專利名稱：改造植物熱穩(wěn)定的疾病抗性的制作方法
改造植物熱穩(wěn)定的疾病抗性聯(lián)邦資助研究聲明本工作得到了美國(guó)農(nóng)業(yè)部第2005-35100-16044號(hào)授權(quán)基金的資助。政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及植物的抗病性。植物病害所導(dǎo)致的作物減產(chǎn)對(duì)全球食物供應(yīng)和人類福祉的破壞是巨大的。植物所演化出的防御機(jī)制可抵御各種生物的侵襲以確保它們的存活和健康。這種植物免疫發(fā)生在多個(gè)水平，主要可分為2個(gè)類型(1，31)。一種是響應(yīng)多種病原體中共有分子的普遍抗性， 另一種是響應(yīng)病原體中毒性因子的“品種特異的”抗性。后者是通過(guò)宿主植物的抗病基因 (R)特異性地識(shí)別病原體中種屬特異的非毒性(Avr)基因所引發(fā)的(3 。這種“基因?qū)颉钡南嗷プ饔米罱K會(huì)引起快速有效的防御反應(yīng)，這包括一種被稱為超敏反應(yīng)(HR)的程序性細(xì)胞死亡，以此來(lái)限制病原體的生長(zhǎng)(3 。目前已經(jīng)對(duì)很多物種中的許多R基因進(jìn)行了分子克隆，其中最大類別的R蛋白含有“核苷酸結(jié)合”(NB)結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域(8，9)。Avr蛋白和R蛋白之間直接或者間接的相互作用可以激活下游信號(hào)傳導(dǎo)事件， 進(jìn)而導(dǎo)致局部的超敏反應(yīng)以及整個(gè)植物的系統(tǒng)獲得性抗性。植物的防御響應(yīng)受到多種環(huán)境因子所調(diào)節(jié)，包括光，濕度以及溫度。溫度變化會(huì)影響植物對(duì)細(xì)菌，真菌，病毒以及昆蟲的疾病抗性(34)。高溫通常會(huì)抑制植物的疾病抗性，這種現(xiàn)象被稱為“熱屏蔽效應(yīng)”。已有報(bào)道表明這種熱敏感性在許多R基因介導(dǎo)的疾病抵御響應(yīng)中都是存在的，例如煙草中N基因(35)介導(dǎo)的疾病抵御響應(yīng)，番茄中Mi基因(6)介導(dǎo)的疾病抵御響應(yīng)，擬南芥中的RPW8基因(36)介導(dǎo)的疾病抵御響應(yīng)，以及擬南芥中的SNCl基因(7)介導(dǎo)的疾病抵御響應(yīng)。因此，本領(lǐng)域中迫切需要提供一種技術(shù)，該技術(shù)可以提高植物對(duì)溫度的耐受性從而避免高溫對(duì)疾病抵御響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。所以，本領(lǐng)域中需要提供一種可以賦予植物溫度不敏感性的基因從而使得植物在高溫下仍保有疾病抗性的技術(shù)。本發(fā)明提供了這樣的基因，并且還提供了賦予植物在通常會(huì)因?yàn)闊崦舾行远鴮?dǎo)致其防御響應(yīng)被降低或者屏蔽的溫度下仍具有疾病抗性的方法。發(fā)明概述現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)溫度可以通過(guò)疾病抗性蛋白來(lái)調(diào)節(jié)植物的防御響應(yīng)。如本申請(qǐng)以下所述，本發(fā)明通過(guò)遺傳篩選的手段從十字花科植物擬南芥中鑒定出了引起植物疾病抗性溫度敏感性的成分，該成分是一種NB-LRR類型的R樣基因SNCl。具體地，本發(fā)明已經(jīng)證明了 SNCl的特定突變體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生熱穩(wěn)定的疾病抗性。為了證明該發(fā)現(xiàn)的通用性，我們對(duì)另一個(gè)R基因N進(jìn)行了類似的修飾，并發(fā)現(xiàn)它也能夠使植物對(duì)煙草花葉病毒具有熱穩(wěn)定的疾病抗性。本發(fā)明的上述發(fā)現(xiàn)為通過(guò)基因工程改造或者育種方式或者兩者結(jié)合的方式來(lái)獲得在一系列溫度范圍下都具有防御響應(yīng)能力的植物品種提供了一種方法學(xué)。大體而言，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其所含核苷酸序列編碼的多肽包含(a) 核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；和(b)富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽可以賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽所包含的LRR結(jié)構(gòu)域含有可以賦予熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述可以賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR結(jié)構(gòu)域包括，E/L (K或R) LD基序或者E/L (K或Y) LV (N或D)基序。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸序列被可操作的連接到可以驅(qū)使其在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子上?？捎玫膯?dòng)子包括組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組織特異性啟動(dòng)子包括根，葉或種子特異的啟動(dòng)子。本申請(qǐng)已經(jīng)描述了這些啟動(dòng)子的實(shí)例。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分離的核酸序列全部或者部分的由合成的核苷酸結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成。在還有一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，核苷酸序列的密碼子使用偏性(codon usage)被優(yōu)化成適于其在植物中進(jìn)行表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)獲得的多肽可以賦予表達(dá)該多肽的植物同時(shí)在22°C和或者同時(shí)在22°C和30°C下都具有疾病抗性。在其他實(shí)施方式中，表達(dá)獲得的多肽可以
賦予表達(dá)該多肽的植物在 23°C，24°C，25°C，26°C，27°C，28°C，29°C，30°C，31 °C，32°C，33°C， 34°C，35°C，36 °C或者更高的溫度下都具有疾病抗性。在其他方面，本發(fā)明還涉及包含有任何此前所述的分離的核酸分子的載體、細(xì)胞、 植物或者植物成分。本發(fā)明記載了這些載體、細(xì)胞以及植物的實(shí)例。在還有一些方面，本發(fā)明涉及賦予植物或者植物成分針對(duì)病原體抗性的方法，該方法包括如下步驟(a)用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該核酸分子所編碼的多肽包含 ⑴NB結(jié)構(gòu)域；以及(ii)LRR結(jié)構(gòu)域，其中該多肽可以賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)；以及(b)從轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞中再生植物或者植物成分，其中該植物或者植物成分具有針對(duì)病原體的抗性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽含有可以賦予熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)后的多肽可以賦予表達(dá)該多肽的植物在廣泛的溫度條件下都具有疾病抗性(如 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C ,35°C, 36°C或者更高的溫度)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的植物與相應(yīng)的對(duì)照植物相比，其在高溫條件下具有更高的抗性水平。