專利名稱：由啟動(dòng)子調(diào)控兩種目的基因表達(dá)的重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、而在正常 細(xì)胞內(nèi)基本不增殖、并在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)抗癌基因的基因序列，及其構(gòu)建的方法。以及這 類基因序列對(duì)腫瘤的殺傷作用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危及生物體生命健康的疾病，目前對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手 術(shù)及放、化療。但常規(guī)治療對(duì)大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對(duì)于大多數(shù)化療藥物而言， 其治療劑量與毒性劑量較為接近，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也造成損害，對(duì)機(jī)體 具有較大毒性，包括危及生命的骨髓抑制、肝腎功能受損等。特異性因此，研究選擇性殺傷 腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對(duì)腫瘤治療非常重要。人體免疫系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)腫瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用。殺傷性T細(xì)胞(CTL)對(duì)腫瘤的生 長(zhǎng)起著重要的抑制作用，已有研究在臨床中應(yīng)用CTL細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞增殖。很多免疫治 療研究也著眼于活化的T細(xì)胞的相應(yīng)作用。目前研究表明，顆粒酶是CTL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì) 胞的重要手段。顆粒酶是人體免疫細(xì)胞的分泌的細(xì)胞因子，在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作 用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)顆粒酶々、8、!1、6、11、1(等多個(gè)成員。其中顆粒酶B發(fā)揮重要作用。顆 粒酶B合成后，以酶原形式儲(chǔ)存在細(xì)胞中，當(dāng)殺傷性T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞時(shí)，顆粒酶B被 切除N端大小為20個(gè)氨基酸的酸性二肽，成為活性形式?；钚孕皖w粒酶B進(jìn)入細(xì)胞 后，可切割prOCaSpase-8(caspase-8原蛋白)，傳導(dǎo)凋亡信號(hào)；通過(guò)水解Bcl-2家族成 員Bid，促進(jìn)線粒體的細(xì)胞色素C釋放，激活下游凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；可直接切割 procaspase-3 (caspase-3 Ι 胃白)，^L Caspase-3, M CAD (caspase activated DNAse)/ICAD(the inhibitor ofcaspase-activated DNAse)，產(chǎn)生有活性的 CAD，最終導(dǎo) 致 DNA 片斷化(GOPNG I S, BARRYM, LISTON P, et al. Granzyme B-induced apoptosi s requires both direct caspaseactivation and relief of caspase inhibition[J]. Immunity, 2003,18 (3) =355-365.) 0顆粒酶B也可直接激活I(lǐng)CAD及CAD，并啟動(dòng)不依賴于 caspase 的核凋亡(SHAR IF-ASKAR IE, ALAM A, RH EAUME Ε, et al. Direct cleavage of the human DNA fragmentation factor~45by granzyme B induces caspase-activated DNase release and DNA fragmentation[J]. EMB0J,2001,20(12) :3101_3113.)。Caspase家族是一類在進(jìn)化上非常保守的蛋白酶類分子。剛合成的Caspases是無(wú) 活性的酶原形式，包括氨基端的prodomain結(jié)構(gòu)和一個(gè)蛋白酶區(qū)域。Caspase的活化包括各 結(jié)構(gòu)域間的蛋白酶解體，大小壓機(jī)形成有活性的的異二聚體，最后兩個(gè)異二聚體連接形成 四聚體。大小兩個(gè)亞基對(duì)于酶的活性均是必需的。利用Caspase的抑制物已經(jīng)將一些活化 Caspase分子的三維結(jié)構(gòu)研究的比較清楚。如Caspase-8，Caspase-3等。這些研究顯示， 活化Caspase為四聚體，兩個(gè)小亞基相鄰排列，兩個(gè)大亞基圍繞在小亞基的周圍；每一大小 亞基形成一球狀分子，球狀分子的核心為6個(gè)d螺旋環(huán)繞的6個(gè)β片層樣結(jié)構(gòu)。兩個(gè)異二聚體以小亞基相連。每一活化Caspase分子含有兩個(gè)酶活性中心，這兩個(gè)活性中心可能獨(dú) 立發(fā)揮作用。Caspase活性中心有保守的五肽序列，即Gln-Ala-Cys-x-Gly。