專利名稱：丙型肝炎病毒的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對血清中的丙型肝炎病毒(HCV)相關抗原進行檢測或定量的方法、以 及在這些檢測和定量中使用的極簡易且操作性高的樣品處理法。
背景技術：
由于HCV在體內(nèi)的病毒量少以及在體外的增殖體系還未確立，現(xiàn)在還不能使用天 然的病毒粒子和純化病毒蛋白得到免疫血清。在人血清中，由于個體差異針對抗原的抗體 產(chǎn)生也不同，也存在著含有針對某區(qū)域的抗原的抗體，但完全不含有針對其它區(qū)域的抗原 的抗體的個體。另外由于是多克隆抗體，也含有針對HCV以外的物質(zhì)的抗體，所以必須充分 考慮到交叉反應等后再對HCV抗體檢查的結果進行判定。由于剛感染HCV后不能產(chǎn)生抗體，所以在直至抗體出現(xiàn)在血中之前的稱為窗口期 的期間檢查抗體時，完全不能檢測到。另外對于丙型肝炎患者的治療，雖然多種干擾素和病 毒唑(ribavirin)有效，但在該治療方法的選擇和過程觀察中僅測定抗體是不充分的。在 這樣的狀況下，包括確定診斷在內(nèi)的檢測病毒抗原和基因的方法引人注目。HCV基因的檢測方法中有NAT (核酸擴增法)和DNA探針法，現(xiàn)在廣泛運用于臨床 現(xiàn)場。在NAT檢查法中，雖然具有靈敏度高特點，但另一方面還存在著幾個困難問題。例如， 為了實施PCR(聚合酶鏈反應)法，由于HCV是RNA病毒，所以必須逆轉錄為DNA，由RNA 向DNA轉錄時，由于容易發(fā)生損失，容易引起污染，所以需要特殊的擴增設備等，而且操作 繁雜，一次不能處理大量樣品，另外檢查費用也高等。在其它的NAT中，例如也需要特殊的 擴增設備等，檢查費用也高等。DNA探針法檢測靈敏度低，直至得到結果需要約20小時(醫(yī) 學與藥學 31 :961-970，1994)。另外，要指出的是檢測HCV基因的方法的一個大問題是樣品中HCVRNA的穩(wěn)定性 低，由于獲取血清工序、中長期保存、凍融操作使得定量值降低等。認為這是由于HCV粒子 表面稍微受到一點傷害，血液中的RNA分解酶就起作用，容易分解HCV RNA的緣故。由于這 些原因，為了程序化使用，在其操作和保存中需要細心注意。作為檢測HCV自身的方法，除了 HCV RNA以外，檢測HCV抗原的方法也引人注目。作為HCV抗原檢測法，就像特開平8-29427所述的那樣，嘗試使用對HCV核心抗原 上的表位具有特異性的單克隆抗體，對來自血清中的核心抗原進行檢測。這個測定方法與 PCR法比較，雖然費用低，在短時間(約3小時)就可得到結果，但另一方面有幾個實用性上 的大問題。即為了處理樣品(血清)，需要進行聚乙二醇處理(4°C 1小時)、離心操作(15分 鐘)、除去上清、尿素處理、堿處理(30分鐘)、添加中和劑等多步驟處理工序。因此由于操 作繁雜，為了獲得再現(xiàn)性，需要熟練度，另外由于需要約2小時的處理時間，所以一次不能
3處理大量的樣品。由于有離心操作、除去上清等工序，所以自動化非常困難。另外與PCR法比較，由 于靈敏度低10 100倍，所以臨床上利用性低。在(Jounal ofHepatology 23 =42-45,1995) 中，作為HCV RNA量，檢測限界處于IO4 IO5拷貝/ml，在(醫(yī)學與藥學6 1065-1070,1996) 中，使用慢性丙型肝炎患者102例的治療前血清的測定結果，相對于用CRT(競爭性逆轉錄 (competitive reverse transcription))-PCR法的陽性率100%，只不過表現(xiàn)出實質(zhì)上與 上述DNA探針法大致同等的陽性率(67%)。因此，在靈敏度方面有很大的研究余地。專利第3176570號和專利第3171827號給出的2種HCV抗原檢測法不需要上述特 開平8-29427的HCV抗原檢測法中作為缺點的包括離心操作等在內(nèi)的多步驟處理工序，只 通過30分鐘的1 2個工序，就可以處理含有HCV的樣品，另外還可以高靈敏度地對HCV抗 原進行檢測。另外由于操作簡化，一次可以處理大量的樣品，而且再現(xiàn)性和精度都提高了。 另外該測定方法與NAT比較，費用低，在短時間就可得到結果。然而在臨床中利用性更高的測定方法在靈敏度、特異性、再現(xiàn)性、操作性、短時間 化、低費用等方面必須進行不斷深入研發(fā)以滿足以上所有要求。在專利第3176570號和專利第3171827號給出的2種HCV抗原檢測法中，雖然樣 品的處理時間做到需要30分鐘，但希望將時間進一步縮短。特別是現(xiàn)在，POCT(point of care testing)檢查在推進醫(yī)院經(jīng)營合理化的美國 正急速擴大，即使從以日本為首的世界范圍看，預測今后會采用。這是在患者身邊進行檢 查，對檢查結果由醫(yī)師立即進行判斷，實施迅速處置，作為對治療過程和直至預后的監(jiān)測的 診療質(zhì)量提高方面起到很大作用的引人注目的方法。POCT與在中央檢查室進行檢查相比， 可以削減樣品的運輸和花在設備上的費用，患者來一次醫(yī)院時，接受檢查和迅速的處置，可 以減輕患者負擔。今后為了適應這樣的要求，必須要將樣品的處理時間盡可能縮短。另外，由于在HCV感染患者血液內(nèi)HCV粒子自身極少，因此HCV抗原也少，希望有 更高靈敏度的檢測方法。專利文獻1特開平8-29427號公報專利文獻2專利第3176570號專利文獻3專利第3171827號專利文獻4特開平8-29427號公報專利文獻5專利第3176570號非專利文獻1醫(yī)學與藥學31 =961-970,1994非專利文獻2Jounal of Hepatology 23:42-45,1995非專利文獻3醫(yī)學與藥學6 1065-1070,199
發(fā)明內(nèi)容
HCV在感染患者內(nèi)，病毒粒子自身極少，因此患者血中含有的HCV抗原也少。另外， 據(jù)推斷很多感染者(攜帶者)在10 30年內(nèi)向肝硬變或肝癌轉移，所以早期發(fā)現(xiàn)和早期 治療很重要。另外對于HCV感染者的治療和予后的推斷重要的是病態(tài)的把握，熱切期盼更 有意義的HCV相關標志(抗原)的測定。而作為臨床上利用性更高的測定方法，靈敏度、特 異性、再現(xiàn)性、短時間化、操作性(全自動化)、低費用作為課題，需要進行不斷開發(fā)以滿足
4所有這些要求。就是說，希望開發(fā)能夠更簡便而且高收率地獲得血清中的HCV粒子、特別是HCV抗 原的方法，以及其高靈敏度檢測和定量法。因此，本發(fā)明的目的在于提供適合通過一般的全自動測定儀器等利用可使用的溫 度對健康診斷等所謂篩選用途的很多樣品在更短時間(簡易)內(nèi)進行處理的高靈敏度HCV 抗原檢測和定量法。S卩，提供與NAT同等或以上的高靈敏度，使樣品中的HCV抗原在更短時間內(nèi)簡易 而且不用高溫游離的處理方法，可適用于一般的全自動測定儀器的HCV抗原檢測以及定量 法。另外，提供了特異識別HCV抗原的單克隆抗體以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤和使用 它們高靈敏度地進行檢測和測定的方法。用于解決課題的手段由于在感染者血中HCV濃度(IO2 IO7拷貝/ml)極低，為了檢測病毒抗原，要求 極高靈敏度。一般認為作為用于捕捉靶抗原的探針而使用抗體的代表性免疫測定法等中使 檢測靈敏度提高的方法有1)使靶抗原分子數(shù)增加，2)使與靶抗原結合的探針的結合性提 高以及使探針量增加，3)減少非特異性反應，4)使用于檢測的信號強度增加，通過將這些 方法組合，可以使靈敏度上升。HCV本身，到現(xiàn)在它的構造還不清楚，由相關黃病毒的結構和一般病毒的有關情報 可推定血中HCV粒子以其基因組RNA被核心抗原包裹，核心抗原再由錨在脂膜上的包膜抗 原(E1，E2)構成的外殼蛋白包圍的狀態(tài)存在。另外，有報道稱血中HCV粒子以與LDL(低密 度脂蛋白)等締合的狀態(tài)存在，另外由于血中存在來自宿主的針對包膜抗原的抗體，所以 人們推測也存在HCV粒子與抗包膜抗原抗體結合的免疫復合物。另外，推測血中也許還存在來自宿主的抗HCV抗原的抗體，當檢測HCV抗原時，該 抗體會與捕捉用探針或檢測用探針競爭。