞或甲基營養(yǎng)酵母菌細胞(例如巴斯德畢赤酵母細胞、甲醇畢赤酵母細胞、安格斯畢赤酵母 (或多形漢遜酵母)細胞、博伊丁假絲酵母細胞和球擬酵母菌細胞)，所述細胞包含正交 tRNA (Ο-tRNA)、正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含編碼感興趣多肽， 例如載體多肽變體和/或靶多肽變體的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被所述 Ο-tRNA識別的選擇者密碼子。盡管正交翻譯系統(tǒng)可使用培養(yǎng)細胞產(chǎn)生含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，這并不意味著本文所用的正交翻譯系統(tǒng)需要完整的活細胞。例如，正交翻譯系統(tǒng)可使用存在細胞提取物的無細胞系統(tǒng)。事實上，使用無細胞體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是一項成熟技術。改進這些體外系統(tǒng)使之利用本文所述正交翻譯系統(tǒng)組分產(chǎn)生具有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。Ο-tRNA和/或O-RS可以是天然產(chǎn)生的或可通過天然產(chǎn)生的tRNA和/或RS的突變，如通過產(chǎn)生各種生物的tRNA文庫和/或RS文庫和/或使用多種可用的突變策略產(chǎn)生。 例如，一種用于產(chǎn)生正交tRNA/氨?；?tRNA合成酶配對的策略包括將異源tRNA/合成酶配對引入系統(tǒng)，其中所述配對作為一種來源或者多種來源，而非使用tRNA/合成酶配對的翻譯系統(tǒng)。候選的異源合成酶的特征包括，如不加載任何宿主細胞tRNA，候選的異源tRNA 的特征包括，如不被任何宿主細胞合成酶氨酰化。此外，異源tRNA對于所有宿主細胞合成酶是正交的。產(chǎn)生正交配對的第二個策略包括產(chǎn)生突變文庫用于篩選和/或選擇0-tRNA 或0-RS。也可將這些策略組合。ιΗ交 tRNA (0-tRNA)希望正交tRNA(Ο-tRNA)介導將非天然氨基酸摻入多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含Ο-tRNA在體內(nèi)或體外識別的選擇者密碼子。因此包含Ο-tRNA的組合物還包含正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，其中O-RS優(yōu)選用非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。含有Ο-tRNA的此類組合物還可包含體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)。細胞中還可存在包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被 Ο-tRNA識別的選擇者密碼子，或一種或多種選擇者密碼子的組合。產(chǎn)生重組正交tRNA并篩選其對選擇者密碼子起反應而將非天然氨基酸摻入多肽的效率的方法參見如，國際申請公布號WO 2002/086075，“產(chǎn)生正交tRNA酰胺基tRNA合成酶對的方法和組合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS";W0 2004/094593，“擴展遺傳編碼”(EXPANDING EUKARY0TIC GENETIC CODE，，;以及 2004 年 7 月 7 日提交的 TO 2005/019415。參見 Forster 等，(2003) “通過全新設計的翻譯遺傳編碼程序性肽模擬物合成酶” “Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo，，Proc Natl Acad Sci U S A 100:6353-6357 ；和 Feng 等，(2003)“通過單一氨基酸變換擴展 tRNA 合成Bl的 tRNA i只另Ij""Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change"Proc Natl Acad Sci USA 100:5676-5681。其它細節(jié)參見美國專利號 7，045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262，040 ；7，183，082 ；7，199，222 和 7，217，809。ιΗ交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用于產(chǎn)生，例如包含非天然氨基酸的載體和/或靶多肽變體的O-RS系統(tǒng)優(yōu)選在體外或體內(nèi)用非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。通過包含O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的多核苷酸可將O-RS提供給翻譯系統(tǒng)。產(chǎn)生0-RS，測定其氨?；剩?或改變其底物特異性的一般細節(jié)參見國際公布號WO 2002/086075，名為“產(chǎn)生正交tRNA氨?；?tRNA合成酶對的方法和組合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)；和 WO 2004/094593,名為“擴展真核遺傳編碼”(EXPANDING THE EUKARY0TIC GENETIC CODE)。還參見，Wang 和 Schultz “擴展遺傳編石馬，，(Expanding the genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66(2005)；及Hoben 和Soil (1985)Methods Enzymol 113 :55_59，它們的內(nèi)容通過引用全文納入本文。此類系統(tǒng)的其它細節(jié)參見美國專利號 7, 045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262，040 ； 7，183，082 ；7，199，222 和 7，217，809。來源和宿主生物體可任選用于產(chǎn)生，例如包含非天然氨基酸的載體多肽變體和靶多肽變體的正交翻譯組分(Ο-tRNA和0-RS)可衍生自任何生物或生物的組合，以便用于任何其它物種的宿主翻譯系統(tǒng)，只要所述O-tRNA/0-RS組分與宿主系統(tǒng)能以正交方式起作用，所述非天然氨基酸經(jīng)反應形成穩(wěn)定的本發(fā)明載體_靶偶聯(lián)物。正交配對中的Ο-tRNA和O-RS無需衍生自同一生物。例如，正交組分可衍生自用于真細菌宿主系統(tǒng)的古細菌基因。另外，正交Ο-tRNA可衍生自古細菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii) > ^m ^ ￥ !^υ If lif (Methanobacterium thermoautotrophicum) ； 鹽菌，如沃氏富鹽菌(Haloferax volcanii)和鹽細菌種NRC-1 ；閃爍古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌 (Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細菌(Aeuropyrum pernix)、海沼甲燒球菌 (Methanococcus maripaludis) > ￥ ^υ Bf ^(Methanopyrus kandleri) > K ￥ ^tA 疊球菌(Methanosarcina mazei) (Mm)、而才超高溫熱棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、深?；鹎蚓?Pyrococcus abyssi)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus) (Ss)、超嗜熱古菌(Sulfolobus tokodaii)、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、火山熱原體(Thermoplasma volcanium)等；或真細菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermphilus)等；而正交O-RS可衍生自以下生物(或生物的組合)，例如古細菌，如詹氏甲烷球菌、嗜熱堿甲烷桿菌；鹽細菌，如沃氏富鹽菌和鹽細菌種NRC-I ；閃爍古生球菌、激烈火球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細菌、海沼甲烷球菌、甲烷嗜高熱菌、 梅氏甲烷八疊球菌、耐超高溫熱棒菌、深海火球菌、硫磺礦硫化葉菌、超嗜熱古菌、嗜酸熱原體、火山熱原體等；或真細菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、枯草芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在其它系統(tǒng)中，真核生物來源，例如植物、藻類、原生動物、真菌、酵母菌、動物(例如哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動)等也可用作Ο-tRNA和O-RS的來源。而且，O-tRNA/O-RS配對的各組分可衍生自同一生物或不同生物。Ο-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS配對可在體內(nèi)或體外選擇或篩選和/或可用于細胞， 例如真細菌細胞，從而產(chǎn)生含有非天然氨基酸的多肽。所用的真細菌細胞可包括但不限于， 例如，大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。選擇者密碼子各種選擇者密碼子均可擴增蛋白質(zhì)生物合成機器的遺傳密碼子框架。例如，選擇者密碼子可包括，如獨特的三堿基密碼子、無義密碼子(如終止密碼子(如琥珀密碼子(UAG)或乳白密碼子(UGA)))、非天然密碼子、至少四堿基的密碼子、罕用密碼子等。可將許多選擇者密碼子引入所需基因，例如一個或一個以上、兩個或兩個以上、三個以上等?？刹捎贸Ｒ?guī)的定點誘變將選擇者密碼子引入編碼感興趣多肽(例如，對象的自身抗原等)的多核苷酸中感興趣的位點?？蓞⒁姡鏢ayers等(1988)，“硫代磷酸酯寡核苷酸定向誘變中的 5，，3，核酸外切酶(5'，3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，，，Nucleic Acids Res, 16 :791_802o 利用不同的選擇者密碼子，可利用多對正交tRNA/合成酶配對，從而能利用這些不同的選擇者密碼子同時位點特異性地摻入多個非天然氨基酸，例如包含至少一個非天然氨基酸。非天然氨基酸也可由罕用密碼子編碼。例如，當體外蛋白合成反應中的精氨酸濃度下降時，證實罕用的精氨酸密碼子AGG可利用丙氨酸?；暮铣蓆RNA而有效插入Ala。參見例如，Ma等，(1993) “用具有不同反密碼子的合成tRNAAla進行體外蛋白質(zhì)工程改造”(In vitro protein engineering using synthetic tRNAa1s with different anticodons) Biochemistry 32:7939-7945。在這種情況下，合成tRNA與大腸桿菌中少量存在的天然 tRNAtog競爭。此外，一些生物不能利用所有三聯(lián)密碼子。已可在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中利用藤黃微球菌(Micrococcus luteus)的未指定密碼子AGA插入氨基酸。參見例如， Kowal和Oliver，(1997) “在藤黃微球菌中使用未指定的密碼子進行基于tRNA的氨基酸誘變(Exploiting unassigned codons in Micrococcus luteus for tRNA-based amino acid mutagenesis) "Nucl Acid Res 25:4685—4689。選擇者密碼子也可包括延伸密碼子，例如四個或四個以上堿基的密碼子，如四個、 五個、六個或更多堿基的密碼子。四堿基密碼子的例子包括，例如AGGA、CUAG, UAGA, CCCU 等。五堿基密碼子的例子包括,例如AGGAC、CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC等。將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)，例如本文它處所述的載體多肽和/或靶多肽的具體方法可包括使用基于移框抑制的擴展密碼子。四個或四個以上堿基的密碼子可將例如一個或多個非天然氨基酸插入同一蛋白質(zhì)。在其它例子中，反密碼子環(huán)可解碼，例如至少一種四堿基密碼子、至少一種五堿基密碼子或至少一種六堿基密碼子或更多。由于可能的四堿基密碼子有256種，所以同一細胞中可用四個或四個以上堿基的密碼子編碼多種非天然氨基酸。參見Anderson等，(2002) “探索密碼子和反密碼子大小的極限”(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size)Chemistry and Biology 9 :237_244 ;Magliery等，(2001)“擴展遺傳編碼選擇有效的四堿基密碼抑制子，以及在大腸桿菌中使用文庫法鑒定“狡猾的” 四減基密石馬子，，(Expanding the Genetic Code -Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty，，F(xiàn)our-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli) J Mol Biol 307 :755_769 ;Ma 等，(1993) “體外使用具有不同反密碼子的合成tRNAAlaI程改造蛋白”(In vitro protein engineering using synthetic tRNAaia with different anticodons)Biochemistry 32 :7939 ；Hohsaka 等，(1999) “在體外蛋白合成系統(tǒng)中將含大芳族基團的非天然氨基酸有效摻入鏈霉親合素，，(Efficient Incorporation of Nonnatural Amino Acids with Large Aromatic Groups into Streptavidin in In Vitro Protein Synthesizing Systems)J Am Chem Soc 121 :34-40 ；以及Moore等，(2000) “四聯(lián)密碼子密碼子擴增的啟示，以及翻譯步驟大小的說明，？ (Quadruplet Codons !implications for Code Expansion and the Specification of Translation Step Size) J Mol Biol 298:195-209。四堿基密碼子已在各種正交系統(tǒng)中用作選擇者密碼子?？蓞⒁?，例如，WO 2005/019415 ；WO 2005/007870和WO 2005/07624。 還可參見 Wang 和 Schultz，(2005) “擴展遺傳編碼”(Expanding the genetic Code) Angewandte Chemie Int Ed 44 :34_66。對于給定系統(tǒng)，選擇者密碼子還可包括天然三堿基密碼子中內(nèi)源性系統(tǒng)不用(或很少用)的那個天然堿基密碼子。例如，這包括缺乏能識別該天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或該三堿基密碼子是罕用密碼子的系統(tǒng)。選擇者密碼子任選包含非天然堿基對。適用于本文方法和組合物的非天然堿基對的描述包括例如Hirao等，(2002)，“將氨基酸類似物摻入蛋白質(zhì)的非天然堿基對(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein)”，Nature Biotechnology，20 :177—182。·， (2002) “Enzymatic Phosphorylation
of Unnatural Nucleosides”(非天然核苷的酶促磷酸化)J Am Chem Soc 124 14626-14630。刪if相 圣碰表汰禾口·滅 遞肽和/或靶多肽在實施例所述的實施方式中，在巴斯德畢赤酵母中利用正交翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生包含第一非天然氨基酸，對-乙?；奖彼岬妮d體多肽HSA以便與包含第二非天然氨基酸的靶多肽偶聯(lián)。巴斯德畢赤酵母中所用的正交組分包括衍生自大腸桿菌酪氨酰tRNA-合成酶的 O-RS和Ο-tRNA，例如衍生自大腸桿菌的突變型酪氨酰tRNA。UA琥珀型抑制因子，二者用作宿主巴斯德畢赤酵母細胞中的正交配對。對于產(chǎn)生包含非天然氨基酸的載體多肽和/或靶多肽，在甲基營養(yǎng)酵母菌中利用0-RS/0-tRNA配對的特征在于，其具有優(yōu)于其它正交系統(tǒng)，例如大腸桿菌、釀酒酵母或哺乳動物細胞的數(shù)個優(yōu)點。首先，甲基營養(yǎng)酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、 安格斯畢赤酵母(多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母細胞和球擬酵母菌的真核亞細胞結(jié)構能將UAA摻入要求復雜翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，例如哺乳動物蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白 (HSA)和人中性中性肽鏈內(nèi)切酶(NEP)，所述翻譯后修飾例如是為生物學活性進行的糖基化、二硫鍵形成、硫酸化、乙?；?、異戊烯化和蛋白水解加工。因此，在細菌系統(tǒng)中最終成為無活性包涵體的許多蛋白質(zhì)在甲基營養(yǎng)酵母菌中成為生物學活性分子。第二，在甲基營養(yǎng)酵母菌中表達和制備的包含UAA的蛋白質(zhì)不含可能妨礙蛋白質(zhì)所專門設計的治療應用效力的高濃度熱原，例如脂多糖或抗原，如高甘露糖寡糖。第三，外來基因在甲基營養(yǎng)酵母菌中的遺傳操作可采用許多良好建立的技術和方法，例如基因靶向、高頻DNA轉(zhuǎn)化、 功能互補克隆(Lin-Cereghino等，(2002) “在巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組蛋白，，(Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastor is.) " Curr Opin Biotechnol 13:329-332)。有內(nèi)源性誘導型啟動子和可選擇標記物可用為由甲基營養(yǎng)酵母菌宿主產(chǎn)生各種含UAA蛋白質(zhì)增加了靈活性。除了這些優(yōu)點，甲基營養(yǎng)酵母菌，例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(多形漢遜酵母)、博伊丁假絲酵母細胞和球擬酵母菌也良好適用于低成本、大規(guī)模合成包含UAA的復雜蛋白質(zhì)。不難在簡單的、成分明確的鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母菌， 從而無需，例如桿狀病毒表達系統(tǒng)或哺乳動物組織培養(yǎng)所需的昂貴培養(yǎng)基添加劑和高成本設備。通常，甲基營養(yǎng)菌可培養(yǎng)至極高細胞密度，在理想條件下甲基營養(yǎng)酵母菌可倍增至細胞懸液呈粘稠漿液。其快速的生長速度使得重組甲基營養(yǎng)酵母菌株能產(chǎn)生高水平(例如比釀酒酵母的水平高10-100倍)的包含UAA的載體和/或靶多肽。它們便于遺傳操作、重組蛋白生產(chǎn)經(jīng)濟并且能進行真核生物蛋白質(zhì)通常相關的翻譯后修飾使得它們成為表達包含 UAA的異源蛋白質(zhì)的有利系統(tǒng)。4種已知的甲基營養(yǎng)酵母菌屬，例如漢森酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母菌屬具有共同的代謝途徑從而能利用甲醇作為單一碳源。在對甲醇誘導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控反應中，幾種酶快速高水平合成。由于控制這些基因表達的啟動予是最強且最嚴格調(diào)控的酵母菌啟動子，甲基營養(yǎng)酵母菌成為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的最有吸引力的宿主。這些甲基營養(yǎng)酵母菌的細胞可以快速生長至高密度，可通過簡單的培養(yǎng)基操作來調(diào)節(jié)產(chǎn)物表達水平。早已在巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、安格斯畢赤酵母(或多形漢森酵母)和博伊丁假絲酵母中開發(fā)了表達系統(tǒng)，以下文獻進一步描述了這些系統(tǒng)H0Uard等， (2002) “工程改造非常規(guī)酵母菌以便有效合成大分子甲基營養(yǎng)酵母菌屬(Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesis of macromolecules :the methylotrophic genera.)”Biochimie 84 :1089-1093 ;Gellison(2002)《多形漢森酵母 生物學禾口應用》(Hansenula Polymorpha :Biology and Applications),第 1 版，W-V 公司 (Wiley-VCH)，紐約；美國專利號6，645，739 ；Gellisen (2000) “在甲基營養(yǎng)酵母菌中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)(Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. ) "Applied Microbiology and Biotechnology 54 :741_750?？缮唐坊彽迷S多這些系統(tǒng)用于學術和工業(yè)實驗室，例如阿特斯生物技術公司(Artes Biotecnology)的漢森酵母試劑盒和英杰公司(Invitrogen)的畢赤酵母試劑盒?？蓮募谆鶢I養(yǎng)酵母菌表達和純化包含一個(或多個)非天然氨基酸的載體多肽變體和/或靶多肽變體。如本文它處所述，可在巴斯德畢赤酵母中從調(diào)節(jié)特征非常適合該目的的醇氧化酶I(AOXl)啟動子表達外來基因。酵母菌在利用大多數(shù)碳源，例如甘油、葡萄糖或乙醇生長期間，AOXl啟動子受到嚴格阻遏，但在用甲醇生長期間被高度誘導(Tschorp 等.(1987) “在巴斯德畢赤酵母中從兩個甲醇調(diào)節(jié)啟動子表達IacZ基因(Expression of the IacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. )"Nucl Acids Res 15:3859-3876)。Paqxi調(diào)節(jié)的基因所編碼蛋白質(zhì)的表達，例如載體多肽變體和/ 或靶多肽變體，通常達到用甲醇培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母中可溶總蛋白的> 30%。為產(chǎn)生重組載體和/或靶多肽變體，首先用阻遏碳源培養(yǎng)Paoti-控制的表達菌株以產(chǎn)生生物質(zhì)，例如最大程度提高培養(yǎng)密度，然后換以含甲醇的培養(yǎng)基，例如BMGY、BMMY或BMM作為單一能源以誘導外來基因表達。然而，甲醇不誘導的啟動子也宜用于表達編碼載體多肽或多肽變體和/或靶多肽或多肽變體的異源基因。該表達系統(tǒng)中AOXl啟動子的備選啟動子是巴斯德畢赤酵母GAP、 FLDU A0X2、ILCl和YPTl啟動子。關于這些啟動子的調(diào)控、可能最有利于從這些啟動子表達外來基因的條件和巴斯德畢赤酵母中通過這些啟動子表達外來蛋白質(zhì)的其它細節(jié)描述于，例如Sears等，(1998) “巴斯德畢赤酵母中組成型和受調(diào)控基因表達的一套通用載體 (A Versatile Set of Vectors for Constitutive and Regulated Gene Expression in Pichia pastoris.) "Yeast 14 :783_790 ；Vassileva 等，(2001) “利用 GAP 啟動子在甲基異源酵母菌巴斯德畢赤酵母中表達乙型肝炎表面抗原(Expression of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the GAP promoter. )"J Biotechnology 88 :21_35 ;Shen等，(1998) “在巴斯德畢赤酵母中控制外來基因表達的氮源調(diào)控的強啟動子(A strong nitrogen-source regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. )，，Gene 216:93-102; Lin-Cereghino等，“在巴斯德畢赤酵母中表達外來基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.)，，《遺傳工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods)，第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow 編，斯普林格公司(Springer), 紐約(2005)。雖然可用搖瓶培養(yǎng)在巴斯德畢赤酵母或其它甲基營養(yǎng)酵母菌中表達載體和/或
