專利名稱：使用二磷酸甲羥戊酸脫羧酶從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法
使用ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法本發(fā)明涉及使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁 -3-烯-I-醇的生產(chǎn)3-甲基丁 -3-烯-I-醇的方法。本發(fā)明也涉及能夠催化甲羥戊酸的脫羧作用的酶用于從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的用途。此外，其涉及在酶促催化反應(yīng)中甲羥戊酸作為生產(chǎn)3-甲基丁 -3-烯-I-醇的起始材料的用途。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)異戊ニ烯的方法，所述方法包括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁 -3-烯-I-醇的生產(chǎn)3-甲基丁 -3-烯-I-醇的方法，并且還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁 -3-烯-I-醇轉(zhuǎn)化為異戊ニ烯的步驟。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)異戊醇的方法，所述方法包括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁-3-烯-I-醇的生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的方法， 并且還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁 -3-烯-I-醇轉(zhuǎn)化為異戊醇的步驟。3-甲基丁-3-烯-I-醇對應(yīng)式C5H1(i0。它能夠用于生產(chǎn)異戊烯醇，異戊烯醇用于香料或在制藥エ業(yè)中作為構(gòu)件使用。它是通過異丁烯和甲醛的化學縮合，生成3-甲基丁 -3-烯-I-醇進ー步被異構(gòu)化為異戊烯醇生產(chǎn)的。本文用于生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的路線涉及甲羥戊酸途徑生產(chǎn)甲羥戊酸，然后ニ磷酸化，然后脫羧-脫水至焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-I-醇酷，并最后兩次脫磷酸至3-甲基丁 -3-烯-I-醇(美國專利申請20080092829)。3-甲基丁 -3-烯-I-醇能夠被轉(zhuǎn)化為異戊ニ烯，異戊ニ烯是輪胎エ業(yè)的關(guān)鍵化合物，并且也在粘合劑中有許多應(yīng)用。它是使用若干種路線化學地生產(chǎn)的-從油中萃取蒸餾(C5切取餾分)-異戊烯脫氫-異戊烷的雙脫氫-異丁烯和甲醛反應(yīng)-丙酮和こ炔的反應(yīng)-丙烯ニ聚化W02009/076676報道了至異戊ニ烯的代謝途徑。途徑基于甲羥戊酸途徑的下游中間體，即焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-I-醇酯或異戊烯基焦磷酸的脫磷酸-脫水。此方法的缺點是要求經(jīng)歷整個甲羥戊酸途徑甲羥戊酸雙磷酸化，然后脫羧-脫水至焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-I-醇酷，再異構(gòu)化為異戊烯基焦磷酸，并最后雙脫磷酸/脫水至異戊ニ烯。異戊醇是非常重要的化學制品，通常用作脂肪、油、樹脂和生物堿的溶剤。在香料エ業(yè)中，例如在用于香皂和化妝品香料的異戊醇水楊酸酯的制造中存在對異戊醇的需求。它也用于磷酸的制造。此外，它用于擬除蟲菊酷的合成。生產(chǎn)異戊醇的商業(yè)方法包括雜醇油的分餾、烷烴的氯化和隨后的水解以生產(chǎn)異構(gòu)體的混合物以及正丁烯的低壓羰基合成或加氫甲酰基化，然后氫化獲得的異戊醛。存在為生產(chǎn)上述化合物提供環(huán)境友好、有成本效益的和簡單的方法的需求。如權(quán)利要求所述主題滿足該需求。
因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁 -3-烯-I-醇的方法。特別地，本發(fā)明涉及從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的方法，其特征為用具有脫羧酶活性的酶轉(zhuǎn)化甲羥戊酸。因此，本方法包括甲羥戊酸的酶促催化的脫羧作用。當用于本發(fā)明背景時術(shù)語“脫羧作用”優(yōu)選地指脫水性脫羧作用。術(shù)語“甲羥戊酸”包含甲羥戊酸和甲羥戊酸的陰離子，所述陰離子是生物介質(zhì)中的主要形式。甲羥戊酸是生產(chǎn)萜和類固醇的被稱為甲羥戊酸途徑的生物合成途徑中的前體。甲羥戊酸是焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-I-醇酯的主要前體，后者反過來是所有類萜的基礎(chǔ)。在圖I中顯示甲羥戊酸的結(jié)構(gòu)式。