專利名稱：在纖維二糖脫氫酶存在下增加纖維素材料水解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在纖維二糖脫氫酶存在下增加用酶組合物進行的纖維素材料水解的方法。相關(guān)技術(shù)纖維素是單糖葡萄糖通過β -1，4_鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β -連接葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，使其對纖維二糖水解酶的攻擊開放。纖維二糖水解酶接著從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-連接二聚體。β-葡糖苷酶水解纖維二糖為葡萄糖。纖維二糖脫氫酶作為多種真菌物種的纖維素降解蛋白體的組分分泌。該酶為單亞基、多域的催化纖維二糖至纖維二糖酸內(nèi)酯的氧化的酶，同時還原多種底物。氧化底物很大程度上取決于具體的纖維二糖脫氫酶，并包括但不限于鐵、氧化的分類、細胞色素C、金屬離子和分子氧。已提出或提示纖維二糖脫氫酶活性的幾種生物功能。其包括但不限于過氧化氫自由基介導(dǎo)的纖維素剪切，脫木質(zhì)化，木侵襲(wood invasion)，病原體防御和混合真菌群體中的選擇優(yōu)勢。已顯示纖維二糖脫氫酶參與纖維素的解聚，其已歸于在纖維二糖和!^e(II) 或其他還原金屬的存在下由纖維二糖脫氫酶(Mansfield等，1997，Appl. Environ. Microbiol. 63 (10) :3804-3809)生成活性氧物質(zhì)(R0Q。亦將脫木質(zhì)化功能歸于纖維二糖脫氫酶，同樣是與漆酶或木質(zhì)素過氧化物酶一同生成R0S。亦提出ROS的纖維二糖脫氫酶生成可能為針對利用木素纖維素的病原體和更具攻擊性的真菌菌種的防衛(wèi)機理。盡管本領(lǐng)域提出當添加至纖維素酶混合物時，纖維二糖脫氫酶具有解聚作用，因此具有溫和的增強作用(Mansfield等，1997，見上)，本發(fā)明觀察到纖維二糖脫氫酶對于纖維素酶組合物可具抑制性。本發(fā)明提供了用于減少纖維二糖脫氫酶對酶組合物進行的纖維素材料水解的抑制作用的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括用包含一種或多種(幾種) 纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的酶組合物處理纖維素材料。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括
(a)用包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明進一步涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的酶組合物水解。附圖簡述

圖1顯示嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)纖維二糖脫氫酶在具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus) GH61A肽存在和不存在下對里氏木霉纖維素分解酶組合物水解微晶纖維素的作用。嗜熱毀絲霉纖維二糖脫氫酶和桔橙熱子囊菌GH61A多肽表示為相對于里氏木霉纖維素酶組合物的基礎(chǔ)加載，每克纖維素蛋白mg數(shù)的百分比增加(percent addition)。顯示了來自三次重復(fù)水解的誤差棒。圖2顯示了特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)纖維二糖脫氫酶在具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌GH61A肽存在和不存在下對里氏木霉纖維素分解酶組合物水解微晶纖維素的作用。特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶和桔橙熱子囊菌GH61A多肽表示為相對于里氏木霉纖維素酶組合物的基礎(chǔ)加載，每克纖維素蛋白mg數(shù)的百分比增加。顯示了來自三次重復(fù)水解的誤差棒。圖3顯示了嗜熱毀絲霉纖維二糖脫氫酶(CBDH)在具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌GH61A肽存在和不存在下(GH61A)對里氏木霉纖維素分解酶組合物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈的作用。嗜熱毀絲霉纖維二糖脫氫酶和桔橙熱子囊菌GH61A多肽表示為相對于里氏木霉纖維素酶組合物的基礎(chǔ)加載，每克纖維素蛋白mg數(shù)的百分比增加。顯示了來自三次重復(fù)水解的誤差棒。圖4顯示了特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶、具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌GH61A和米曲霉(Aspergillus oryzae) CEL3A β -葡糖苷酶的組合對微晶纖維素的水解的作用。特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶、桔橙熱子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3A β -葡糖苷酶表示為相對于里氏木霉纖維素酶組合物的基礎(chǔ)加載，每克纖維素蛋白mg數(shù)的百分比增加。顯示了來自三次重復(fù)水解的誤差棒。圖5顯示了特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶、具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3Ai3 -葡糖苷酶對磷酸溶脹的纖維素的水解的作用。圖6顯示了特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的桔橙熱子囊菌GH61A多肽對米曲霉CEL3Ai3 -葡糖苷酶轉(zhuǎn)化細菌纖維素的作用。特異腐質(zhì)霉纖維二糖脫氫酶、桔橙熱子囊菌GH6IA多肽和米曲霉CEL3A β -葡糖苷酶表示為每克纖維素蛋白mg 數(shù)的百分比增加。顯示了來自三次重復(fù)水解的誤差棒。定義纖維素分解增強活性術(shù)語“纖維素分解增強活性”在本文中定義為增強具有纖維素分解活性的多肽水解纖維素材料的生物學(xué)活性。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素酶蛋白在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性l_50mg總蛋白/g PCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99. 5% w/w的纖維素分解蛋白，及0.5-50% w/w的具有纖維素分解增強活性的蛋白質(zhì)，在50-65°C 歷時1-7天，與用相等的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素酶蛋白 /g PCS中的纖維素)所進行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，在總蛋白重量的3% 的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的 3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)存在下使用 CELLUCLAST 1. 5L (Novozymes A/S，Bagsvaerd, Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強活性的多肽通過降低達到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的多肽催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1. 01 倍，更優(yōu)選至少1. 05倍，更優(yōu)選至少1. 10倍，更優(yōu)選至少1. 25倍，更優(yōu)選至少1. 5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族61糖苷水解酶術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定義為根據(jù)Henrissat B. ,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem. J. 280 :309_316，及Henrissat B. JfIBairoch A. , 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat將GH61家族列為未分類的，這表明對屬于該家族的多肽，如機理，催化性親核體/堿以及催化性質(zhì)子供體等性質(zhì)是未知的。纖維二糖脫氫酶術(shù)語“纖維二糖脫氫酶”在本文中定義為纖維二糖受體1-氧化還原酶(E. C. 1. 1.99. 18)，其在受體存在下催化纖維二糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖酸-1，5-內(nèi)酯和還原的受體。2，6_ 二氯靛酚可充當受體，鐵，特別是!^e(SCN)3、分子氧、泛醌或細胞色素 C以及可能的許多其他多酚類亦可。該酶的底物包括纖維二糖、纖維寡糖、乳糖和D-葡糖基-1，4-β-D-甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露二糖、硫代纖維二糖(thiocellobiose)、半乳糖基-甘露糖、木二糖、木糖。電子供體優(yōu)選為在還原端具有葡萄糖或甘露糖的β-1-4 二己糖，盡管α-1-4己糖苷、己糖、戊糖和β-1-4五鄰體(pentomer)亦顯示充當這些酶的底物(Henriksson 等，1998, Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology ；1383 :48-54 ；禾口 Schou 等，1998，Biochem. J. 330 :565-571)。纖維二糖脫氫酶包含兩個家族，1和2，其差異在于纖維素結(jié)合基序(CBM)的存在。 纖維二糖脫氫酶的3維結(jié)構(gòu)特征在于兩個球狀域，每個含有兩個輔酶之一血紅素或黃素。 活性位點位于兩個域之間的縫隙。纖維二糖脫氫酶的催化循環(huán)遵循有序的順序機理。纖維二糖的氧化通過從纖維二糖至黃素的2電子轉(zhuǎn)移發(fā)生，生成纖維二糖酸-1，5-內(nèi)酯和還原的黃素?；钚訤AD通過電子轉(zhuǎn)移至血紅素基團而再生，留下還原的血紅素。天然狀態(tài)的血紅素通過與氧化底物在第二活性位點反應(yīng)來再生。氧化底物優(yōu)選為鐵氰化鐵(iron ferricyanide)、細胞色素C或氧化的酚類化合物如二氯靛酚(DCIP)，其為常用于色度法測定的底物。金屬離子和O2亦為底物，但對于大多數(shù)纖維二糖脫氫酶，對于這些底物的反應(yīng)速率比對于鐵或有機氧化劑觀察到的要低幾個數(shù)量級。在纖維二糖酸內(nèi)酯釋放之后，產(chǎn)物可進行自發(fā)的開環(huán)以生成纖維二糖酸(Hal Iberg等，2003，J. Biol. Chem. 278 :7160-7166)。纖維素分解活性術(shù)語“纖維素分解活性”在本文中定義為水解纖維素材料的生物學(xué)活性。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測量總纖維素分解活性，和(2) 測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如^iang 等，Outlook for cellulase improvement-Screening and selection strategies,2006, Biotechnology Advances M :452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatman No. 1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、 棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatman No. 1 濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由hternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987, Measurement of cellulase activities, Pure App1. Chem. 59 :257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中纖維素在50-65°C進行3-7日，與未添加纖維素分解蛋白的對照水解相比較。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉，pH 5，ImM MnSO4, 50-65°C，72小時，通過 AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA)進行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)切-1，4-(1，3 ；1， 4)-β-D-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0-D-glucan 4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合的β-1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素成分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，Biotechnology Advances 24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268的方法，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β_1，4-連接葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997, Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of eellobiohydroIases, Trends in Biotechnology 15 :160-167 ；Teeri 等，1998, Trichoderma reesei eellobiohydrolases why so efficient on crystalline cellulose ？ ,Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù) van Tilbeurgh 等，1982，F(xiàn)EBS Letters 149 152-156 及 van Tilbeurgh 和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBS Lettersl87 :283-288描述的方法使用熒光性二糖衍生物4-甲基傘形基-β -D-乳糖苷來測定纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶術(shù)語“β-葡糖苷酶”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原 β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum !production,purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42 :55-66^基本方法測定葡糖苷酶活性。