29靶多肽，但該系統(tǒng)中表達的蛋白質(zhì)水平通常在發(fā)酵罐培養(yǎng)中更高，因為在發(fā)酵罐中可以控制諸如PH、通氣和碳源加料速度等參數(shù)，從而達到超高細胞密度，例如> 100克/升干細胞重量；> 400克/升濕細胞重量；> 5000D_單位/毫升(參見，例如Lin-Cereghino 等，(2002) “發(fā)酵罐培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母來產(chǎn)生重組蛋白(Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. )" Curr Opin Biotechnol 13 =329-332)。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的特點是便于將表達菌株從搖瓶放大到高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)。通常采用三步方法在巴斯德畢赤酵母或其它甲基營養(yǎng)酵母菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)中表達P_A。X1轉(zhuǎn)錄控制下的基因編碼的載體和/或靶多肽變體。在第一步中，用簡單的成分確定培養(yǎng)基培養(yǎng)工程改造的巴斯德畢赤酵母表達菌株，該培養(yǎng)基包含不可發(fā)酵的Paoti-抑制型碳源以允許細胞生長。第二步包括過渡期，該期間以生長限制速度向培養(yǎng)物中加入甘油以進一步增加培養(yǎng)物的生物質(zhì)并制備細胞以供誘導。在第三步中，向培養(yǎng)物中加入甲醇，其添加速度應使細胞在生理上適應代謝甲醇并合成重組蛋白。然后定期上調(diào)甲醇加料速度直至獲得所需生長速度和蛋白質(zhì)表達速度(Lin-Cereghino等，“在巴斯德畢赤酵母中表達外來基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.) ”〈〈遺傳工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods),第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow編，斯普林格公司，紐約(2005))。培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基廉價，成分確定，由諸如甘油和/或甲醇等碳源、生物素、鹽、痕量元素和水構成。培養(yǎng)基不含熱原和毒素，因此與人用藥劑的制備相容?？梢栽诎麅?nèi)或胞外制備在甲基營養(yǎng)酵母菌中表達的重組載體多肽變體和/或靶多肽變體。由于甲基營養(yǎng)酵母菌只分泌低水平的內(nèi)源蛋白，分泌的重組蛋白可占培養(yǎng)基中蛋白的大部分。因此，將重組載體和/或靶多肽變體導入培養(yǎng)基可用作蛋白質(zhì)純化中的第一步，從而無需采用苛刻的酵母菌裂解方法并避免內(nèi)源性酵母蛋白污染重組蛋白的可能性。然而由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和折疊要求，將異源蛋白質(zhì)分泌入培養(yǎng)基通常只針對正常情況下由它們的天然宿主細胞分泌的那些蛋白質(zhì)。然而，可利用試劑盒，例如英杰公司的原創(chuàng)畢赤酵母表達試劑盒(Original Pichia Expression Kit, Invitrogen)、英杰公司的多拷貝畢赤酵母表達試劑盒(Multi-Copy Pichia Expression Kit, Invitrogen)、研發(fā)協(xié)作技術公司的畢赤酵母蛋白表達系統(tǒng)(Pichia Protein Expression System, Research Corporation Technologies)，其中從業(yè)人員可用預先制備的表達盒將感興趣基因與編碼其天然分泌信號、釀酒酵母α-因子前肽原或巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶(ΡΗ01)信號的序列克隆在框內(nèi)，從而能分泌入培養(yǎng)基?，F(xiàn)已開發(fā)了許多技術來回收甲基營養(yǎng)酵母的胞內(nèi)重組蛋白(Sh印ard等，(2002) “通過細胞透化處理回收巴斯德畢赤酵母的胞內(nèi)重組蛋白 (Recovery of intracellular recombinant proteins from the yeast Pichia pastoris by cell permeabilization.) ” J Biotechnology 99 :149-160 ；美國專利號 6，821，752)。AA^g^^Mir^^iigajiT^iiMTffe各種蛋白質(zhì)純化方法是本領域熟知的，可用于純化和分析在甲基營養(yǎng)酵母菌中表達的包含UAA的載體和/或靶多肽和多肽變體。這些技術以及分析多肽所需的其它技術包括下列文獻所描述的那些:R. Scopes,《蛋白質(zhì)純化》(Protein Purification)，S-V公司(Springer-Verlag), (1982) ；Deutscher，去》(Methods in Enzymology),182卷蛋白質(zhì)純化指導(Guide to Protein Purification)，學術出版公司(Academic Press, Inc).紐約.(1990) ；Sandana(1997)《蛋白質(zhì)的生物分離》(Bioseparation of Proteins)，學術出版公司；Bollag等(1996)《蛋白質(zhì)方法》(Protein Methods)，第2版， W-L 公司(Wiley-Liss)，紐約；Walker (1996)《蛋白質(zhì)方法手冊》(The Protein Protocols Handbook)休瑪効β出版社(Humana Press)，新澤西州；Harris和Angal (1990)《蛋白質(zhì)純化應用實用方法》(Protein Purification Applications :A Practical Approach)牛津 IRL出版社(IRL Press at Oxford)，牛津，英格蘭；Harris和Angal《蛋白質(zhì)純化方法使用方法》(Protein Purification Methods :A Practical Approach)牛津 IRL 出版社，牛津，英格蘭；Scopes (1993)《蛋白質(zhì)純化原理和實踐》(Protein Purification principles and Practice)，第3版，S_V公司，紐約Janson和Ryden (1998)《蛋白質(zhì)純化原則、高分辨率方法及應用》(Protein Purification principles, High Resolution Methods and Applications)，第2版，WV公司，紐約；以及Walker (1998)《蛋白質(zhì)方法，光盤版》(Protein Protocols on⑶-ROM)，休瑪娜出版社，新澤西州；以及其中引用的參考文獻。誠禾口·通常利用適合在大腸桿菌中復制的穿梭載體工程改造將感興趣基因，例如編碼載體多肽和/或靶多肽或其變體并包含選擇者密碼子的基因置于高度誘導型甲基營養(yǎng)酵母菌啟動子控制下的核酸構建物。由于質(zhì)粒在甲基營養(yǎng)酵母菌中較不穩(wěn)定，通常隨后使表達構建物線性化，轉(zhuǎn)化入，例如巴斯德畢赤酵母屬細胞、漢森酵母屬細胞、假絲酵母屬細胞或球擬酵母屬細胞，并整合入基因組。整合通常是位點特異性的；然而，在多形漢森酵母中觀察到高頻率的非同源整合(Agaphonov等，(2005) “空泡蛋白分選缺陷刺激多形漢森酵母中人尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑的蛋白水解加工(Defect of vacuolar protein sorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogen activator in the yeast Hansenula polymorpha. )"FEMS Yeast Reseach 5:1029-1035)。 關于甲基營養(yǎng)酵母菌的通用分子操作，例如轉(zhuǎn)化、基因靶向、通過功能互補克隆、利用可用的可選擇標記等的其它細節(jié)可見，例如Peberdy編，(1991)《真菌的應用分子遺傳學》 (AppliedMolecular Genetics of Fungi).劍橋大學出版社，英國；《多形漢森酵母生物學禾口應用》(Hansenula Polymorpha :Biology and Applications),第一版，W~V公司；Higgins 和Cregg.《畢赤酵母方案(分子生物學方法)》(Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology))，第一版.休瑪娜出版社新澤西州(1998)；和其中引用的參考文獻。在優(yōu)選的實施方式中，在甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中表達載體多肽變體和/或靶多肽變體，例如本文它處詳述的那些?？赏ㄟ^以下三個基礎步驟在巴斯德畢赤酵母中表達大多數(shù)外來基因?qū)⒕幋a載體或靶多肽的基因插入表達載體；將該表達載體引入巴斯德畢赤酵母基因組；和分析產(chǎn)生外來基因所表達的載體或靶多肽的推定表達菌株，該方法在上文描述。幸運的是，巴斯德畢赤酵母的分子遺傳操作的技術，例如DNA-介導的轉(zhuǎn)化、基因靶向、基因替代和通過功能互補克隆類似于釀酒酵母所述的那些。然而，與釀酒酵母相反，質(zhì)粒在巴斯德畢赤酵母中不穩(wěn)定，編碼感興趣蛋白質(zhì)的表達構建物通過同源重組整合入巴斯德畢赤酵母基因組。巴斯德畢赤酵母的分子遺傳操作方案詳述于，例如Cregg等， (1985) “巴斯德畢赤酵母作為轉(zhuǎn)化的宿主系統(tǒng)(Pichia pastoris as a host system for transformations.)”Molec Cell Biol 5 :3376_3385 ;Lin_Cereghino 等，“在巴斯德畢赤酵母中表達夕卜來基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.) ” 《遺傳工程改造原理和方法》(Genetic Engineering Principles and Methods)，第23卷， 第1版，Jane K. Setlow編，斯普林格公司，紐約(2005) ；Higgins和Cregg.《畢赤酵母方案 (分子生物學方法)》(Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology))，第一版.休瑪娜出版社新澤西州(1998) ；Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中表達異源蛋白質(zhì)(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.)”FEMS Microbiol Rev 24 :45_66，和其中引用的參考文獻。有各種巴斯德畢赤酵母宿主菌株和表達載體可用。實際上，所有巴斯德畢赤酵母表達菌株衍生自伊利諾斯州皮奧里亞市北區(qū)研究實驗室(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL)的NRRL-Y 111430。大多數(shù)表達菌株具有能選擇包含合適互補標記的表達載體的一個或多個營養(yǎng)缺陷型標記。宿主菌株因A0X1、A0X2或二者中有缺陷而具有不同的甲醇代謝能力。事實上，在AOXl和/或A0X2中有突變的菌株可能是比野生型菌株更好的外來蛋白質(zhì)生產(chǎn)者(Cregg等.(1987)“在甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中乙型肝炎抗原的高水平表達和有效裝配(High level expression and efficient assembly of hepatitis B antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. )"Bio/ Technology 5 :479_485 ;Chiruvolu等，(1997) “采用分批補料發(fā)酵在巴斯德畢赤酵母的 Ilfl^BI^PSM^tt^Z^^MilSS (Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentation. )Enzyme Microb Technol 21:277-283)。然而，aoxf菌株甚至保留了高水平地誘導從AOXl啟動子表達外來蛋白的能力。宿主菌株，包括某些重組蛋白表達可能更有利的蛋白酶缺陷型宿主菌株的更詳細信息見，例如Brierley等，(1998) “重組胰島素樣生長因子_1 (IGF-I)的分泌(Secretion of recombinant insulin-like growth factor-1 (IGF-I).) "Methods Mol Biol 103 :149-177 ;White等，(1995) “大規(guī)模表達、純化和鑒定血栓調(diào)節(jié)蛋白的小片段第六結(jié)構域和甲硫氨酸388的作用(Large-scale expression, purification, and characterization of small fragments of thrombomodulin :the roles of the sixth domain and of methionine 388.) "Protein Eng 8:1177-1187。大多數(shù)巴斯德畢赤酵母表達載體設計成大腸桿菌/巴斯德畢赤酵母穿梭載體，該載體含有復制起點以便維持在大腸桿菌中以及在一種或兩種生物體中起作用的可選擇標記，例如在巴斯德畢赤酵母中可選擇的ARG4、HIS4、ADEl、URA3、TRPl和某些抗生素，例如 Zeocin 和Geneticin 和/或可在大腸桿菌中選擇的許多抗生素耐受標記中的任一種。 表達載體通常包含5’ AOXl啟動子序列和用于轉(zhuǎn)錄終止的A0X1-衍生序列，二者之間有多克隆位點。雖然AOXl啟動子已成功用于表達多種外來蛋白，但仍有可能不適用該啟動子的情況，例如就生產(chǎn)食品而言。該表達系統(tǒng)中AOXl啟動子之外的備選啟動子是巴斯德畢赤酵母A0X2、ICLU GAP、FLDl和YPTl啟動子。包含任何上述啟動子的通用表達載體圖譜和可能的載體組分清單還可見，例如Lin-Cereghino等，“在巴斯德畢赤酵母中表達外來基因 (Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.)，，〈〈遺傳工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods),第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow 編，斯普林格公司，紐約(2005)；和Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基營養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中表達異源蛋白質(zhì)(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast
32Pichia pastoris.) ” FEMS Microbiol Rev 24:45-66。此外，許多載體的 DNA 序列可見英杰公司網(wǎng)站(www. invitrogen. com)，各自可從英杰公司單獨購得和在巴斯德畢赤酵母表達試劑盒中購得。通用分子克降方法和技術參考文獻中描述了很多分離、克隆和擴增核酸的方法以便準備，例如將感興趣基因，例如編碼載體多肽變體或靶多肽變體的基因克隆入上述表達構建物，這些方法可用于本發(fā)明以便，例如在甲基營養(yǎng)酵母菌，如巴斯德畢赤酵母中提供感興趣基因并表達。這些技術的進一步細節(jié)可見=Berger和Kimmel，《分子克隆技術指南一酶學方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第 152 卷，學術出版社公司，圣迭戈，加利福尼亞州(Berger) ；Sambrook等，《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第 3 版)，1_3 卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，2000 ( “Sambrook")； 《核酸方法學手冊》(The Nucleic Acid Protocols Handbook) Ralph Rapley (編)(2000) 冷泉港，休瑪娜出版社公司(Rapley)；《最新分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology), F. Μ. Ausubel 等編，《最新方法》(Current Protocols)，格林出版合伙公司(Greene Publishing Associates, Inc.)和約翰韋利父子公司(John Wiley & Sons, Inc.)的合作企業(yè)(增補2007) (“ Ausubel"))；《PCR方法，方法和應用指南》(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications) (Innis等編)學術出版公司·圣迭戈，加利福尼亞州(1990) (Innis) ；Chen 等(編)《PCR 克隆方法》(PCR Cloning Protocols)，第 2 版 (《分子生物學方法》(Methods in Molecular Biology)，第192卷)休瑪娜出版社；Vil joen 等(2005)《分子診斷PCR手冊》(Molecular Diagnostic PCR Handbook)斯普林格公司； Demidov和 Broude(編)(2005)《DNA 擴增當代技術和應用》(DNA Amplification =Current Technologies and Applications)地平線生物科學公司(Horizon Bioscience)，懷蒙特漢姆(Wymondham)，英國。其它有用的參考文獻，例如，用于細胞分離和培養(yǎng)，例如，用于隨后的核酸分離，包括Freshney (1994)《動物細胞培養(yǎng)，基本技術手冊》(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)，第 3 版，W_L 公司，紐約及其中引用的文獻；Payne 等(1992)《植物細胞和組織在液體系統(tǒng)中的培養(yǎng)》(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)約翰韋利父子公司紐約，紐約州；Gamborg和Phillips (編)(1995)《植物細胞、組織和器官培養(yǎng)》(Plant Cell, Tissue and Organ Culture)；《基礎方法斯普林格實驗室手冊〉〉(Fundamental Methods Springer Lab Manual), S-V 公司(Springer-Verlag) (伯林、海德堡、紐約)以及Atlas和Parks (編)《微生物培養(yǎng)基手冊》(The Handbook of Microbiological Media) (1993) CRC 出版社(CRC Press)，伯克萊屯，佛羅里達州?？缮唐坊彽迷S多試劑盒用于從細胞純化質(zhì)?；蚱渌嚓P核酸(參見，例如，法瑪西亞生物技術公司(Pharmacia Biotech)的EasyPr印 和FlexiPr印 ；斯特拉塔基因公司(Stratagene)的 StrataClean ；恰根公司(Qiagen)的 QIApi^p )。任何分離的和 / 或純化的核酸都可以進一步操作以制備其它核酸，用于轉(zhuǎn)染細胞、摻入相關載體以感染生物體以便表達等。典型的克隆載體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、以及用于調(diào)節(jié)特定靶核酸表達的啟動子。載體任選包含基因表達盒，其含有至少一個獨立終止子序列、使表達盒在真核細胞或原核細胞或者二者中復制的序列(例如，穿梭載體)以及用于原核和真核系統(tǒng)的選擇標記。參見Sambrook，Ausubel和Berger。另外，基本上任何核酸都可以從任何商業(yè)來源定制或訂購，例如阿拉巴馬州亨茨維爾的操縱子技術公司(Operon Technologies Inc.，Huntsville，AL) 0應該知道，雖然本文詳述了構建包含化學反應性非天然氨基酸的載體和/或靶多肽變體的特定方法，例如利用甲基營養(yǎng)酵母菌中正交翻譯系統(tǒng)，但它們無需視作限制性的。 可利用，例如大腸桿菌、釀酒酵母、哺乳動物細胞等中的正交翻譯系統(tǒng)構建包含第一反應性氨基酸的載體多肽變體和/或包含第二反應性氨基酸的靶多肽變體。此外，構建具有非天然氨基酸的載體和/或靶多肽的其它，例如非正交方法也包括在本文的許多實施方式中。 下文進一步詳述此類方法。將非天然氨基酸盲接摻入載體多肽和/或靶多肽的非IH交方法如上所述，在本發(fā)明的不同實施方式中，可通過直接摻入方法，例如正交翻譯系統(tǒng)構建載體多肽和靶多肽或載體多肽和靶多肽變體(各自包含反應性非天然氨基酸，當與另一個中的非天然氨基酸反應時，形成穩(wěn)定的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物)。由于正交系統(tǒng)能高產(chǎn)率地產(chǎn)生正確折疊和翻譯后修飾并含位點特異性摻入的非天然氨基酸的多肽，這代表了優(yōu)選的實施方式。然而，還可采用其它策略將非天然氨基酸直接摻入多肽鏈以便將第一和第二非天然氨基酸分別引入載體多肽變體和/或靶多肽變體。應該知道，在本文的典型實施方式中，非天然氨基酸在多肽構建期間摻入載體和/或靶多肽，而不通過翻譯后化學衍生加入。例如，在一級構建期間將非天然氨基酸摻入，例如載體和/或靶多肽的一種通用體外生物合成方法利用無義或移碼抑制型tRNA，其用所需非天然氨基酸作化學酰化， 然后加入能支持蛋白質(zhì)生物合成的提取物中，該提取物包含含有所需琥珀無義突變的基因。該方法已用于將超過100種非天然氨基酸位點特異性地摻入任何大小的各種蛋白質(zhì)，可用于本文產(chǎn)生包含非天然氨基酸的載體和/或靶多肽變體。參見，例如Cornish 等.(1995) “用擴展的遺傳密碼探究蛋白質(zhì)結(jié)構和功能”(Probing Protein Structure and Function with an Expanded Genetic Code)Angew Chem Int Ed Engl 34 :621_633 ；Noren 等.