結(jié)構(gòu)研究還顯 示，在Caspase前體到活化Caspase的過(guò)程中，大亞基的羧基端和小亞基的氨基端順勢(shì)相鄰 有利于形成正確的酶活性中心(Nicholson Dff, et al，Identification and inhibition of the ICE/CED3protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 376 37~43,1995. Thornberry ΝΑ, et al, A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukinl betaprocessing in monocyte. Nature 356 :768_774,1992)。Caspase-3 是 一個(gè)主要的凋亡效應(yīng)因子。顆粒酶能切割Caspase-3原蛋白，產(chǎn)生一個(gè)具有部分酶活性的 中間體，該中間體與成熟酶在結(jié)構(gòu)上很相似，然后，中間體進(jìn)行自我切割，切去prodomain 結(jié)構(gòu)，形成活化的Caspase-3，發(fā)揮促凋亡作用。凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形態(tài)，是機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下，啟動(dòng)自身內(nèi)部 機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡具有特征性的形態(tài)學(xué)變化，早期表現(xiàn)為胞漿空泡，染 色質(zhì)濃縮，隨后胞漿空泡與細(xì)胞膜融合，與細(xì)胞分離，引起水分丟失，細(xì)胞皺縮。細(xì)胞核也出 現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解的過(guò)程。最后形成凋亡小體。凋亡細(xì)胞脫離組織，被巨噬細(xì)胞吞 噬，較少產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為腫瘤治療提供除化學(xué)治療和放射治療外的新 途徑。但在此過(guò)程中需要新的方法，特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少對(duì)正常細(xì)胞的損害。目前腫瘤基因治療的主要障礙是不能有效地將目的基因特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤 細(xì)胞，并使其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。而基因治療的療效與腫瘤細(xì)胞受基因轉(zhuǎn)染的數(shù)量密切相 關(guān)。因此，研究與發(fā)展促使目的基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)在腫瘤治療中至關(guān)重要。促使目的 基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)并殺傷腫瘤細(xì)胞，不僅能提高治療的效果，也能減少正常 細(xì)胞受到的傷害。啟動(dòng)子的研究和使用，為此提供了重要方法學(xué)基礎(chǔ)。啟動(dòng)子是基因的一 個(gè)組成部分，控制目的基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，決定基因的活動(dòng)。啟動(dòng) 子由核苷酸組成，其本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而控制基因活動(dòng)。 有研究表明，CEA啟動(dòng)子可啟動(dòng)雙自殺基因CD和TK在CEA陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(王天 寶，董文廣，汪建平，CEA啟動(dòng)子特異性啟動(dòng)雙自殺基因CD與TK在CEA+惡性腫瘤中表達(dá)中 華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版)2008，2(1) :24-27)。人端粒酶催化亞單位(hTERT)啟動(dòng)子可 驅(qū)動(dòng)野生型P53基因在人端粒酶陽(yáng)性人大腸癌細(xì)胞株SW620中表達(dá)(黃明文，余新，洪葵 等，hTERT啟動(dòng)子調(diào)控p53基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗腫瘤作用中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2008，15(3) 429-432)。存活素(Survivin)是凋亡蛋白抑制家族(inhibitorof apoptosis protein, IAP)成員，可抑制由Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。IAP家族在雞、大鼠、人體內(nèi)均能檢 測(cè)到，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) HIAPl， HIAP2， XIAP(X-chromosome linked IAP), NAIP(neuronal apoptosis inhibiting protein)禾口 Survivin 等成員?，F(xiàn)有石if 究表明，人 Survivin 基因位 于17q25，全長(zhǎng)16. 5kD，在細(xì)胞核、胞漿內(nèi)均可檢測(cè)到。Survivin在70%的上皮細(xì)胞腫瘤中 表達(dá)，并與疾病的進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。Survivin可抑制 由于生長(zhǎng)因子缺乏、紫外線照射、FasL等因素引起的細(xì)胞凋亡。現(xiàn)有體內(nèi)、體外研究表明，Survivin啟動(dòng)子在正常細(xì)胞組織中幾乎完全沉默，使得 Survivin在正常組織細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。在膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺、胃癌、肝癌、卵巢癌及黑色素 瘤等腫瘤中Survivin啟動(dòng)子都具有較強(qiáng)的調(diào)控能力，表明Survivin啟動(dòng)子是一個(gè)廣譜的腫瘤特異性啟動(dòng)子，能促使基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)。Survivin啟動(dòng)子包括了 CDE/ CHR位點(diǎn)、E2F-like、TP53和Spl結(jié)合位點(diǎn)。因而，探索研究Survivin啟動(dòng)子調(diào)控目的基因 的構(gòu)建方法，并將其用于腫瘤治療，這正是本發(fā)明的目的所在。啟動(dòng)子是基因(gene)的一個(gè)組成部分，是一段DNA序列，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄) 的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子就像“開(kāi)關(guān)”，決定基因的活動(dòng)。啟動(dòng)子由核苷酸組成，其 本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。啟動(dòng) 子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，可被RNA聚合酶識(shí)別，開(kāi)始基因的轉(zhuǎn)錄。基因是攜帶有遺傳信息的DNA序列，由核苷酸組成?；虻谋磉_(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯 兩個(gè)相互獨(dú)立但又緊密聯(lián)系的階段。真核生物的mRNA前體轉(zhuǎn)錄完成后，要經(jīng)過(guò)5’端加帽 的修飾過(guò)程，5’帽子結(jié)構(gòu)除了能保護(hù)mRNA免遭核酸酶和磷酸酶的攻擊外，在隨后的翻譯起 始過(guò)程中核糖體小亞基通過(guò)識(shí)別5’端帽子結(jié)構(gòu)來(lái)尋找蛋白質(zhì)合成的起始位點(diǎn)，而后再與 mRNA5’端結(jié)合并沿mRNA滑行至第一個(gè)AUG進(jìn)行翻譯。但目前研究發(fā)現(xiàn)，除了正常的翻譯起 始機(jī)制外，還存在一種不依賴5’帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始機(jī)制。這種5’非翻譯區(qū)包含的順式 作用元件本身無(wú)啟動(dòng)子活性，但其卻能引導(dǎo)mRNA直接進(jìn)入核糖體開(kāi)始不依賴于帽子結(jié)構(gòu) 的翻譯。這種不依賴5’帽子結(jié)構(gòu)的翻譯，就是由IRES介導(dǎo)的翻譯起始。IRES是5’非編 碼區(qū)的一段DNA序列，這些序列長(zhǎng)度因物種不同而各異。具有與18S核糖體RNA的3’末端 互補(bǔ)的序列，在上游啟動(dòng)子的控制下，兩個(gè)基因及IRES序列同時(shí)轉(zhuǎn)錄成一條單鏈mRNA。但 是，兩個(gè)基因的翻譯是獨(dú)立的，可以翻譯得到兩個(gè)基因的產(chǎn)物。并且能使在IRES上下游的 基因表達(dá)更嚴(yán)格地限定在具有Survivin啟動(dòng)子活性的細(xì)胞中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一個(gè)核苷酸序列，包括啟動(dòng)子、目的基因和IRES序列。啟動(dòng) 子能控制目的基因的表達(dá)，使目的基因能在至少一種腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。目的基因能通過(guò)翻 譯轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物，這種產(chǎn)物能殺傷腫瘤細(xì)胞，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。本發(fā)明中的目的基因可 人工合成或來(lái)自動(dòng)物體內(nèi)。本發(fā)明中，核苷酸序列內(nèi)包含一 IRES序列，此序列可使兩種基 因在一個(gè)啟動(dòng)子的作用下表達(dá)，翻譯得到兩種基因各自的產(chǎn)物，提高殺傷腫瘤的能力。本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明由啟動(dòng)子調(diào)控兩種目的基因表達(dá)的重組載體，其特征在于構(gòu)建方法如下所 述①提取survivin啟動(dòng)子基因，②提取人的細(xì)胞基因mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，③在cDNA中擴(kuò)增第一目的基因，④在cDNA中擴(kuò)增第二目的基因，⑤將內(nèi)切酶切開(kāi)的Survivin啟動(dòng)子基因片斷與基本載體分子用連接酶連接成第 一中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第一目的基因片斷與第一中間載體分子用連接酶連接成第二 中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第二目的基因片斷與第二中間載體分子用連接酶連接成第三中 間載體，將用內(nèi)切酶切開(kāi)的IRES基因片斷和第三中間載體用連接酶連接成重組載體，⑥將重組載體引入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使重組載體分子隨受體 細(xì)胞擴(kuò)增，篩選出含有重組載體分子的受體細(xì)胞。