一個單位的葡糖苷酶活性定義為在40°C，ρΗ 5，以 ImM對硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷為底物，在含有0. 01 %TWEEN 20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾對硝基苯酚。木聚糖降解活性術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定義為水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和( 測定單獨的木聚糖分解活性(內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。 最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結(jié)于幾個公開文獻中，包括Biely和Puchard，Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) : 1636-1647 ;Spanikova 禾口 Biely,2006, Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by SchizophylIum commune, FEBS Letters 580(19) :4597-4601 ；Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely 禾口 Kubicek,1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321:375—381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括燕麥小麥(oat spelt)、山毛櫸木(beectiwood)和落葉松木(Iarctiwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。 最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖， 如 Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3) :257-270 中所述。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St. Louis, MO, USA)水解的增加來確定的 Iml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉pH 5， 50 °C, 24 小時，如 Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279所述使用對羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測定法進行糖分析。木聚糖酶活性術(shù)語“木聚糖酶活性”在本文中定義為1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(Ε. C. 3. 2. 1.8)，其催化木聚糖中l(wèi)，4-i3-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在 500C，pH 5從每升2g樺木木聚糖作為底物在含有0. 01%TWEEN 20的50mM乙酸鈉中水解的起始期間每分鐘產(chǎn)生ι. O μ mol還原糖(以葡萄糖當量(glucose equivalents)測定， 如 Lever,1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279 所述)。β -木糖苷酶活性術(shù)語“ β -木糖苷酶活性”在本文中定義為β -D木糖苷木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短β (1 — 4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的木糖苷酶活性定義為在 40°C, pH 5從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷在含有0.01%TWEEN 20的 IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1. O μ mol對硝基苯酚。
乙酰木聚糖酯酶活性術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定義為羧酸酯酶活性(EC 3. 1. 1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶?、乙?；咎?、乙?；咸烟?、乙酸α-萘酯 (alpha-napthyl acetate)禾口乙酸對石肖基苯酉旨(p—nitrophenyl acetate)的水角軍。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0. 5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0. 01%TWEEN 20的50mM乙酸鈉pH 5. 0中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶活性定義為能夠在pH 5， 25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolate anion)的酶量。阿魏酸酯酶活性術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)活性”在本文中定義為 EC 3. 1. 1. 73 (IUBMB Enzyme Nomenclature)中的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰糖水解酶酶活性，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸羥基-3-甲基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA, cinnAE、FAE-I 或 FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH 5. 0中的0. 5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH 5，25°C每分鐘釋放出1 μ mol對硝基苯酚陰離子的酶量。α-葡糖醛酸糖苷酶活性術(shù)語“α-葡糖醛酸糖苷酶活性”在本文中定義為 α -D-葡糖苷酸葡糖酸酸水角軍活性(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase activity) (EC 3. 2. 1. 139)，其催化α -D-葡糖苷酸水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)de Vries, 1998，J. Bacteriol. 180 :243-249確定的。 一個單位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能夠在pH 5，40°C每分鐘釋放出Iymol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性術(shù)語“ α _L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”在本文中定義為α -L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶活性(EC 3. 2. 1. 55)，其催化對α _L_阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶活性對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α -阿拉伯糖苷酶、α -L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200 μ 1的每ml的IOOmM乙酸鈉pH 5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木 MW (Megazyme International Ireland, Ltd. ，Bray, Co. fficklow) ^t 400Cii^f 30 中， 接著通過AMINEX HPX-87H 柱層析(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA) 的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)初生細胞壁 (primary cell wall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。 次生細胞壁(secondary cell wall)在細胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈 β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、 阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。
纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel 等，1995，于 Handbook on Bioethanol (Charles Ε· Wyman編)，pp. 105-118,Taylor & Francis,Washington D. C. ；ffyman, 1994,Bioresource Technology 50 :3-16 ；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 695-719 ;Mosier 等，，1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper 主編，Volume 65, pp. 23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素。在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。 在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。 在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面， 纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭。在另一個方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸稈術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸稈“在本文中定義為通過用熱和稀硫酸處理而源自玉米秸稈的纖維素材料。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10 %，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多 4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少 95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99% 純，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。所述多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多肽制備物基本上 (essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。
成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有纖維素分解增強活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本)中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性(longest identity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,見上文)的Needle程序(優(yōu)選3· 0· 0版或更高版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為在用多肽進行的tfasty搜索 (Pearson, W. R. ,1999, 于 Bioinformatics Methods and Protocols 中，S. Misener 禾口 S. A. Krawetz編，pp. 185-219)中E值(或期望值)小于0. 001的預(yù)測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽或其同源序列的氨基和/ 或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence) ”在本文中定義為從成熟編碼序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列，其中所述亞序列編碼具有生物活性的多肽片段。等位變體(allelic variant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。 在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10 %純，更優(yōu)選至少20 %純，更優(yōu)選至少40 %純，更優(yōu)選至少60 %純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5 %的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少 94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98% 純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99. 5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA 結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。 起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自 mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段。當所述核酸構(gòu)建體含有表達編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(control sequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的 (susceptible)。