在本發(fā)明的背景中術(shù)語isoprenol(3_甲基丁-3-烯-I-醇)包含對應(yīng)式C5HltlO的化合物。isoprenol的IUPAC名稱為3-甲基丁-3-烯-I-醇。3-甲基丁-3-烯-I-醇的異名是，例如，2-甲基-1-丁烯-4-醇、3-丁烯-I-醇-3-甲基、3-異戊烯基醇、3-甲基-3-丁烯-I-醇、異丁烯基甲醇、異丙烯基こ醇和甲代烯丙基甲醇。 在本發(fā)明的背景中術(shù)語“具有脫羧酶活性的酶”指能使甲羥戊酸脫羧，特別是根據(jù)圖2給出的反應(yīng)圖解的酶。催化的反應(yīng)是同時的脫水和脫羧作用。能夠如所附的實施例I或7描述地測量此酶促活性。在優(yōu)選的實施方案中，具有脫羧酶活性的酶是分類為ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶的酶，或是源自此類酶并具有使甲羥戊酸脫羧以生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的能力的酶。用EC號EC 4-1. I. 33分類ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶。ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶能催化甲羥戊酸ニ磷酸的脫羧作用。在此反應(yīng)中，ATP和5-ニ磷酸甲羥戊酸被轉(zhuǎn)化為ADP、磷酸、焦磷酸3-甲基丁-3_烯-I-醇酯和C02。在圖2中顯示由ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶催化的反應(yīng)。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(例如在Reardon等(Biochemistry 26 (1987), 4717-4722)中的)測量ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶的活性。優(yōu)選地，如實施例I或7中描述的測量活性，其中使用ニ磷酸甲羥戊酸代替甲羥戊酸。已經(jīng)報道至少在ー些情況下反應(yīng)是ニ價陽離子依賴性的(參見，例如，Krepkiy等，Protein Science 13 (2004)，1875-1881 ；Michihara 等，Biol. Pharm. Bull. 25 (2002)，302-306)。ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶是這樣的酶，其在其天然功能中是細菌中類異戊ニ烯合成的甲羥戊酸途徑的部分，以及是真核生物中固醇生物合成途徑的部分。已經(jīng)從多種生物例如動物、真菌、酵母和細菌中鑒定并分離了它。它也被某些植物表達。已經(jīng)確定了若干ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶的三維結(jié)構(gòu)(參見，例如，Byres等(J. Mol. Biol. 371 (2007)，540-553) ;Bonanno 等(Proc. Natl Acad. Sci. USA 98(2001)，12896-12901) ；Voynova 等，Archives of Biochemistry and Biophysics 480 (2008), 58-67))，并且能夠獲得關(guān)于其活性位點、對催化反應(yīng)和實際酶促反應(yīng)決定性的氨基酸殘基的可觀的知識(參見例如 Byres 等(J. Mol. Biol. 371 (2007)，540-553) ；Bonanno 等(Proc.NatlAcad. Sci. USA 98(2001)，12896-12901))。在大多數(shù)情況下酶由約 300 至 400 個氨基酸組成，并使用ATP作為共底物，ATP在脫羧作用反應(yīng)中被轉(zhuǎn)化為ADP和無機磷酸。已經(jīng)描述了多種生物的ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶，并且編碼它們的氨基酸和核苷酸序列也可以從多個來源獲得。原則上在本發(fā)明的背景中能夠使用任何ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶，特別是來自原核或真核生物的。例如描述了動物(例如褐家鼠(Rattus norvegicus)、原雞(Gallusgallus)、人、小鼠(Mus musculus)、野豬(Sus scrofa)、黑腹果蜆(D. melanogaster)、秀麗隱桿線蟲(C. elegans)和布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)),植物(例如擬南芥、銀杏(Ginko biloba)、水稻、豌豆(Pisum sativum)),酵母(例如釀酒酵母和白假絲酵母(Candida albicans))的真核ニ磷酸甲輕戍酸脫羧酶。也描述了多種原核ニ磷酸甲輕戍酸脫羧酶，例如螺桿菌屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytgenes)、朽1檬明串珠菌、路氏乳桿菌,這僅是幾例。表I提供了來自不同生物的ニ磷酸甲羥戊酸脫羧酶的序列表，指出了能夠從各自的數(shù)據(jù)庫檢索到它們的登錄號。表I