在本申請中所謂HCV抗原只要沒有特別說明，指 的是被HCV基因組RNA編碼的蛋白質(zhì)。即包括被認為是結構蛋白的核心抗原、El抗原、E2 抗原、或被認為是非結構蛋白的NS2、NS3、NS4、NS5抗原等。在含有HCV抗原的樣品中，可看到由于HCV抗原和抗體導致的病毒粒子或免疫復 合物的形成。為了檢測其中的例如HCV核心抗原，需要I)破壞HCV粒子，在使核心抗原從 HCV粒子游離出來的同時盡可能使核心抗原單分子化，II)對來自宿主的抗HCV抗原抗體進 行鈍化或除去，III)使核心抗原從與抗HCV抗原抗體以外的其它血中成分的相互作用中游 離。為了除去抗HCV抗原抗體，可以通過離心操作或親和柱操作等除去，但由于處理工序增 加，所以最好進行鈍化。就是說，在確定的檢測體系中使有限樣品量中含有的核心抗原從HCV粒子、抗HCV 抗原抗體、其它血中成分等最大限度地游離為單分子的狀態(tài)可使與探針反應的抗原分子數(shù) 增加。在本發(fā)明中，通過短時間而且簡易的樣品處理，使最大限度游離為單分子狀態(tài)，可使 與探針的反應性變得更高。因此，本發(fā)明提供的發(fā)明之一是對樣品中的HCV核心抗原只在短時間內(nèi)進行簡單 操作，使其成為適合使用探針檢測狀態(tài)的處理方法。以及為了利于樣品中HCV核心抗原的 檢測，通過對與捕捉用探針或檢測用探針競爭的來自宿主的抗HCV核心抗原抗體在短時間 內(nèi)進行簡單處理，同時使其鈍化的處理方法。
利用本發(fā)明，通過使用給出的處理方法，樣品中存在的HCV核心抗原從病毒粒子 或免疫復合物游離，同時通過使樣品中存在的抗HCV核心抗原的人抗體鈍化，通過使用例 如象抗體那樣的探針的免疫測定法，可以容易而且高靈敏度地進行檢測。另外，本發(fā)明還提供為了自含有HCV相關抗原的樣品做成適合HCV核心抗原與探 針例如與抗體形成免疫復合物的狀態(tài)，通過使HCV核心抗原從病毒粒子游離，同時用使樣 品中存在的抗HCV相關抗原的人抗體鈍化的處理劑對樣品進行處理的工序，對游離的HCV 相關抗原使用例如象抗體那樣的探針的免疫測定法進行檢測以及定量的方法、和檢查試劑
品.ο檢測使用的探針例如抗體是與HCV核心抗原特異結合的抗體，只要是表現(xiàn)出一定 的高親和性的就可以，希望捕捉被處理樣品中HCV核心抗原的一種探針可以識別并結合 HCV核心抗原的C端側。這里所謂的核心抗原的C端側指的是自HCV核心抗原的氨基酸序 列第81位至160位的序列、或其中的一部分。特別是識別HCV核心抗原的氨基酸序列編號 的 100-120、111-130、即 100-130 的抗體有用。這里所說的探針指的是免疫小鼠、大鼠、土撥鼠、兔、雞、山羊、綿羊、牛等實驗動物 后得到的多克隆抗體；從免疫的個體分離脾細胞等，通過與骨髓瘤細胞等融合得到的雜交 瘤產(chǎn)生的單克隆抗體；或使脾細胞、血中白血球通過EB病毒轉染導致不斷增殖的細胞產(chǎn)生 的單克隆抗體；HCV感染的人、黑猩猩等產(chǎn)生的單克隆抗體；從小鼠、人等的免疫球蛋白的 cDNA、染色體DNA得到的可變區(qū)基因片段、或免疫球蛋白的cDNA、染色體DNA的一部分與人 工制備的序列組合構成的可變區(qū)基因片段、使用人工基因序列構成的可變區(qū)基因片段、或 用將以它們作為材料通過基因重組手法制作的可變區(qū)基因片段與免疫球蛋白恒定區(qū)基因 片段組合而構成的重組抗體基因轉化細胞而產(chǎn)生的重組抗體；上述可變區(qū)基因片段與例如 噬菌體的結構蛋白融合后制作的噬菌體抗體；用通過將上述可變區(qū)基因片段與其它的合適 基因片段例如myc基因的一部分等組合構成的重組抗體基因轉化細胞而產(chǎn)生的重組抗體； 與受體等蛋白質(zhì)特異結合的分子或對它進行改變得到的探針；此外通過組合化學技術制 作的探針等，只要是對HCV核心抗原表現(xiàn)出高特異性、親和性的分子，都可以使用。在本申請發(fā)明中，作為上述探針之一，獲得了與HCV核心抗原結合的單克隆抗體。 單克隆抗體可以象以下那樣制備。例如將含有HCV核心區(qū)的融合多肽或多肽單獨或與BSA、 KLH等結合后作為抗原，與各種佐劑混合后定期對BALB/c小鼠等的腹腔內(nèi)或皮內(nèi)進行免 疫。在血中抗體效價上升的時間點，作為加強免疫將本抗原注入到尾靜脈內(nèi)，無菌摘出脾 臟后，與適當?shù)男∈蠊撬枇黾毎赀M行細胞融合，得到雜交瘤。本方法可以根據(jù)Kehler與 Milstein 的方法(Nature 256 :495_497，1975)進行。將通過上述方法得到的雜交瘤細胞株在適當?shù)呐囵B(yǎng)液中進行培養(yǎng)，然后選擇對本 抗原顯示出特異反應的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株進行克隆。對于產(chǎn)生抗體的雜交瘤的克 隆，除了極限稀釋法之外還可以利用軟瓊脂法(Eur. J. Immunol. 6 511-519,1976)等。然 后通過蛋白A等的柱層析等方法純化產(chǎn)生的單克隆抗體。另外除上述單克隆抗體以外，也 可以制作作為探針使用的分子。例如，關于重組抗體在Hoogenboon的綜述等中有詳細記載 (Trends in Biotechnology，15 :62_70，1997)。根據(jù)本發(fā)明制備的單克隆抗體可以在HCV核心抗原的檢測和定量用中作為酶聯(lián) 免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫斑點測定、放射免疫測定、基于凝集的測定、或其它熟知的免疫測定法中的檢查試劑使用。另外，在檢測中使用標記抗體時，作為標記化合物可以使用例 如熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶、染色物質(zhì)等。例如，為了檢測樣品(血清)中來自HCV的結構蛋白，使用以夾心反應體系為原理 的方法時，要使用的診斷試劑盒包括包被于固體支持體(例如微量滴定孔的內(nèi)壁)的本發(fā) 明1種或以上的單克隆抗體和與標記物質(zhì)結合的1種或以上的單克隆抗體或它們的片段。 固相化于固體支持體的單克隆抗體和標記的單克隆抗體的組合任意，可以選擇能夠獲得高 靈敏度的組合。作為可使用的固體支持體如聚苯乙烯或聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯制的微量滴定 板、試管、毛細管、珠(乳膠粒子或紅血球、金屬化合物等)、膜(脂質(zhì)體等)、濾器等。在本申請發(fā)明中使用免疫測定法對用酸化劑處理的樣品的核心抗原進行了測定。 此時使用抗HCV核心抗原的單克隆抗體進行測定。就像實施例所示那樣，將固相化抗體使 用2種單克隆抗體、用于檢測的標記抗體使用2種單克隆抗體的檢測體系與固相化抗體使 用3種單克隆抗體、用于檢測的標記抗體使用2種單克隆抗體的檢測體系進行比較。比較 結果表明固相化抗體使用3種單克隆抗體、用于檢測的標記抗體使用2種單克隆抗體的檢 測體系反應性上升。認為這是由于固相化抗體使用3種單克隆抗體產(chǎn)生的效果。因此，本 發(fā)明還可以提供使用單克隆抗體的HCV核心抗原的免疫測定法。表明對于固相化抗體使用 識別HCV核心抗原C末端的氨基酸編號100-120、或111-130的2種抗體相比，使用3種抗 體的反應性提高了。附圖的簡單說明