(1989) “將非天然蛋白質(zhì)位點特異性摻入蛋白質(zhì)的通用方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins) ” Science 244:182-188;和Bain等.(1989) “將非天然氨基酸生物合成性位點特異性地摻入多肽 (Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide.) " JACS 111 :8013_8014。在其它實施方式中，非天然氨基酸可經(jīng)化學合成直接摻入較小的載體和/或靶多肽(60-100個氨基酸)。固相肽合成是廣泛用于化學合成含非天然氨基酸的肽和小蛋白的方法(參見如Merrifield(1963)《固相肽合成I，四肽合成》(Solid Phase Peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrap印tide) JACS 85 :2149_2154)，可改進該方法以產(chǎn)生包含非天然氨基酸的載體和/或靶多肽，其可反應以產(chǎn)生穩(wěn)定的偶聯(lián)物。該技術通常包括兩階段第一階段固相肽合成(SPPS)包括在聚合支持物上通過反復的偶聯(lián)-去保護循環(huán)，用受保護的氨基酸衍生物組裝肽鏈。固相連接肽的游離N末端胺可與一個N-保護的氨基酸單位，例如非天然氨基酸偶聯(lián)。然后將該單位去保護，暴露下一氨基酸可連接的新N-末端胺。雖然通常是通過分步方法合成肽，但可在各偶聯(lián)步驟結(jié)束時通過過濾除去和洗去肽-固體支持物基質(zhì)的所有可溶性試劑。在SPPS第二階段，將肽從支持物上切割，并移除側(cè)鏈保護基團以產(chǎn)生肽，如包含一個或多個非天然氨基酸的載體或靶多肽。 固相肽合成主要采用兩種形式Fmoc (Carpino等，(1972)《9-芴甲氧酰氨基保護基團》 (9-Fluorenylmethoxycarhonyl amino-protecting group)J Org Chem 37 :3404_3409)， 其中使用了堿不穩(wěn)定的α-氨基保護基，以及t-Boc，其中使用了酸不穩(wěn)定的α-氨基保護基。各方法涉及不同的樹脂和氨基酸側(cè)鏈保護以及后續(xù)切割/去保護步驟。肽合成的其它細節(jié)可參見以下出版物和其中引用的參考文獻Crick等.(1961) “蛋白質(zhì)的遺傳密石馬的通用性質(zhì)(General nature of the genetic code for proteins.)，，Nature 192 :1227-1232 ；Hofmann等· (1966) “多肽的研究.XXXVI.吡唑-咪唑替代對S-肽片段的 S-蛋白活化效力的影響 1_3(Studies on Polypeptides. XXXVI. The Effect of Pyrazole-Imidazole Replacements on the S—Protein Activating Potency of an S-Peptide Fragment1—3.)” JACS 88 :5914_5919 ;Kaiser 等.(1989) “包括酶在內(nèi)的生物活性月太禾口蛋白質(zhì)的合成方法(Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes.)，，Acc Chem Res 22 :47_54 ;Nakatsuka 等·(1987)“半合成酶巰基枯草桿菌蛋白酶催化的肽區(qū)段合成(Peptide segment synthesis catalyzed by the semisynthetic enzyme thiolsubtilisin.)” JACS 109 :3808_3810 ；Schnolzer 等.(1992) “通過接合未保護的合成肽主鏈-工程改造HIV蛋白酶來構建蛋白質(zhì)(Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides backbone-engineered HIV protease.)"Science 5054 221~225 ；Chaiken φ . (1981) 合成妝禾口蛋白質(zhì)(Semisynthetic peptides and proteins. )，，CRC Crit Rev Biochem 11 255-301 ；0fford(1987) “通過化學方法工程改造蛋白質(zhì)？(Protein engineering by chemical means ？ ) "Protein Eng 1 :151-157 ；和 Jackson 等.“設計肽連接酶以便全合成含非天然催化殘基的核糖核酸酶A (A designed peptide ligase for total synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues. )，，Science 5184:243-247?？捎糜谂悸?lián)載體多肽和靶多肽變體的化學偶聯(lián)反應目前用于化學偶聯(lián)靶多肽變體(例如，治療性小肽變體)與載體多肽變體的方法包括利用非特異性試劑，例如戊二醛或碳二亞胺活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯，和防止載體多肽_載體多肽或靶多肽_靶多肽偶聯(lián)物形成的高特異性異雙功能交聯(lián)劑。然而，此類試劑僅可用于化學修飾有限數(shù)量的氨基酸殘基(例如，包含胺、酮、硫醇、巰基或羧基的氨基酸)。利用這些交聯(lián)劑將載體多肽偶聯(lián)于靶多肽可擾亂載體多肽、靶多肽或得到的載體-靶多肽偶聯(lián)物的構象，因而降低偶聯(lián)物的穩(wěn)定性、生物學活性、藥代動力學活性等。利用此類交聯(lián)劑常導致載體多肽-靶多肽復合物的異質(zhì)群體產(chǎn)生，這些異質(zhì)群體難以分離，從而降低生產(chǎn)效率并使質(zhì)量控制復雜。相反，本發(fā)明偶聯(lián)物是在正交偶聯(lián)反應，例如下述任一化學連接反應中通過摻入載體多肽變體的第一非天然氨基酸(例如，利用甲基營養(yǎng)酵母菌細胞中的正交翻譯系統(tǒng)) 與摻入靶多肽變體的第二非天然氨基酸反應而產(chǎn)生。這些反應可根據(jù)合適的反應條件在體外或體內(nèi)進行。由于僅有載體和靶多肽變體上存在的非天然氨基酸參與連接反應，本發(fā)明方法能可靠地用于高效產(chǎn)生充分確定的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物的均質(zhì)群體(例如，包含相同的化學計量和確定的連接位點)。由于各種化學反應性第一和第二非天然氨基酸可任選分別摻入載體和靶多肽變體，載體_靶多肽偶聯(lián)物的產(chǎn)生不僅限于進行具體化學連接反應的那些條件，例如靶多肽變體、載體多肽變體或得到的載體-靶偶聯(lián)物可能不穩(wěn)定的條件。此外，現(xiàn)有技術有利地將非天然氨基酸摻入多肽的任何氨基酸位置。因此，載體和靶多肽中的第一和第二化學反應性非天然氨基酸位置的選擇可分別任選根據(jù)，例如載體和靶多肽變體中非天然氨基酸位置的選擇任選根據(jù)，例如置于該位置是否會改變，如載體多肽、靶多肽或所得載體-靶多肽偶聯(lián)物的構象、生物學活性、藥理學活性、穩(wěn)定性、生物利用度或其它特性。在下文詳述的一個示范性但非限制性實例中，摻入HSA的對-乙酰基苯丙氨酸可通過肟連接與摻入ABT-510的ε-(2_(氨基氧基)乙?；?_L_賴氨酸反應以產(chǎn)生血清半衰期延長的HSA-ABT-510偶聯(lián)物。應該知道以下實施例中說明的不是本發(fā)明唯一的實施方式。從本文描述應該知道各種化學連接反應可用于偶聯(lián)包含第一反應性非天然氨基酸的載體多肽與包含第二反應性非天然氨基酸的靶多肽，其中所述偶聯(lián)使第一和第二非天然氨基酸反應。在本發(fā)明的各種實施方式中，第一和第二非天然氨基酸任選通過以下反應中的一個或多個反應親電-親核反應、肟連接、酮與親核試劑反應、醛與親核試劑反應、羰基和親核試劑之間的反應、磺?；陀H核試劑之間的反應、酯化反應、位阻酯基和親核試劑之間的反應、硫酯基團和親核試劑之間的反應、穩(wěn)定的亞胺基和親核試劑之間的反應、環(huán)氧基團和親核試劑之間的反應、氮丙啶基團和親核試劑之間的反應、親電試劑和脂族胺或芳族胺之間的反應、親電試劑和酰胼之間的反應、親電試劑和碳酰胼之間的反應、親電試劑和氨基脲之間的反應、親電試劑和氨基硫脲之間的反應、親電試劑和羰基酰胼之間的反應、親電試劑和硫代羰基酰胼之間的反應、親電試劑和磺?；ｋ葜g的反應、親電試劑和卡巴胼之間的反應、親電試劑和硫卡巴胼之間的反應、親電試劑和羥胺之間的反應、親核試劑或親核試劑，例如羥基或二醇和硼酸或酯之間的反應、過渡金屬催化的反應、鈀催化的反應、銅催化的雜原子烷化反應、環(huán)加成反應、1，3環(huán)加成反應、2，3環(huán)加成反應、炔-疊氮化物反應、狄爾斯-阿德爾反應或鈴木偶聯(lián)反應。下文進一步詳述了這些反應中的一些。肟連接首先在未保護多肽的化學選擇性連接中采用肟連接以圖產(chǎn)生結(jié)構受控的分子量大于IOkD的合成大分子(Rose (1994)“同源人工蛋白質(zhì)的便利合成(Facile Synthesis of Homogenous Artifcial Proteins.) ” JACS 116:30-33)。在第一步中，制備攜帶酸基的純化多肽和攜帶氨基氧基的第二純化多肽。在第二步中，該兩種多肽在非常溫和的條件下通過形成肟鍵而自發(fā)性地自我裝配。室溫下，得到的肟在PH 2-7的水中穩(wěn)定。如以下實施例所述，通過在pH < 5，ABT-510變體中ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸殘基的氨基氧基與HSA變體中對-乙?；奖彼釟埢耐磻a(chǎn)生 HSA-ABT-510偶聯(lián)物。氨基氧基與酮基經(jīng)歷選擇性肟連接以便將ε_(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸共價連接于對_乙?；奖彼?，因而將HSA共價偶聯(lián)于ABT-510。1，3-偶極環(huán)加成反應1，3-偶極環(huán)加成也稱為“克里克(click)”化學反應，其是1，3-偶極和親偶極試劑，例如取代的烯烴以形成5-元環(huán)。1，3_偶極環(huán)加成的一個有用實例是疊氮化物_炔烴胡氏環(huán)加成(Azide-Alkyne Huisgen Cycloaddition)，例如疊氮化物和末端或內(nèi)部炔烴之間的1，3_偶極環(huán)加成得到1，2，3_三唑。該銅(I)-催化的反應是溫和而極其有效的，無需保護基團，在許多情況中無需純化(Rostovtsev等.(2002) “分步胡氏環(huán)加成過程銅 (I)-催化的疊氮化物和末端炔烴的區(qū)域選擇性連接(A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process :Copper(I)-Catalyzed Regioselective Ligation of Azides and Terminal Alkynes) ”Angew Chem Int Ed 41:2596-2599)。由于該反應涉及環(huán)加成而非親核取代， 蛋白質(zhì)修飾的選擇性極高。向反應混合物中加入催化量的Cu(I)鹽，該反應可在室溫， 水性條件下進行，區(qū)域選擇性優(yōu)秀(1，4 > 1，5)。參見，例如Tornoe等.(2002) “固相上的肽三唑區(qū)域特異性銅(i)_催化末端炔烴與疊氮化物的1，3_偶極環(huán)加成得到[1，2， 3]-三唑(Peptidotriazoles on solid phase [1, 2, 3]_triazoles by regiospecif ic copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.) ”T Org Chem 67 :3057_3064 ；和 Rostovtsev等.(2002)“分步胡氏環(huán)加成過程銅 (I)-催化的疊氮化物和末端炔烴的區(qū)域選擇性連接”Angew Chem Int Ed 41:2596-2599。 疊氮化物和炔官能團對生物學分子和水性環(huán)境具有較大惰性，從而能在偶聯(lián)，例如載體多肽與靶多肽時采用疊氮化物-炔烴胡氏環(huán)加成。三唑與自然界發(fā)現(xiàn)的常見酰胺部分具有相似性，但與酰胺不同，其對切割不敏感。此外，三唑幾乎不能氧化或還原。鈴木偶聯(lián)反應包含表面暴露的含芳基碘的非天然氨基酸的靶多肽變體(或載體多肽變體) 可通過鈀催化的鈴木偶聯(lián)共價連接于包含表面暴露的硼非天然氨基酸殘基，例如對_硼苯丙氨酸、間_硼苯丙氨酸或鄰_硼苯丙氨酸的載體多肽變體(或靶多肽變體)。為描述該化學反應，參見，例如Miyaura和Suzuki (1995) “有機硼化合物的鈀-催化交叉偶聯(lián)反應(Palladium-Catalyzed Cross-Coupling Reactions of Organoboron Compounds) ”Chemical Reviews 95 2457 和 Suzuki (1999) “有機硼衍生物與有機親電試劑的交叉偶聯(lián)反應的最新進展，1995-1998 (Recent advances in the cross-coupling reactions of organoboron derivatives with organic electrophiles, 1995-1998) ”.Tournal of OrRanometallic Chemistry 576:147。芳基碘是在有機金屬化學中有各種應用的反應性基團，包括硅烷化、氨基羰基化、Heck芳基化、乙烯化、與芳基乙炔交叉偶聯(lián)和許多其它應用。在鈴木偶聯(lián)反應中利用非天然氨基酸的其它細節(jié)見2008年10 月30日提交的美國專利申請?zhí)?2/262，025，名為“遺傳編碼的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid) ”和 2008 年 10 月 30 提交的國際申請 PCT/US2008/081868， 名為“遺傳編碼的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid)”。銅_催化的雜原子烷基化反應包含非天然氨基酸殘基的靶多肽變體或載體多肽變體可參與銅催化的雜原子烷化反應(Chan等.(2003) “銅促進C—N和C—0鍵與苯基和吡啶基硼酸交叉
偶聯(lián)(Copper promoted C---N and C---0 bond cross-coupling with phenyl and
pyridylboronates). "Tetrahedron Letters 44:3863)。不對稱還原(Huang φ (2000)“衍生自L-a-氨基酸的手性氧氮雜硼啉酮催化苯乙酮與硼烷的不對稱還原(Asymmetric reduction of acetophenone with borane catalyzed by chiral oxazaborolidinone derived from L-a-amino acids). ，，Synthetic Communications 30 :2423)、 狄爾 斯-阿德爾反應(Ishihara和Yamamoto (1999) “芳基硼化合物在有機合成轉(zhuǎn)化中作為酸催化劑(Arylboron Compounds as Acid Catalysts in Organic SyntheticTransformations). "European Journal of Organic Chemistry 3 :527-538)以及各禾中其
它轉(zhuǎn)化，其中所述非天然氨基酸包含硼酸基團。還可利用載體或靶多肽變體表面上存在的硼非天然氨基酸殘基與包含醇基團、二醇基團、氨基-醇或含二胺部分的相應靶或載體多肽變體上的非天然氨基酸殘基形成可逆硼酯。例如，硼酸與二醇形成可逆共價復合物。該化學反應的早期描述可參見Lorand和Edwards (1959) “苯硼酸離子的多元醇復合物和結(jié)構(Polyol Complexes and Structure of the Benzeneboronate Ion). " Journal of Organic Chemistry 24 769-774。還可與氨基醇(Springsteen等.^)01) “硼酸的光度傳感器的開發(fā)(The Development of Photometric Sensors for Boronic Acids) ·，，Bioorganic Chemistry 四259-270)、氨基酸(Mohler和Czarnik (1994) “芳基硼酸的α-氨基酸螯合絡合 (Alpha-Amino Acid Chelative Complexation by an Arylboronic Acid). [CA119 (17) 181171a 中引用文件的勘誤].” JACS 116 :2233 ；Mohler 和 Czarnik(1993) “芳基硼酸的 α _ 氨基酸螯合絡合(Alpha-Amino Acid Chelative Complexation by an Arylboronic Acid)” JACS 115 :7037-7038)、醇鹽(Cammidge 和 Cr6py (2004) “采用不對稱鈴木反應合成手t生聯(lián)二蔡(Synthesis of chiral binaphthalenes using the asymmetric Suzuki reaction). "Tetrahedron 60:4377—4386)禾口徑 月虧酸(hydroxamic acid) (Lamande 等.(1980) “帶有硼原子和超價磷原子的組合物的結(jié)構和酸性(Structure et acidite de composes a atome de bore et de phosphore hypercoordonnes)，，Journal of Organometallic Chemistry 329 :1-29)形成可逆復合物。在化學連接反應中利用硼氨基酸的其它細節(jié)可見2008年10月30日提交的美國專利申請?zhí)?2Λ62，025，名為“遺傳編碼的硼酸氨基酸”;2008年10月30提交的國際申請PCT/US2008/081868，名為“遺傳編碼的硼酸氨基酸”；和其中引用的參考文獻?！?+31環(huán)加成反應在某些實施方式中，包含第一非天然氨基酸的載體多肽變體可通過[2+3]環(huán)加成偶聯(lián)于包含第二非天然氨基酸的靶多肽變體。在一個實施方式中，所述第一非天然氨基酸包含炔基或疊氮基部分，所述第二非天然氨基酸包含疊氮基或炔基部分。例如，所述第一非天然氨基酸包含炔基部分(例如，在非天然氨基酸對-炔丙基氧基苯丙氨酸)，所述第二非天然氨基酸包含疊氮基部分。在另一實例中，所述第一非天然氨基酸包含疊氮基部分(例如，在非天然氨基酸對-疊氮基-L-苯丙氨酸中)，所述第二非天然氨基酸包含炔基部分。 在[2+3]環(huán)加成反應中利用非天然氨基酸描述于2004年4月4日提交的美國專利申請?zhí)?10/擬6，919，名為“非天然反應性氨基酸遺傳密碼添加(Unnatural Reactive Amino Acid Genetic Code Additions)”。親電-親核反應在一些實施方式中，摻入載體多肽變體(或靶多肽變體)的非天然氨基酸中存在的一個反應性基團是親電部分，摻入靶多肽變體(或載體多肽變體)的第二非天然氨基酸中存在的反應性基團是親核部分。本領域技術人員已知與親核部分反應形成共價鍵的合適親電部分。此類親電部分包括但不限于例如，羰基、巰基、醛基、酮基、位阻酯基、硫酯基、穩(wěn)定的亞胺基、環(huán)氧基團、氮丙啶基團等。親核和親電試劑之間的反應產(chǎn)物通常包含原始存在于，例如親核部分中的原子。
38在一些實施方式中，根據(jù)所用的親核部分和與親核部分反應的親電部分(例如，醛、酮等)， 親電試劑是與親核部分(反應)的醛或酮，包括反應產(chǎn)物，例如肟、酰胺、腙、還原的腙、碳腙 (carbohydrazone)、 ^代碳月宗(thiocarbohydrazone)、石黃酉先基月宗(sufonylhydrazone)、M 基脲、氨基硫脲或類似的官能團。與羧酸的連接通常稱為碳酰胼或羥肟酸。與磺酸連接通常稱為磺基酰胼或N-磺?；u胺。隨后可通過化學還原穩(wěn)定得到的連接鍵。本領域技術人員已知可與醛和酮反應形成共價鍵的合適親核部分。此類親核部分包括但不限于脂族胺或芳族胺，例如乙二胺。在其它實施方式中，非天然氨基酸可包含反應性基團，例如-NR1-NH2 (酰胼)、-NR1 (C = 0) NR2NH2 (氨基脲)、-NR1 (C = S) NR2NH2 (氨基硫脲)、-(C = 0) NR1NH2 (羰基酰胼)、-(C =幻NR1NH2 (硫代羰基酰胼)、-(SO2) NR1NH2 (磺?；ｋ?、-N#NR2 (C = 0) NR3NH2 (卡巴胼)、-NR1NR2 (C = S) NR3NH2 (硫代卡巴胼)、或-O-NH2 (羥胺)，其中R1、! 2和R3各自獨立為H或具有1-6個碳的烷基，優(yōu)選H。在本發(fā)明的一方面，反應性基團是酰胼、羥胺、碳酰胼或磺?；ｋ?。本發(fā)明還可采用其它反應性化學反應，包括但不限于施陶丁格連接(Maudinger ligation)和烯烴復分解化學反應(參見，例如Mahal等.(1997) “通過寡糖生物合成工程改造細胞表面的化學反應性(Engineering Chemical Reactivity on Cell Surfaces Through Oligosaccharide Biosynthesis). "Science 276:1125-1128)。許多其它偶聯(lián)化學反應也適用，可根據(jù)待摻入載體和靶多肽的非天然氨基酸而采用。本領域技術人員熟知此類反應，進一步的細節(jié)描述于，例如Dawson等.(1994) “通過天然化學連接合成蛋白質(zhì)(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation) ·，，Science 266:776-779; Lemieux等.(1998) “蛋白質(zhì)、寡糖和細胞的化學選擇性連接反應(Chemoselective ligation reactions with proteins,oligosaccharides and cells). "TIBS 16:506-513; Knipe，Chris.〈〈有機反應機制，2004》(Organic Reaction Mechanisms, 2004.)紐約Wiley， 2004 ；等等。藥物組合物及其給藥 本發(fā)明的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物任選用于治療應用，例如與合適的藥物載體組合。此類組合物包含，例如治療有效量的偶聯(lián)物和藥學上可接受的載體或賦形劑。此類載體或賦形劑包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或它們的組合。將制劑制備成適合給藥方式。給予蛋白質(zhì)的方法通常是本領域熟知的，可應用于本發(fā)明偶聯(lián)物的給予?？筛鶕?jù)本領域熟知的方法，任選在一種或多種合適的體外和/或體內(nèi)疾病動物模型中檢驗包含一種或多種本發(fā)明載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的治療性組合物以確認效力、組織代謝和/或預測劑量。具體地說，首先可通過(比較)本文非天然(蛋白)與未偶聯(lián)靶蛋白的活性、穩(wěn)定性或其它合適的手段(例如，比較載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，如HSA-TSP-I 偶聯(lián)物(或HSA-ABT-510偶聯(lián)物)與未偶聯(lián)于HSA且不含任何非天然氨基酸的TSP(或 ABT-510))來測定劑量，即，采用相關試驗。通過常規(guī)用于使分子最終接觸血液或組織細胞的任何途徑給藥?？刹捎萌魏魏线m方式給予本發(fā)明的載體-肽/靶多肽偶聯(lián)物，任選與一種或多種藥學上可接受的載體一起。 就本發(fā)明而言，有將此類偶聯(lián)物給予患者的合適方法可用，雖然可利用多種途徑給予具體的組合物，但某一特定途徑提供的作用或反應常能比另一途徑更快捷和有效。