修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入， 以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是由表達經(jīng)修飾而編碼多肽變體的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生的多肽。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(human intervention)，通過修飾多核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括用包含一種或多種(幾種) 纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，所述方法進一步包括回收所述經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的酶組合物糖化纖維素材料；(b) 用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(C) 從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明進一步涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的酶組合物水解。在一個方面，所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個方面，所述方法進一步包括從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。在上述每一個方法中，纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的存在與所述纖維二糖脫氫酶存在而所述具有纖維素分解增強活性的多肽不存在相比增加了酶組合物對所述纖維素材料的水解。本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料糖化為可發(fā)酵的糖，并將可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為許多有用物質(zhì)，例如化學(xué)品和燃料。從纖維素材料產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解 (糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明纖維素材料的加工可使用本領(lǐng)域常規(guī)工藝達成。而且，本發(fā)明的方法可使用任何配置為依照本發(fā)明運作的常規(guī)生物質(zhì)加工裝置實施。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個步驟中組合(Philippidis，G. P.，1996，Cellulose bioconversion technology, 于 Handbook on Bioethanol Production and Utilization, ffyman, C. E 編，Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212)。SSCF 包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan, J.，和 Himmel， Μ. ,1999, Enzymes, energy and the environment :A strategic perspective on the U. S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15 :817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨的水解步驟，所述步驟可以在同一個反應(yīng)器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，S卩，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個或多個(幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L. R.，Weimer, P. J.，vm Zyl， W. H.，禾口 Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization-Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66 :506-577)。在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中任何已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(Fernanda de Castilhos Corazza, Flavio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin 禾口 Ivo Neitzel，2003， Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology25 :33-38 ； Gusakov, A. V.，禾口 Sinitsyn，A. P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose :1. A mathematical model for a batch reactor process，Enz. Microb. Technol. 7 :346-352)、研磨反應(yīng)器(Ryu, S. K.，和 Lee，J. Μ.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol·Bioeng· 25 :53-65)， 或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，Α. V.，Sinitsyn, Α. P.，Davydkin, I. Y.，Davydkin, V. Y.，Protas，0. V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl. Biochem. Biotechnol. 56 :141-153)。其它反應(yīng)器類型包括 流化床、升流層、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細胞壁的纖維素材料成分(Chandra等，2007，Substrate pretreatment :The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics ？ Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108 :67-93 ；Galbe 禾口 Zacchi，2007，Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production，Adv. Biochem.Engin./ Biotechnol. 108 :41-65 ；Hendriks 禾口 Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol. 100 :10-18 ；Mosier 等，2005，F(xiàn)eatures of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass，Bioresource Technol. 96 :673-686 ；Taherzadeh 禾口 Karimi，2008，Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production A review, Iht.J. of Mol. Sci. 9 :1621-1651 ；Yang 禾口 Wyman，2008，Pretreatment : the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2 :26-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進行預(yù)浸泡、潤濕或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界吐0、臭氧和、輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進行。或者，預(yù)處理可以與酶水解同時進行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可以到達纖維素和其它部分，例如，半纖維素。將纖維素材料通過或穿過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選 170-190°C進行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學(xué)催化劑的加入。蒸汽預(yù)處理的停留時間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和任何化學(xué)催化劑的加入。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，使得纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后對物質(zhì)的爆炸放料(explosive discharge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流， 以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff禾口 Murray, 1996，Bioresource Technology 855 1-33 ；Galbe 和 Zacchi，2002，Appl. Microbiol. Biotechnol. 59 :618-628 ；美國專利申請 No. 20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如或SO2(通常0. 3至3% w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并促進酶水解(Ballesteros等，2006，Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132 :496-508 ；Varga ^,2004, Appl.Biochem. Biotechnol. 113-116 509-523 ；Sassner 等，2006，Enzyme Microb. Technol. 39 :756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理術(shù)語“化學(xué)處理“指能促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/ 或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、 濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是吐504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓。可以用很多反應(yīng)器設(shè)計進行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray， 1996, supra ；Schell 等，2004，Bioresource Technol. 91 :179-188 ；Lee 等，1999，Adv. Biochem.Eng. Biotechnol. 65 :93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85_150°C的低溫進行石灰預(yù)處理，停留時間從1 小時到幾天(Wyman 等，2005，Bioresource Technol. 96 :1959-1966 ；Mosier 等，2005， Bioresource Technol. 96 :673-686) WO 2006/11089UW0 2006/118099,WO 2006/110900 和WO 2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180_22(TC進行5_15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt 禾口 Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64 :139-151 ；Palonen 等， 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117 1-17 ；Varga ^,2004, Biotechnol. Bioeng. 88 567-574 ;Martin 等，2006，J. Chem. Technol. Biotechnol. 81 :1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選 1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。
濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。 然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W0 2006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨處理纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達60% (Gollapalli等，2002， Appl. Biochem. Biotechnol. 98 :23_35 ；Chundawat 等，2007, Biotechnol. Bioeng. 96 219-231 ；Alizadeh 等，2005，Appl. Biochem. Biotechnol. 121 :1133-1141 ；Teymouri 等， 2005，Bioresource Technol. 96 :2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇00-60%乙醇)在160-200°c提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol. Bioeng. 90 :473-481 ；Pan等， 2006，Biotechnol. Bioeng. 94 :851-861 ；Kurabi 等，2005，Appl. Biochem. Biotechnol. 121 219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實例如Schell等，2003，Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108 :ρ· 69-85，和 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686，和美國專利公開申請2002/0164730所述。在一個方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸 (mild acid)處理進行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、 酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的 PH范圍內(nèi)進行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0. 01至20wt%酸，更優(yōu)選0. 05至IOwt %酸，甚至更優(yōu)選0. 1至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2. Owt %酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸， 并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持數(shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60 分鐘的時間。在另一個方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進行。在另一個方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。 預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機械預(yù)處理術(shù)語“機械預(yù)處理”指各種類型的研磨或碾磨(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。物理預(yù)處理術(shù)語“物理預(yù)處理”指促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/ 蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指優(yōu)選約 300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi 的壓力。在另一個方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自 Sunds Defibrator AB, Sweden 的 Sunds Hydrolyzer 中進行。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對纖維素材料進行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時進行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機械預(yù)處理。因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進行機械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu, 1996, Pretreatment of biomass，于 Handbook on Bioethanol Production and Utilization，Wyman，C. E 編，Taylor &Francis,Washington,DC,179-212 ； Ghosh 禾口 Singh，1993， Physicochemical and biological treatments for enzymatic/ microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. App1. Microbiol.39 295-333 ；McMillan，1994，Pretreating lignocellulosic biomass :a review, 于 Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel, Baker 禾口 Overend 編，ACS Symposium Series 566， American Chemical Society, Washington， DC， chapter 15 ；Gong, Cao, Du 禾口 Tsao，1999，Ethanol production from renewable resources，于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper 編，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65 :207-241 ；Olsson 禾口 Hahn-Hagerdal，1996，F(xiàn)ermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz. Microb. Tech. 18 312—331 ；禾口Vallander禾口Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials :State of the art，Adv.Biochem. Eng. /Biotechnol. 42 :63-95)0趣化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將纖維素材料例如所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料水解以將纖維素和任選地也將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、 木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物在具有本發(fā)明[酶] 活性的多肽存在下以酶法進行。所述組合物可進一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進行。 在一個優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進行。水解可以以補料批式或連續(xù)的過程進行，其中將預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的處理時間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達 200小時，但是通常優(yōu)選進行約12至約96小時，更優(yōu)選約16至約72小時，并且最優(yōu)選約 24至約48小時。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且最優(yōu)選約40°C 至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3. 5至約7，并且最優(yōu)選約4至約 6，特別是約pH 5。干燥固體含量優(yōu)選約5至約50wt%，更優(yōu)選約10至約40wt%，并且最優(yōu)選約20至約30wt%。具有纖維素分解增強活性的多肽和酶的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、含纖維素底物、含纖維素底物的濃度、含纖維素底物的預(yù)處理、溫度、時間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白對于纖維素材料的有效量是約0. 5至約 50mg，優(yōu)選約0. 5至約40mg，更優(yōu)選約0. 5至約25mg，更優(yōu)選約0. 75至約20mg，更優(yōu)選約0. 75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0. 5至約10mg，并且最優(yōu)選約2. 5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維二糖脫氫酶的有效量是約0. 01至約50mg，優(yōu)選約0. 5至約40mg，更優(yōu)選約0. 5至約25mg，更優(yōu)選約0. 75至約20mg，更優(yōu)選約0. 75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0. 5至約IOmg且最優(yōu)選約2. 5至約IOmg 每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0. 01至約50. Omg,優(yōu)選約0. 01至約40mg，更優(yōu)選約0. 01至約30mg，更優(yōu)選約0. 01至約20mg，更優(yōu)選約0. 01至約10mg，更優(yōu)選約0. 01至約5mg，更優(yōu)選約0. 025至約1. 5mg,更優(yōu)選約0. 05至約1. 25mg,更優(yōu)選約0. 075至約1. 25mg,更優(yōu)選約0. 1至約1. 25mg,甚至更優(yōu)選約0. 15至約1. 25mg,并且最優(yōu)選約0. 25至約1. Omg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽對于纖維素分解蛋白的有效量是約0. 005至約1. Og,優(yōu)選約0. 01至約1. Og,更優(yōu)選約0. 15至約0. 75g，更優(yōu)選約 0. 15至約0. 5g，更優(yōu)選約0. 1至約0. 5g，甚至更優(yōu)選約0. 1至約0. 5g，并且最優(yōu)選約0. 05 至約0. 2g每g纖維素分解蛋白。發(fā)璧。可通過一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物，發(fā)酵從經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨或同時的。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇底物，如本領(lǐng)域中所公知。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(；和/或C5發(fā)酵生物體，或它們的組合。C6和C5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成理想的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細菌和真菌發(fā)酵生物體的實例如Lin等，2006，Appl. Microbiol. Biotechnol. 69 :627-642 所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌禾中，優(yōu)選酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬(Pichia)，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS 5773;假絲酵母屬(Candida)，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、 蕓薹假絲酵母(Candida brassicae)、休哈塔假絲酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candida diddensii)、偽熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis)的其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運動發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)；漢遜酵母屬(Hansenula)，如異常漢遜酵母(Hansenula anomala)； 克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，如脆壁克魯維酵母(K. fragilis)；裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S. pombe)；和大腸桿菌(E. coli)的菌株，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株。在一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) 0在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面， 酵母是假絲酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是 Clavispora Opuntiae0在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus) 0在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomyces clausenii) (Philippidis, G. P. , 1996, Cellulose bioconversion technology,于 Handbook on Bioethanol Production and Utilization, ffyman, C. E.編， Taylor & Francis, Washington,DC, 179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括，例如，運動發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum) (Philippidis, 1996，見上文)。在一個優(yōu)選的方面，細菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細菌是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOL RED 酵母(可從Red Mar/Lesaffre，USA 獲得)、FALI (可從 Fleischmann，s Yeast,Burns Philp Food Inc., USA 的部門獲得)、SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鮮酵母(可從 Khanol Technology, WI, USA 獲得)、BIOFERM AFT 和 XR(可從 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA，USA 獲得)、GERT STRAND (可從 Gert Strand AB，Sweden 獲得)和 FERMIOL (可從 DSM Specialties 獲得)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen 禾口 Ho，1993， Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl. Biochem. Biotechnol.39-40 135-147 ；Ho 等，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl.Environ. Microbiol. 64 :1852-1859 ；Kotter 禾口 Ciriacy，1993，Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae，Appl. Microbiol. Biotechnoi. 38 :776-783 ；Walfridsson 等，1995， Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLl and TALI genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase,Appl. Environ. Microbiol. 