圖1是表示對在樣品處理中由于酸化劑(鹽酸)濃度不同產(chǎn)生的效果進行研究的 結果圖。使用健康人樣品(normal)和5種HCV-抗原陽性樣品。圖2是表示對在樣品處理中由于添加濃度不同的非離子型表面活性劑 (TritonXlOO)產(chǎn)生的效果進行研究的結果圖。使用健康人樣品(normalplasma)和3種 HCV-抗原陽性樣品。圖3是表示HCV-抗原陽性樣品與本發(fā)明的樣品處理后游離的核心抗原活性的測 定值以及使用現(xiàn)有方法在樣品處理后游離的核心抗原活性的測定值的相關性的圖。用于實施發(fā)明的最好方式作為本發(fā)明的樣品，包括全血、血漿、血清、尿、唾液、腦脊髓液等生物學體液以及 肝組織等。使樣品中存在的抗體活性失活的條件已知有堿處理、酸處理等。對血清等進行酸 處理時，一部分來自血清的蛋白質(zhì)等不可逆變性，因場合不同有時會產(chǎn)生沉淀或白濁。因 此，樣品酸處理后，在處理樣品的吸液操作中，往往出現(xiàn)堵住等障礙，另外，測定時在捕捉靶 抗原的抗體等探針結合的擔體或固相有時吸附裹入變性蛋白質(zhì)等沉淀，呈假陽性。此外，有 時在這些沉淀物中裹入靶抗原，由于可與探針結合的抗原量的減少，出現(xiàn)靈敏度降低的問 題。本申請發(fā)明通過向酸化劑添加其它物質(zhì)，可以達到防止由于酸處理引起的沉淀或 白濁等不可逆變性或防止假陽性和使靈敏度提高。其中作為酸化劑，鹽酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸等合適。特別是酸化劑濃 度在處理時濃度為0. 13N或以上至IN以下好，優(yōu)選0. 5N 1N。此時加了酸化劑的樣品在
7PH2. 5以下處理，而在大部分樣品中都是在pH2. 0以下進行處理。作為向酸化劑添加的物質(zhì)之一可考慮表面活性劑。已知多種表面活性劑具有破壞 蛋白質(zhì)高級結構的作用，具有使病毒粒子膜破壞和使樣品中抗靶抗原的抗體變性，以及使 不溶性蛋白質(zhì)可溶化的效果。然而，在這樣的表面活性劑存在下，也存在靶抗原的結構表位 被破壞，與捕捉抗原用抗體等探針的結合變?nèi)酰`敏度降低的大的問題。另外，表面活性劑的變性作用大多是可逆的，有時通過稀釋或透析將表面活性劑 濃度變稀，可將暫時變性的結構恢復。這表明存在與捕捉靶抗原的探針或檢測用探針進行 競爭的來自樣品的抗體，結果使得靈敏度降低。即，表面活性劑的添加具有以上所述的二面 性。表面活性劑可根據(jù)它們的結構和性質(zhì)分為許多類型。離子型中有陰離子型、陽離子型、 兩性離子型、非離子型表面活性劑等。在這些表面活性劑中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將酸化劑與特別是在同一分子中具有碳 數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面 活性劑組合，表現(xiàn)出沉淀物等酸處理問題、樣品中抗體的可逆變性等表面活性劑處理的問 題均被消除，HCV抗原檢測靈敏度大幅上升的效果，使得本發(fā)明完成。另外發(fā)現(xiàn)在包含酸化劑和該表面活性劑的處理劑中添加TritonXlOO等聚氧乙烯 異辛基苯基醚類或NP-40等聚氧乙烯壬基苯基醚類等非離子型表面活性劑、或添加尿素、 硫脲等蛋白質(zhì)變性劑、或添加半胱氨酸、半胱胺、二甲氨基乙硫醇、二乙氨基乙硫醇或二異 丙氨基乙硫醇等還原劑更好。即本發(fā)明提供特征如下的含HCV樣品的處理方法通過將含有HCV的樣品用含有 (1)酸化劑，以及(2)在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑，以及(3)蛋白質(zhì)變性劑、非離子型表面 活性劑或還原劑的處理劑進行處理，使HCV抗原游離以及將與HCV抗原結合的抗體破壞。另外發(fā)現(xiàn)通過向(3)蛋白變性劑、非離子型表面活性劑或還原劑中添加，或取代 它們添加單糖類、二糖類、檸檬酸、或檸檬酸鹽類，可增強本發(fā)明的效果。作為在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩 性離子型表面活性劑，N-十二烷基-N，N- 二甲基-3-銨-1-丙磺酸(N-Dodecyl-N，N-di methyl-3-ammonio-l-propanesulfonate)、N-十四燒基-N, N- 二甲基-3-銨-1-丙磺酸 (N-TetradecyI-N, N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate)、N-十六燒基-N, N- 二 甲基-3-銨-1-丙石黃酸(N-Hexadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate)、 N-十八燒基-N, N- 二甲基-3-銨-1-丙磺酸(N-Octadecyl-N，N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate) ^^fxSo作為在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的陽離子型表面活性劑，氯化癸基三甲基銨(Decyltrimethylammonium Chloride)、 氯化十二烷基三甲基銨(Dodecyltrimethylammonium Chloride)、氯化十四烷基 三甲基銨(Tetradecyltrimethylammonium Chloride)、氯化十六烷基三甲基銨 (Hexadecyltrimethylammonium Chloride)、溴化癸基三甲基銨(Decyltrimethylammonium Bromide)、、溴化十二燒基三甲基銨(Dodecyltrimethylammonium Bromide)、、溴化十四 烷基三甲基銨(Tetradecyltrimethylammonium Bromide)、溴化十六烷基三甲基銨 (Decyltrimethylammonium Bromide)、氯化月桂基口比唆鐵(Laurylpyridinium Chloride)、
8氯化十四烷基吡啶鐺(Tetradecyl pyridiniumChloride)、氯化十六烷基吡啶鐺(Cetyl pyridinium Chloride)等合適。在同一分子中具有這樣的碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩 性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑濃度優(yōu)選處理時濃度為0. 或以上至15% 以下，更優(yōu)選0. 5% 10%。作為在酸化劑和在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季 銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑濃度存在下的非離子型表面活性劑， TritonXlOO等聚氧乙烯異辛基苯基醚類，以及NP-40等聚氧乙烯壬基苯基醚類、吐溫80等 聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯類等合適，它們的濃度，處理時濃度優(yōu)選或以上至7. 5%以 下，更優(yōu)選或以上至5%以下。本申請所述的百分率用重量/質(zhì)量X 100%表示。作為在酸化劑和在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季 銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑濃度存在下的蛋白質(zhì)變性劑，尿素或 硫脲等合適，它們的濃度在處理時濃度優(yōu)選0. 5M或以上，更優(yōu)選IM或以上至4M以下，在 溶解性等沒有問題的場合，例如預先向樣品處理用管添加粉末尿素等場合，可以使用到IOM 之前的濃度。作為在酸化劑和在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季 銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑濃度存在下的還原劑，半胱氨酸、半 胱胺、二甲氨基乙硫醇、二乙氨基乙硫醇、二丙氨基乙硫醇等合適，它們的濃度在處理時濃 度優(yōu)選0. 25mM或以上至IOOOmM以下，更優(yōu)選1. 5mM或以上至200mM以下。向酸化劑和在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑中添加的單糖類或二糖類，麥芽糖、蔗糖、 海藻糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇、半乳糖、右旋糖合適。