藥學上可接受的載體部分由所給予的具體組合物以及給予該組合物所采用的具體方法決定。因此，本發(fā)明藥物組合物有各種合適的制劑。本領域熟知藥學上可接受的載體和賦形劑，可通過熟知的方法將一種或多種本發(fā)明偶聯(lián)物配制成藥物組合物(參見，例如《雷明頓藥學科學和實踐》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy), 第 21 版，A. R. Gennaro 編·，馬克出版公司(Mack Publishing Company) (2005)；《肽和蛋白質(zhì)的藥物制劑開發(fā)》(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins)，S. Frokjaer 和 L. Hovgaard 編.，Taylor & Francis (2000)；和《藥物賦形劑手冊》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第 3 版，A. Kibbe 編·，藥學出版社 (Pharmaceutical Press) (2000))?？赏ㄟ^各種途徑給予本發(fā)明的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。還可經(jīng)脂質(zhì)體給予載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。本領域技術人員通常知曉此類給藥途徑和適當?shù)闹苿?。還可將單獨的或與其它合適組分組合的本發(fā)明偶聯(lián)物制成氣溶膠制劑(即，它們可“噴霧”)以便經(jīng)吸入給藥?？蓪馊苣z制劑置于加壓的可接受推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣，等等。適合胃腸外，例如通過關節(jié)內(nèi)(關節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑給藥的制劑包括水性和非水性、等滲無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與所需受者的血液等滲的溶質(zhì)，還包括水性和非水性無菌懸液，其可含有懸浮劑、 增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。包裝核酸的制劑可存在于單劑量或多劑量的密封容器中，例如安瓿和小瓶。胃腸外給藥和靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的給藥方法。具體地說，早已用于載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物治療劑的給藥途徑以及目前使用的制劑為本發(fā)明偶聯(lián)物提供優(yōu)選的給藥途徑和制劑。就本發(fā)明而言，根據(jù)具體應用，給予患者的劑量足以在一段時間內(nèi)在患者中實現(xiàn)有益的治療反應，或者，例如抑制病原體的感染、降低或阻止疾病狀態(tài)的癥狀，或其它合適的活性。劑量取決于具體組合物/制劑的效力和所用載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的情況以及待治療患者的體重或表面積。劑量的大小還取決于特定患者中給予具體組合物/制劑相伴的任何不利副作用是否存在、其性質(zhì)和程度，等等。確定待給予組合物/制劑的疾病(例如，癌癥、遺傳疾病、糖尿病、AIDS等)治療或預防有效量時，醫(yī)師評估循環(huán)血漿水平、制劑毒性、疾病的進展和/或抗非天然氨基酸多肽抗體的產(chǎn)生，如果相關的話。給予，例如70公斤患者的劑量范圍通常與目前采用的治療性蛋白質(zhì)的劑量相等， 并為相關載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的改變活性或血清半衰期作調(diào)整。本發(fā)明的組合物/制劑可通過任何已知的常規(guī)治療補充治療條件，包括給予抗體、給予疫苗、給予細胞毒性劑、 天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物學應答修飾劑等。對于給藥，本發(fā)明偶聯(lián)物制劑的給藥速度由相關制劑的LD-50和/或觀察到在各種濃度下(例如適用于患者的體重和總體健康)載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的任何副作用決定?？赏ㄟ^一次劑量或分份劑量實現(xiàn)給藥。制備可給予組合物的通用方法是本領域技術人員已知的，詳述于，例如《雷明頓藥學科學和實踐》，第21版，A. R. Gennaro編.，馬克出版
40公司0005)。如果輸注包含本發(fā)明一種或多種偶聯(lián)物的制劑的患者產(chǎn)生發(fā)熱、寒顫或肌肉疼痛，他/她接受合適劑量的阿司匹林、布洛芬、對乙酰氨基酚或其它鎮(zhèn)痛/退燒藥物。經(jīng)歷輸注反應，例如發(fā)熱、肌肉疼痛和寒顫的患者在將來的輸注之前30分鐘用阿司匹林、對乙酰氨基酚，或者，例如苯海拉明預先給藥。哌替啶用于對退熱藥和抗組胺不快速起反應的更嚴重寒顫和肌肉疼痛。根據(jù)反應的嚴重程度減緩或停止治療。各種對象受益于本發(fā)明提供的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物所提供的治療性治療和/ 或預防性治療?？山o予人和此類動物，包括但不限于家畜，如牛、豬、山羊、綿羊、雞和/或其它一般農(nóng)業(yè)動物包含本文所述偶聯(lián)物的組合物和制劑。一般的家養(yǎng)寵物，如貓、狗、鸚鵡、 長尾鸚鵡也受益于給予治療性或預防性載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。關于生物醫(yī)學測試和獸醫(yī)治療中應用動物模型和動物對象的更多細節(jié)見，例如 Ng，Chow和Ogden編《在生物醫(yī)學研究中使用動物研究者入門》⑴sing Animal Models in Biomedical Research :A Primer for the Investigator)，第一版，新加坡，世界科學出版公司，2008 (Singapore =World Scientific Publishing Company, 2008) ；Conn編《生物醫(yī)學研究模型原始資料》(Sourcebook of Models for Biomedical Research.)斯普林格出版公司，新澤西州托托瓦(Totowa，NJ Springer)，2008 ；Woodhead編，《生物醫(yī)學研究中的非哺乳動物模型(第一卷)》(Nonmammalian Animal Models for Biomedical Research (Vol 1))，紐約科學出版社，1990 (New York =Academic Press，1990)。還參見Adams等，《獸醫(yī)藥 里學禾口治療，第7V片反》(Veterinary Pharmacology and Therapeutics. Eighth Edition)，美國韋理-布萊克維爾(USA =Wiley-Blackwell)，2001 ；Kahn和Line編·《默克獸醫(yī)手冊 第九版》(Merck Veterinary Manual. Ninth Edition)，美國默克(USA =Merck), 2005 ;R 其所引文獻。本發(fā)明提供的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物不僅可給予以治療對象，如人中的疾病狀態(tài)，還可以進行療效測試，以及代謝測試，毒理學測試和具體測試以確定載體肽-靶多肽偶聯(lián)物對生殖功能的影響或胚胎毒性，或確定其致癌潛能。進行這些觀察性研究能將本發(fā)明偶聯(lián)物給予各種動物對象。本領域技術人員非常熟悉多種醫(yī)學測試和測量，從而有助于選擇給予包含本發(fā)明偶聯(lián)物的組合物/制劑的動物對象。此類動物對象包括但不限于；如哺乳動物，如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬、倉鼠、非人靈長類(猴，包括獼猴、狒狒、舊大陸猴和黑猩猩)、豚鼠、大鼠、小鼠和/或貓。鳥類，如家禽(雞、火雞)、澳洲鸚鵡、鸚鵡目的鳥和籠養(yǎng)鳥和/或鳥舍鳥，以及鳥類胚胎，也可用于本發(fā)明提供的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的研究和開發(fā)，生產(chǎn)，質(zhì)控或安全性測試。魚類，如斑馬魚、新月魚和劍尾魚；兩棲類，包括如青蛙、蠑螈；和爬行類(蛇，蜥蜴和龜)也可以用于各種測試以確定本文所述組合物和/或其給藥方法的安全性，有效劑量和/或毒理學特性。參見，例如Barry等0()0 ，《爬行動物、兩棲動物、魚類和頭足類生物醫(yī)學研究的應用的信息資源》information Resources for Reptiles,Amphibians,Fish, and Cephalopods Used in Biomedical Research)，美國農(nóng)業(yè)部國家農(nóng)業(yè)圖書館動物福利信息中心(United States Department of Agriculture National Agricultural Library Animal Welfare Information Center),及其所弓|文獻。試劑盒和廠商文件
試劑盒也是本發(fā)明的一個特征。例如，試劑盒可任選裝有本發(fā)明提供的任一或多種載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物?；蛘?，試劑盒可裝有合成包含第一化學反應性非天然氨基酸的載體多肽變體和/或包含第二化學反應性非天然氨基酸的靶多肽變體，例如治療性小肽的試劑。此類試劑可包括，例如反應性非天然氨基酸，包含適合產(chǎn)生含非天然氨基酸的載體多肽和/或靶多肽變體的正交翻譯系統(tǒng)組分的宿主細胞，例如甲基營養(yǎng)酵母菌細胞，進行連接反應以產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的溶液，產(chǎn)生包含一種或多種本發(fā)明偶聯(lián)物的治療制劑的試劑，培養(yǎng)基，等等。本發(fā)明試劑盒可裝有其它組分，例如指導以下應用的使用說明書，構建表達包含非天然氨基酸的載體多肽和/或靶多肽的甲基營養(yǎng)酵母菌株，進行化學連接反應以產(chǎn)生載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，等等。試劑盒可裝有容納試劑盒組分的容器，實施本文的任何方法或任何方法組合的使用說明材料，利用試劑盒提供的細胞(例如，甲基營養(yǎng)酵母細胞)產(chǎn)生在所選氨基酸位置包含化學反應性非天然氨基酸的感興趣載體和/或靶多肽的使用說明書。
實施例提供以下實施例是為說明而非限制本發(fā)明。應理解，本文所述的實施方式只是為了說明，本領域技術人員應了解據(jù)此作出的各種改進或改變，它們包括在本申請的構思和范圍以及所附權利要求書的范圍內(nèi)。擴展甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母的遺傳庫為增加含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)誘變的應用，在甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中開發(fā)了重組表達系統(tǒng)。將以前在釀酒酵母中開發(fā)的非天然氨基酸特異性氨?；?tRNA合成酶/抑制型tRNAfeaRS/tRNA-)配對插入真核轉(zhuǎn)錄控制元件之間并穩(wěn)定地摻入巴斯德畢赤酵母基因組。大腸桿菌酪氨酰-和亮氨酰_RS/tRNA。UA配對均顯示在巴斯德畢赤酵母中正交，二者用于對琥珀密碼子起反應而高產(chǎn)率和保真度地摻入8種非天然氨基酸。一個實例顯示包含酮氨基酸(對-乙?；奖彼?(圖6b，結(jié)構1)的重組人血清白蛋白突變體可在該系統(tǒng)內(nèi)有效表達，并通過肟連接選擇性偶聯(lián)于含ε- -(氨基氧基)乙?；?_L-賴氨酸殘基的治療性肽模擬物。此外，通過調(diào)控aaRS水平系統(tǒng)性優(yōu)化甲基營養(yǎng)酵母菌中的非天然氨基酸表達，從而在搖瓶中表達突變型人血清白蛋白超過150mg/L，比釀酒酵母中報道的高一個數(shù)量級。該方法應能高產(chǎn)率地產(chǎn)生含非天然氨基酸的復雜蛋白質(zhì)，其表達在現(xiàn)有系統(tǒng)中不現(xiàn)實。最近開發(fā)的方法能在原核和真核生物中遺傳編碼具有新特性的各種非天然氨基酸(包括熒光團、金屬離子螯合劑、光束縛和光交聯(lián)基團、NMR、結(jié)晶和頂探針及翻譯后修飾的氨基酸)(Xie*khultz(2006) “蛋白質(zhì)的化學工具包一擴展的遺傳密碼(A chemical toolkit for proteins—an expanded genetic code). " Nat Rev Mol Cell Biol 7: 775-782 ;Chin 等.Q003) “擴展的真核遺傳密碼(An expanded eukaryotic genetic code).，，Science 301 :964-967 ；Wang 等· (2006) “擴展遺傳密碼(Expanding the genetic code). "Annu Rev Biophys Biomol Struct ；35 :225-249)。通過開發(fā)正交氨?；?tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNA。UA)配對實現(xiàn)這點，該配對設計成對無義或移框密碼子起反應而選擇性插入所需非天然氨基酸。迄今為止，該方法已用于將超過40種非天然氨基酸加入大腸桿菌、釀酒酵母和幾種哺乳動物細胞譜系的遺傳庫(Chin等.(2003)“擴展的真核遺傳密碼”Science 301 :964-967 ；Wang 等.Q006) “擴展遺傳密碼”Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 :225-249 ;Liu等.Q007) “在哺乳動物細胞中將非天然氨基酸遺傳摻入的蛋白質(zhì)(Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells). "Nat Methods 4 :239-244)。通過將正交aaRS/tRNACUA配對及不同tRNA身份元件移植入宿主生物體來實現(xiàn)這些系統(tǒng)的正交性，從而宿主氨?；瘷C器與植入的aaRS/tRNA配對之間不發(fā)生交叉氨?；?但仍維持翻譯功能)。在目前的系統(tǒng)中，已經(jīng)證明在大腸桿菌中利用衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰_RS/tRNAeuA配對的aaRS/tRNAeuA配對(Wang等.Q001) “產(chǎn) IE tRNA ^ fflffl Tj (A general approach for the generation of orthogonal tRNAs). ”Chem Biol 8 :883-890)和在釀酒酵母(Chin等.(2003)“擴展的真核遺傳密碼(An expanded eukaryotic genetic code). ”Science 301 :964-967 ；Chin 等.(2003) “擴展的貞核i^l專密石馬白勺進展(Progress toward an expanded eukaryotic genetic code. ) "Chem Biol 10 :511-519)或哺乳動物細胞(Liu等.(2007)“在哺乳動物細胞中將非天然氨基酸遺傳摻入的蛋白質(zhì)."Nat Methods 4:239-244)中的大腸桿菌酪氨酰-或亮氨酰-RS/tRNACUA 配對最成功。然后采用定向進化改變正交aaRS的特異性，從而其能識別感興趣的非天然氨基酸而非內(nèi)源性氨基酸。 為將該方法應用于產(chǎn)生細菌宿主中不易表達的大量蛋白質(zhì)，需要成本低、可擴展并能產(chǎn)生復雜的、翻譯后修飾蛋白質(zhì)的重組系統(tǒng)。一種此類宿主是巴斯德畢赤酵母， 其能產(chǎn)生哺乳動物蛋白，而其產(chǎn)率與大腸桿菌的相當(Cereghino等.Q000) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中的異源蛋白質(zhì)表達(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris). " FEMS Microbiol Rev 24:45-66)。治療性蛋白，例如腫瘤壞死因子(TNF)、破傷風毒素片段C(TTC)和人血清白蛋白(HSA) 在高密度發(fā)酵中的表達水平> IOg Γ1 (Shekhar (2008) “畢赤酵母的能力印度生物技術工業(yè)讓非常規(guī)的酵母菌工作(Pichia power Jndia' s biotech industry puts unconventional yeast to work). " Chem Biol 15 :201-202 ；Clare φ . (1991) 多個串聯(lián)整合基因的巴斯德畢赤酵母菌株中高水平表達破傷風毒素片段C(High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene).，，Biotechnology (紐約)9 :455-460 ； Ohya等.000 “通過反復分批補料發(fā)酵在甲基營養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母中優(yōu)化人血清白蛋白產(chǎn)生(Optimization of human serum albumin production in methylotrophic yeast Pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation). "Biotechnol Bioeng 90 :876-887 ;Sreekrishna等.(1989) “在甲基營養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母中合成的重組人腫瘤壞死因子的高水平表達、純化和表征(High-level expression，purification， and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia pastoris) ·，，Biochemistry 28:4117-4125)。巴斯德畢赤酵母以此類產(chǎn)率產(chǎn)生蛋白質(zhì)的能力歸因于其醇氧化酶1啟動子(ρωχι)，其是已知最高度調(diào)節(jié)和最強的啟動子(Cos等.Q006) “不同啟動子下在甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中異源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的操控策略、監(jiān)測和控制綜述(Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters -.a review). " Microb Cell Fact5:17)。此外，巴斯德畢赤酵母缺乏可污染大腸桿菌中表達的治療性蛋白的內(nèi)毒素，還不會像釀酒酵母那樣產(chǎn)生抗原性al，3聚糖連接鍵(Cregg等.(199 “在巴斯德畢赤酵母中表達夕卜來基因的最新進展(Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris). ”Biotechnology (紐約)11 :905-910)。另外，現(xiàn)在能調(diào)節(jié)巴斯德畢赤酵母中的糖基化模式，包括控制唾液酸化(Li等.Q006) “在糖基工程改造巴斯德畢赤酵母中優(yōu)化人源化 IgG (Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris). ” Nat Biotechnol 24 :210-215) 0出于這些原因，我們開發(fā)了在巴斯德畢赤酵母中遺傳編碼非天然氨基酸的方法。我們在此報道了八種非天然氨基酸位點特異性地引入在該宿主中高產(chǎn)率和保真度地表達的重組人血清白蛋白(rHSA)。材料用于進行本文所述實驗的DNA引物(例如，表1和下文所列那些)購自加利福尼亞州圣迭戈的整合DNA技術公司(Integrated DNA Technology, San Diego, CA)。用于制備下述構建物的限制性酶購自馬薩諸塞州貝弗利的新英格蘭實驗室(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ) 。 pPIC3.5ki^# ( ^Sie JAL http://tools, invitrogen. com/content/sfs/ manuals/ppic3. 5kpao_man.pdf)和酵母菌感受態(tài)、轉(zhuǎn)化方案和培養(yǎng)基處方購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司anvitrogen，Carload，CA)。多拷貝畢赤酵母表達試劑盒F型手冊(Invitrogen Life,Τ. ,Vol. K1750-01,Edn. F 85(英杰生命技術公司(Invitrogen Life Technologies)，卡爾斯巴德，加利福尼亞州 92008 ；2005))見 http//tools, invitrogen. com/content/sfs/manuals/pichmulti_man. pdf。DNA在大腸桿菌DH10B (英杰公司)中擴增或者利用鉬Pfx(英杰公司)通過PCR擴增。rHSA基因(登錄號BC034023)獲自馬里蘭州貝塞斯達國立衛(wèi)生研究院的哺乳動物基因保藏所(Mammalian Gene Collection,National Institutes of Health, Bethesda, MD)。DNA測序確認所有DNA構建物(諾華研究基金會基因組研究院(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation),拉霍亞，力口利福尼亞州)。雙重營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母菌株，GS200(his4，arg4)和pBLARG載體由加利福尼亞州克萊爾蒙特科克研究院的詹姆斯克萊格實驗室(James Cregg laboratory at the Keck Graduate Institute,Claremont,CA)饋贈。利用紐約州羅切斯特費氏科學公司 (Fisher Scientific, Rochester, NY)的2和Imm電穿孔小杯對加利福尼亞州赫拉克勒斯 BR公司(Bio-Rad，Hercules，CA)的GenePulser Xcell進行巴斯德畢赤酵母和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。用于蛋白質(zhì)分析的Tris-甘氨酸(4-20% ) SDS-PAGE凝膠購自英杰公司。通過英杰公司的Purelink miRNA分離試劑盒或得克薩斯州奧斯汀安比昂公司(Ambion，Austin，TX) 的Ribo-純-酵母試劑盒隨附的技術方案和試劑收集RNA。利用加利福尼亞州圣何塞Adobe 公司(Adobe，San Jose, CA)的Photoshop CS2測定所有反應性凝膠條帶密度。設計兩種基因盒表達系統(tǒng)由于自主復制質(zhì)粒在巴斯德畢赤酵母中相對不穩(wěn)定(Higgins等.(1998)“巴斯德畢赤酵母介紹(Introduction to Pichia pastoris.) ”Methods Mol Biol 103:1-15)，設計了一種系統(tǒng)，其中感興趣的靶基因(例如，rHSA)和aaRS/tRNAeuA配對在兩個不同質(zhì)粒的盒中編碼并穩(wěn)定整合入基因組。圖1提供用于構建巴斯德畢赤酵母中琥珀型抑制的盒的載體。白色箭頭標明各質(zhì)粒的可選擇標記物。黑色箭頭標明復制起點。豎直條紋箭頭標明啟動子和轉(zhuǎn)錄終止元件。雙重營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母菌株GS200(arg4，his4)用作蛋白質(zhì)表達的宿主菌株，感興趣的基因，例如HSA摻入商品化購得的pPIC3. 5k質(zhì)粒(HIS4，GenK) (圖 la) (Invitrogen Life, Τ.