在還有一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)育種、轉(zhuǎn)化或二者結(jié)合的方法來(lái)導(dǎo)入核酸分子。 優(yōu)選地，植物是單子葉植物或雙子葉植物，病原體是細(xì)菌，真菌，線蟲，昆蟲或者病毒?？捎糜诒景l(fā)明的植物的實(shí)例包括但不限于，十字花科植物如擬南芥，毛果楊(美國(guó)黑楊)，馬鈴薯(土豆)，甜瓜(香瓜)，紫花苜蓿(苜蓿)，香液楊樹(香脂白楊)，四季豆(蕓豆)， 大豆(黃豆)，蒺藜苜蓿，煙草(Nicotiana tabacum)，粘性煙草，西紅柿(番茄)，馬鈴薯品種(Solanum tuberosum subsp. andigena)，兵豆(扁豆)，亞麻(胡麻)，葡萄(釀酒葡萄)，水稻印度組(Oryza sativa Indica Group)(印度大米)，水稻日本組(Oryza sativa Japonica Group)(日本大米)，玉米，大麥和小麥。在另一方面，本發(fā)明涉及基本上純的多肽，其包含(a)NB結(jié)構(gòu)域；和(b)LRR結(jié)構(gòu)域，該多肽可以賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。優(yōu)選地，該多肽可以賦予表達(dá)該多肽的植物同時(shí)在22°C和下或者同時(shí)在22°C和30°C下都具有疾病抗性。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基本上純的多肽包含有可以賦予熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方式中，所述基本上純的多肽可以賦予表達(dá)該多肽的植物在23°C，240C，25°C，26°C，27°C，28°C， 29°C,30°C,3rC, 32°C，33°C，34°C，35°C，36°C或者更高的溫度下都具有疾病抗性。
術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定的防御響應(yīng)”是指，植物中NB-LRR多肽介導(dǎo)的病原體防御響應(yīng)，該防御響應(yīng)發(fā)生在某一溫度，在該溫度下如果缺少該NB-LRR多肽時(shí)植物無(wú)法對(duì)病原體啟動(dòng)防御響應(yīng)。該溫度要高于植物在缺少該多肽的情況下仍啟動(dòng)病原體防御響應(yīng)能力所需的溫度。例如，優(yōu)選地，熱穩(wěn)定防御響應(yīng)時(shí)的溫度要比因?yàn)椴痪哂性摱嚯亩率怪参锸ゲ≡w防御響應(yīng)能力的溫度高2°C，3°C，4°C或者甚至5°C ；更優(yōu)選地，熱穩(wěn)定的防御響應(yīng)時(shí)的溫度要比因?yàn)椴痪哂性摱嚯亩率怪参锸ゲ≡w防御響應(yīng)能力的溫度高6°C，7°C，或者甚至 8°C ；最優(yōu)選地，熱穩(wěn)定的防御響應(yīng)時(shí)的溫度要比因?yàn)椴痪哂性摱嚯亩率怪参锸ゲ≡w防御響應(yīng)能力的溫度高9°C，10°C，或irC (或者甚至12°C或更高溫度)。術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”是指從與其天然伴存的成分中分離出來(lái)的多肽，例如熱穩(wěn)定的 NB-LRR 疾病抗性多肽(例如，SNC1-3，SNC1 E640R, N Y646K，或 N Y638K N648D 多肽， 或者圖9或圖10中記載的那些多肽)。通常，當(dāng)該多肽所占的質(zhì)量百分比至少為60%，并且不含有與該多肽天然結(jié)合的蛋白和天然存在的有機(jī)分子時(shí)，則該多肽被稱為基本上純的多肽。優(yōu)選地，熱穩(wěn)定的NB-LRR疾病抗性多肽所占的質(zhì)量百分比至少為75%，更優(yōu)選至少 90%，最優(yōu)選至少99%。基本上純的熱穩(wěn)定的NB-LRR疾病抗性多肽可通過(guò)多種方法獲得， 例如，通過(guò)從天然原材料(例如，植物細(xì)胞)中提取獲得；通過(guò)表達(dá)編碼熱穩(wěn)定NB-LRR疾病抗性多肽的重組核酸獲得；或者通過(guò)化學(xué)合成蛋白質(zhì)的方法獲得。純度可以通過(guò)任何適用的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，例如，柱色譜，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者HPLC分析。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”是指不含有其它基因的核酸分子，所述其它基因是指在從中獲取分離的核酸分子的生物體的天然存在的基因組中與分離的核酸分子側(cè)翼相連的基因。因此該術(shù)語(yǔ)包括，例如，導(dǎo)入到載體中的重組DNA;導(dǎo)入到能自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒中的重組DNA ；導(dǎo)入到原核或真核細(xì)胞基因組DNA中的重組DNA ；或者以不含有其他序列的單獨(dú)分子(例如，通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組片段或cDNA片段)的形式存在的重組DNA。該術(shù)語(yǔ)還包括作為雜合基因一部分的重組DNA，所述雜合基因編碼其它的多肽序列。 術(shù)語(yǔ)“源自，，或“衍生自，，或“來(lái)源于”是指，從天然存在的序列中分離出來(lái)，或者含有天然存在序列(例如，cDNA,基因組DNA，合成的DNA或它們的組合)。術(shù)語(yǔ)“屏蔽溫度”是指，在該溫度下植物對(duì)某種病原體的防御響應(yīng)能力失去效力從而使得該植物不能對(duì)這種病原體產(chǎn)生抗性。術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白”是指任意的氨基酸鏈，不管它們的長(zhǎng)度以及是否存在翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”是指，任何半透膜所界定出來(lái)的含有原生質(zhì)體且能夠自我繁殖的細(xì)胞。如果希望該細(xì)胞可以進(jìn)一步增殖，則該細(xì)胞還可以包含細(xì)胞壁。本申請(qǐng)中使用的植物細(xì)胞包括但不限于，藻類，藍(lán)藻，種子，懸浮培養(yǎng)物，胚芽，分生區(qū)，愈傷組織，葉子，根，芽， 配子體，孢子體，花粉以及小孢子。術(shù)語(yǔ)“植物成分”是指，從完整的植物或者植物細(xì)胞上獲得的部分、片段或者器官。 植物成分的實(shí)例包括但不限于，體胚，葉子，莖，根，花，蔓，果實(shí)，接穗，種子以及根莖。術(shù)語(yǔ)“十字花科植物”是指任何歸入十字花科的植物。十字花科植物包括許多農(nóng)作物，包括但不限于，油菜(例如，油青四九菜心(Brassica campestris)和甘藍(lán)型油菜 (Brassica napus))，青花菜，卷心菜，抱子甘藍(lán)，蘿卜，羽衣甘藍(lán)，芥藍(lán)，球莖甘藍(lán)，花椰菜，蕪菁，大頭菜，芥菜，山葵，以及擬南芥。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指，通過(guò)一定方法導(dǎo)入到細(xì)胞中并成為由該細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)得到的生物體基因組的一部分的核酸分子(例如，DNA)。這種轉(zhuǎn)基因可以包括與轉(zhuǎn)基因的生物體部分或完全異源的(也就是外源的)基因，或者可以表示與該生物體的內(nèi)源基因具有序列一致性的基因。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”是指一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含有通過(guò)一定方法導(dǎo)入到該細(xì)胞中并成為由該細(xì)胞發(fā)育生長(zhǎng)所得到的生物體基因組一部分的核酸分子(例如，DNA序列)。本申請(qǐng)中所使用的轉(zhuǎn)基因生物體通常是轉(zhuǎn)基因的植物，其中所述DNA(例如，轉(zhuǎn)基因)通過(guò)特定技術(shù)被導(dǎo)入到其細(xì)胞核或其細(xì)胞質(zhì)基因組中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的植物可以含有一種或者多種本申請(qǐng)中所描述的分離的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“病原體”是指一種生物體，該生物體在感染生長(zhǎng)中的植物組織后可以在該植物組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生疾病反應(yīng)。