另外向酸化劑和在同一分 子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽 離子型表面活性劑中添加的檸檬酸或檸檬酸鹽類，檸檬酸、檸檬酸水合物、檸檬酸鈉鹽、檸 檬酸鉀鹽合適。作為向酸化劑添加的其它物質(zhì)可以考慮尿素等蛋白質(zhì)變性劑。已知尿素等蛋白質(zhì) 變性劑通過削弱氫離子鍵，對蛋白質(zhì)的高級結構具有部分破壞作用，所以可以使病毒粒子 膜破壞和使樣品中抗靶抗原的抗體變性。另外還具有使例如在大腸菌表達的重組蛋白質(zhì)由 不溶性級分包涵體變?yōu)榭扇芑仁共蝗苄猿恋砦锟扇芑男Ч?。然而，在尿素等蛋白質(zhì)變 性劑存在下，也存在靶抗原的結構表位被破壞，與捕捉抗原用抗體等探針的結合變?nèi)?，靈敏 度降低的大的問題。另外，尿素等蛋白質(zhì)變性劑的變性作用往往是可逆的，有時通過稀釋或透析等將 蛋白質(zhì)變性劑濃度變稀，可將暫時變性的結構恢復。這表明存在與捕捉靶抗原的探針或檢 測用探針進行競爭的來自樣品的抗體，結果使得靈敏度降低。即，尿素等蛋白質(zhì)變性劑的添 加具有以上所述的二面性。本發(fā)明人通過將酸處理和蛋白質(zhì)變性劑處理組合，發(fā)現(xiàn)沉淀物等酸處理的問題、 樣品中抗體的可逆變性等蛋白質(zhì)變性劑處理的問題被消除，使得本發(fā)明的另一個發(fā)明完 成。本申請發(fā)明人通過在處理時添加IM或以上的蛋白質(zhì)變性劑之一的尿素可以使酸處理導致的沉淀物形成大大減少。作為這樣的蛋白質(zhì)變性劑，尿素、硫脲等合適。另外蛋白 質(zhì)變性劑濃度在處理時濃度優(yōu)選IM或以上，更優(yōu)選1. 5M或以上至8M以下。另外還發(fā)現(xiàn) 通過向包含酸化劑和蛋白質(zhì)變性劑的處理劑中添加TritonXlOO等聚氧乙烯異辛基苯基醚 類，以及NP-40等聚氧乙烯壬基苯基醚類等非離子型表面活性劑，具有使靈敏度上升等效 果。另外也可以向包含酸化劑和蛋白質(zhì)變性劑的處理劑中添加還原劑。如對上述實驗進行概括，本發(fā)明提供含有HCV的樣品的處理方法，其特征是通過 將含有HCV (丙型肝炎病毒)的樣品用含有(1)酸化劑，以及(2)蛋白質(zhì)變性劑，或在同一 分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或 陽離子型表面活性劑的處理劑處理，使HCV抗原游離和破壞與HCV抗原結合的抗體。另外提供特征如下的對含HCV樣品的處理方法通過將含有HCV的樣品用含有下 面的(1)、(2)中的至少一種或一種以上物質(zhì)和(3)中的至少一種或一種以上的物質(zhì)的處理 劑處理，使HCV抗原游離和破壞與HCV抗原結合的抗體。(1)、(2)、(3)的物質(zhì)是(1)酸化 劑、(2)蛋白質(zhì)變性劑、(3)非離子型表面活性劑或還原劑。另外，本申請發(fā)明的處理可以在 高溫下進行，優(yōu)選在20°C 50°C，更優(yōu)選在25°C 42°C進行。顯然通過使用本發(fā)明的處理方法，可以從含有具有與HCV同樣構造的病毒粒子的 樣品使病毒抗原游離為適合使用探針的測定方法的狀態(tài)。其中所謂具有與HCV同樣構造的 病毒是可形成具有這樣結構的病毒粒子的病毒，所述病毒粒子由包裝基因組RNA、DNA的蛋 白質(zhì)和包圍該蛋白的膜蛋白質(zhì)與脂膜構成；或是可形成具有這樣結構的病毒粒子的病毒， 所述病毒粒子由包裝基因組RNA、DNA的蛋白質(zhì)和包圍該蛋白的脂膜構成；或是可形成具有 這樣結構的病毒粒子的病毒，所述病毒粒子由內(nèi)包基因組RNA、DNA的蛋白質(zhì)與脂膜構成。例如，作為HCV的類似病毒，包括黃病毒類、人免疫缺陷病毒等逆病毒等。另外還 包括象具有基因組DNA的乙型肝炎病毒那樣的具有基因組DNA的病毒，或雖然不帶包膜蛋 白質(zhì)，但具有包裝基因組DNA的蛋白質(zhì)的人細小病毒等。
實施例以下實施例給出了本發(fā)明的例證，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實施例。實施例1.雜交瘤的制作法將根據(jù)專利第3171827號所述的方法制備的融合HCV核心蛋白質(zhì)(Trp Cll)溶解 于6M尿素后，按照終濃度0. 2 1. Omg/mL用含有0. 15MNaCl的IOmM磷酸緩沖液(pH7. 3) 稀釋，與等量的夕AH” ^混合，作為Trp Cll懸浮液。將Trp Cll濃度調(diào)整到終濃 度0. 1 0. 5mg/mL的該懸浮液注射到4 6周齡的BALB/c品系小鼠腹腔內(nèi)。2周后進行 同樣的免疫，再于約2周后，向尾靜脈內(nèi)注射將Trp Cll調(diào)整到0. Olmg/mL的生理鹽水溶 液。在最后的加強免疫后第3天，在無菌條件下從該免疫動物摘出脾臟，用剪刀剪成 切片，再用篩過濾使脾臟成為一個一個細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次。在8-氮雜鳥嘌 呤存在下培養(yǎng)數(shù)日，將完全除去回復突變體的對數(shù)增殖期小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0Agl4經(jīng) 上述同樣洗凈后，就該細胞1. 8 X IO7個與脾細胞1. OX IO8個加入到50mL容量的離心管中， 并混合。于200 Xg下離心分離5分鐘，除去上清，加入保溫在37°C的含有50%聚乙二醇 4000 (PEG4000 ；Merck公司生產(chǎn))的RPMI-1640培養(yǎng)基lmL，進行細胞融合。
融合細胞經(jīng)離心分離(200 X g，5分鐘)除去PEG4000后，使用96孔板，在含有次黃 嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(以下省略為HAT)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 2周， 只使雜交瘤增殖。然后在不含有HAT的培養(yǎng)基中使其成長發(fā)育，約2周后對產(chǎn)生目的抗體 的克隆用ELISA法進行檢測，得到產(chǎn)生具有所期望反應特異性的本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。對于得到的雜交瘤，根據(jù)常規(guī)的極限稀釋法，對產(chǎn)生目的抗體的株進行檢測和 單一克隆化，將得到的雜交瘤分別命名為HC11-14、HC11-10、HC11-15、HC11-3、HCll-IU HC11-7、HC11-9、以及 HC11—21。HCl 1-14 (FERM BP—6006)、HCl 1—10 (FERM BP—6004)、 HCl 1-3 (FERM BP-6002)、HC11-11 (FERM BP-6005)、W&HC11_7(FERM BP-6003)的雜交瘤于 1997 年 7 月 4 日，HCl 1-15 (FERM BP-6782)于 1999 年 7 月 16 H, HCl 1-9 (FERM BP-08493)、 HC11-2KFERM BP-08494)的雜交瘤于2003年9月25日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合 研究所專利生物保藏實施例2.單克隆抗體的制作法將通過實施例2所述方法得到的雜交瘤移植到用降植烷等處理后小鼠腹腔，取得 腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。該單克隆抗體的純化利用結合了蛋白A的瓊脂糖凝膠柱分離 IgG級分。由上述8種雜交瘤產(chǎn)生的分別的單克隆抗體Cll-15、Cll-14、Cll-10、C11-7、 C11-9、C11-11、C11-21以及C11-3的同種型通過使用小鼠的Ig各個同種型試劑盒(Zymed 公司生產(chǎn))，闡明了 Cll-10、Cll-7 是 IgG2a ；Cll-14、Cll-3、Cll-9、Cll-21、Cll-11、C11-1 是IgGl。