，Vol. K1750_01，Edn. F 85 (英杰生命技術公司，卡爾斯巴德， 加利福尼亞州92008 ；2005))。rHSA因其在產(chǎn)生增強短命治療性多肽的血清半衰期的融合蛋白或肽生物偶聯(lián)物中的應用而用作模型蛋白(Kim等.Q003) “胰高血糖素-樣肽1-白蛋白偶聯(lián)物的開發(fā)和表征體內(nèi)活化胰高血糖素-樣肽1受體的能力(Development and characterization of a glucagon-1ike peptide 1-albumin conjugate :the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo) ·，，Diabetes 52 :751-759 ；Huang 等.Q008) “巴斯德畢赤酵母中表達的新型艾賽那肽-4人血清白蛋白融合蛋白的制備禾口表征(Preparation and characterization of a novel exendin-4 human serum albumin fusion protein expressed in Pichia pastoris) ·，，J Pept Sci 14:588-595; Chimng等.Q002) “利用重組人血清白蛋白的藥學方案(Pharmaceutical strategies utilizing recombinant human serum albumin) ·，，Pharm Res 19:569-577)。rHSA 因為復雜的蛋白質(zhì)二硫鍵而不能在大腸桿菌和釀酒酵母中表達。然而，能在巴斯德畢赤酵母中進行此類翻譯后修飾。此外，HSAWM氨基酸的哺乳動物“前-原(pre-pro)”前導序列(圖Ie)與在巴斯德畢赤酵母中表達完全相容并能將成熟的蛋白質(zhì)運送入培養(yǎng)基 (Kobayashi (2006) “重組人血清白蛋白開發(fā)綜述(Summary of recombinant human serum albumin development). "Biologicals 34 =55-59) 前-原前導肽在運輸期間切割以產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)(例如，rHSAE37X)。相對于SEQ ID NO :1，rHSA中第37個殘基表示對琥珀密碼子起反應而摻入的非天然氨基酸。首先制備編碼能用于轉(zhuǎn)化GS200的rHSAg^s和rHSAEOT(的序列組件。制備以下 PPIC3. ^(-rHSA(野生型rHSA)構建物野生型rHSA基因得自哺乳動物基因保藏所(NIH)， 基因登錄號 BC034023。為與 pPIC3. 5k 線性化(Invitrogen Life,Τ. ,Vol. K1750-01,Edn. F 85(英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州92008 ；2005))相容，通過改進的斯特拉塔基因公司快變誘變(Quik Change mutagenesis, Stratagene)方案(Zheng 等.Q004)“有效的一步位點定向和位點飽和誘變方案(An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol) ·，，Nucleic Acids Res 32 :ell5),利用以下弓| 物(IDT)除去rHSA的BglII位點以產(chǎn)生rHSA野生型用于BglII781的-BglII 1F，5，_GAC AGA CCT TAC CAA AGT CCA CAC GGA ATG CTG CCA TG—3’ 和-BglII 1R，5，-GGT AAG GTC TGT CAC TAA CTT GGA AAC TTC TGC AAA CTC AGC TTT GGG-3，，和用于 BglII817 的 BglII 2F，5，-CAT GGA GAC CTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG G-3，和-BglII 2R，5，-CAA GCA GGT CTC CAT GGC AGC ATT CCG TGT GGA C_3，。利用以下引物擴增 rHSA野生型HSA 正向，5，-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC-3， 和 HSA 反向，5，-GCT AAC GAA TTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C—3，， 用EcoRI和BamHI (NEB)消化，連接入類似消化的pPIC3. 5k載體(英杰公司，載體圖譜見 http//tools, invitrogen. com/content/sfs/manuals/ppic3. 5kpao man, pdf)以產(chǎn)生 PPIC3. 5k-rHSA野生a (或pPIC3. 5k_rHSAE37X，如下所述)。通過DNA測序驗證構建物，在大腸桿菌DH10B (英杰公司)中擴增。通過PCR誘變產(chǎn)生Glu37TAG突變型rHSA(rHSAE37X)構建物。采用改進的快變誘變方案和以下引物用琥珀型密碼子TAG替代Glu37密碼子Glu37F，，5，-GAT TGC CTT TGC TCA GTA TCT TCA GCA GTG TCC ATT TTA GGA TCA T-3，和 Glu37 R，，5，-GTT TTT GCA AAT TCA GTT ACT TCA TTC ACT AAT TTT ACA TGA TCC TAA AAT GG-3，。Glu37 處于溶液可接近的螺旋中，如此應有助于肽與引入該位點的化學反應性非天然氨基酸(即，對-乙?；奖彼?，圖6b，結(jié)構1)偶聯(lián)，并確保較大基團的摻入對天然蛋白質(zhì)結(jié)構和折疊的破壞盡量低。然后利用以下引物擴增rHSAE37X:HSA正向，5，-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC-3，禾口 HSA 反向，5’ -GCT AAC GAA TTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C—3，，用 EcoRI 禾Π BamHI (NEB)消化并連接入類似消化的pPIC3. 5k載體，如以上HSAltta所述，從而將HSArara置于AOXl啟動子和終止子的轉(zhuǎn)錄控制下。如上所述，通過DNA測序驗證rHSAE37X構建物，pPIC3. 5k-rHSAE37Xo在5，A0X1啟動子線性化pPIC3. 51^把4^7)(或？？比3. 5k_rHSA野生型能基因組整合一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)化盒；通常多個拷貝導致靶蛋白的總產(chǎn)率較高(Buckholz等.(1991)“商 mit^r^M^^^W^M^t (Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins). "Biotechnology (N Y) 9 :1067-1072)。以此方式整合使得 AOXl 完整，從而保留酵母快速利用甲醇的能力(Mut+表型)?；蛘?，可對AOXl基因任一側(cè)作線性化進行基因替代，從而由 PPIC3. 5k 載體(Invitrogen Life, Τ. , Vol. Κ1750-01, Edn. F 85 (英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州92008 ；2005))替代AOXl基因。缺乏AOXl的酵母利用甲醇依賴較弱的A0X2基因，它們的表型是Hiuts。由于通常利用Hiuts酵母進行rHSA表達(Kupcsulik等.(2005)“通過產(chǎn)生HSA的巴斯德畢赤酵母Mut^菌株的統(tǒng)計學和正常動力學模型描述來優(yōu)化特定產(chǎn)物形成速率(Optimization of specific product formation rate by statistical and formal kinetic model descriptions of an HSA producing Pichia pastoris Mut (S) strain). " Chem Biochem Eng Q 19 :99-108), pPIC3. 5k HSAe37x 和pPIC3. 5k-rHSA野生s經(jīng)線性化并用于替代AOXl基因以產(chǎn)生GS200_rHSAE37X或GS200_rHSA
(兩種菌株均是HIS4，arg4, GenE, muts)。成功的轉(zhuǎn)化體在缺乏組氨酸的極限培養(yǎng)基平板和含有最多0. 25mg/ml氨基糖苷類抗生素Geneticin 的富集培養(yǎng)基平板上正常生長。為用pPIC3. 5k HSAe37x 或 pPIC3. 5k_rHSA野生型序列組件轉(zhuǎn)化 GS200，用 BglII (NEB) 線性化20 μ g pPIC3. 5k-rHSAE37X或pPIC3. 5k_rHSA野生a，通過乙醇沉淀濃縮至10 μ 1，在 2mm電穿孔小杯(費氏公司(Fisher))中加入80 μ 1新鮮的感受態(tài)GS200，用GenePulser hell (BR公司)以巴斯德畢赤酵母設置(2000ν，25μΡ，200Ω)作電穿孔。用Iml冷的IM 山梨醇回收細胞。將250 μ 1回收的細胞接種在補加了 ^ig Hir1L-精氨酸(arg)的再生右旋糖Bacto瓊脂(RDB)平板(15cm)上，30°C溫育。3天后，將菌落挑入含Iml酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培養(yǎng)基的96孔2ml板塊(Nunc)，生長過夜2 °C，300r. p. m.)。培養(yǎng)液作 1 1000稀釋，將1-2 μ 1等份試樣接種于含有0. 25mg ml—1 Geneticin (英杰公司)的 YPD瓊脂板，30°C溫育。4天后，GS200-rHSAE37X轉(zhuǎn)化體G3顯示生長良好，挑取并制成感受態(tài)。 還挑取顯示生長良好的GSZOO-rHSAg^^克隆。為將正交aaRS/tRNACUA配對是否整合入基因組，改進以前為優(yōu)化釀酒酵母中琥珀型抑制和重組過表達而開發(fā)的載體(Chen等.Q007) “在釀酒酵母中產(chǎn)生和分析含非天然氨基酸的突變型蛋白質(zhì)的改進系統(tǒng)(An improved systemfor the generation and analysis of mutant proteins containing unnatural amino acids in Saccharomyces cerevisiae) · ” J Mol Biol 371 :112-122)(圖 lb)。將以前在釀酒酵母中開發(fā)的對-乙?；奖彼醎(pApa，圖6b，結(jié)構1)特異性氨?；?tRNA合成酶(pApaRS) Ghang等.Q003) “蛋白質(zhì)的體內(nèi)位點特異性修飾的新方案(A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo) ·，，Biochemistry 42， 6735-6746)插入醇脫氫酶1啟動子(Padhi)和含His6-標簽的終止子(Tadhi)之間以檢驗其表達。為制備aaRS/tRNA·配對以供整合入巴斯德畢赤酵母基因組，用以下引物通過 PCR 擴增含有 pApaRS 的pPRl-PPG幻+35 //Μ- ΙΝΑ『υΑ載體(Chen 等.Q007) “在釀酒酵母中產(chǎn)生和分析含非天然氨基酸的突變型蛋白質(zhì)的改進系統(tǒng)”J Mol Biol 371 =112-122), 從而排除了 TRP和2μ起點區(qū)，加入限制性位點KpnI和HindIII :pESC F, 5'-TAC CAC TAG AAG CTT GGA GAA AAT ACC GCA TCA GGA AAT TGT AAA CGT—3，和 pESC R，5，-GTG AGG GCA GGT ACC GTT CTG TAA AAA TGC AGC TCA GAT TCT TTG TTT G_3，，用 HindIII 和KpnI (NEB) 消化。用以下引物擴增PBLARG (加利福尼亞州克萊爾蒙特科克研究院的詹姆斯克萊格實驗室饋贈)的ARG4編碼區(qū) 41 4卩新，5，-六狀 TAT GGT ACC TGC CCT CAC GGT GGT TAC GGT-3， 和 ARG4 R 新，5’ -CAT TTC AAG CTT CTA GTG GTA GGA ATT CTG TAC CGG TTT AC-3，，用 KpnI和HindIII消化，連接入類似消化的pPRl-PpG/a+35T/P4-tRNA『UA PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生重組真核ARG4載體，pREAV-PADH1-pApaRS。利用以下引物通過PCR擴增pREAV-P^-pApaRS， 從而排除了 PADH1_pApaRS-TADH1 區(qū)域，加入限制性位點 AscI 和 AflII :pESC-A0X-KET0 (酮)F， 5' -ATC GTA CTT AAG GAA AGC GTA CTC AAA CAG ACA ACC ATT TCC-3'禾P pESC-AOX-KETO R，5，-TTC TCA GGC GCG CCA TCG CCC TTC CCA ACA GTT GCG-3，。通過尺寸作圖和測序驗證構建物。將缺乏5’ CCA的相關大腸桿菌IRNA^a作為三串聯(lián)重復插入磷酸甘油酸酯激酶
1啟動子(Ppffil)之后。如前所述(Chen等.Q007) “在釀酒酵母中產(chǎn)生和分析含非天然氨基酸的突變型蛋白質(zhì)的改進系統(tǒng)” J Mol Biol 371 :112-122)，為促進轉(zhuǎn)錄后加工，tRNA側(cè)接酵母抑制型tRNA基因，SUP4的區(qū)域。真核下游加工加入tRNA功能所需的5’ CCA。精氨基琥珀酸裂合酶(ARG4)編碼區(qū)替代起點和磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸異構酶(TRP)標記得到重組真核ARG4載體(pREAV-P-i-pApaRS) (圖lc)。該盒的擴增僅在基因組摻入下可能，因為其缺乏復制的真核起點。采用上述方案，利用感受態(tài)G3(例如，感受態(tài)GS200-rHSAE37X轉(zhuǎn)化體)作轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生GS200_rHSAE37X/ pREAV-P^rpApaRS,除了將回收的細胞接種在缺乏L-組氨酸和精氨酸的RDB平板上。3天后，將菌落挑入96孔2ml板塊，如上所述再篩選對0.25mg mPGeneticin 的耐受性。以相同方式產(chǎn)生 GS200-rHSA 野生a /pREAVPadhi-pApaRS (HIS4, ARG4，GenE，muts)以分離菌落 F2。因此，在ARG4編碼區(qū)線性化PREAV-Padhi-pApaRS，隨后轉(zhuǎn)化入GS200_HSAE37X和GS200-HSA野生型分別得到完全原養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母GSZOO-HSA./pREAV-P·-pApaRS和GSZOO-HSAltta /pREAV-P^rpApaRS 菌株。(兩種菌株均是 HIS4，ARG4, GenE, muts)。巴斯德畢赤酵母的琥珀型抑制所有蛋白質(zhì)表達實驗遵循多拷貝畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen Life,T.，Vol.K1750-01, Edn. F 85 (英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州92008 ； 2005))中的 muts 方案。從含有 0. 25mg πιΓ1 Geneticin 的平板挑取 GS200_rHSAE37X/ pREAV-P^m-pApaRS 或 GS200-rHSA野麵/pREAV-PADH1-pApaRS 的 14 個克隆，在 IOml 緩沖甘油復合培養(yǎng)基(BMGY) (29. 2°C,300r. p. m.)中生長至接近飽和(OD600 ^ 12-18)。1500g(10 分鐘)離心培養(yǎng)液，重懸在含2mM pApa氨基酸的2ml緩沖甲醇復合培養(yǎng)基(BMMY)(伊利諾斯州德斯·普雷恩城SC公司(SynChem, Des Plaines, IL))。繼續(xù)生長6天，每24小時補充甲醇至0.5%。每M小時加入200 μ 1(10%培養(yǎng)體積)培養(yǎng)基或無菌水以彌補蒸發(fā)。每對小時取出50 μ 1培養(yǎng)基，通過3000g離心(5分鐘)沉淀細胞。將25 μ 1澄清的培養(yǎng)基加入 12. 5 μ 1 SDS加樣緩沖液，95°C加熱1分鐘，用SDS-PAGE凝膠(英杰公司)作電泳(150V 1 小時)。琥珀型抑制僅發(fā)生在用甲醇和pApa氨基酸(pApa AA)培養(yǎng)的含載體酵母中。在甲醇誘導條件下生長2-3天后，通過考馬斯染色(40%甲醇，10%乙酸，50%水， 0.1% (w/v)考馬斯亮藍R250(SA公司(Sigma-Aldrich)))在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)凝膠上觀察到從GS2OO-HSA野生a /pREAV-P^-pApaRS分離的克隆產(chǎn)生全長rHSAWT(66.5kDa)。6天后rHSA野生a的表達出現(xiàn)峰值。GS200-rHSA野生型/ pREAV-P^rpApaRS的克隆F2_wt顯示表達最高，其用于進一步比較。相反，當用甲醇作為主要碳源并添加了 pApa氨基酸培養(yǎng)6天后，GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆未能產(chǎn)生全長rHSAE37pApa。參見，例如圖2b ；泳道2是GS200 ；泳道3是GS200_HSAE37X ；泳道4 是 GS200-pREAV-PAQX1-pApaRS ；泳道 5-7 是 GS200-HSAE37X/pREAV_PAQX1-pApaRS ；和泳道 8 是 GS200-HSA 野生型 /pREAV-P^Hi-pApaRS。通過基因組PCR驗證所有構建物的基因組整合(圖7 ；從一次轉(zhuǎn)化選擇4個克隆并標記為 1-4)。預計的 PCR 產(chǎn)物是 rHSA(1851bp)、pApaRS (1317bp)和 tRNA 盒(IlOObp)。 克隆2中缺乏pApaRA擴增可能是技術假象。圖加的下部凝膠描述了為檢驗釀酒酵母 +pPRl-PPGK1-3SUP4-tRNA (泳道 1)和巴斯德畢赤酵母 +pREAV_PADH1-pApaRS (泳道 2)中 tRNACUA 表達而進行的northern印跡結(jié)果。對于陰性對照，泳道3和4是分別是缺乏載體的釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母菌株。圖加的上部凝膠顯示了內(nèi)源性絲氨酸t(yī)RNA的northern印跡， 說明所有樣品中相等的miRNA制備。簡言之，如下所示進行northern印跡以驗證tRNAeuA的轉(zhuǎn)錄在各自的表達條件下培養(yǎng)兩個巴斯德畢赤酵母克隆，G3-2和GS200及兩個釀酒酵母克隆， SCY4-pPRl-PPGK1+2SUP4-tRNA 和 SCY4，收獲微小 RNA (miRNA)。將各樣品的 2 μ g RNA 加載到兩份6% Novex TBE-尿素凝膠(英杰公司)上，180V下電泳1小時。利用)(Cell surelock mini-cell (英杰公司)、0.切TBE緩沖液(英杰公司)和隨附的方案將RNA轉(zhuǎn)移至Biodyne B尼龍膜(帕爾生命科學公司(Pall Life Science))。膜與UV Stratalinker 2400 (加利福尼亞州拉霍亞斯特拉塔基因公司)自發(fā)交聯(lián)。用伊利諾斯州洛克福特皮爾斯公司 (Pierce, Rockford, IL)的North2South化學發(fā)光雜交和檢測試劑盒的方案和試劑進行雜交和檢測。一條印跡與tRNASCT的特異性生物素化探針溫育；tRNAser cere 1，5’-/5Biosg/ CAT TTC MG ACT GTC GCC TTA ACC ACT CGG CCA T_3，，tRNAser cere 2，5，-/5Biosg/GAA CCA GCG CGG GCA GAG CCC AAC ACA TTT CAA G_3，，tRNAser pich 1，5，-/5Biosg/CTG CAT CCT TCG CCT TAA CCA CTC GGC CAT CGT A_3，，tRNAser pich 2，5，-/5Biosg/ACA CGA GCAGGG TTC GAA CCT GCG CGG GCA GAG C-3’，第二條印跡與tRNAg^W特異性生物素化探針溫育tRNA 5，biot，5，-/5Biosg/GGA AGG ATT CGA ACC TTC GAA GTC GAT GAC GG-3’ and tRNA 3，biot，5，_/5Biosg/TCT GCT CCC TTT GGC CGC TCG GGA ACC CCA CC-3，。探針在 55°C溫育過夜，與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物結(jié)合，用魯米諾/增強劑-穩(wěn)定的過氧化物溶液(皮爾斯公司)檢測(圖加)。通過條帶密度測定tRNA相對量。通過 northern印跡分析，圖2的結(jié)果表明巴斯德畢赤酵母+pREAV-Padhi-pApaRS中tRNAeuA的轉(zhuǎn)錄是釀酒酵母中同一盒的約1. 5倍(圖2a)。雖然有這些結(jié)果，GS200-HSAE37X/pREAV-PAI)H1-pApaRS菌株中Hk6x-標簽的蛋白質(zhì)印跡未檢測到PApaRS (圖8)。一次轉(zhuǎn)化檢驗4個不同的克隆。這些結(jié)果表明缺乏琥珀型抑制與pApaRS摻入水平低相關。(如本文它處所述進行蛋白質(zhì)印跡)。為解決pApaRS表達低，修飾pREAV以便用強效Paqxi啟動子驅(qū)動pApaRS表達，通過給PApaRS基因的5’端加入Kozak共有序列(ACCATGG)進一步增強pApaRS 表達(Kozak(1990) “下游二級結(jié)構有助于真核核糖體識別起始密碼子(Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes). "Proc Natl Acad Sci U S A 87 :8301-8305)。最終構建物pREAV_PAQX1-pApaRS 中，ADHl 終止子(Tadhi)也被 AOXl 終止子(Taqxi)替代(圖 Id)。為產(chǎn)生 pREAV-PAQX1-pApaRS， 從pPIC3. 5k獲得AOXl啟動子和終止子序列。用以下引物擴增pApaRS =KETO-Koz-F, 5，-TTC TGA GAA TTC ACC ATG GCA AGC AGT AAC TTG ATT AAA CAA TTG C_3 IPKetoRS R 6xHis，5， -TAG GCT CGG CCG CTT AGT GGT GGT GGT GGT GGT GTT TCC AGC AAA TCA GAC AGT AAT TCT TTT TAC-3，，用 EcoRI 和 NotI (NEB)消化，連接入類似消化的 pPIC3. 5k 以產(chǎn)生 pPIC3. 5k-pApaRS。用以下引物從 pPIC3. 5k_pApaRS 擴增 Paqxi-pApaRS-TArai 編碼區(qū) pPIC-keto A0X5 F，5’-ATC GTA CTT MG AGA TCT AAC ATC CM AGA CGA MG GTT GAA TGA AAC-3’ 和 pPIC-keto AOXTT R，5，-TGC ACA GGC GCG CCA AGC TTG CAC AAA CGA ACT TCT CAC TTA ATC 17(-3，，用48(；1和4打11(陬8)消化，連接入類似消化的 pREAV-P^m-pApaRS PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生pREAV-PAOT1-pApaRS。如上所述，通過尺寸作圖和測序驗證構建物。通過將pREAV-PA。xl-pApaRS 轉(zhuǎn)化入 GS2OO 來構建 GS200-pREAV_PA。xl-pApaRS (his4, ARG4，GenE, muts)菌株，但接種在補充了 ^ig ml—1組氨酸的RDB平板上，不進一步篩選 Geneticin 耐受性。采用上述方案，用感受態(tài)G3 (例如，GS200_rHSAE37X)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS(HIS4, ARG4，GenE, muts)，除了將回收的細胞接種在缺乏L-組氨酸(His)和Arg的RDB平板上。該轉(zhuǎn)化的克隆僅在甲醇和pApa氨基酸存在下產(chǎn)生全長rHSAE37pApa，其水平約為10-20%相同克隆含有rHSAStt3^甲醇誘導后2_3天，通過SDS-PAGE觀察蛋白質(zhì)，每M小時補充甲醇至0.5%，表達6天后達到峰值(圖2b)。缺乏pREAV盒、pPIC3. 5k盒、甲醇補充或pApa氨基酸的酵母未能產(chǎn)生可由考馬斯染色檢測的蛋白質(zhì)。沒有PApa氨基酸存在下蛋白質(zhì)不表達表明pApaRS/tRNA ^ja配對與內(nèi)源性氨?；g不發(fā)生交叉氨酰化。胰蛋白酶消化物，LC-MS/MS證實pApa位點特異性地摻入 rHSAE37X(圖2c)。pApa(圖2c中以Ε*表示)摻入成熟rHSAE37pApa的殘基37處。觀察到的片段離子系列無疑支持這一取代。為表達足夠的rHSAE37pApa蛋白以便進行LC-MS/MS分析，改進上述蛋白質(zhì)表達分析條件。簡言之，將IL BMGY接種于YPD配制的20ml飽和的G3-2培養(yǎng)液，培養(yǎng)至(約M小時，