這樣的病原體包括但不限于，細(xì)菌，支原體，真菌，卵菌，昆蟲， 線蟲，病毒以及類病毒。有關(guān)這些病原體所導(dǎo)致的植物疾病都已經(jīng)記載在Chapters 11-16 of Agrios，Plant Pathology, 3rd ed.，Academic Press，Inc.，New York，1988 中。細(xì)菌病原體的實(shí)例包括但不限于，歐文氏菌屬(例如，軟腐歐文氏菌)，假單胞桿菌屬(例如，丁香假單胞菌)，以及黃單胞菌屬(例如，開(kāi)姆佩斯崔斯菌(X. campepestris) 和水稻細(xì)菌性條斑病菌)。真菌或者真菌樣致病病原體的實(shí)例包括但不限于，鏈格孢屬(例如，蕓苔生鏈格孢和番茄早疫病菌)，殼二孢屬(例如，豌豆殼二胞菌)，葡萄孢屬(例如，灰葡萄孢菌)，尾孢菌屬(例如，大豆紫斑病菌和玉米灰斑病菌)，炭疽菌屬(例如，菜豆炭疽菌)，色二孢屬 (例如，馬伊德殼色單隔孢)白粉菌屬(例如，格蘭米尼斯菌(E.graminis f. sp)和大麥白粉病菌)，鐮刀菌屬(例如雪腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，禾谷鐮刀菌，茄鐮孢菌，串珠鐮孢菌和粉紅鐮孢菌)，頂囊殼屬(例如小麥全蝕病菌)，長(zhǎng)蠕孢屬(例如，大斑病長(zhǎng)蠕孢菌，碳色長(zhǎng)蠕孢菌，玉米小斑病菌)，殼球孢屬(例如菜豆殼球孢菌和稻瘟菌)，叢赤殼屬(例如赤球叢赤殼菌)，霜霉屬(例如，大豆霜霉菌，煙草霜霉菌)，莖點(diǎn)霉屬(例如，甜菜莖點(diǎn)霉菌)，榴梗孢屬(例如，棉根腐病菌)，疫霉屬(例如，樟疫霉菌，惡疫霉菌，菜豆疫霉病菌，煙草黑脛病菌，柑桔褐腐疫霉菌，大豆疫霉菌，晚疫病菌)單軸霉屬(例如，葡萄生單軸霉菌)，叉絲單囊殼屬(例如，蘋果白粉病菌)，柄銹菌屬(例如玉米柄銹菌，小麥條銹病菌，小麥稈銹菌，天門冬屬柄銹菌，葉銹病菌和花生銹病菌)，腐霉屬(例如瓜果腐霉菌)，核腔菌屬(例如小麥穎枯病菌)，梨孢屬(例如，水稻稻瘟病菌)，腐霉屬(例如，終極腐霉菌)，絲核菌屬(例如，立枯絲核菌和禾谷絲核菌)，小菌核菌屬(例如，木霉菌)，核盤菌屬(例如，核盤菌)，針殼孢屬(例如，番茄殼針孢菌，大豆褐紋殼針孢菌，狗牙根殼針孢菌，小麥殼針孢菌)，根串珠霉屬(例如，煙草根黑腐病菌)，鉤絲殼屬(例如，葡萄白粉菌)，黑星菌屬(例如，蘋果黑星病菌)，輪枝孢屬(例如，黃萎菌和黑白輪枝菌)。致病的線蟲實(shí)例包括但不限于，根結(jié)線蟲(例如，根結(jié)線蟲屬，如南方根結(jié)線蟲， 花生根結(jié)線蟲，奇特伍德根結(jié)線蟲，北方根結(jié)線蟲，爪哇根結(jié)線蟲，擬禾本科根結(jié)線蟲，小突根結(jié)線蟲，禾本科根結(jié)線蟲，和納西根結(jié)線蟲)，孢囊線蟲(例如，孢囊線蟲屬，如甜菜孢囊線蟲，大豆胞囊線蟲，甘蔗胞囊線蟲，水稻胞囊線蟲，禾谷胞囊線蟲，木豆胞囊線蟲，微小胞囊線蟲，豌豆孢囊線蟲，麥類孢囊線蟲，地中海孢囊線蟲，莫斯孢囊線蟲(H. mothi)，高粱孢囊線蟲和玉米孢囊線蟲，又或例如，球孢囊屬，如馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲)，襲根線蟲 (例如，腎形腎狀線蟲，半穿刺線蟲，矮尾短體線蟲，柑桔穿孔線蟲，香蕉穿孔線蟲，劍線蟲， 里弗斯劍線蟲，微小擬毛刺線蟲，實(shí)夜蛾異小桿線蟲和松材線蟲)，以及地上部線蟲(例如， 剪股穎粒線蟲(Anguina funesta)，小麥粒線蟲，莖線蟲，食菌莖線蟲和干尖線蟲)。病毒性病原體的實(shí)例包括但不限于，煙草花葉病毒(TMV)，煙草壞死病毒(TNV)， 馬鈴薯卷葉病毒X，馬鈴薯病毒Y，番茄斑點(diǎn)萎凋病毒，以及番茄環(huán)斑病毒。如之前所述，本申請(qǐng)已經(jīng)鑒定，分離或者改造，以及表征了一些編碼熱穩(wěn)定NB-LRR 抗病多肽的基因。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了許多保護(hù)植物抵御病原體的重要改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)。 例如，本發(fā)明提供了一種有效且經(jīng)濟(jì)的手段來(lái)保護(hù)植物在熱屏蔽或者熱敏感的溫度條件下來(lái)抵御植物病原體。本發(fā)明的保護(hù)植物抵御病原體的方法可以降低傳統(tǒng)化學(xué)試劑的使用 (例如，使用殺真菌劑，除菌劑，殺線蟲劑，殺蟲劑或者殺病毒劑)或者使得化學(xué)試劑的使用最小化，這些化學(xué)試劑通常是農(nóng)民為了控制植物病原體的傳播并防護(hù)作物免受致病病原體侵害而使用的。此外，因?yàn)楹袩岱€(wěn)定的NB-LRR抗病多肽的植物對(duì)于病原體及其疾病不再那么易受感染，因此本發(fā)明進(jìn)一步提升了生產(chǎn)效率并提高了作物植物以及觀賞性植物的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此，本發(fā)明對(duì)于生產(chǎn)高質(zhì)量和高產(chǎn)量的農(nóng)產(chǎn)品提供了幫助，例如，水果，觀賞性植物，蔬菜，谷物以及由于病原體所導(dǎo)致的減產(chǎn)、產(chǎn)生缺陷以及斑點(diǎn)的大田作物；本發(fā)明還提高了農(nóng)產(chǎn)品的貨架期并降低了操作成本，以及為農(nóng)業(yè)(例如谷物和大田作物)，工業(yè)(例如，油料種子)和商業(yè)(例如，纖維植物)提供了高質(zhì)量和高產(chǎn)量的作物。此外，由于本發(fā)明減少了使用化學(xué)試劑保護(hù)植物抵御病原體的必要性，所以本發(fā)明還有益于作物的生長(zhǎng)環(huán)境。通過(guò)使用可以表達(dá)本發(fā)明中的基因的植物所生產(chǎn)獲得的遺傳改進(jìn)的種子和其它植物產(chǎn)物，從而可以實(shí)現(xiàn)在先前因?yàn)闃O端溫度和全球氣候變化而不能進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的區(qū)域來(lái)進(jìn)行農(nóng)業(yè)耕作。構(gòu)建體如之前所討論，本發(fā)明涉及載體，尤其是質(zhì)粒以及其它在遺傳工程中通常使用的載體，它們含有上述分離的編碼熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的核酸分子。優(yōu)選地，這些包含在載體中的核酸分子可操作地連接到可以在真核細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的調(diào)控元件上。通常，含有所述分離的核酸分子的重組DNA分子在5’至3’轉(zhuǎn)錄方向上以可操作的方式連接有能夠促進(jìn)、起始和/或調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)域 (啟動(dòng)子區(qū)域)；編碼熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的核酸分子，以及；轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)域(或者稱為3’非翻譯區(qū)域)。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)核酸序列被排列到可以影響第二個(gè)核酸序列功能的位置時(shí)，則被稱作第一個(gè)核酸序列“可操作的連接”到第二個(gè)核酸序列。優(yōu)選地，這兩條序列是同一個(gè)連續(xù)的核酸分子的一部分，更優(yōu)選是相鄰的序列。“重組”核酸或者“重組DNA分子” 可以通過(guò)人工組合兩條分離的序列片段獲得，例如，通過(guò)化學(xué)合成方式獲得或者通過(guò)使用遺傳工程技術(shù)對(duì)分離出的核酸片段進(jìn)行操作后獲得?！爸亟MDNA構(gòu)建體”，“重組載體”，“表達(dá)載體”，或“表達(dá)盒”是指，任何來(lái)源的能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制，并且在它所含的 DNA分子中有一條或者多條DNA序列以功能上可操作的方式連接在一起的一種試劑，例如質(zhì)粒，粘粒，病毒，BAC(人工細(xì)菌染色體)，自復(fù)制序列，噬菌體，或線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈 DNA或RNA核苷酸序列。