61 :4184-4190 ；Kuyper 等， 2004， Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation :a proof of principle， FEMS Yeast Research 4 655-664 ；Beall1991,Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech. Bioeng. 38 :296-303 ；Ingram 等，1998， Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnoi. Bioeng. 58 :204-214 ；Zhang 等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267 :240-243 ;Deanda等，1996， Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl. Environ. Microbiol. 62 :4465-4470 ；WO 2003/062430,xylose isomerase)0在一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) 0在另一個優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進行約8至約96小時，如約M至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH 3至約pH 8，如約pH 4-5,6或7。在一個優(yōu)選的方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進行約12至約96小時，如通常為M-60小時發(fā)酵。在一個優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約 60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且 PH通常為約pH 3至約pH 7，優(yōu)選約pH 4_7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOltl,特別是約2 χ IO8 活細胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進行發(fā)酵的進一步指導(dǎo)可以在例如“The Alcohol Textbook，，(K. Jacques, Τ. P. Lyons 禾口 D. R. Kelsall 編，Nottingham University Press, United Kingdom 1999)中找到，其通過提述并入本文。對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進一步改進發(fā)酵工藝， 而且特定地，改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇 (meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、 B、C、D 禾口 E。參見,例如，Alfenore 等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag (2002)，其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的仵何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇 (例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機酸(例如， 乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5- 二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、 丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。 發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖牵g(shù)語“醇”包括包含一個或多個羥基基團的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如， Gong, C. S. , Cao, N. J. , Du, J.,禾口 Tsao, G. Τ. , 1999, Ethanol production from renewable resources, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T.編，Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany,65 :207-241 ；Silveira, Μ. Μ., 禾口 Jonas, R. ,2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59 :400-408 ；Nigam, P.,禾口 Singh, D. , 1995, Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute, Process Biochemistry 30(2) :117-124 ； Ezeji, T. C. , Qureshi, N.禾口 Blaschek, H. P. , 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOl and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6) :595_603o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面， 所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen, R.,禾口 Lee, Y. Y. , 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass,Appl. Biochem. Biotechnol. 63—65 :435_448。在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語“酮”包括含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek， 2003，見上文。在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard， A.,禾口 Margaritis,A. ,2004,Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering87(4) :501_515o在另一個優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和 K.Kiriyama,1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water Science and Technology 36 (6-7) 41-47 ；禾口 Gunaseelan V. N.于 Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114,1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production :A review。_可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、蒸餾或提取。例如， 通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇。可以獲得純度高達約96ν01%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。具有纖維素分解增強活性的多肽及其多核苷酸在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強活性的多肽。在一個方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口 [Fff]-[TF] -K-[AIV],其中X為任意氨基酸，XG，5)為在4或5個連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(4)是在 4個連續(xù)位置的任意氨基酸。具有上述所示的基序的多肽可進一步包含H-X(l, 2) -G-P-X (3) - [Yff] - [AILMV]，[EQ] -X-Y-X (2) -C-X-[EHQN] -[FILV] -X-[ILV]或H-X(l, 2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV] 和[EQ]-Χ—Υ—Χ(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X -[ILV],其中X為任意氨基酸，X(l，2)為在1個位置或2個連續(xù)位置的任意氨基酸，X(3) 為3個連續(xù)位置的任意氨基酸，而XO)為2個連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在一個優(yōu)選的方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽進一步包含H-X(l，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的分離的多肽包含[Εζ ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X- [ILV]。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強活性的多肽進一步包含 H-X (1，2) -G-P-X (3) -[YW] -[AILMV] 和[Εζ ] -Χ-Υ-Χ ⑵-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二個方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽具有下述基序[ILMV]-P-X(4，5)-G—x—Y-[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)~A~[HNQ]，其中X為任意氨基酸，X (4, 5)為在4或5個連續(xù)位置的任意氨基酸，而X (3)為3 個連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在第三個方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽包含與SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 16的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少 75 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少85 %、甚至更優(yōu)選至少90 %、最優(yōu)選至少95 %且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的氨基酸序列(下文中稱為 “同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽序列為SEQ ID NO :2的氨基酸20至326， SEQ ID NO 4的氨基酸18至239，SEQ ID NO 6的氨基酸20至258，SEQ ID NO 8的氨基酸 19 至 226，SEQ ID NO 10 的氨基酸 20 至 304，SEQ ID NO 12 的氨基酸 16 至 317，SEQ ID NO 14的氨基酸23至250或SEQ ID NO 16的氨基酸20至M9。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 2 的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸20至3 或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸20至 326。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :2的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :2的成熟多肽組成。 在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :2的氨基酸20至3 或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:2的氨基酸20至幻6組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 4 的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :4的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸18至239或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸18至 239。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :4的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :4的成熟多肽組成。 在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :4的氨基酸18至239或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:4的氨基酸18至239組成。