4929. 2°C,300r. p.m.)至 OD600 12-18。以 1500g 離心培養(yǎng)液，重懸在補加了 10%BMMY*2mM pApa的200ml緩沖極限甲醇(BMM)。培養(yǎng)6天后(29. 2°C，300r. p. m.甲醇和體積補加)，以 3000g離心培養(yǎng)液，棄去細胞，將上清液流過馬薩諸塞州比爾里卡密理博公司(Milipore， Billerica,MA)的0. 22 μ m濾器。4°C加入NH4SO4并緩慢攪拌至50%飽和(58. 2g)進行硫酸銨(NH4SO)沉淀上清液，20，OOOg離心20分鐘，再加入NH4SO4至75%飽和(31. 8g)，20，OOOg 離心20分鐘。第二次沉淀中含有rHSAE37pApa，將其重懸在FPLC緩沖液A(25mM Tris-HCl, 25mM氯化鈉，ImM EDTA，Ix蛋白酶抑制劑混合物(瑞士巴塞爾的羅氏公司((Roche，Basel， CH)))，pH = 8. 5)中。利用 AKTA 純化儀 FPLC (AB 公司(Amersham Biosciences)，皮斯卡塔韋，新澤西州)，MonoQ 5/5柱(GE保健公司(GE Healthcare))純化(20-35%緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)洗脫)重新溶解的蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE凝膠分析諸餾分，合并，用30MWC0 透析盒(皮爾斯公司)以PBS透析，利用AKTA純化儀FPLC，Superdex 20010/300GL (GE保健公司)純化(14分鐘后洗脫，PBS, 0. 5毫升/分鐘)。SDS-PAGE凝膠分析諸餾分，合并， 用 Dynamax HPLC (藍尼公司(Rainin)，奧克蘭)，C8Vydac HPLC 柱(300mm，200 A，5 μ m，格雷絲公司(Grace))純化(水配制的40-46% MeCN,0. 1% TFA洗脫)。SDS-PAGE凝膠分析諸餾分，含rHSAE37pApa&組分快速冷凍并凍干成白色粉末。以相似方式純化F2-野生型(wt)
WrHSA野生型。還原條件下(IOmM TCEP，IM鹽酸胍，IOOmM鹽酸三乙醇胺，pH = 7. 8)，用胰蛋白酶消化純化的rHSAE37X過夜，以便進行胰蛋白酶消化和納米-RP LC-MS/MS。利用S印-Pak， C18(沃特斯公司(Waters)，米爾福德，馬薩諸塞州)，通過反相固相提取來純化消化物并凍干。凍干的肽與過氧甲酸(9份濃甲酸+1份30% H2O2)在冰上溫育1小時將半胱氨酸氧化成磺基丙氨酸，將甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸砜(Matthiesen等.Q004) “利用過氧甲酸氧化擴大胰蛋白酶肽的質(zhì)量分布(Use of performic acid oxidation to expand the mass distribution of tryptic peptides). "Analytical chemistry 76,6848-6852)。力口入過量的巰基乙醇并用水作20倍稀釋來猝滅反應。用裝配了紐約州羅徹斯特熱電公司的 LTQ Orbitrap 雜交質(zhì)i普儀(LTQ Orbitrap hybrid mass spectrometer, ThermoElectron, Rochester, NY)的加利福尼亞州圣克拉拉安捷侖技術公司(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)的HPLC系統(tǒng)進行納米-RP LC-MS/MS。將胰蛋白酶消化物以約2微升/分鐘的流速加載到通氣柱設置的預柱上(4cm, 100 μ m i.d. ,5ym, Monitor C18，伊利諾斯州芝力口哥柱工程公司(Column Engineering)) (Licklider等.Q002) “具有通氣柱的納米級毛細 iW^ffifeie" ΦΚΜ θ^ ^(Automation of nanoscale microcapillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a vented column) ·，，Analytical chemistry 74 :3076-3083)。10分鐘的加載/洗滌期間后，將預柱在線切換為分析柱(10cm， 75 μ m i.d. ,5ym C18)開始梯度洗脫。層析曲線是100 %溶劑A (0. 1 %水性乙酸)到 50 %溶劑B (乙腈配制的0. 1 %乙酸)，40分鐘，約100納升/分鐘。按照前10方案(top IOscheme)進行數(shù)據(jù)依賴性MS/MS采集，其中質(zhì)譜儀編程為首先記錄高分辨率Orbitrap掃描(m/z500-2，000)，然后是10次數(shù)據(jù)-依賴性MS/MS掃描(相對碰撞能量=35% ;3Da分離窗)。利用MASCOT (矩陣科學公司(Matrixscience)，倫敦，英國)檢索SwissProt 51.6 數(shù)據(jù)庫的原始數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)鑒定，其中PApa作為變量修飾(variable modification) 0優(yōu)化表達
為優(yōu)化rHSAE37pApa表達，通過將pPIC3. 5k_rHSAE37X插入AOXl基因座的5，區(qū) (這樣保留了 AOXl 基因的完整性)來產(chǎn)生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS (HIS4， ARG4，GenE)快速甲醇利用(Mut+)突變株。以此方式插入基因組可導致多聚化，從而產(chǎn)生Gen 耐受性標記和感興趣基因的串聯(lián)拷貝(Cereghino等.Q000) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中的異源蛋白質(zhì)表達(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris) ·，，F(xiàn)EMS Microbiol Rev 24:45-66)。為產(chǎn)生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS (HIS4, ARG4, GenE, Mut+)，用 SacI 或 Sail (NEB)線性化 20 μ gpPIC3. 5k-rHSAE37X并轉(zhuǎn)化入新鮮的感受態(tài)GS200，如前所述。用Iml冷的IM山梨醇回收細胞，接種在補加了 O.^ig ml—1精氨酸的RDB平板上。將菌落挑入含Iml YPD的^iil 96 孔板塊，培養(yǎng)至飽和(29. 2 V，300r. p. m.)，作1 100稀釋，將等份試樣接種于含有0_3. Omg πιΓ1 Geneticin 的平板上。將在最高l.Omg πιΓ1 Geneticin 下存活的克隆1D12制成感受態(tài)，如前所述用pREAV-PA(m-pApaRS轉(zhuǎn)化，接種在缺乏Arg和His的RDB平板上。將菌落挑入含Iml 96孔板塊，培養(yǎng)至飽和，作1 100稀釋，在Geneticin l.Omg ml—1平板上再篩選。 挑取14個存活的克隆，檢驗有pApa氨基酸和甲醇存在下的rHSAE37pApa表達。采用上述muts 方案?？寺5顯示蛋白質(zhì)表達最高，將其在測試表達中與G3-2比較(圖9)。用SDS-PAGE凝膠分析 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAQX1-pApaRS (mut+)培養(yǎng)液(圖 9，泳道 1)和 GS200_rHSAE37X/ pREAV-PA0X1-pApaRS(muts)培養(yǎng)液(圖9，泳道2)的25 μ 1澄清培養(yǎng)液，作考馬斯染色。得到的Κ5克隆顯示耐受最高1. 0mg/ml的Geneticin ,而上述muts克隆G3-2在0. 25mg/ml Geneticin 以上死亡，這與多拷貝表達盒的摻入一致(Cereghino等.Q000) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中的異源蛋白質(zhì)表達(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris). 'T7EMS Microbiol Rev 24 :45-66 ；英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州92008 ；2005)。分析有甲醇和pApa氨基酸存在下分離克隆的全長rHSAE37pApa表達顯示產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是相應Hiuts同等物的約1. 5-2. 0倍(圖9)。 通過條帶密度測定蛋白質(zhì)的相對量。為進一步增加rHSAE37pApa的產(chǎn)量，比較6個不同啟動子(包括PAm)驅(qū)動pREAV載體中pApaRS轉(zhuǎn)錄的能力。檢驗轉(zhuǎn)錄物mRNA水平、pApaRS蛋白質(zhì)水平和rHSAE37pApa總產(chǎn)量。 根據(jù)與甲醇誘導的相容性選擇衍生自酵母菌，GTP結(jié)合蛋白I(YPTl) Gears等.(1998) “巴斯德畢赤酵母中組成型和調(diào)控基因表達的一套通用載體(A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris). "Yeast 14 :783-790 ;Segev等.(1988) “酵母菌GTP-結(jié)合YPTl蛋白和哺乳動物對等物與分泌機制相關(The yeast GTP-binding YPTl protein and a mammalian counterpart are associated with the secretion machinery). "Cell 52 :915-924)禾口甘油酸一3-憐酸脫氫酶(GAP) (Cos等.Q006) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中在不同啟動子控制下異源蛋白產(chǎn)生的操作策略、監(jiān)測和控制綜述(Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters -.a review). "Microb Cell Fact 5 17 ；Waterham 等.(1997) “巴斯德畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的分離及其啟動子的調(diào)節(jié)和使用(Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter). "Gene 186 :37-44)的胃禾中啟云力子；衍生自醇氧化酶II (A0X2) (Ohi等.(1994) “巴斯德畢赤酵母A0X2基因中甲醇調(diào)節(jié)的 JH禾口負)1質(zhì)式作用7Π件(The positive and negative cis-acting elements for methanol regulation in the Pichia pastoris A0X2 gene). "Mol Gen Genet 243 :489-499) > ^ 醛脫氫酶I (FLDl) (Cos等.Q006) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中在不同啟動子控制下異源蛋白產(chǎn)生的操作策略、監(jiān)測和控制綜述”Microb Cell Fact 5 :17)和異檸檬酸裂合酶I (ICLl) (Cos等.Q006) “甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中在不同啟動子控制下異源蛋白產(chǎn)生的操作策略、監(jiān)測和控制綜述”Microb Cell Fact 5 :17)的三種甲醇誘導型啟動子。利用截短的Ρωχ2，其通過刪除兩個阻遏結(jié)合序列之一而增強該啟動子(Ohi 等.(1994) “巴斯德畢赤酵母Α0Χ2基因中甲醇調(diào)節(jié)的正和負順式作用元件.”Mol Gen Genet 243:489-499)。在合成酶的過度產(chǎn)生對于酵母菌有毒性，或者隔離細胞能量使之不能產(chǎn)生rHSAE37X的情況中可利用較弱的Pypti和Pmp啟動子Gears等.(1998) “巴斯德畢赤酵母中組成型和調(diào)控基因表達的一套通用載體.”kast 14 :783-790)。通過PCR擴增巴斯德畢赤酵母基因組DNA的所有啟動子連同它們的5’非翻譯區(qū) (圖10)。分別利用以下引物，通過PCR擴增基因組DNA(巴斯德畢赤酵母GS200)的Paqx2、 Ργρτι、Picli、Pfldi 和 Pgap :PA0X2 F，5，-GTA TCG CTT AAG TCC AAG ATA GGC TAT TTT TGT CGC ATA AAT TTT TGT C-3’ 和 ΡΑ0Χ2 R，5，-CGT TAG CCA TGG TTT TCT CAG TTG ATT TGT TTG TGG GGA TTT AGT AAG TCG-3，；PYPTl F,5' -GTA TCG CTT AAG CAT ATG ATG AGT CAC AAT CTG CTT CCA CAG ACG AG-3，和 PYPTl R，5，-CGT TAG CCA TGG GAC TGC TAT TAT CTC TGT GTG TAT GTG TGT ATT GGG C_3’ ；PICLl F，5’ -GTA TCG CTT AAG GAA TTC GGA CAA ATG TGC TGT TCC GGT AGC TTG—3，禾口 PICLl R，5’ -CGT TAG CCA TGG TCT TGA TAT ACT TGA TAC TGT GTT CTT TGA ATT GAA AG-3’ ；PFLDl F，5’ -GTA TCG CTT AAG GCA TGC AGG AAT CTC TGG CAC GGT GCT AAT GG-3，和 PFLDl R，5，-CGT TAG CCA TGG TGT GAA TAT CAA GAA TTG TAT GAA CAA GCA AAG TTG G_3’ ；PGAPl F，5，-GTA TCG CTT AAG GGA TCC TTT TTT GTA GAA ATG TCT TGG TGT CCT CGT C-3'禾P PGAPl R,5' -CGT TAG CCA TGG TGT GTT TTG ATA GTT GTT CAA TTG ATT GAA ATA GGG AC-3，。圖10顯示溴化乙錠染色的凝膠與Ikb+ 標準樣側(cè)接PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的預計長度為:PA0X2 342bp, PYPTl 508bp, PICLl 683bp, PFLDl 597bp和PGAP 493bp。用Af III和NcoI (NEB)消化PCR擴增片段，并連接入類似消化的pREAV-PAQX1-pApaRS(通過瓊脂糖凝膠純化除去P_AQX2編碼區(qū)后)以產(chǎn)生pREAV-P啟動子-pApaRSo序列證實后，將各啟動子克隆入pApaRS的pREAV載體5’(端)以替代PAQX1，并將其轉(zhuǎn)化入以前產(chǎn)生的Mut+GS200-HSAE37X。終止子保留Taqxi。圖3a提供pREAV-PPM。tCT-pApaRS 的線性圖譜，說明啟動子區(qū)域可變。PCR擴增基因組DNA的啟動子(如結(jié)果示于圖7的實驗)。用AatII線性化質(zhì)粒(如同以前描述的構建物pREAV-PAQX1-pApaRS)，轉(zhuǎn)化入新鮮的感受態(tài)GS200-rHSAE37X(克隆IDl2)，接種于如前所述缺乏Arg和His的RDB平板以產(chǎn)生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PPromoter-pApaRS (HIS4, ARG4, GenE, Mut+)。在 0· 75 和 1. Omg πιΓ1 下篩選存活克隆的Geneticin 耐受性。將對應于各啟動子的48個克隆挑取入含BMGY的Iml 96 孔板塊，培養(yǎng)至飽和(29. 2°C, 24小時，300r. p. m.)。1500g離心飽和培養(yǎng)液10分鐘，將細胞重懸在 200 μ L BMMY+2mM pApa 氨基酸。6 天后( . 2°C，300r. p. m.，含補樣)，3000g 離心澄清培養(yǎng)液10分鐘，利用96孔點樣工具將1-2 μ L澄清的培養(yǎng)液點樣在0. 45微米硝酸纖維素膜(BR公司)。采用標準蛋白質(zhì)印跡技術(Burnette (1981) “蛋白質(zhì)印跡將蛋白質(zhì)從十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至未修飾的硝酸纖維素并用抗體和放射性碘標記白勺AM白白勺X身寸才目(Western blotting :electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A). "Anal Biochem 112 :195-203)，用HSA抗體[1A9]HRP偶聯(lián)物(阿比康公司(Abeam))探測膜，用 ECL HRP化學發(fā)光檢測試劑和方案(GE保健公司)檢測。選擇對應于各啟動子的兩個表達最高的克隆(A0X2 -M 禾Π Β7 ；YPTl =Dll 禾Π Β7 ；ICLl :Ε5 禾Π Η3 ；FLDl =Ell 禾Π F3 ；GAP :B7 禾Π BlO ；和AOXl :Ε3和Ε7)作平行測試表達(圖3和4)。甲醇誘導6天后，通過northern和蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測P-^^^-pApaRS表達水平并與 PA0X1-pApaRS比較(圖北)。由于巴斯德畢赤酵母固有的表達差異，選擇兩個克隆作蛋白質(zhì)印跡分析。用甲醇作為主要碳源培養(yǎng)PREAV-Pjazw-PAPaRS每次轉(zhuǎn)化GS200_rHSAE37X的兩個克隆6天，裂解，用SDS-PAGE凝膠分離(圖北，上部凝膠)。考馬斯染色凝膠以驗證等量加載。通過蛋白質(zhì)印跡分析裂解物的pApaRs-Hi^^圖北，下部凝膠)。為進行蛋白質(zhì)印跡，在測試表達條件下培養(yǎng)克隆A0X2 :A6和B7 ；YPTl =Dll和B7 ； ICLl :E5 禾口 H3 ；FLDl =Ell 禾口 F3 ；GAP :B7 禾口 BlO ；禾口 AOXl :E3 禾口 E7，沉淀(3000g, 10 分 中)， 用2ml ^astBuster(新澤西州吉布斯城的諾瓦金公司(Novagen，Gibbstown, NJ))+IOmM β-巰基乙醇和完全蛋白酶抑制劑混合片劑(羅氏)裂解。以20，OOOg澄清樣品，將15μ1 裂解液在4-20% SDS-PAGE凝膠上電泳(1 15小時，150V)。利用轉(zhuǎn)印跡SD半干轉(zhuǎn)移室 (BR公司)，在iTobin轉(zhuǎn)移緩沖液(24mM tris堿，192mM甘氨酸，20 %乙醇)(2小時，20V， IOOmAmp)中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0. 45微米硝酸纖維素膜(BR公司)?？捡R斯染色凝膠上殘留的蛋白質(zhì)(圖北，上圖)以確保等量加載。采用標準蛋白質(zhì)印跡技術(Burnette (1981)“蛋白質(zhì)印跡將蛋白質(zhì)從十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至未修飾的硝酸纖維素并用抗體和放射性碘標記的A蛋白的X射線照相檢測· "Anal Biochem 112 :195-203)，用抗 His6x-HRP偶聯(lián)抗體(SA公司)印跡膜，用ECL (GE保健公司)HRP化學發(fā)光檢測試劑和方案檢測(圖北，下圖)。通過條帶密度測定相對表達率。在mRNA水平，Pfldi驅(qū)動pApaRS轉(zhuǎn)錄比PAm高4倍，產(chǎn)生的pApaRS蛋白多5倍。 PGAP> Pypti、Preu和均顯示PApaRS表達低于Pfuu。與該結(jié)果一致的是，PFLD1-pApa的總琥珀型抑制最高，其中通過檢測進入培養(yǎng)基的rHSAE37pApa表達(圖4)。如圖4所示，各啟動子系統(tǒng)的兩個克隆用甲醇作為主要碳源和PApa氨基酸獨立培養(yǎng)6天。用變性SDS-PAGE凝膠對25 μ 1澄清的培養(yǎng)液作電泳，考馬斯染色。通過條帶密度和BSA對照計算rHSAStta (泳道 15)為351.6mg Γ1。根據(jù)密度，Pfldi (取泳道9和10的平均值)表達最多43%的蛋白質(zhì)或 151. 2mg Γ1。最高產(chǎn)量是> l50mg/l或rHSA野生型的約43% (352mg/l)(圖11)。圖11是圖 4的柱狀圖，顯示rHSAE37pApa中琥珀型抑制與啟動子驅(qū)動pApaRS產(chǎn)生的函數(shù)關系。根據(jù)圖4 所示SDS-PAGE凝膠上考馬斯條帶密度測定蛋白質(zhì)產(chǎn)量。如下所述定量測定圖4中的rHSA Stta蛋白對25 μ 1 BSA標準品或測試蛋白質(zhì)表達的未純化THSAa^a培養(yǎng)液進行SDS-PAGE 凝膠電泳(參見圖12)。泳道7是IflSAltts測試蛋白質(zhì)表達培養(yǎng)液的1 1稀釋液。對BSA 標準品條帶密度(泳道2-5)作圖，并作線性擬合。！"HSAltts條帶( 泳道7和泳道8)的密度平均為83.33或351.55!^/!111。非天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(其它圖中的rHSAE37X)測定為相同rHSAs生^樣品的百分比。通過northern印跡分析在圖北中產(chǎn)生最多蛋白質(zhì)的克隆的pApaRSmRNA轉(zhuǎn)錄(圖 3c,下部凝膠)。為進行northern印跡，在測試表達條件下培養(yǎng)表達最高的克隆A0X2，B7 ； YPTl，Dll ；ICL1,H3 ；FLDl，Ell ；GAP，B7 ；和 A0X1，E36 天。收集 3x IO8 個細胞(2. 5ml, OD600 =1.0)，通過RiboPure-酵母試劑盒(安變公司(Ambion))試劑和方法分離總RNA。將 13yg各RNA樣品加載到2%甲醛凝膠0%瓊脂糖，20mM MOPS，8mM乙酸鈉，2. 2mM甲醛，pH =7. 0)上。加載前，將3體積的NorthernMax甲醛加載染料(安變公司)與1體積RNA混合，加熱至65°C，15分鐘，先在冰上冷卻5分鐘，再上樣。對凝膠進行電泳(50V，2小時)，通過18S和^SrRNA的溴化乙啶染色證實等量加載和RNA完整性(圖3c，上圖)。通過標準印跡設備，在IOx SSC緩沖液(1.5M氯化鈉，0. 15M檸檬酸鈉pH = 7.0)中將RNA吸到Biodyne B尼龍膜(帕爾生命科學公司)上。用h SSC緩沖液清洗膜兩次，干燥并用斯特拉塔基因公司的UV Stratalinker MOO自交聯(lián)。采用皮爾斯公司的North2South化學發(fā)光雜交和檢測試劑盒的方案和試劑進行雜交和檢測。簡言之，55°C，溫育400-500 μ g生物素化探針過夜ketoRS3 生物素 5，/5Biosg/TGA GAC GCT GCT TAA CCG CTT C-3，和 ketoRS4 生物素 5，/5Biosg/TAA AGA AGT ATT CAG GAT CGG ACT G_3，，結(jié)合鏈霉親和素-HRP 偶聯(lián)物，用魯米諾/增強劑-穩(wěn)定的過氧化物溶液(皮爾斯公司)檢測(圖3c，下圖)。通過條帶密度測定mRNA相對滴度。肟連接于rHSAE37DADa為證明這種修飾的rHSA能用作生物活性肽的載體，在rHSAE37pApa的唯一酮側(cè)鏈和抗血管生成性肽ABT-510之間進行肟連接(圖5)。該連接反應的示意圖見圖fe。ABT-510 肽具有ε- -(氨基氧基)乙?；?_L-賴氨酸作為第六殘基。如下文進一步描述的， 37°C下溫育75μΜ rHSAE37pApa (圖5a，上部反應)與2.25mM肽過夜形成肟連接鍵。相同條件下用rHSA(圖5a，下部反應)沒有反應發(fā)生。該血小板反應蛋白(TSP-I)裂解素1型重復模擬物在人中顯示強效的抗腫瘤活性，但通過靜脈內(nèi)給予時會被腎臟快速清除(Hoekstra等.Q005) “晚期癌癥患者中血小板反應蛋白模擬血管生成抑制劑 ABT-510的I期安全、藥代動力學和藥效學研究(Phase I safety, pharmacokinetic, and pharmacodynamic study of the thrombospondin-l-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients with advanced cancer)·，，J Clin Oncol 23 :5188-5197 ；Yang 等.Q007) “聯(lián)用血小板反應蛋白-1肽ABT-510與丙戊酸是成神經(jīng)細胞瘤的有效抗血管生成策略(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is an effective anti-angiogenesis strategy in neuroblastoma). "Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher等.Q002) “血小板反應蛋白_1肽模擬物的全身性處理抑制腫瘤生長 (Inhibition of tumor growth by systemic treatment with thrombospondin-1 peptide mimetics). "Int J Cancer 98 :682-689)。合成以獨特 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)_L_ 賴氨酸UAA替代第6L-正纈氨酸殘基的9氨基酸肽模擬物(安娜斯派克公司(Anaspec)，圣何塞,加利福尼亞州)。該肽的序列為Ac-Sar-Gly-Val-D-aloIle-Thr-Lys (Aoa)-Ile-Arg-P ro-NEt MW= 1097. 3Da)。根據(jù)TSP-I的已知結(jié)構-活性關系，在該位置進行修飾估計不會顯著改變生物學活性(Haviv等.(2005)“血管生成和腫瘤生長的血小板反應蛋白-1模擬肽抑制劑藥代動力學和生物學活性的設計、合成和優(yōu)化(Thrombospondin-1 mimetic peptide