對于得到的各種單克隆抗體，使用根據(jù)來自HCV核心區(qū)的序列每10個氨基酸 重復而合成的約20個氨基酸的肽進行表位解析。Cll-14、Cll-10、C11-7和C11-3識別 專利第 3171827 號所述的序列。Cll-9、C11-21 分別識別 2 1DvkFPGGGQIVGGVYLIi3RR4c^P 100PRGSRPSWGPTDPRHRSRNVG120的序列。即C11-9是識別HCV核心抗原氨基酸編號21-40的 序列的單克隆抗體，C11-21識別HCV核心抗原氨基酸編號100-120的序列的單克隆抗體。實施例4.樣品處理條件研究(處理條件研究)1)酸化劑濃度向HCV抗原陰性樣品或HCV抗原陽性樣品(#19、#86、#89、#92_4、 #96) 100 μ L中添加各種鹽酸濃度的水溶液50 μ L，于37°C溫育10分鐘，將其中的100 μ L作 為測定樣品，使用以下所述的測定法進行研究。向 96 孔微量培養(yǎng)板(Costar High Binding Plate)加 200 μ L 的 4 μ g/mL 濃度的 抗HCV核心抗原單克隆抗體(cll-3和cll-7等量混合)，于4°C溫育過夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液pH7. 3洗2次后，加350 μ L的含有0. 5% 酪蛋白鈉的IOmM磷酸緩沖液ρΗ7. 1，溫育2小時。除去封閉液后，將含有中和劑的反應緩沖 液100 μ L和各個用樣品處理法得到的測定樣品加到各個孔中，邊攪拌，邊于室溫反應1小 時，用含有0. 05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液ρΗ7. 3 (洗凈液)350 μ L清洗6次，再添加辣 根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體(C11-10和C11-14等量混合)200yL，于室溫反應 30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、30%過氧化氫水0. 9 μ 1/ ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液ρΗ5· 0) 200 μ L，溫育30分鐘。加5N硫酸50yL停止酶反應，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 口 f MTP32)測定
11492nm(參考波長630nm)的吸光度，結果如圖1所示。另外，圖1所示的鹽酸濃度用將樣品 (Sample)和處理劑混合后的處理時濃度表示。HCV陽性樣品(#19、#86、#89、#92-4, #96)在不含有鹽酸的溶液中即使于37°C溫 育10分鐘，也幾乎檢測不到核心抗原活性，從處理時的鹽酸濃度0. 167N開始證實核心抗原 活性，在0. 5 0. 867N為峰。當使用硫酸替代鹽酸進行研究時，幾乎得到同樣結果。2)在酸化劑共存下的各種表面活性劑濃度向HCV抗原陰性樣品或HCV抗原陽性 樣品(#110、#120、#117、#89) 100 μ L添加將各種表面活性劑溶解于1. 5Ν鹽酸濃度的水溶 液后的該溶液50 μ L，于37°C溫育10分鐘，將其中的100 μ L作為測定樣品，用上述1)中方 法進行研究(表1 表4)。就像表1 表4表示的那樣，判斷4例樣品中的2例表現(xiàn)出比各個樣品判定基準 高的反應性，具有表面活性劑添加效果。該結果證實如果與鹽酸或硫酸這樣的酸化劑一起 添加各種表面活性劑，表面活性劑可使HCV核心抗原陽性樣品中的核心抗原免疫活性有很 大上升。添加效果已被證實了的是在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和 叔胺或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑。在同一分子中具有碳數(shù)8個以下的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的表面活性劑沒有 觀察到添加效果。另外在同一分子中具有10個碳數(shù)的單鏈烷基和仲胺的象MEGA-10這樣 的非離子型表面活性劑效果弱。象TritonXlOO或吐溫20這樣的非離子型表面活性劑或 象CHAPS這樣的具有類固醇骨架的表面活性劑沒有表現(xiàn)出反應性的提高。十二烷基硫酸鈉 (SDS)幾乎不能確認效果，2. 5%或以上的高濃度下在與樣品反應中生成白色沉淀。此外， 對N-十二烷酰基肌氨酸鈉或脫氧膽酸等也進行了研究，在與酸化劑共存時，溶解性差，不 能進行研究。通過向酸化劑中添加在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺 或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑，已經(jīng)證實測定靈敏度提高。從 該酸化劑和表面活性劑的處理劑中除去酸化劑，只用有效果的表面活性劑進行處理，測定 靈敏度大大降低。由此可以認為測定靈敏度的上升是以酸化劑作為基礎，通過添加表面活 性劑大大上升的結果。表 1 表4 3)酸化劑共存下的蛋白質(zhì)變性劑向HCV抗原陰性樣品或HCV抗原陽性樣品(#86、#96、#117、#89) 100 μ L添加將蛋 白質(zhì)變性劑之一的尿素溶解于1. 5Ν鹽酸濃度水溶液后的該溶液50 μ L，于37°C溫育10分 鐘，將其中的IOOyL作為測定樣品，用1)上述的方法進行研究(表5)。如果添加蛋白質(zhì)變性劑之一的尿素，以僅使用酸化劑作為對照，確認上升約 1.4 2倍的樣品。另外，在僅以酸化劑處理時，有時血清蛋白等變性沉淀或產(chǎn)生白池，往往 變成了吸液管操作障礙或沉淀物所致大的假陽性的原因。另外，認為由于這些沉淀物中裹 入目的抗原導致靈敏度降低。在處理時通過添加IM或以上尿素，判明可大大減少這樣的沉 淀物，特別是在處理時通過添加1. 5M或以上至8M以下尿素，確認效果更好。尿素可溶解至 約10M，由于也存在因保存條件引起的析出等問題，所以作為溶液使用時，處理時濃度和處 理液量與樣品量的比有關。表 5 4)在酸化劑和同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑共存下的非離子型表面活性劑的研究向HCV抗原陰性樣品(正常血漿)或3例HCV抗原陽性樣品(#120、#117、 #97) 100 μ L添加使非離子型表面活性劑Triton XlOO與含有1. ON鹽酸與5. 0%溴化十二 烷基三甲基銨(略為C12TAB)的溶液混合后的溶液100 μ L，于37°C溫育10分鐘，將其中的 100 μ L作為測定樣品，用1)所述方法進行研究(圖5)。圖5所示的非離子型表面活性劑Triton XlOO的濃度用處理樣品時的濃度表示。 在HCV抗原陰性樣品(正常血漿)中即使添加Triton X100，也幾乎看不到其信號的變化， 而在HCV抗原陽性樣品(#120、#117、#97)中，當處理樣品時添加1 % 7. 5%的濃度時，確 認反應性提高。特別是Triton XlOO為 5%時表現(xiàn)出高的反應性。5)在酸化劑和同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑共存下的蛋白變性劑的研究向HCV抗原陰性樣品(正常血漿)或4例HCV抗原陽性樣品(#120、#118、#117、 #97) 100 μ L添加使非離子型表面活性劑Triton X100與含有1.0N鹽酸與5.0% C12TAB的 溶液混合后的溶液10(^1^，于371溫育10分鐘，將其中的100 μ L作為測定樣品，用1)所 述方法進行研究，求各個HCV抗原陽性樣品的免疫活性對HCV抗原陰性樣品的免疫活性的 比率(HCV抗原陽性樣品的吸光度/HCV抗原陰性樣品的吸光度)，如表6所示。
表6
HCV抗原陽性樣品