本申請(qǐng)所述的“啟動(dòng)子”是指，可以與RNA聚合酶(通常也還有其他轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合促使下游DNA序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的序列可以是具有如rRNA(核糖體 RNA)或tRNA (轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)功能的RNA分子。通常，所產(chǎn)生的RNA是雜化核RNA (hnRNA)，其內(nèi)含子被剪切后產(chǎn)生mRNA (信使RNA)?！爸参飭?dòng)子”是指能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的天然的或者非天然的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子可以在植物發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中在絕大部分或所有植物組織中都發(fā)揮功能。組織特異的，器官特異的或者細(xì)胞特異的啟動(dòng)子只有在或者是主要在相應(yīng)的特定組織，器官或者細(xì)胞類型中進(jìn)行表達(dá)。此處所使用的特異的表達(dá)是指，任何可以在特定組織或發(fā)育階段或者在特定環(huán)境條件下提高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，但是其也有可能在其它組織或發(fā)育階段或者在特定環(huán)境條件下引起表達(dá)甚至引起明顯的表達(dá)。臨時(shí)調(diào)控啟動(dòng)子只在或者主要在植物發(fā)育的特定階段或者天數(shù)內(nèi)發(fā)揮功能。誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在存在內(nèi)源性或者外源性刺激的情況下可以選擇性地表達(dá)可操作性連接的DNA 序列，例如應(yīng)答化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)或者響應(yīng)環(huán)境的、激素的，化學(xué)的和/或發(fā)育的信號(hào)。 誘導(dǎo)性或調(diào)控性啟動(dòng)子包括，例如，受到光，熱，壓力，洪水或干旱，植物激素，傷口，寒冷，或者化學(xué)物質(zhì)如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或保護(hù)劑調(diào)控的啟動(dòng)子。對(duì)于絕大部分情況而言，可以使用任意的植物啟動(dòng)子來(lái)作為5’調(diào)控序列來(lái)調(diào)節(jié)特定的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，如植物RNA聚合酶II啟動(dòng)子。當(dāng)融合到異源的DNA序列時(shí)， 這樣的啟動(dòng)子通常使融合的序列按照與該啟動(dòng)子正常連接的基因序列相似的方式來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？梢栽趩?dòng)子中加入調(diào)控序列片段(例如，融合到含有部分的或者完整的自身調(diào)控序列的活性啟動(dòng)子的5’末端融合，或者插入到該活性啟動(dòng)子的內(nèi)部)。或者，可以將異源的調(diào)控序列添加到失活的殘缺的啟動(dòng)子的5’上游區(qū)域，該失活的殘缺的啟動(dòng)子例如是只含有 TATA核心序列，或者有時(shí)還可以含有CCAAT序列。含有特定順式作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的啟動(dòng)子，可以從基因表達(dá)總體調(diào)控的不同方面來(lái)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行控制。本發(fā)明中的啟動(dòng)子序列可以含有調(diào)控基因表達(dá)的順式作用元件。順式作用元件可以是啟動(dòng)子的一部分，也可以是位于所述啟動(dòng)子的上游或者下游。從遠(yuǎn)距離對(duì)啟動(dòng)子發(fā)揮作用的順式作用元件(或其構(gòu)成的組合)通常稱為抑制子或增強(qiáng)子。 增強(qiáng)子能夠上調(diào)RNA聚合酶在啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄起始速度，而抑制子則可以降低該速度。在有些情況下，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或抑制子具有相同的元件。順式作用元件通常位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上的位點(diǎn)并對(duì)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上的速度進(jìn)行調(diào)控。在植物細(xì)胞中具有活性的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，胭脂堿合成酶 (NOS)啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S (有時(shí)在本申請(qǐng)中也稱為35S)啟動(dòng)子；煙草花葉病毒啟動(dòng)子；玄參花葉病毒啟動(dòng)子；以及肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，如擬南芥肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“組織特異性啟動(dòng)子”是指，能夠使其下游基因在植物發(fā)育的特定時(shí)間在特定的細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)錄水平得到增強(qiáng)的調(diào)控序列，例如增強(qiáng)基因在營(yíng)養(yǎng)組織或生殖組織中的轉(zhuǎn)錄水平。受到發(fā)育調(diào)控的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括，只在(或主要只在)特定組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，例如營(yíng)養(yǎng)組織如根、葉或莖，或者生殖組織如果實(shí)、胚珠、種子、花粉、 雌蕊、花，或者任意胚組織。生殖組織特異性的啟動(dòng)子可以是，例如，胚珠特異的，胚芽特異的，胚乳特異的，珠被特異的，種皮特異的，花粉特異的，花瓣特異的，萼片特異的，花柱特異的，或者它們的一些組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道組織特異性的啟動(dòng)子可能會(huì)在除靶組織以外的其他組織中驅(qū)動(dòng)與其可操作連接的序列的表達(dá)。因此，本申請(qǐng)中的組織特異性的啟動(dòng)子是一種優(yōu)先在靶點(diǎn)組織中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，但其也有可能在其他組織中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的核酸分子可操作的連接在組織特異性的啟動(dòng)子上，或連接在引導(dǎo)其在葉組織或葉組織的某個(gè)區(qū)域中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子上。其他可能適合的調(diào)控序列的實(shí)例還包括，內(nèi)含子，3’非編碼區(qū)域例如聚腺苷酸序列(poly A sequences)，隔離子區(qū)域及類似的調(diào)控序列。用于鑒定，獲取以及與本發(fā)明中所述核酸分子一起組合使用這樣的調(diào)控元件的分子生物學(xué)技術(shù)屬于本領(lǐng)域的已有技術(shù)。轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)基因的棺物或棺物成分本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因的植物，它們通過(guò)轉(zhuǎn)化獲得并表達(dá)熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽?！稗D(zhuǎn)化的”，“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指細(xì)胞、組織、器官或者生物體內(nèi)被導(dǎo)入了外來(lái)的核酸，例如重組載體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以含有一種或者多種本發(fā)明所述的核酸分子。優(yōu)選地，所導(dǎo)入的核酸被整合到受體細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組DNA中，這些被導(dǎo)入的核酸可以被遺傳給其后代?！稗D(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞或生物體也包括了該細(xì)胞或生物體的后代，以及通過(guò)使用“轉(zhuǎn)基因的”植物作為父本進(jìn)行雜交育種所獲得的后代，該后代因?yàn)榇嬖谥亟M的表達(dá)構(gòu)件或載體所以可以展現(xiàn)出改變后的表型。轉(zhuǎn)化的方法對(duì)于本發(fā)明而言并不是至關(guān)重要的，各種已知的植物轉(zhuǎn)化方法都適用于本發(fā)明。例如，本發(fā)明中將DNA序列導(dǎo)入到植物和/或植物細(xì)胞中的過(guò)程可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)，亦或者通過(guò)基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(粒子槍或生物彈方法)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該DNA序列還可以通過(guò)質(zhì)體轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入到細(xì)胞質(zhì)基因組中。本發(fā)明也可以通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化(floral dip transformation)來(lái)將構(gòu)建體導(dǎo)入到植物中。此處可以使用帶有遺傳構(gòu)建體的農(nóng)桿菌對(duì)開(kāi)花植物如擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該花隨后結(jié)成種子，然后再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從后代幼苗中篩選出轉(zhuǎn)基因的植物?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)再生獲得的整個(gè)植物，例如通過(guò)培養(yǎng)已經(jīng)用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞、愈合組織或者葉圓片來(lái)獲得整個(gè)植物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)幾乎來(lái)自任意植物的各種細(xì)胞、組織以及器官進(jìn)行培養(yǎng)從而成功地再生整株植物。本發(fā)明適用于單子葉植物以及雙子葉植物，而且也適用于新的和/或改良的轉(zhuǎn)化技術(shù)。為了能夠高效地從植物細(xì)胞或植物組織中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物，用于轉(zhuǎn)化的植物組織最好是具有高再生能力的組織。通過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)得到的植物組織來(lái)再生植物的技術(shù)已為本領(lǐng)域所公知。如之前所述，本發(fā)明所生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物可以是任意的雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選地，例如是，玉米、豌豆、大豆、苜蓿、木薯、馬鈴薯、棉花以及谷物(例如，大麥、 燕麥、黑麥、黑小麥和小麥)。玉米包括所有種類的玉米，以及所有用它育種獲得的玉米品種。小麥包括所有品種的小麥，包括但不限于春小麥、冬小麥以及所有兼性的小麥品種(facultative wheat varieties)。小麥還包括任何其他的小麥品種，包括但不限于， 硬質(zhì)小麥(Triticum durum)，斯佩爾特小麥(Triticum spelta)，二粒小麥(Triticum dicoccum)以及一粒小麥(Triticum monococcum)。小麥還包括任何可以與前述的任一小麥品種進(jìn)行育種的種類。大豆包括所有的大豆品種，以及所有可以由其育種獲得的品種。水稻包括所有的水稻品種，以及所有由它育種獲得的品種。大麥包括所有的大麥品種，以及所有由它育種獲得的品種。燕麥包括所有品種的燕麥，以及所有由它育種獲得的品種。芥花子(Canola)是一個(gè)新詞，其是指通過(guò)遺傳修飾的油菜籽植物、油菜籽(甘藍(lán)型油菜)和蕪菁油菜(白菜型油菜)獲得的種子、油和粉，此處的介花子包括所有的油菜籽植物以及可以由其育種獲得的生物體。本發(fā)明所用的根瘤農(nóng)桿菌包括該物種所有的菌株以及類型。棉花包括所有棉屬植物，以及所有可以由其育種獲得的植物。本發(fā)明的方法包括，將含有可以在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子可操作的連接到編碼熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的核酸序列上的方法(圖8，9，10和11示出了分離的DNA分子的實(shí)例)，以及通過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)獲得植物(以及這些植物的可繁育的后代植物) 的方法。后代包括特定植物或者植物種系的可繁育的后代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因種子的制備?！稗D(zhuǎn)基因種子”是指，該植物種子的細(xì)胞核中導(dǎo)入了一種基本上純的核酸分子，該核酸分子可以編碼含有能夠賦予植物熱穩(wěn)定的防御響應(yīng)能力的NB-LRR多肽；例如，含有包括LRR熱穩(wěn)定的亞結(jié)構(gòu)域的NB-LRR多肽，該多肽可以調(diào)節(jié)表達(dá)該多肽的植物的防御響應(yīng)能力，例如通過(guò)本申請(qǐng)所記載的轉(zhuǎn)化方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”是指，通過(guò)最初的轉(zhuǎn)化體所獲得的植物，或者由其后代得到的后代，或者轉(zhuǎn)化后的植物所獲得的雜交體及其后代，只要這些后代在它的細(xì)胞核基因組中含有重組的 DNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因的植物成分。術(shù)語(yǔ)“植物成分”是指從完整的植物或者植物細(xì)胞中獲得的部分、片段或者器官。植物成分的實(shí)例包括但不限于，體胚，葉子，莖，根， 花，蔓，果實(shí)，接穗，種子，塊莖以及根莖。通過(guò)以下的附圖、發(fā)明詳述以及權(quán)利要求可以更好地理解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)
點(diǎn)ο