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的方法，其特征在于其包括用具有脫羧酶活性的酶將甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為3-甲基丁 -3-烯-I-醇的步驟。
2.權(quán)利要求I的方法其中具有脫羧酶活性的酶是具有二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(EC4.I. I. 33)活性的酶。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中具有二磷酸甲羥戊酸脫羧酶活性的酶包含選自SEQIDNO :1至16所示的氨基酸序列的氨基酸序列，或者是包含與選自SEQ ID NO :1至16所示的氨基酸序列的氨基酸序列至少15%同一的氨基酸序列并顯示二磷酸甲羥戊酸脫羧酶的酶促活性的酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中具有二磷酸甲羥戊酸脫羧酶活性的酶包含SEQID NO 6,16、17、18或19的氨基酸序列，或者是包含與SEQ ID NO :6、16、17、18或19的氨基酸序列至少30%同一的氨基酸序列并顯示二磷酸甲羥戊酸脫羧酶的酶促活性的酶。
5.權(quán)利要求I至4任一項的方法,所述方法在體外實施。
6.權(quán)利要求I至5任一項的方法，其中添加共底物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中共底物是ATP、rNTP、dNTP、多磷酸鹽或焦磷酸鹽，或這些化合物的任意混合物。
8.權(quán)利要求I至4任一項的方法，其特征在于酶促轉(zhuǎn)化是由表達能催化甲羥戊酸脫羧作用至3-甲基丁 -3-烯-I-醇的酶的生物實現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中能催化甲羥戊酸脫羧作用至3-甲基丁-3-烯-I-醇的酶是具有二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(EC 4. I. I. 33)活性的酶。
10.具有脫羧酶活性的酶用于通過甲羥戊酸脫羧作用從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁 -3-烯-I-醇的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中具有脫羧酶活性的酶是具有二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(EC4.I. I. 33)活性的酶。
12.甲羥戊酸用于生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-I-醇的用途。
13.從甲羥戊酸生產(chǎn)異戊二烯的方法，所述方法包括權(quán)利要求I至9任一項的方法，并還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁 -3-烯-I-醇轉(zhuǎn)化為異戊二烯的步驟。
14.從甲羥戊酸生產(chǎn)異戊醇的方法，所述方法包括權(quán)利要求I至9任一項的方法，并還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁 -3-烯-I-醇轉(zhuǎn)化為異戊醇的步驟。
全文摘要
描述了使用甲羥戊酸作為底物，通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法，以及能催化甲羥戊酸的脫羧作用的酶用于從甲羥戊酸生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。還描述了甲羥戊酸作為起始材料在酶促催化的反應(yīng)中生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的用途。也公開了生產(chǎn)異戊二烯的方法，所述方法包括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法，并且還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁-3-烯-1-醇轉(zhuǎn)化為異戊二烯的步驟以及生產(chǎn)異戊醇的方法，所述方法包括使用甲羥戊酸作為底物并通過脫羧作用步驟將其酶促轉(zhuǎn)化為3-甲基丁-3-烯-1-醇的生產(chǎn)3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法并還包括將生產(chǎn)的3-甲基丁-3-烯-1-醇轉(zhuǎn)化為異戊醇的步驟。
文檔編號C12P5/02GK102686734SQ200980163111
公開日2012年9月19日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者M·德勒庫特, M·阿尼斯莫瓦, P·馬利埃, R·夏亞特 申請人:環(huán)球生物能源股份有限公司, 財富科學家股份有限公司