尿素(M)正常血漿#97#117#118#1200.01.022.323.13.49.70.51.031.735.14.513.71.01.028.045.04.311.41.51.052.877.38.321.92.01.065.282.47.825.42.51.094.696.29.730.43.01.0155.8142.013.836.73.51.0232.3216.316.049.3表6所示的作為蛋白質(zhì)變性劑之一的尿素(Urea)濃度用處理樣品時的濃度表示。 HCV抗原陽性樣品(#120、#117、#97)的免疫活性對HCV抗原陰性樣品(正常血漿)的免疫 活性的比確認從添加0. 5M尿素開始顯著上升，隨著尿素濃度增加，至少在添加到3. 5M尿素 之前一直上升。在本次研究中，預處理液中尿素濃度達到8M的話，由于溶解性差，所以不能 進行預處理時4M或以上尿素的研究。因此，確認通過與作為蛋白質(zhì)變性劑使用的試劑共存，HCV核心抗原的免疫活性上 升。當然，可以認為這些共存效果如果是尿素以外的蛋白質(zhì)變性劑，也能夠確認同樣的效^ ο6)在酸化劑和同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽 的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑共存下的還原劑的研究向HCV抗原陰性樣品(正常血漿)或3例HCV抗原陽性樣品(#120、#117、 #97) 100 μ L添加含有1. ON鹽酸和5. 0% C12TAB的溶液與作為還原劑的二乙氨基乙硫醇鹽 酸混合后的溶液10(^1^，于371溫育10分鐘，將其中的100 μ L作為測定樣品，用1)所述 方法進行研究(表7)。其中使用的還原劑二乙氨基乙硫醇鹽酸濃度用處理樣品時的濃度表示。在HCV抗 原陰性樣品(正常血漿)中即使添加二乙氨基乙硫醇鹽酸，也幾乎看不到該樣品信號的變 化，而在HCV抗原陽性樣品(#120、#117、#97)中，當處理樣品時從0. 25mM或以上的還原劑 濃度開始確認信號上升，特別是還原劑濃度在IOmM或以上時，確認3例樣品都上升了 30% 或以上，而在#117中添加20mM還原劑時，信號增加到2倍或以上。表 7
17 NT:未試驗實施例5.使用本發(fā)明處理法和現(xiàn)有的處理法(1)對HCV核心抗原進行檢測在專利第3171827 號和青柳等人的報告中(Journal of ClinicalMicrobiology, 37 =1802-1808,1999)，表明通過用含有高濃度十二烷基硫酸鈉等陰離子型表面活性劑和兩 性離子型表面活性劑的處理液進行30分鐘的熱處理，可以高靈敏度地檢測HCV核心抗原。 用該樣品處理法和本發(fā)明處理法檢測各個樣品中的HCV核心抗原，并進行了比較。(用本發(fā)明處理法測定HCV核心抗原)將樣品100 μ L 與處理液(IN HC1，7 % C12TAB，3. 5 % N-十六烷基-N，N-二甲 基-3-銨-1-丙磺酸、7% TritonXlOO,2Μ尿素、IOmM 二乙氨基乙硫醇鹽酸)100 μ L混合，于 37°C進行10分鐘預處理。向 96 孔微量培養(yǎng)板(Costar High Binding Plate)的各個孔加 200 μ L 的 4 μ g/mL 的抗HCV核心抗原單克隆抗體(cl 1-3和cl 1-7等量混合)，于4°C溫育過夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液(pH7. 3)洗2次后，加350 μ L的含有0. 5%酪蛋白鈉的IOmM磷酸 緩沖液(ΡΗ7. 1)，溫育2小時。除去封閉液后，將含有中和劑的反應緩沖液IOOyL和經(jīng)處理 的測定樣品100 μ L加到各個孔中。邊攪拌，邊于室溫下反應1小時，用含有0.05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液 (ρΗ7. 3)(洗凈液)350yL清洗6次，再添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體 (C11-10和C11-14等量混合)200 μ L，于室溫反應30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶 液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、30%過氧化氫水0.9 μ 1/ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液 PH5. 0) 200 μ L，溫育30分鐘。加5N硫酸50 μ L使酶反應停止，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 口 t MTP32)測定492nm(參考波長630nm)的吸光度。(用現(xiàn)有處理法(1)測定HCV核心抗原)將樣品100 μ L 與處理液(15% SDS,2% CHAPS,0. 3% TritonX100、2M尿素)50 μ L 混合，于56°C進行30分鐘處理。然后恢復到室溫，作為測定樣品。
向 96 孔微量培養(yǎng)板(Costar High Binding Plate)的各個孔加 200 μ L 的 4 μ g/mL 的抗HCV核心抗原單克隆抗體(cl 1-3和cl 1-7等量混合)于4°C溫育過夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液(pH7. 3)洗2次后，加350 μ L的含有0. 5%酪蛋白鈉的IOmM磷酸 緩沖液(ΡΗ7. 1)，溫育2小時。除去封閉液后，將反應緩沖液100 μ L和經(jīng)處理的測定樣品 100 μ L加到各個孔中。邊攪拌，邊于室溫反應1小時，用含有0. 05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 3) (洗凈液)350yL清洗6次。添加HRP標記的單克隆抗體(C11-10和C11-14等量混 合)200 μ L，于室溫反應30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、 30%過氧化氫水0. 9 μ 1/ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液(ρΗ5· 0)) 200 μ L，溫育30分鐘。加 5Ν硫酸50 μ L使酶反應停止，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 α f MTP32)測定492nm (參考波長 630nm)的吸光度。表8和表9給出了使用以上2種預處理法檢測HCV核心抗原的結果，它們的相關 性如圖3所示。就像表8和表9所示的那樣，本發(fā)明處理法與現(xiàn)有方法比較，30例HCV-RNA 陽性樣品中的反應性確認上升1. 85 6. 7倍，反應性平均上升3. 6倍。特別是在5例樣 品(No. 9，11，24，25，30)中，用現(xiàn)有方法不能檢測到，但使用本發(fā)明處理法可很容易檢測到 HCV核心抗原，靈敏度更高。另外，相關系數(shù)為0.894，表現(xiàn)出高相關性。表8 表 9