圖1A-1E顯示突變體intl02具有溫度不敏感的防御響應(yīng)。圖IA顯示突變體sncl-Ι在22°C下所表現(xiàn)出的矮生表型在時(shí)被得到了抑制。 所示為4周齡的植物。圖IB顯示intl02突變使sncl-l在下保留了對(duì)致病病原體的抗性。所示為番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(I3St)DCSOOO在22°C和時(shí)分別在野生型、sncl-Ι和intl02_l sncl-1中的生長(zhǎng)情況。圖IC顯示intl02突變使sncl-Ι在下產(chǎn)生了矮生型。所示為3周齡的植物。圖ID顯示intl02_l sncl_l中防御基因的表達(dá)水平在22°C和都得到了上調(diào)， 并且該基因在intl02-l sncl-1中的表達(dá)上調(diào)依賴于PAD4。PRl和SNCl的表達(dá)使用RNA 雜交檢測(cè)。圖IE示出了 int 102-1 sncl-Ι在時(shí)其矮生表型被pad4和nahG所抑制。所示為在下印跡處理后的野生型，intl02-l sncl-lpad4，和intl02-l sncl-1 nahG的生長(zhǎng)情況。圖2A-2C示出了 sncl-3突變使得SNCl獲得了溫度不敏感的活性。
圖2A示出了具有sncl-3突變的SNCl在下誘導(dǎo)產(chǎn)生了超敏反應(yīng)(HR)。4種 p35S: SNCl GFP 構(gòu)建體=SNCl 野生型(WT)，SNC1-1，SNC1-3 和 SNC1_4(同時(shí)含有 sncl-Ι 和 sncl-3突變)，通過(guò)農(nóng)桿菌(農(nóng)桿菌滲入法)導(dǎo)入到煙草(Nb)葉子中。所示為導(dǎo)入3天后的葉子。箭頭所示為HR。圖2B示出了 22°C和時(shí)SNC1:GFP蛋白在Nb中的亞細(xì)胞定位。圖2A所示的導(dǎo)入后的葉子在開(kāi)始HR的前一天使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析。除SNCl-I外，SNC1-3和SNC1-4 在時(shí)都被保留在細(xì)胞核內(nèi)。由于SNClWT的信號(hào)很弱，對(duì)其成像的曝光使用了更長(zhǎng)的時(shí)間。圖2C示出了 SNCl :GFP蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位。將與圖2A中相同的4個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化12小時(shí)后使用熒光顯微鏡觀察GFP熒光信號(hào)。相比其他三個(gè)樣品，SNClffT使用了更長(zhǎng)的曝光時(shí)間。圖2D顯示核導(dǎo)出信號(hào)(NES)消除了 SNC1-3和SNC1-4的活性。SNC1-3 GFP， SNC1-3:GFP:NES, SNC1-4:GFP,以及SNC1_4:GFP:NES使用農(nóng)桿菌滲入法轉(zhuǎn)入Nb中，并在 22°C和下分析它們的HR誘導(dǎo)活性。每片葉子的左半部導(dǎo)入了 SNC1:GFP融合蛋白，而葉子的右半部導(dǎo)入了相應(yīng)的融合了 NES的SNCl :GFP融合蛋白。所示為導(dǎo)入3天后的葉子。 箭頭所示的HR僅在不含有NES的融合蛋白半邊觀察到?？s寫WT,SNClffTiGFP ；-1, SNCl-I GFP ；_3，SNC1_3:GFP ；-4，SNC1_4:GFP ；-3: NES, SNC1-3:GFP:NES；-4:NES, SNC1-4:GFP:NES0圖3A-3C顯示M0S3和M0S6基因?qū)τ赟NC1-3蛋白的活性而言是必需的。圖3A顯示sncl-4的矮生表型被mos3或mos6所抑制。所示為22°C和下培養(yǎng)的野生型，sncl-4 mos3, sncl-4 mos6和sncl-4三周齡的幼苗。圖:3B 和 3C 示出了野生型(wt)，mos3, mos6 和 pad4 植物中 SNCl-I GFP 蛋白在22°C (圖3A)以及SNC1-3:GFP蛋白在沘°C (圖3C)的亞細(xì)胞定位。SNC1WT:GFP， SNC1-1:GFP，和SNC1-3:GFP分別是在22°C或下通過(guò)在從mos3，mos6和pad4突變體植株中分離出的原生質(zhì)體中進(jìn)行表達(dá)獲得，并且GFP信號(hào)在轉(zhuǎn)化后12小時(shí)使用熒光顯微鏡觀察。如在野生型中一樣，該SNCl-I和SNC1-3蛋白存在于pad4突變體細(xì)胞核中，但是它們絕大多數(shù)都存在于mos3和mos6的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜中。縮寫Wt，野生型；其他同圖2。圖4A-4B顯示N基因中的突變使得防御響應(yīng)對(duì)溫度不敏感。圖4A示出了野生型以及三種N基因突變型在22°C和30°C下在Nt中誘導(dǎo)產(chǎn)生的 HR。該野生型和突變型N基因使用農(nóng)桿菌滲入法與其誘導(dǎo)物p50 —起導(dǎo)入Nt中。野生型 N基因在22°C而非30°C下誘導(dǎo)出HR，而所示Y646K和Y646KN648D突變型在兩種溫度下都能夠誘導(dǎo)HR。圖4B示出了當(dāng)N-citrine和p50共同表達(dá)時(shí)，N-citrine在22°C和30°C下在Nb 中的定位。N-citrine嵌合基因和p50 —起使用農(nóng)桿菌滲入，對(duì)citrine信號(hào)進(jìn)行三天的監(jiān)測(cè)。該N-citrine蛋白在細(xì)胞核中的定位可在22°C下觀測(cè)到，在30°C下則不能。圖5顯示核導(dǎo)出信號(hào)(NES)抑制了 SNC1-3和SNC1-4蛋白的核定位。所示為Nb中 28°C表達(dá)的 SNC1 -3GFP，SNC1 -4GFP，SNC1-3:GFP:NES,和 SNC1 _4GFPNES 蛋白的定位。絕大部分 SNC1-3 GFP 和 SNC1-4 GFP 定位在細(xì)胞核中，而 SNC1-3 GFP NES 和 SNC1-4 GFP NES 在細(xì)胞核中的表達(dá)量出現(xiàn)了減少，并在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上出現(xiàn)表達(dá)。名詞縮寫和圖2中一致。
圖6顯示M0S3和M0S6基因?qū)τ赟NC1-3以及SNC1-4蛋白的活性而言是必需的。 所示為SNC1-3:GFP在22°C (A)以及SNC1_4:GFP蛋白在22°C (B)和(C)分別在野生型(wt)，mos3, mos6 和 pad4 中的亞細(xì)胞定位。SNC1_3:GFP，SNC1_4:GFP 在 22°C禾口 28°C下在從mOS3，mOS6和pad4突變體植株中分離獲得的原生質(zhì)體中進(jìn)行表達(dá)，并且GFP信號(hào)在轉(zhuǎn)化后12小時(shí)使用熒光顯微鏡觀察。如在野生型中的一樣，該SNC1-3和SNC1-4蛋白存在于 pad4突變體的細(xì)胞核中，但是它們?cè)趦煞N溫度下絕大多數(shù)都存在于mos3和mos6的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜中?？s寫wt，野生型；其他同圖2中一樣。圖7示出了 SNCl蛋白的氨基酸序列。其中TIR，NB-ARC和LRR結(jié)構(gòu)域分別使用斜體，粗體和雙下劃線突出顯示。sncl-1，sncl-3和sncl-5的突變用高亮顯示。圖8示出了擬南芥中的與SNCl同源的500條同源序列。所示為Genbank中的編號(hào)。圖9示出了在擬南芥以外的其他物種中發(fā)現(xiàn)的SNCl同源序列。列表為500條在非擬南芥物種中找到的SNCl的同源序列。所示為Genbank的編號(hào)。圖10示出了對(duì)于賦予熱穩(wěn)定的疾病抗性有用的R突變。列表所示為對(duì)賦予熱穩(wěn)定的疾病抗性有用的R蛋白中的突變。圖11示出了 R基因及其修飾體之間的序列比對(duì)，該修飾使得R基因可以賦予所選定的植物熱穩(wěn)定的防御響應(yīng)能力。發(fā)明詳述鍵植物的免疫系統(tǒng)含有多個(gè)層面的響應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)各種生物侵襲，以保證植物的生存， 健康以及繁殖(1，2)。這些防御響應(yīng)受到非生物的環(huán)境因素調(diào)節(jié)，例如光、濕度以及溫度 (3-7)。如之前所述，高溫會(huì)抑制很多植物在正常情況下所具有的對(duì)病原體侵襲的防御響應(yīng)能力。防御相應(yīng)能力的這種溫度敏感性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了威脅，但這種溫度調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制仍然未知。本發(fā)明以下部分證明了，已知可以識(shí)別病原體效應(yīng)因子的疾病抗性(R) 基因(8，9)是一種溫度感應(yīng)器，該溫度感應(yīng)器可以使疾病抗性具有溫度敏感性。