54inhibitors of angiogenesis and tumor growth :design, synthesis,and optimization of pharmacokinetics and biological activities). ”J Med Chem 48 :2838-2846)。為進行肟連接，將2. 25mM(0. 5mg)肽加入200 μ 1肟連接緩沖液(1. 5Μ氯化鈉，500mM乙酸鈉，pH =4.4)中的75 μ M rHSAE37pApa或rHSAgj生型(L0mg)，3rC溫育過夜。pH<5時，氨基氧基與 PApa的酮基經(jīng)歷選擇性肟連接從而將ABT-510肽共價連接于rHSAE37pApa的殘基37 (圖5a， 上部反應)。用 Dynamax HPLC (藍尼公司)，C8 Vydac HPLC 柱(300mm，200 Α，5μπι，格雷絲公司)純化(水配制的40-46%乙腈洗脫，0. 1% )反應體系。收集諸餾分，合并，通過考馬斯染色SDS-PAGE凝膠分析。利用裝有芥子酸基質(zhì)的線性MALDI-T0F MS Biflex III (馬薩諸塞州比爾里卡BD公司(Burker Daltonics))儀器進行基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI) 質(zhì)譜法來檢測完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量和驗證該肽衍生rHSAE37pApa的程度(圖恥)。用該蛋白質(zhì)處理前后！"HSAltts的質(zhì)量改變可忽略，表明在相同條件下用氨基-氧基修飾的ABT-510肽處理IflSAltts (殘基37處的谷氨酸)時，MALDI質(zhì)譜法未觀察到偶聯(lián)。利用rHSA野生a +肽禾Π rHSAE37pApa+肽之間的質(zhì)量差異由于E37pApa突變而低 60Da(905Da減去60Da = 845Da))測定連接效率(約77% )。以前的偶聯(lián)方案利用苯胺催化劑進行有效連接(Dirksen等.(2006) “肟連接的親核催化(Nucleophilic catalysis of oxime ligation). ”Angew Chem Int Ed Engl 45 :7581-7584 ;Dirksen 等· (2006) “腙形成和轉(zhuǎn)移的親核催化涉及動態(tài)共價化學反應(Nucleophilic catalysis of hydrazone formation and transimination !implications for dynamic covalent chemistry). "J Am Chem Soc 128 :15602-15603)；然而，在不利用苯胺而利用75 μ M rHSAE37pApa和三倍過量肽的過夜反應中，肟偶聯(lián)于rHSAE37pApa的產(chǎn)率約為77%。將8種UAA加入遺傳庫為說明該新產(chǎn)生的重組表達系統(tǒng)的通用性，將釀酒酵母方法開發(fā)的非天然aaRS 插入PREAV-Pfuu。圖6a提供含大腸桿菌酪氨酰-RS基因(aal )和酪氨酰抑制型tRNA盒 (tRNACUA)的優(yōu)化PREAV-Pfldi載體的示意圖。將對-苯甲酰苯丙氨酸(pBpa，光交聯(lián)劑，圖 6b，結(jié)構 3，Chin 等· (2003) “擴增的真核遺傳密碼(An expanded eukaryotic genetic code). "Science 301 :964-967)、對-疊氮基苯丙氨酸(piVzapa，光交聯(lián)劑，化學反應性， 圖6b，結(jié)構4，Deiters等.“將具有新型反應性的氨基酸加入釀酒酵母的遺傳密碼 (Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae). "J Am Chem Soc 125 :11782-11783)、對-(炔丙基氧基)苯丙氨酸(pPpa， 化學反應性，圖6b，結(jié)構5，Deiters等.Q003) “將具有新型反應性的氨基酸加入釀酒酵母的遺傳密碼” J Am Chem Soc 125 :11782-11783)、對-甲氧基苯丙氨酸(pMpa，結(jié)構/功能探針，圖6b，結(jié)構6，Chin等.(2003) “擴增的真核遺傳密碼."Science 301:964-967) 和對-碘代苯丙氨酸(plpa，重原子，圖6b，結(jié)構7，Chin等.Q003) “擴增的真核遺傳密碼· "Science 301 :964-967))的特異性aaRS均插入優(yōu)化的pREAV-PFLD1載體中Pfldi之后 (圖6a和6b)。為比較，野生型大腸桿菌酪氨酰-RS (wt，圖6b，結(jié)構幻也插入新的表達載體。利用以下引物，通過PCR擴增酪氨酸(Wt)、pBpa、pAzapa、pPpa、pMp￡^npIpa的特異性非天然 aaRS =KETO-Koz-F 和 KetoRS R 6xHis (上述的)，用 NcoI 和 EagI (NEB)消化，連接入類似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS (通過瓊脂糖凝膠純化除去pApaRS區(qū)域后)。序列驗證后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入前述GS200-rHSAE37X克隆1D12以產(chǎn)生GS200-rHSAE37X/pREAV-PFII)1-(合成酶_) (HIS4，ARG4，GenK，Mut+)。每次轉(zhuǎn)化選擇12個克隆，通過前述96孔形式的斑點印跡篩選。選擇每次的最佳生產(chǎn)克隆(tyr，A9 ；pBpa,B7 ；pAzapa C9 ；pPpa，D6 ；pMpa，E6 ；和 plpa， F6)，并在上述rHSA表達實驗中與FLDl (即，具有pREAV-PFU)1-pApaRS的菌株)Ell比較以測定在有(+)和沒有(_)非天然氨基酸1，3-7及其相應aaRS存在下它們抑制rHSAE37X* 37位的琥珀型突變的能力，其中X指定為非天然氨基酸。這些實驗的結(jié)果見圖6c。25μ1 未純化的澄清培養(yǎng)液作SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯染色。泳道2是用野生型(wt)酪氨酰-RS的rHSAE37Y表達。泳道15是rHSA野生型的表達。pApa和pAzapa突變體的抑制率相似 (rHSA野生型產(chǎn)率的40-45% )；除plpa外，所有其它突變體表達>20 %的rHSAg^a產(chǎn)率(圖 6c)。通過條帶密度測定相對蛋白質(zhì)產(chǎn)量。沒有相關氨基酸存在下未觀察到蛋白質(zhì)表達，證明該新系統(tǒng)的高度正交性。最近，制備了第二正交大腸桿菌亮氨酰-衍生RS/tRNA。UA配對(稱為LeuRS的 aaRS)以便在釀酒酵母中將其它非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)(Lemke等.Q007) “遺傳編碼的光束縛氨基酸控制蛋白質(zhì)磷酸化(Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid)·，，Nat Chem Biol 3 :769-772 ; Summerer 等·(2006) “遺傳編碼的熒光氨基酸(A genetically encoded fluorescent amino acid). "Proc Natl Acad Sci U S A 103 :9785-9789)。為在新巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中容納衍生自該正交配對的非天然LeuRS，修飾PREAV-Pfldi質(zhì)粒的tRNA區(qū)域。如前所述，切除 Ppgki下游已有的tRNA:盒，替換以對應于缺乏5’CCA并由SUP4區(qū)段隔開的tRNA^^三串聯(lián)重復的編碼區(qū)，從而產(chǎn)生pREAVlw-PFU)1。將4，5-二甲氧基-2-硝基芐基絲氨酸(DMNB-S， 光束縛絲氨酸，圖6e，結(jié)構8，Lemke等.Q007) “遺傳編碼的光束縛氨基酸控制蛋白質(zhì)磷酸化· "Nat Chem Biol 3 :769-772)和2-氨基-3-(5-( 二甲基氨基)萘-1磺酰胺)丙酸 (丹?；彼?，丹?；鶡晒鈭F，圖6e，結(jié)構9，SUmmerer等.Q006) “遺傳編碼的熒光氨基酸.”Proc Natl Acad Sci U S A 103:9785-9789)的特異性 LeuRS 突變體插入 PFU)1 后產(chǎn)生 pREAVleu-PFU)1-LeuRS (圖 6d 禾口 6f)。圖6d提供含大腸桿菌亮氨酰-RS基因和亮氨酰抑制型tRNA序列組件 (1 eu-tRNA(CUA))的優(yōu)化 pREAVleu_PFLD1 載體的示意圖。為產(chǎn)生 pREAVleu_PFLD1，合成(DNA 2.0，門洛帕克，加利福尼亞州)對應于缺乏5’ CCA并由SUP4區(qū)段隔開的tRNA思三串聯(lián)重復的片段，并利用以下引物作PCR擴增Leu tRNA F, 5' -AAG GAA GCT AGC CTC TTT TTC AAT TGT ATA TGT G-3'和 Leu tRNA R,5' -CGT ACA CGC GTC TGT ACA GAA AAA AAA GAA AAA TTT G_3，。用 NheI 和 MluI (NEB)消化得到的 643bp 產(chǎn)物，連接入類似消化的pREAV-PFU)1-pApaRS (通過瓊脂糖凝膠純化除去酪氨酰tRNA后)以產(chǎn)生 pREAVleu-PFLD1-pApaRS0利用以下引物擴增DMNB-S和丹?；翘烊话被岬奶禺愋詀aRS LeuRS F，5，-ATT CAC ACC ATG GAA GAG CAA TAC CGC CCG GAA GAG-3 IPLeuRS R，5，-TTA ATT CGC GGC CGC TTA GCC MC GAC CAG ATT GAG GAG TTT ACC TG-3，，用NcoI和NotI(NEB) 消化，連接入類似消化的pREAVleu-PFU)1-pApaRS (通過瓊脂糖凝膠純化除去pApaRS編碼區(qū)后)以產(chǎn)生PREAVleu-Pmn-DMNB-S或PREAV1w-Pfldi-丹?；?圖6d)。序列證實后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入GS200-rHSAE37X(克隆1D12)并以所述的96孔斑點印跡形式篩選?？寺 :A5 (DMNB-S) 和B :G12(丹?；?鑒定為緩沖液極限甲醇(BMM)培養(yǎng)基中誘導后，在測試表達條件下生長 3天的成功生產(chǎn)克隆。為進行比較，!·把々野生型在8匪￥中表達3天(圖6f)。圖6f提供為檢驗有(+)和沒有(_)非天然氨基酸存在下rHSAE3ra的表達所進行的實驗結(jié)果。用SDS-PAGE 凝膠分析25 μ 1未純化的澄清培養(yǎng)液中的各蛋白質(zhì)表達，作考馬斯染色。泳道4也是3天
B rHSA 野生型最近證明DMNB-S的特異性LeuRS突變體接受DMNB-S的半胱氨酸類似物 (DMNB-C)，該類似物因易于合成而用于這些實驗。雖然沒有相關氨基酸存在下產(chǎn)生少量的全長蛋白質(zhì)(對于DMNB-S，背景是35% rHSAE37DMNB_s，對于丹酰基是6% rHSAE37ffgt s)，胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS證實有相應非天然氨基酸存在下該系統(tǒng)的高保真度 (圖13)。如圖13所示，圖6f的泳道2的rHSAE37__c蛋白進行胰蛋白酶消化，然后進行上述LC-MS/MS，除了消化物中胰凝乳蛋白酶替代胰蛋白酶。上幅色譜圖(黑色)顯示對.45-60.05分鐘之間冗-1^肩5運行的總離子計數(shù)(TIC)。第三和第四色譜圖分別是2+和3+荷電物質(zhì)的離子提取，對應于胰凝乳蛋白酶肽，)(DHVKLVNEVTEF，其中X(rHSA 的第37位殘基)是DMNB-C(峰下總面積，“MA” = 224582204)。第五和第六色譜圖分別是2+和3+荷電物質(zhì)的離子提取，對應于胰凝乳蛋白酶肽，)(DHVKLVNEVTEF，其中X是亮氨酸的異亮氨酸(峰下總面積“MA” = 20029397)。如下所示進行計算E37DMNB_C百分比=224582204/(224582204+20029397) *100 = 91. 8 % 和 E37L 百分比=20029397/ (224582204+20029397)^100 = 8. 2%。未檢測到可察覺量的對應于X處其它天然氨基酸摻入的離子種類。實際上，存在氨?；种菩蛅RNA常抑制無義密碼子的非特異性連讀。表達3天后，rHSAE37__c的抑制率是rHSAgj生型產(chǎn)率的約37%，rHSAE37ffgt基的抑制率是rHSA野生型產(chǎn)率的 23%。在釀酒酵母中優(yōu)化含有非天然氨基酸蛋白質(zhì)表達的早先嘗試在模型系統(tǒng)中獲得的最高產(chǎn)量是8-15mg/l，比本發(fā)明開發(fā)的巴斯德畢赤酵母中顯示的產(chǎn)量低多于一個的數(shù)量級。Wang實驗室的工作最近證明酵母菌中無義介導mRNA降解(NMD)途徑的敲減可將蛋白質(zhì)表達最高增加2倍(Wang和Wang(2008) “酵母菌中非天然氨基酸有效摻入的新方法(New methods enabling efficient incorporation of unnatural amino acids in yeast). ” J Am Chem Soc 130 :6066-6067)。聯(lián)用衍生自 SNR52 的啟動子來驅(qū)動 tRNAcua 轉(zhuǎn)錄，它們能達到的突變型蛋白質(zhì)產(chǎn)量比以前在釀酒酵母中產(chǎn)生的(約為15mg/l)高300-倍 (Wang和Wang (2008) “酵母菌中非天然氨基酸有效摻入的新方法.” J Am Chem Soc 130 6066-6067)。因此，敲除NMD途徑的UPFl基因和利用SNR52-tRNACUA啟動子系統(tǒng)還可增加巴斯德畢赤酵母中的產(chǎn)量。此外，Kobayashi實驗室的工作證明，當以分批補料發(fā)酵而非標準搖瓶表達時，巴斯德畢赤酵母的rHSAg^s產(chǎn)量要高多于一個數(shù)量級(> IOg Γ1) (Ohya(2005) “通過反復分批補料發(fā)酵優(yōu)化甲基營養(yǎng)酵母菌巴斯德畢赤酵母中的人血清白蛋白產(chǎn)生(Optimization of human serum albumin production in methylotrophic yeast Pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation). "Biotechnol Bioeng 90 :876-887)?？傊?，我們將生物合成摻入非天然氨基酸的方法拓展至甲基營養(yǎng)酵母菌。兩種 aaRS/tRNACUA配對顯示在巴斯德畢赤酵母中是正交的，它們用于對rHSAE37X的殘基37處的琥珀密碼子起反應而表達含8種不同非天然氨基酸的突變型蛋白。突變型蛋白在搖瓶中的表達水平高，保真度優(yōu)秀。這些結(jié)果提示該表達系統(tǒng)適用于許多其它非天然氨基酸及目前在釀酒酵母中開發(fā)的合成酶，不限于本文討論的非天然氨基酸或aaRS/tRNA。UA配對。該新系統(tǒng)的高產(chǎn)量和保真度使其能獲得有用量的具有獨特生物學和藥學特性的治療性蛋白質(zhì)。 例如，可采用化學方法，如肟連接或銅催化1，3-環(huán)化加成反應(克里克化學反應)位點特異性地PEG化或交聯(lián)蛋白質(zhì)，可摻入金屬離子結(jié)合氨基酸以結(jié)合放射性同位素，可分別從例如HSA或靶向蛋白等載體蛋白制備肽、毒素或SiRNA偶聯(lián)物，所述靶向蛋白例如抗體。此外，在體外抗血管生成試驗中檢驗了前述rHSAE37pApa-ABT-510偶聯(lián)物。拓展rHSA_E37pApa用作內(nèi)源性、非-免疫原性運載體的嘗試目前應用于其它快速清除的肽，包括胰高血糖素-樣肽 1模擬物(GLP-I)和甲狀旁腺激素(PTH)肽。盡管已經(jīng)出于清楚和理解的目的在某種程度上詳細地描述了本發(fā)明，但是本領域技術人員通過閱讀本說明書可清楚地了解，可在不背離本發(fā)明真實范圍的情況下對形式和細節(jié)作出各種改變。例如，上述所有技術和設備都可用于各種組合。如同各出版物、專利、專利申請和/或本文引用的其它文獻專門表明出于所有目的通過引用納入本文的程度一樣， 本申請中提到的所有出版物、專利、專利申請和/或文獻都通過引用全文納入本文。成孰HSA^MiS酸序歹Il (不句,括信號序歹Il或IiTflt序歹II) SEQ ID NO!DAHKS TEFAKTCVADESAENCDKSL DDNPNLPRLVRPEVDVMCTA ECCQAADKAACLLPKLDELR EFAEVSKLVTDLTKVHTECC SHCIAEVENDEMPADLPSLA LRLAKTYETTLEKCCAAADP LLVRYTKKVPQVSTPTLVEV TPVSDRVTKCCTESLVNRRP TALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV AASQAALGL成熟TSP-I的氨基酸序列(不包括信號序列)SEQ ID NO 2NR IPESG⑶NSV FDIFELTGAA RKGSGRRLVK GPDPSSPAFR IEDANLIPPVPDDKFQDLVD AVRAEKGFLL LASLRQMKKT RGTLLALERK DHSGQVFSVV SNGKAGTLDLSLTVQGKQHV VSVEEALLAT GQffKSITLFV QEDRAQLYID CEKMENAELD VPIQSVFTRD
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LASIARLRIA KGGVNDNFQG VLQNVRFVFG TTPEDILRNK GCSSSTSVLL TLDNNVVNGSSPAIRTNYIG HKTKDLQAIC GISCDELSSM VLELRGLRTI VTTLQDSIRK VTEENKELANELRRPPLCYH NGVQYRNNEE WTVDSCTECH CQNSVTICKK VSCPIMPCSN ATVPDGECCPRCffPSDSADD GffSPffSEffTS CSTSCGNGIQ QRGRSCDSLN NRCEGSSVQT RTCHIQECDKRFKQDGGffSH WSPWSSCSVT C⑶GVITRIR LCNSPSPQMN GKPCEGEARE TKACKKDACPINGGffGPffSP WDICSVTCGG GVQKRSRLCN NPTPQFGGKD CVGDVTENQI CNKQDCPIDGCLSNPCFAGV KCTSYPDGSff KCGACPPGYS GNGIQCTDVD ECKEVPDACF NHNGEHRCENTDPGYNCLPC PPRFTGSQPF GQGVEHATAN KQVCKPRNPC TDGTHDCNKN AKCNYLGHYSDPMYRCECKP GYAGNGIICG EDTDLDGffPN ENLVCVANAT YHCKKDNCPN LPNSGQEDYDKDGIGDACDD DDDNDKIPDD RDNCPFHYNP AQYDYDRDDV GDRCDNCPYN HNPDQADTDNNGEGDACAAD IDGDGILNER DNCQYVYNVD QRDTDMDGVG DQCDNCPLEH NPDQLDSDSDRIGDTCDNNQ DIDEDGHQNN LDNCPYVPNA NQADHDKDGK GDACDHDDDN DGIPDDKDNCRLVPNPDQKD SDGDGRGDAC KDDFDHDSVP DIDDICPENV DISETDFRRF QMIPLDPKGTSQNDPNWVVR HQGKELVQTV NCDPGLAVGY DEFNAVDFSG TFFINTERDD DYAGFVFGYQSSSRFYVVMW KQVTQSYffDT NPTRAQGYSG LSVKVVNSTT GPGEHLRNAL WHTGNTPGQVRTLffHDPRHI GffKDFTAYRff RLSHRPKTGF IRVVMYEGKK IMADSGPIYD KTYAGGRLGLFVFSQEMVFF SDLKYECRDPABT-510 肽的氨基酸序列 SEQ ID NO 3(N-Ac-Sar)-Gly-Val-(D-alloIle)-Thr-Nva-Ile-Arg-(Pro-NHEt)
權利要求