合)200 μ L，于室溫反應30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、 30%過氧化氫水0. 9μ 1/ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液pH5. 0) 200 μ L，溫育30分鐘。加 5Ν硫酸50 μ L使酶反應停止，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二口 f MTP32)測定492nm(參考波長 630nm)的吸光度，與使用實施例5的本發(fā)明處理法的HCV核心抗原檢測中得到的結果進行 比較(表11和表12)。當固相中添加cll-3、cll-7以及cll_21，以及作為酶標記抗體直接利用cll_14， 取代cll-10使用cl 1-9時，反應性平均上升約1.31倍，特別是No. 19反應性上升至1.65 倍(表12)。這可認為是在固相抗體中使用了 3種識別HCV核心抗原C末端氨基酸編號 100-120、以及111-130的抗體產(chǎn)生的效果。即與在固相中使用2種識別HCV核心抗原氨基 酸序列100-130的抗體相比，使用3種更容易捕捉核心抗原，可看到測定值上升。實施例7.單克隆抗體組合的反應性將樣品100 μ L 與預處理液(IN HCl, 7% C12TAB,7% TritonXlOO, 2M 尿素、IOmM 二乙氨基乙硫醇鹽酸)100 μ L混合，于37°C進行10分鐘預處理。向96孔微量培養(yǎng)板(Costar High Binding Plate)的各個孔加200 μ L的共計 4μ g/mL的抗HCV核心抗原單克隆抗體(cll-3與cll-7 ；或cll-3、cll_7和cll_ll ；或 cll-3、cll-7和cll-21等量混合)于4°C溫育過夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖 液(PH7. 3)洗2次后，加350 μ L的含有0. 5%酪蛋白鈉的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 1)，溫育 2小時。除去封閉液后，將含有中和劑的反應緩沖液100 μ L和經(jīng)預處理法處理的測定樣品 100 μ L加到各個孔中。邊攪拌，邊于室溫反應1小時，用含有0. 05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 3) (洗凈液)350 μ L清洗6次。添加HRP標記的單克隆抗體(C11-9和C11-14等量混 合)200 μ L，于室溫反應30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、 30%過氧化氫水0. 9μ 1/ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液pH5. 0) 200 μ L，溫育30分鐘。加 5Ν硫酸50 μ L使酶反應停止，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 α f MTP32)測定492nm (參考波長 630nm)的吸光度，研究用于固相的抗體的添加效果(表10)。通過向固相添加cl 1-3、cl 1-7以及cll-11和cll_21，HCV-RNA陽性樣品的反應性 上升。認為這是在固相抗體中使用了 3種識別HCV核心抗原C末端氨基酸100-120、以及 111-130的抗體產(chǎn)生的效果。即與在固相中使用2種識別HCV核心抗原氨基酸序列100-130 的抗體相比，可看到使用3種更容易捕捉HCV核心抗原，測定值上升。另外表11和表12給出了通過使用在實施例6的固相中固相化了 cll-3與 cll-7(等量混合)的板和作為酶標記抗體使用的cll-14與cll-10的組合(抗體組合 1)，以及使用固相化了 cll-3、cll-7和cll-21 (等量混合)的板和作為酶標記抗體使用 的cll-14與cll-9的組合(抗體組合2)，對多數(shù)HCV-RNA陽性樣品進行測定的結果。在 HCV-RNA陽性樣品中抗體組合2相對于抗體組合1反應性平均上升約1. 31倍，特別是No. 19 反應性上升至1.65倍。表10
21 表11 表 12 實施例8.酸化劑必要性的研究將樣品(健康人血清和3例HCV核心抗原陽性樣品)100 μ L與除去酸化劑的處理 液(7% C12TAB，3. 5% N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸、7% TritonX100、2M 尿 素、IOmM 二乙氨基乙硫醇鹽酸)100 μ L混合，于37°C進行10分鐘預處理。向96孔微量培 養(yǎng)板(Costar High BindingPlate)的各個孔加200 μ L的4 μ g/mL的抗HCV核心抗原單克 隆抗體(cl 1-3與cl 1-7等量混合)于4°C溫育過夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖 液(PH7. 3)洗2次后，加350 μ L的含有0. 5%酪蛋白鈉的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 1)，溫育 2小時。除去封閉液后，將含有中和劑的反應緩沖液100 μ L和經(jīng)處理的測定樣品100 μ L 加到各個孔中。邊攪拌，邊于室溫反應1小時，用含有0.05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液 (ρΗ7· 3)(洗凈液)350 μ L清洗6次。添加HRP標記的單克隆抗體液(Cl 1-10和Cl 1-14等 量混合)200 μ L，于室溫反應30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯 二胺、30%過氧化氫水0. 9μ 1/ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液(pH5. 0)) 200 μ L，溫育30分 鐘。加5Ν硫酸50 μ L使酶反應停止，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 π f MTP32)測定492nm(參 考波長630nm)的吸光度。得到的結果如表13所示。表13 由表13進一步確認各個HCV陽性樣品(#110、#120、#117)在不含有鹽酸的溶液中 即使于37°C溫育10分鐘，也幾乎檢測不到核心抗原活性，但自處理時的鹽酸濃度0. 13N開 始證實核心抗原活性，在0. 5 1. ON確認存在非常高的核心抗原活性。實施例9.雜交瘤的制作法(2)將具有來自HCV基因型Ib核心抗原1 173號序列的重組HCV核心蛋白質(zhì) (I-C173)溶解于6M尿素后，用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液(pH7. 3)稀釋至終濃度 0. 2 1. Omg/mL,與等量的，八H ”卞混合。將該懸浮液注射到4 6周齡的BALB/ c品系小鼠腹腔內(nèi)。每隔2周進行3次同樣的免疫，再于2周后，將I-C173調(diào)整到0. Olmg/ mL的生理鹽水溶液注射到尾靜脈內(nèi)。在最終加強免疫后第4天，在無菌條件下從該免疫動 物摘出脾臟，用剪刀剪成碎片，再用篩將脾臟制成一個一個的細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗 3次。在8-氮雜鳥嘌呤存在下培養(yǎng)數(shù)日，與上述同樣將完全除去了回復突變體的對數(shù)增 殖期小鼠骨髓瘤細胞株SP2洗凈后，將該細胞3. 26 X IO7個與脾細胞2. 28 X IO8個加入到 50mL容量的離心管中，并混合。于200 Xg下離心分離5分鐘，除去上清，加保溫在37°C的 含有50%聚乙二醇4000(PEG4000 ；Merck公司生產(chǎn))的RPMI-1640培養(yǎng)基lmL，進行細胞 融合。融合細胞經(jīng)離心分離(200 X g，5分鐘)除去PEG4000后，使用96孔板，在含有HAT 的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 2周，只使雜交瘤增殖。然后在不含有HAT的培養(yǎng)基中使 其成長發(fā)育，約2周后對產(chǎn)生目的抗體的克隆用ELISA法進行檢索，得到產(chǎn)生具有所希望反 應特異性的本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。