本發(fā)明進(jìn)一步證明了，通過(guò)改變SNCl和N蛋白的特定殘基可以對(duì)抗這種溫度效應(yīng)并使植物在高溫下仍具有防御響應(yīng)能力。這些發(fā)現(xiàn)可以用來(lái)使植物在廣泛溫度條件下都具有有效的植物免疫應(yīng)答能力。就如本申請(qǐng)以下部分所詳細(xì)描述的，本發(fā)明使用擬南芥的sncl-1突變體作為起始株系從而分離獲得可以在高溫條件下仍保留很高疾病抗性的突變體。sncl-Ι突變體在 NB-LRR型R蛋白SNCl上具有錯(cuò)義突變，同時(shí)在它的正常生長(zhǎng)溫度22°C下具有組成型的防御響應(yīng)并展現(xiàn)出矮化表型，但在更高的溫度如下其雖然展現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)表型但卻具有疾病的易感染性。通過(guò)突變體的篩選一些突變體，這些突變體在22°C和下都具有依賴sncl-Ι生長(zhǎng)的和防御突變體的表型。將通過(guò)上述篩選獲得的一個(gè)突變體作為SNCl的等位基因(sncl-4)進(jìn)行克隆，其中SNCl蛋白的E640突變?yōu)镵(稱為sncl_3突變)(表1)。 單獨(dú)的sncl-3突變就足以在低溫和高溫條件下誘導(dǎo)出很強(qiáng)的疾病抗性，而不需要存在原始的sncl-Ι突變。該發(fā)現(xiàn)第一次揭示了 R蛋白中的突變而不是植物天然免疫系統(tǒng)中其他因子的突變就足以使得植物獲得溫度不敏感的特性。因此，該R基因是防御響應(yīng)中的溫度感應(yīng)器。此外，R蛋白SNCl中的特定突變可以改變溫度敏感性，使得它們能夠在低溫和高溫條件下都具有活性。我們對(duì)SNCl蛋白的這種溫度敏感性的分子學(xué)基礎(chǔ)同樣進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)溫度會(huì)對(duì)SNCl蛋白的亞細(xì)胞定位產(chǎn)生影響SNC1的細(xì)胞核定位與其生物學(xué)活性相關(guān)。只在22°C 下具有活性的SNCl-I蛋白其在22°C時(shí)主要集中在細(xì)胞核中，但是在下則位于細(xì)胞核外；而在22°C和都具有活性的SNC1-3蛋白在這兩種溫度條件下均位于細(xì)胞核中。在 SNC1-3蛋白上添加核導(dǎo)出信號(hào)將會(huì)導(dǎo)致SNC1-3蛋白被移出細(xì)胞核，并導(dǎo)致SNCl蛋白在
下失去活性。因此，溫度對(duì)R蛋白定位的調(diào)節(jié)作用是R蛋白溫度敏感性的本質(zhì)，這進(jìn)一步導(dǎo)致了疾病抗性的溫度敏感性。這些在擬南芥SNCl中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律對(duì)于由其他NB-LRR型R蛋白介導(dǎo)的疾病抗性具有普適性。例如，煙草N基因(11)介導(dǎo)了對(duì)煙草花葉病毒的抗性，但這種抗性在30°C的高溫條件下會(huì)受到抑制。當(dāng)向N基因中導(dǎo)入sncl-3的同源突變后，可以使植物具有熱穩(wěn)定的抗性(表1)，這表明了疾病抗性中的溫度敏感性存在普適的機(jī)制。雖然這些突變所產(chǎn)生的分子水平的變化還并不清楚，但可以認(rèn)為這很可能是LRR區(qū)域的E640殘基附近的帶電性由負(fù)電轉(zhuǎn)變?yōu)榱苏姀亩淖兞?R蛋白的構(gòu)象或影響了它與其它蛋白的相互作用所導(dǎo)致的。 通過(guò)將SNCl的E640突變?yōu)镽可以獲得熱穩(wěn)定的HR(表1)，該現(xiàn)象進(jìn)一步支持了我們的推論。以下將對(duì)前述提到的實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)作進(jìn)一步描述。麵對(duì)sncl-1 (10)進(jìn)行遺傳篩選，以尋找高溫條件下的防御響應(yīng)抑制機(jī)制存在缺陷的突變體。野生型的擬南芥植株并不具有組成型的防御響應(yīng)，因?yàn)檫@些防御響應(yīng)通常會(huì)妨礙植物的生長(zhǎng)并且有時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。擬南芥sncl-Ι突變體具有組成型的防御響應(yīng)， 并在正常生長(zhǎng)溫度22°C下還展現(xiàn)出因?yàn)镾NCl連接區(qū)存在錯(cuò)義突變(10)所導(dǎo)致的矮生表型，這些表型在高溫例如下會(huì)受到抑制(7)(圖1A，B)。通過(guò)篩選分離得到一種突變體int (溫度不敏感)102-1，該突變體在22°C和下都具有sncl-Ι依賴的矮化表型(圖 1C)。intl02-lSncl-l突變體在22°C時(shí)和sncl-Ι —樣都對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(I3St) DC3000具有抗性，但是與sncl-Ι不同的是它在時(shí)仍然對(duì)該病毒具有抗性(圖1B)。因此，該intl02-lsncl-l突變體確實(shí)具有溫度不敏感(熱穩(wěn)定的)的組成型防御響應(yīng)。與前述結(jié)果相一致的是，兩個(gè)響應(yīng)水楊酸(SA)增加的基因PRl和SNCl (7，12)在下其在 intl02-lsncl-l中的表達(dá)水平要比野生型或sncl-1中的表達(dá)水平來(lái)的高(圖1D)，其中所述水楊酸與疾病抗性的增強(qiáng)有關(guān)聯(lián)。突變體htl02-lsncl-l的防御表型和生長(zhǎng)表型都會(huì)被編碼SA降解酶的nahG(13)以及防御響應(yīng)中的pad4(14)缺陷所抑制(圖1D，E，數(shù)據(jù)未示出)，這進(jìn)一步證實(shí)了突變體int 102-1 sncl-Ι在下的防御響應(yīng)被上調(diào)。我們基于INT102基因緊密連鎖到SNCl的特點(diǎn)在作圖群體中對(duì)其進(jìn)行了克隆 (online methods)。對(duì)intl02-lsncl_l突變型的SNCl基因的測(cè)序結(jié)果揭示，其中的一個(gè) G到A的點(diǎn)突變導(dǎo)致了 SNCl的LRR結(jié)構(gòu)域中第640位氨基酸殘基由谷氨酸變成了賴氨酸 (稱為 sncl-3)(表 1)。表1. SNCl和N蛋白中分離或產(chǎn)生的突變
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其所含的核苷酸序列編碼的多肽包括(a)核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；以及(b)富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述LRR結(jié)構(gòu)域包含賦予所述熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述核酸分子被可操作的連接到可以驅(qū)使其在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子上。
4.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，或組織特異性啟動(dòng)子。
5.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是根特異性啟動(dòng)子，葉特異性啟動(dòng)子或種子特異性啟動(dòng)子。
6.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述核酸分子是合成的。
7.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列的密碼子使用偏性被優(yōu)化成適于在植物或植物成分中進(jìn)行表達(dá)。
8.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域包括，E/L (K或R) LD基序或者E/L (K或Y) LV (N或D)基序。
9.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是SNC1-3，SNClE640R, NY646K,或者 NY646K N648D 多肽。
10.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是SNCl的同源物，其中該同源物包含有所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域。