具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 6 的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :6的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :6的氨基酸20至258或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :6的氨基酸20至 258。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :6的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :6的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :6的成熟多肽組成。 在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :6的氨基酸20至258或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:6的氨基酸20至258組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :8的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :8的氨基酸19至2 或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO :8的氨基酸19至 226。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :8的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :8的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :8的成熟多肽組成。 在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO :8的氨基酸19至2 或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:8的氨基酸19至2 組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:10的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO: 10的氨基酸20至304或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:10的氨基酸 20至304。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 10的氨基酸序列或其等位變體， 或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由 SEQ ID NO :10的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 10的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO: 10的氨基酸20至304或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 10的氨基酸20至304組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:12的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO: 12的氨基酸16至317或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:12的氨基酸 16至317。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 12的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由 SEQ ID NO :12的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 12的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO: 12的氨基酸16至317或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 12的氨基酸16至317組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:14的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO: 14的氨基酸23至250或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:14的氨基酸 23至250。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 14的氨基酸序列或其等位變體， 或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由 SEQ ID NO :14的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 14的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO: 14的氨基酸23至250或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 14的氨基酸23至250組成。具有纖維素分解增強活性的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO 16的氨基酸序列或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID NO 16的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:16的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:16的氨基酸20至249或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQ ID N0:16的氨基酸 20至對9。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:16的氨基酸序列或其等位變體， 或其具有纖維素分解增強活性的片段的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽由 SEQ ID NO :16的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID N0:16的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 16的氨基酸20至249或其等位變體，或其具有纖維素分解增強活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQ ID NO 16的氨基酸20至249組成。優(yōu)選地，SEQ ID NO :2的成熟多肽的片段含有至少277個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少 287個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少297個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID NO :4的成熟多肽的片段含有至少185個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少195個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少205個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID NO :6的成熟多肽的片段含有至少200個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少 212個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少2 個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID NO :8的成熟多肽的片段含有至少175個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少185個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少195個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID NO: 10的成熟多肽的片段含有至少240個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少255個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少270個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID N0:12的成熟多肽的片段含有至少255個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少270個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少285個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID N0:14的成熟多肽的片段含有至少175個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少190個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少205個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID NO 16的成熟多肽的片段含有至少200個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少210個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少220個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少831個核苷酸，更優(yōu)選至少861個核苷酸，且最優(yōu)選至少891個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO :3的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少555個核苷酸，更優(yōu)選至少585個核苷酸，且最優(yōu)選至少615個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO :5的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少636個核苷酸，且最優(yōu)選至少672個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO :7的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少525個核苷酸，更優(yōu)選至少555個核苷酸，且最優(yōu)選至少585個核苷酸。 優(yōu)選地，SEQ ID NO :9的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少720個核苷酸，更優(yōu)選至少 765個核苷酸，且最優(yōu)選至少810個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO 11的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少765個核苷酸，更優(yōu)選至少810個核苷酸，且最優(yōu)選至少855個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO 13的核苷酸67至796的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少525個核苷酸，更優(yōu)選至少570個核苷酸，且最優(yōu)選至少615個核苷酸。優(yōu)選地，SEQ ID NO 15的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少630個核苷酸，且最優(yōu)選至少 660個核苷酸。在第四個方面，具有纖維素分解增強活性的多肽由在至少非常低嚴格條件，優(yōu)選至少低嚴格條件，更優(yōu)選至少中嚴格條件，更優(yōu)選至少中-高嚴格條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴格條件，且最優(yōu)選至少非常高嚴格條件下與下述雜交的多核苷酸編碼(i) SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO 15 的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO :13的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO :7、SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO :15 的基因組 DNA 序列，(iii) (i)或(ii)的亞序列，或(iv) (i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J. Sambrook，E. F. Fritsch 和 T. Maniatus，1989，見上)。 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13或SEQ ID NO :15的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸， 或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可編碼具有纖維素分解增強活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO :1的核苷酸388至1332， SEQ ID NO 3的核苷酸98至821，SEQ ID NO 5的核苷酸1 至978，SEQ ID NO 7的核苷酸 55 至 678，SEQ ID NO :9 的核苷酸 58 至 912，SEQ ID NO 11 的核苷酸 46 至 951，SEQ ID NO 13的核苷酸67至796或SEQ ID NO 15的核苷酸77至766。SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :8、SEQID N0:10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :14 或 SEQ ID NO 16的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少 25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？墒褂蒙踔粮L的探針，例如優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少700個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少 900個核苷酸長度的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常標記探針以探測相應(yīng)的基因(例如，用％P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。本發(fā)明涵蓋此類探針。因而，可從由此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自此類其他菌株的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的 DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQ ID NO :1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在 Sounthern 印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在如上文所述非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :15 的成熟多肽編碼序列；包含于SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 13的成熟多肽編碼序列中的 cDNA 序列，或包含 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 15的基因組DNA序列，其全長互補鏈，或它們的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :1的核苷酸388至1332。