1.一種制備共價偶聯(lián)的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的方法，該方法包括在載體多肽合成或翻譯期間將第一非天然氨基酸殘基摻入該載體多肽；在靶多肽合成或翻譯期間將第二非天然氨基酸殘基摻入該靶多肽；和使該第一和第二非天然氨基酸殘基反應以產(chǎn)生所述共價偶聯(lián)的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在翻譯期間將所述第一非天然氨基酸摻入所述載體多肽包括(a)提供翻譯系統(tǒng)，其包含(i)所述第一非天然氨基酸，(ii)正交tRNA-合成酶(O-RS)，(iii)被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特異性氨酰化的正交tRNA(O-tRNA)，和(iv)編碼所述載體肽的核酸，其中所述核酸包含所述0-tRNA識別的選擇者密碼子；和(b)翻譯所述核酸，藉此在翻譯期間將所述第一非天然氨基酸摻入所述載體多肽。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體或靶多肽在甲基營養(yǎng)酵母菌細胞中產(chǎn)生。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體或靶多肽在假絲酵母(Candida)細胞、漢遜酵母(Hansenula)細胞、畢赤酵母(Pichia)細胞或球擬酵母菌(Torulopsis)細胞中產(chǎn)生。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體多肽與人血清白蛋白(HSA)同源。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體多肽是以下物質(zhì)或與以下物質(zhì)同源抗體，HER2抗體和0KT3抗體，抗體片段，F(xiàn)ab, Fe, scFv，白蛋白，血清白蛋白，牛血清白蛋白，卵白蛋白，C-反應性蛋白，伴白蛋白，乳清蛋白，匙孔賊血藍蛋白(KLH)，離子載體蛋白，?；d體蛋白，信號轉(zhuǎn)導銜接蛋白，雄激素結(jié)合蛋白，鈣結(jié)合蛋白，鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白， 血漿銅藍蛋白，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白，f_盒蛋白，脂肪酸_結(jié)合蛋白，卵泡抑素，卵泡抑素_相關蛋白，GTP-結(jié)合蛋白，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白，鐵-結(jié)合蛋白，潛在TGF-β結(jié)合蛋白， 光_收集蛋白復合物，淋巴細胞抗原，膜轉(zhuǎn)運蛋白，神經(jīng)垂體素運載蛋白，周質(zhì)結(jié)合蛋白，磷酸_結(jié)合蛋白，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，磷脂轉(zhuǎn)移蛋白，視黃醇_結(jié)合蛋白，RNA-結(jié)合蛋白， S-期激酶-相關蛋白，性激素_結(jié)合球蛋白，甲狀腺素_結(jié)合蛋白，鈷胺素傳遞蛋白，皮質(zhì)激素傳遞蛋白，運鐵蛋白_結(jié)合蛋白或維生素D-結(jié)合蛋白。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶多肽是以下物質(zhì)或與以下物質(zhì)同源 TSP-1、ABT-510、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、甲狀旁腺激素(PTH)、核糖體滅活蛋白(RIP)、 血管抑素、艾賽那肽-4、脫輔基蛋白、心房鈉尿因子、心房利納多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降鈣素、 c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1 α、單核細胞炎性蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、 R91733、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40配體、補體抑制劑、細胞因子、上皮嗜中性粒細胞活化肽 _78、GR0a、MGSA、GRO0 ,GROy ,MIPl-α、ΜΙΡ1_β、MCP_1、上皮嗜中性粒細胞活化肽、 促紅細胞生成素(EPO)、剝落毒素、成纖維細胞生長因子(TOF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、 生長因子、水蛭素、LFA-1、人胰島素、人胰島素樣生長因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干擾素、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11、IL-12、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、白血病抑制因子、神經(jīng)生長因子、PDGF、 肽激素、多效生長因子、熱原性外毒素Α、熱原性外毒素B、熱原性外毒素C、松弛素、促生長素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 1、人腫瘤壞死因子(hTNF)、人腫瘤壞死因子α、人腫瘤壞死因子β、Ras, Tat、炎性分子、信號轉(zhuǎn)導分子、牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)或BP320抗原。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述第一非天然氨基酸摻入所述載體多肽產(chǎn)生包含所述第一非天然氨基酸的HSA變體。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是對-乙?；奖彼帷?br> 10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸摻入所述HSA變體的氨基酸37位，其中氨基酸位置的編號根據(jù)SEQ ID NO 1的。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸在翻譯期間摻入所述HSA變體。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述第二非天然氨基酸摻入所述靶多肽產(chǎn)生包含所述第二非天然氨基酸的TSP-I變體。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述第二非天然氨基酸摻入所述靶多肽產(chǎn)生包含所述第二非天然氨基酸的ABT-510變體。
14.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是 ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述TSP-I變體的氨基酸6位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID NO 2的。
16.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸摻入所述TSP-I變體的氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID NO 2的。
17.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸在合成期間摻入所述TSP-I變體。
18.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID Ν0:3的。
19.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸摻入所述ΑΒΤ-510變體的氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照SEQ ID Ν0:3的。
20.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸在合成期間摻入所述ΑΒΤ-510變體。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體多肽是HSA變體，其中所述第一非天然氨基酸是對-乙?；奖彼?，其中所述對乙酰基苯丙氨酸在翻譯期間摻入所述HSA 變體的氨基酸37位，其中所述HSA變體中氨基酸位置的編號依照SEQ ID Ν0:1，其中所述靶多肽是TSP-I變體，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸，其中所述ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸在合成期間摻入所述TSP-I變體的氨基酸6位，其中所述TSP-I變體中氨基酸位置的編號依照SEQ ID NO :2，其中所述對-乙?；奖彼岷挺?(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生HSA-TSP-I偶聯(lián)物。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體多肽是HSA變體，其中所述第一非天然氨基酸是對-乙?；奖彼幔渲兴鰧σ阴；奖彼嵩诜g期間摻入所述HSA 變體的氨基酸37位，其中所述HSA變體中氨基酸位置的編號依照SEQ ID N0:1，其中所述靶多肽是ABT-510變體，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2_(氨基氧基)乙?；?_L_賴氨酸，其中所述ε_(2-(氨基氧基)乙?；?_L-賴氨酸在合成期間摻入所述ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位，其中所述ABT-510變體中氨基酸位置的編號依照SEQ ID N0:3，其中所述對-乙?；奖彼岷挺臺(2-(氨基氧基)乙酰基)-L_賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生 HSA-ABT-510 偶聯(lián)物。
23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通過一種或多種以下機制反應親電_親核反應、酮與親核試劑反應、肟連接、醛與親核試劑反應、羰基和親核試劑之間的反應、磺?；陀H核試劑之間的反應、酯化反應、位阻酯基和親核試劑之間的反應、硫酯基團和親核試劑之間的反應、穩(wěn)定的亞胺基和親核試劑之間的反應、環(huán)氧基團和親核試劑之間的反應、氮丙啶基團和親核試劑之間的反應、親電試劑和脂族胺或芳族胺之間的反應、親電試劑和酰胼之間的反應、親電試劑和碳酰胼之間的反應、親電試劑和氨基脲之間的反應、親電試劑和氨基硫脲之間的反應、親電試劑和羰基酰胼之間的反應、親電試劑和硫代羰基酰胼之間的反應、親電試劑和磺?；ｋ葜g的反應、親電試劑和卡巴胼之間的反應、親電試劑和硫卡巴胼之間的反應、親電試劑和羥胺之間的反應、親核試劑或親核試劑，例如羥基或二醇和硼酸或酯之間的反應、過渡金屬催化的反應、鈀催化的反應、銅催化的雜原子烷化反應、環(huán)加成反應、1，3環(huán)加成反應、2，3環(huán)加成反應、炔-疊氮化物反應、 狄爾斯_阿德爾反應或鈴木偶聯(lián)反應。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述反應的效率大于50%、大于70 %或大于 90%。
25.一種通過權利要求1所述方法產(chǎn)生的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物。
26.如權利要求25所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽是包含至少一個所述第一非天然氨基酸的HSA變體，且所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的TSP-I變體。
27.如權利要求25所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽是包含至少一個所述第一非天然氨基酸的HSA變體，所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的 ABT-510 變體。
28.如權利要求26或27所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是對_乙?；奖彼帷?br> 29.如權利要求28所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第一氨基酸摻入所述HSA變體的氨基酸37位，其中氨基酸位置的編號根據(jù)SEQ ID NO :1的。
30.如權利要求29所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第一氨基酸在翻譯期間摻入所述HSA變體。
31.如權利要求26或27所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第二氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸。
32.如權利要求31所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述TSP-I變體的氨基酸6位，其中氨基酸位置的編號是依照 SEQ ID NO 2 的。
33.如權利要求31所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述TSP-I變體的氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照 SEQ ID NO 2 的。
34.如權利要求32或33所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期間摻入所述TSP-I變體。
35.如權利要求31所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述ΑΒΤ-510變體的氨基酸6位，其中氨基酸位置的編號是依照 SEQ ID NO :3 的。
36.如權利要求31所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸摻入所述ΑΒΤ-510變體的氨基酸1位，其中氨基酸位置的編號是依照 SEQ ID NO :3 的。
37.如權利要求35或36所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期間摻入所述TSP-I變體。
38.如權利要求26所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽是在氨基酸37位包含對乙?；奖彼岬腍SA變體，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含 ε -(2_(氨基氧基)乙?；?-L_賴氨酸的TSP-I變體，其中所述對_乙?；奖彼岷?ε _(2-(氨基氧基)乙?；?_L-賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。
39.如權利要求26所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽是在氨基酸37位包含對乙?；奖彼岬腍SA變體，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含 ε -(2_(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸的ΑΒΤ-510變體，其中所述對-乙酰基苯丙氨酸和 ε _(2-(氨基氧基)乙?；?_L-賴氨酸通過肟連接反應以產(chǎn)生所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物。
40.如權利要求25所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物的血清半衰期長于所述靶多肽。
41.一種載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其包含包含第一非天然氨基酸殘基的載體多肽結(jié)構域；和包含第二非天然氨基酸殘基的靶多肽結(jié)構域，其中所述載體多肽結(jié)構域和靶多肽結(jié)構域通過所述第一和第二非天然氨基酸殘基偶聯(lián)在一起。
42.如權利要求41所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽結(jié)構域包含抗體、抗體片段、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反應性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔賊血藍蛋白(KLH)、離子載體蛋白、?；d體蛋白、信號轉(zhuǎn)導銜接蛋白、 雄激素結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、血漿銅藍蛋白、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、f_盒蛋白、脂肪酸-結(jié)合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相關蛋白、GTP-結(jié)合蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、鐵-結(jié)合蛋白、潛在TGF-β結(jié)合蛋白、光-收集蛋白復合物、淋巴細胞抗原、膜轉(zhuǎn)運蛋白、神經(jīng)垂體素運載蛋白、周質(zhì)結(jié)合蛋白、磷酸_結(jié)合蛋白、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白、 磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、視黃醇_結(jié)合蛋白、RNA-結(jié)合蛋白、S-期激酶-相關蛋白、性激素-結(jié)合球蛋白、甲狀腺素-結(jié)合蛋白、鈷胺素傳遞蛋白、皮質(zhì)激素傳遞蛋白、運鐵蛋白-結(jié)合蛋白或維生素D-結(jié)合蛋白。
43.如權利要求41所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述靶多肽結(jié)構域包含以下一種或多種TSP-1、ABT-510、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)、甲狀旁腺激素(PTH)、核糖體滅活蛋白(RIP)、血管抑素、艾賽那肽_4、脫輔基蛋白、心房鈉尿因子、心房利鈉多肽、 心房肽、C-X-C 趨化因子、了39765、嫩？-2丄嫩-7841~0-&41~0-13 41~0-(；、1卩-10、6。卩-2、嫩？-4、 PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細胞因子、CC趨化因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎性蛋白-1 α、單核細胞炎性蛋白-1 β、RANTES、 I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40 配體、補體抑制劑、細胞因子、上皮嗜中性粒細胞活化肽-78、GRO α、MGSA、GRO β、GRO γ、MIPl-α、 MIPl-β、MCP-1、上皮嗜中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素(EPO)、剝落毒素、成纖維細胞生長因子(FGF)、FGF21、G-CSF、 促性腺激素、生長因子、水蛭素、LFA-1、人胰島素、人胰島素樣生長因子(hIGF)、hIGF-I、 hIGF-II、人干擾素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、白血病抑制因子、 神經(jīng)生長因子、PDGF、肽激素、多效生長因子、熱原性外毒素Α、熱原性外毒素B、熱原性外毒素C、松弛素、促生長素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 、人腫瘤壞死因子(hTNF)、人腫瘤壞死因子α、人腫瘤壞死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信號轉(zhuǎn)導分子、牛胰蛋白酶抑制劑 (BPTI)或 BP320 抗原。
44.如權利要求41所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽結(jié)構域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸殘基是對乙?；奖彼幔渲兴霭卸嚯慕Y(jié)構域包含TSP-1，其中所述第二非天然氨基酸殘基是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸。
45.如權利要求41所述的載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體多肽結(jié)構域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸殘基是對乙?；奖彼?，其中所述靶多肽結(jié)構域包含ABT-510，其中所述第二非天然氨基酸殘基是ε-(2-(氨基氧基)乙?；?_L_賴氨酸。
46.如權利要求41所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通過一種或多種以下機制共價偶聯(lián)親電-親核反應、酮與親核試劑反應、肟連接、醛與親核試劑反應、羰基和親核試劑之間的反應、磺?；陀H核試劑之間的反應、酯化反應、位阻酯基和親核試劑之間的反應、硫酯基團和親核試劑之間的反應、穩(wěn)定的亞胺基和親核試劑之間的反應、環(huán)氧基團和親核試劑之間的反應、氮丙啶基團和親核試劑之間的反應、親電試劑和脂族胺或芳族胺之間的反應、親電試劑和酰胼之間的反應、親電試劑和碳酰胼之間的反應、親電試劑和氨基脲之間的反應、親電試劑和氨基硫脲之間的反應、親電試劑和羰基酰胼之間的反應、親電試劑和硫代羰基酰胼之間的反應、親電試劑和磺?；ｋ葜g的反應、親電試劑和卡巴胼之間的反應、親電試劑和硫卡巴胼之間的反應、親電試劑和羥胺之間的反應、親核試劑或親核試劑，例如羥基或二醇和硼酸或酯之間的反應、過渡金屬催化的反應、鈀催化的反應、銅催化的雜原子烷化反應、環(huán)加成反應、1，3環(huán)加成反應、2，3環(huán)加成反應、炔_疊氮化物反應、狄爾斯_阿德爾反應或鈴木偶聯(lián)反應。
47.一種細胞，其包含權利要求31所述的載體多肽_靶多肽偶聯(lián)物。
48.如權利要求47所述的細胞，其特征在于，所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的載體多肽結(jié)構域包含含有所述第一非天然氨基酸的HSA變體。
49.如權利要求48所述的細胞，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是對_乙?；奖彼?。
50.如權利要求47所述的細胞，其特征在于，所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的靶多肽結(jié)構域包含含有所述第二非天然氨基酸的TSP-I變體。
51.如權利要求47所述的細胞，其特征在于，所述載體多肽-靶多肽偶聯(lián)物的靶多肽結(jié)構域包含含有所述第二非天然氨基酸的ABT-510變體。
52.如權利要求5 0或51所述的細胞，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是 ε-(2-(氨基氧基)乙?；?-L-賴氨酸。
全文摘要
提供制備載體多肽的方法，該方法包括將第一非天然氨基酸摻入載體多肽變體，將第二非天然氨基酸摻入靶多肽變體，使該第一和第二非天然氨基酸反應以產(chǎn)生偶聯(lián)物。還提供了采用所提供方法產(chǎn)生的偶聯(lián)物。此外，還提供了甲基營養(yǎng)酵母菌中的正交翻譯系統(tǒng)和利用這些系統(tǒng)產(chǎn)生包含非天然氨基酸的載體和靶多肽變體的方法。
文檔編號C12N5/10GK102307905SQ200980156791
公開日2012年1月4日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權日2008年12月10日
發(fā)明者P·G·舒爾茨, T·楊 申請人:斯克利普斯研究院