對于得到的雜交瘤，根據(jù)常規(guī)的極限稀釋法，進行產(chǎn)生目的抗體株的檢索和單一 克隆化，將得到的雜交瘤命名為0T3，于2004年6月1日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合 研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)。(FERM BP-10032)。實施例10.單克隆抗體的制作(2)將通過實施例5所述方法得到的雜交瘤移植到用降植烷處理后的小鼠腹腔，獲得 腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。該單克隆抗體的純化利用結合了蛋白A的瓊脂糖凝膠柱分離 IgG級分。由上述雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體A0T3的同種型使用小鼠的Ig各個同種型試劑 盒(Zymed公司生產(chǎn))，闡明是IgG2b。對于得到的各個單克隆抗體，使用來自HCV核心區(qū)序 列合成的20個氨基酸的肽進行表位解析。A0T3特異識別1Q1RGSRPSWGPTDPRHRSRNVG12°的序 列。A0T3對于該序列比cll-21表現(xiàn)出更高的反應性。實施例11.樣品處理條件研究(2)(處理條件研究)1)麥芽糖濃度向HCV抗原陰性樣品或HCV抗原陽性樣品ΙΟΟμ L中添加含有各種
24濃度麥芽糖的預處理劑(1N !1(1，3.5%(12148，3%^十六烷基-隊^二甲基-3-銨-1-丙 磺酸(C16APS)、3% N-十八烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸(C18APS) ,7% TritonXlOO, 3M尿素、IOmM 二乙氨基乙硫醇鹽酸)100 μ L，于37°C溫育10分鐘，將其中的100 μ L作為測 定樣品，使用以下所述的測定法進行研究。向96 孔微量培養(yǎng)板(Costar High Binding Plate)加 200 μ L 的 4 μ g/mL 的抗 HCV核心抗原單克隆抗體(cl 1-3，cl 1-7，A0T3,以1 2 1的比率混合)，于4°C溫育過 夜。用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液(pH7. 3)洗2次后，加350 μ L的含有0. 5%酪 蛋白鈉的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 1)，溫育2小時。除去封閉液后，將含有中和劑的反應緩沖 液100μ L和各個通過樣品處理法得到的測定樣品加到各個孔中，邊攪拌邊于室溫下反應1 小時，用含有0. 05%吐溫20的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 3)(洗凈液)350 μ L清洗6次，再添 加過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體(C11-9和C11-14等量混合)200yL，于室溫下反應 30分鐘。用洗凈液洗6次，加底物溶液(含有2mg/ml的鄰苯二胺、30%過氧化氫水0. 9 μ 1/ ml的0. IM檸檬酸磷酸緩沖液pH5. 0) 200 μ L，溫育30分鐘。加5N硫酸50 μ L停止酶反應， 用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(二 口 t MTP32)測定492nm(參考波長630nm)的吸光度，結果如表7 所示。另外，表7所示的麥芽糖濃度用將樣品和預處理劑混合后的預處理時濃度表示。各HCV陽性樣品自添加麥芽糖的預處理時濃度2. 5%開始證實存在高的核心抗原 活性，即使10%或以上也可確認。另外，這樣的添加效果除了麥芽糖以外，即使蔗糖、果糖、 甘露糖、海藻糖等也可確認。2)檸檬酸濃度向HCV抗原陰性樣品或HCV抗原陽性樣品100 μ L添加含有各種濃度檸檬酸的預 處理劑(IN HCl, 3. 5% C12TAB,3% C16APS,3% C18APS,7% TritonX100、3M 尿素、5%麥芽 糖、20mM 二乙氨基乙硫醇鹽酸)100 μ L，于37°C溫育10分鐘，將其中的100 μ L作為測定樣 品，用上述1)中所述方法進行研究(表8)。但是，由于向預處理劑中添加了檸檬酸，預處理 后的樣品液的PH有些變化，所以要將反應緩沖液100μ L的中和劑濃度進行適時變更使之 變成中性。另外，表8給出的檸檬酸濃度用樣品與預處理劑混合后的預處理時濃度表示。就像表8所示的那樣，各HCV陽性樣品從添加檸檬酸的預處理時濃度0. 05Μ開始 證實高核心抗原活性，即使在0. 2Μ或以上也可確認。另外這樣的添加效果即使使用包括檸 檬酸鈉鹽在內(nèi)的多種檸檬酸鹽類也可確認。表 14 表 15
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明，可以簡便、短時間使病毒抗原從HCV等病毒粒子中游離，使其為適于 抗體等作為探針檢測抗原的所謂免疫測定方法的狀態(tài)。另外通過本發(fā)明給出的方法，通過 對含有HCV等病毒粒子的樣品進行處理，通過使用抗體等探針檢測抗原的所謂免疫測定方 法，可以簡便、短時間內(nèi)、而且高靈敏度地對病毒抗原進行檢測和定量。另外，通過本發(fā)明可 以簡便、短時間使病毒抗原游離。另外，通過本發(fā)明得到的有用的單克隆抗體由于特異識別丙型肝炎患者血清中的 HCV抗原，所以可以制作使用顯示丙型肝炎的樣品處理法和免疫測定方法判別樣品中有無 HCV等病毒的試劑盒、定量試劑盒以及診斷試劑。另外通過利用本發(fā)明得到的單克隆抗體 和使用非常簡易的處理法的HCV檢測以及定量方法，可以簡單地、操作性好地進行丙型肝
炎的確診。
序列表
<110>株式會社先端生命科學研究所
<120>丙型肝炎病毒的檢測方法
<130>P911
<150>JP2003-367783
<151>2003-10-28
<160>2
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>
<222>(21). . (40)
<223>丙型肝炎病毒核心抗原的部分氨基酸序列
<400>1
Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Glnlie Val Gly Gly Val Tyr Leu
1 510 15
Leu Pro Arg Arg
20<210>2<211>21<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220>
<221><222>(100). . (120)<223>丙型肝炎病毒核心抗原的部分氨基酸序列<400>2Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg151015Ser Arg Asn Val Gly20
權利要求
雜交瘤細胞株，其為HC11 9(FERM BP 08493)、HC11 21(FERMBP 08494)或OT3(FERM BP 10032)。
2.由雜交瘤HC11-9(FERM BP-08493), HCl 1-21 (FERM BP-08494)或 0T3 (FERM BP-10032)產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有HCV樣品的處理方法等，其特征在于將含有HCV(丙型肝炎病毒)的樣品通過用含有(1)酸化劑，以及(2)蛋白質(zhì)變性劑，或在同一分子中具有碳數(shù)10個或10個以上的單鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑的處理劑處理，使HCV抗原游離和將與HCV抗原結合的抗體破壞。
文檔編號C12N5/18GK101892199SQ20101000213
公開日2010年11月24日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權日2003年10月28日
發(fā)明者松原直子, 青柳克己, 飯?zhí)锞妹雷?申請人:株式會社先端生命科學研究所