11.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述多肽記載在圖9、圖10或圖11中。
12.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是N的同源物，其中該同源物包含有所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域。
13.含有任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子的載體。
14.含有任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子的細(xì)胞。
15.含有任一上述權(quán)利要求所述的核酸分子的植物或植物成分。
16.賦予植物或植物成分針對(duì)病原體抗性的方法，該方法包含以下步驟(a)用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述核酸分子編碼的多肽包含(i)核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；以及( )富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)；以及(b)通過(guò)所述轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生植物或植物成分，其中所述植物展現(xiàn)出針對(duì)所述病原體的抗性。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述LRR結(jié)構(gòu)域包含有賦予所述熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。
18.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的方法，與相應(yīng)的對(duì)照植物相比，所述表達(dá)熱穩(wěn)定的NB-LRR多肽的植物或植物成分在所述對(duì)照植物或?qū)φ罩参锍煞值钠帘螠囟认戮哂懈叩目剐运健?br> 19.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述核苷酸序列被可操作的連接到可以驅(qū)使其在植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子上。
20.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，或組織特異性啟動(dòng)子。
21.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是根特異性啟動(dòng)子，葉特異性啟動(dòng)子或種子特異性啟動(dòng)子。
22.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述核酸分子是合成的。
23.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述核苷酸序列的密碼子使用偏好被優(yōu)化成適于其在植物或植物成分中進(jìn)行表達(dá)。
24.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域包括，E/L (K或R) LD基序或者E/L (K或Y) LV (N或D)基序。
25.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述核酸分子通過(guò)育種導(dǎo)入。
26.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述核酸分子通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入。
27.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述植物或植物成分是單子葉植物或雙子葉植物。
28.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的方法，其中所述病原體是細(xì)菌，昆蟲，線蟲，真菌或病毒性病原體。
29.基本上純的多肽，其包含(a)核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；以及(b)富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的多肽，其中所述LRR結(jié)構(gòu)域包含有賦予所述熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。
31.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中當(dāng)該多肽在植物中進(jìn)行表達(dá)時(shí)其定位在植物的細(xì)胞核中。
32.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御反應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域包括，E/L (K或R) LD基序或者E/L (K或Y) LV (N或D)基序。
33.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中該多肽是SNC1-3，SNClE640R，NY646K，或 N Y646K N648D 多肽。
34.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中該多肽是SNCl的同源物，其中所述同源物含有所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域。
35.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中該多肽記載在圖9、圖10或圖11中。
36.根據(jù)任一上述權(quán)利要求所述的多肽，其中該多肽是N的同源物，其中所述同源物含有所述賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的LRR亞結(jié)構(gòu)域。
37.一種植物或植物成分，其含有基本上純的多肽，該多肽包含(a)核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；以及(b)富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的植物或植物成分，其中所述LRR結(jié)構(gòu)域包含有賦予所述熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。
39.包含有基本上純的多肽的植物或植物成分的應(yīng)用，該多肽含有(a)核苷酸結(jié)合(NB)結(jié)構(gòu)域；以及(b)富亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽賦予針對(duì)植物病原體的熱穩(wěn)定防御響應(yīng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的植物或植物成分的應(yīng)用，其中所述LRR結(jié)構(gòu)域包含有賦予所述熱穩(wěn)定防御響應(yīng)的亞結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組可以編碼熱穩(wěn)定的植物抗性多肽的核酸分子，該多肽可以使植物的防御響應(yīng)具有熱穩(wěn)定性，其中該多肽含有NB-LRR結(jié)構(gòu)基序。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這些植物和宿主細(xì)胞可以在廣泛的溫度范圍內(nèi)都展現(xiàn)出較強(qiáng)的疾病抗性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102325442SQ200980157212
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者華健, 朱英 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)