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :1。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30699中的質(zhì)粒PEJG120中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30699中的質(zhì)粒pEJG120 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :3的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :3的核苷酸98至821。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是 SEQ ID NO :3。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30813中的質(zhì)粒 pTter61C中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30813中的質(zhì)粒pTter61C 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :5的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :5的核苷酸1 至978。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是 SEQ ID NO :5。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30812中的質(zhì)粒 pTter61D中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30812中的質(zhì)粒pTter61D 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :7的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :7的核苷酸55至678。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是 SEQ ID NO :7。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30814中的質(zhì)粒 pTter61E中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30814中的質(zhì)粒pTter61E 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :9的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :9的核苷酸58至912。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是 SEQ ID NO :9。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30811中的質(zhì)粒 pTter61G中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30811中的質(zhì)粒pTter61G 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO 11的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :11的核苷酸46至951。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO=Il0在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-50044中的質(zhì)粒pTter61F中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-50044中的質(zhì)粒 pTter61F中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO 13的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :13的核苷酸67至796。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :14的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :13。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30704中的質(zhì)粒PDZA2-7中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30704中的質(zhì)粒pDZA2-7 中含有的成熟多肽編碼序列。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO 15的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :15的核苷酸77至766。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO :16的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO :15。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30878中的質(zhì)粒pTr333中含有的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRL B-30878中的質(zhì)粒pTr333 中含有的成熟多肽編碼序列。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在 42°C，在5X SSPE.0. 3% SDS、200 μ g/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍栏裥詾?0%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2X SSC,0.2% SDS優(yōu)選至少在 450C (非常低嚴格性)，更優(yōu)選至少在50°C (低嚴格性)，更優(yōu)選至少在55°C (中嚴格性)，更優(yōu)選至少在60°C (中-高嚴格性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C (高嚴格性)，并且最優(yōu)選至少在70°C (非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比牛艮據(jù) Bolton 禾口 McCarthy 計算法(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 :1390)得出的 Tm 低大約 5 °C 至大約 10°C，在 0. 9M NaCl，0. 09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA,0. 5 % NP-40，1 XDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸鈉(sodium pyrophosphate)，ImM 舞酸二S1I內(nèi)(sodium monobasic phosphate), 0. ImM ATP 禾口 0. 2mg 每 ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至 24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在 6 X SSC加0. 1 % SDS中洗滌一次15分鐘，并用6 X SSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第五個方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽是由包含與SEQ ID NO :1， SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :11，SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO 15的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少 70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %同一性程度的核苷酸序列，或由上述核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO 1的核苷酸388至1332， SEQ ID NO 3的核苷酸98至821，SEQ ID NO 5的核苷酸1 至978，SEQ ID NO 7的核苷酸 55 至 678，SEQ ID NO :9 的核苷酸 58 至 912，SEQ ID NO 11 的核苷酸 46 至 951，SEQ ID NO 13的核苷酸67至796或SEQ ID NO 15的核苷酸77至766。在第六個方面，所述具有纖維素分解增強活性的多肽是在SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :14 或 SEQ ID NO :16的成熟多肽或其同源序列中包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的人工變體。制備此種人工變體的方法如上文所述。SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :14或SEQ ID NO : 16成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)為10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選做多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，且甚至最優(yōu)選1。具有纖維素分解增強活性的多肽可從任何屬的微生物獲得，在一個優(yōu)選的方面， 從給定來源獲得的多肽分泌至胞外。具有纖維素分解增強活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus) > lif 屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬 (Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解增強活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E. coli)、假單胞菌屬O^eudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium) > iMlfliiM (Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬 (Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)屬多肽，其具有纖維素分解增強活性。在一個優(yōu)選方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的嗜堿芽孢桿菌 (Bacillus alkalophilus) > I ^jv^ifelf lif (Bacillus amyloliquefaciens)
菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的不產(chǎn)色鏈霉菌 (Streptomyces achromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)或淺青紫鏈霉菌 (Streptomyces lividans)多月太。具有纖維素分解增強活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽， 其具有纖維素分解增強活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬 (Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、 Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛 _ 殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬 (Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprmopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、 色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬 (Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬 (Irpex) > MSM (Lentinula) > Leptospaeria> |if M (Magnaporthe) > Melanocarpus> 多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬 (Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、 假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬 (Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有纖維素分解增強活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的卡爾酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母 (Saccharomyces oviformis)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強活性的解纖維枝頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、 黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌 (Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱子菌 (Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、租金抱子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicumΛ Chrysosporium zonatum、桿抱狀德抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、庫威 ,廉抱(Fusarium crookwellense)、大刀,廉抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、 合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色 ,廉抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusarium trichothecioides)、壤片德抱(Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicola lanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpex lacteus)、^ ■ € # (Mucor miehei)、口f % gi g _ (Myceliophthora thermophila)、 粗糙脈？包菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、 Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱殼 (Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、 卵抱梭抱殼(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、 毛梭抱殼(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭抱霉(Thielavia terrestris)、哈茨木毒(Trichoderma harzianum)、康寧木毒(Trichoderma koningii)、 長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉 (Trichoderma viride) Trichophaea saccata $月太0可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfect and imperfect states)，和其它分類學(xué)的等同物，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、 德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心 (Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern RegionalResearch Center) (NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等) 分離的微生物鑒定和獲得具有纖維素分解增強活性的多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA 文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989， 見上文)。可分離包含編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸并將其用于表達具有纖維素分解增強活性的多肽以供如本文中所述在本發(fā)明的方法中進行評價。所述多核苷酸包含編碼具有纖維素分解增強活性的多肽，與SEQ ID N0:1,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :11，SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 15的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的核苷酸序列。所述多核苷酸亦可為編碼具有纖維素分解增強活性的多肽的多核苷酸，其在至少非常低嚴格條件，優(yōu)選至少低嚴格條件，更優(yōu)選至少中嚴格條件，更優(yōu)選至少中-高嚴格條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴格條件，且最優(yōu)選至少非常高嚴格條件下與下述雜交(i) SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO :15 的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO :13的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 9,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴ 或(ii)的全長互補鏈；或如本文中定義的其等位變體和亞序列(J. Sambrook,E. F. Fritsch 和T.ManiatuS，1989，見上)。在一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID N0:1的核苷酸388至1332，SEQ ID NO 3的核苷酸98至821，SEQ ID NO 5的核苷酸1 至978， SEQ ID NO 7 的核苷酸 55 至 678，SEQ ID NO 9 的核苷酸 58 至 912，SEQ ID NO 11 的核苷酸46至951，SEQ ID NO 13的核苷酸67至796或SEQ ID NO 15的核苷酸77至766。如前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。纖維二糖脫氫酶及其多核苷酸在本發(fā)明的方法中，所述纖維二糖脫氫酶可為任何纖維二糖脫氫酶。所述纖維二糖脫氫酶可作為酶活性存在于酶組合物和/或作為添加至組合物的一種或多種(幾種)蛋白質(zhì)組分的組分存在。所述纖維二糖脫氫酶可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個方面，獲得自給定來源的多肽分泌至胞外。所述纖維二糖脫氫酶可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus) lifM (Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)纖維二糖脫氫酶；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E. coli)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium) lif 屬(IlycAacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)屬纖維二糖脫氫酶。在一個方面，所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)纖維二糖脫氫酶。在另一個方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Str印tococcus equisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)或馬鏈球菌獸癌亞禾中 (Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)纖維二糖脫氧酶。在另一個方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Sti^ptomyces achromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)或淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans)纖維二糖脫氫酶。所述纖維二糖脫氫酶也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)纖維二糖脫氫酶；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、 擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、 Claviceps> Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、 隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)HI^ (Diplodia) > H 耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬 (Holomastigotoides)、腐質(zhì)霄屬(Humicola)、奉巴齒菌屬(Irpex) > M M (Lentinula) > Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L 菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬 (Phanerochaete)(Piromyces) > Poitrasia>j[xllii|ifM (Pseudoplectania) > Pseudotrichonympha> 根毛霉屬(Rhizomucor)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬 (Xylaria)纖維二糖脫氫酶。
在另一個方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母 (Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)纖維二糖脫氧醜。在另一個方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、 Chrysosporium inops、 金抱子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、桿抱狀德抱(Fusarium bactridioides)、 禾谷鐮孢(Fusarium cerealis)、庫威鐮孢(Fusarium crookwellense)、大刀鐮孢 (Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖 ,廉抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木,廉抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱 (Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides)、壤片,廉抱(Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicola lanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpex lacteus)、米漂毛毒(Mucor miehei)、 嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱 平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱殼(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼(Thielavia ovispora)、 Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、 €包冑(Thielavia setosa)、 Thielavia subthermophila、zh ^ _、Pp1 ^ 7^ β (Trichoderma harzianum) λ ΙΜ " 木霉(Trichoderma koningii)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)纖維二糖脫氫酶。其他纖維二糖脫氫酶及其來源的實例列于表1.表1公幵的微生物纖維二糖脫氫酶序列
權(quán)利要求
1.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括用包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的酶組合物處理所述纖維素材料。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，進一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。
8.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生所述發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
10.權(quán)利要求8或11的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。
11.權(quán)利要求8-10任一項的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種) 選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。
12.權(quán)利要求8-11任一項的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。
13.權(quán)利要求8-12任一項的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。
14.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽的酶組合物水解。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
16.權(quán)利要求15的方法，進一步包括從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求14-16任一項的方法，其中所述纖維素材料在糖化之前或在發(fā)酵過程中經(jīng)預(yù)處理。
18.權(quán)利要求14-17任一項的方法，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β -葡糖苷酶。
19.權(quán)利要求14-18任一項的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種) 選自下組的酶半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。
20.權(quán)利要求14-19任一項的方法，其中所述酶組合物進一步包含一種或多種(幾種) 選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。
21.權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶、纖維二糖脫氫酶和具有纖維素分解增強活性的多肽降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，和發(fā)酵纖維素材料的方法。
文檔編號C12N9/42GK102325879SQ200980157176
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者E.弗拉森科, E.阿巴特, M.斯維尼 申請人:諾維信股份有限公司