所述的第一目的基因?yàn)轭w粒酶A或顆粒酶B或顆粒酶M或顆粒酶H或顆粒酶J或 顆粒酶K或顆粒酶I或苷激酶，所述的第二目的基因?yàn)閏aspase2或caspase3或caspase6 或 caspase7 或 caspase9 或 caspase 10。所述的第一目的基因?yàn)轭w粒酶B，第二目的基因?yàn)镃aSpaSe3，構(gòu)建方法如下(1) Survivin啟動(dòng)子基因提取根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Survivin基因啟動(dòng)子序列，合成Survivin基因啟動(dòng)子 引物，上游引物5 ’ -CAGGTACCGCCATAGAACCA-3 ’，下劃線處為Kpn I酶切位點(diǎn)，下游引物 5，-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3’,下劃線處為Sac I酶切位點(diǎn)，以H印G-2細(xì)胞基因組DNA為 模板，PCR擴(kuò)增Survivin啟動(dòng)子基因片段，(2)細(xì)胞總mRNA提取在37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人⑶/細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA，(3)活性型顆粒酶B基因提取用TAKARA公司的cDNA合成試劑盒將人CD8+細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)，取 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增顆粒酶B基因序列，上游引物5’ -GCAACGCGTGAGATCA TCG-3’， 下劃線處為Mlu I酶切位點(diǎn)，下游引物5，-CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3 ,下劃線處為Nhe I酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收活性型顆粒酶B 基因片段，(4) caspase-3基因片段提取以人CD8+細(xì)胞cDNA為模板，提取caspase-3基因，上游引 物5，-GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’，下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)，下游引物 5，-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3，，下劃線處為 HindIII 酶切位點(diǎn)，PCR 產(chǎn)物用 10%瓊脂 糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收caspase-3基因片段，(5)質(zhì)粒制備將Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL_3Basic質(zhì)粒用Kpn I與Sac I雙酶37°C消化 3小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，回收片段，取消化后的Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL-3BasiC質(zhì) 粒，以1 3的比例，在16°C時(shí)，用T4DNA連接酶連接16小時(shí)，此質(zhì)粒為PGL3-Sur_Luc，以 相同方法用Mlu I與Nhe I雙酶消化活性型顆粒酶B基因片段和PGL3-Sur-Luc，將活性型 顆粒酶B基因片段連接到此質(zhì)粒中，命名為PGL3-Sur-顆粒酶B_Luc，以相同方法用XhoI和 HindIII雙酶消化caspase-3基因片段和PGL3_Sur_顆粒酶Β-Luc，將caspase-3基因片段 連接到質(zhì)粒中，構(gòu)成PGL3-Sur-顆粒酶B-caspase-3-Luc質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和pIRES-vector 用Nhe 1和Xmal雙酶切，用相同方法將IRES連接至該質(zhì)粒中，構(gòu)成PGL3_Sur_顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc Mf立，(6)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及提取將步驟5的最終連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jml09，Vitagene試 劑盒抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒即為所需重組質(zhì)粒。重組載體在治療肝癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌的藥物中的應(yīng)用。所述的藥物由重組載體與抗腫瘤物質(zhì)組成的藥物，抗腫瘤物質(zhì)為順鉬、紫杉醇、喜 樹(shù)堿中的一種或我種，藥物直接應(yīng)用于患部，或者通過(guò)靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下注射，口 服、使用飼管、血管內(nèi)給予等導(dǎo)入到生物體中，作用于相應(yīng)細(xì)胞組織，藥物所含的重組載體 和具有杭腫瘤物質(zhì)同時(shí)給予；或者通過(guò)先給予一方，然后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后給予另一方的方法導(dǎo)入生物體，重組載體或者是病毒載體，或者是非病毒載體或噬菌體。重組載體包含的核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA/RNA或兩者的混合物，Survivin 啟動(dòng)子、顆粒酶B和caspase-3基因除序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID NO. 6所示的堿基序列之外，還可以是與SEQID NO. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID NO. 6 的 DNA 互補(bǔ)的堿基 序列DNA雜交、且編碼具有顆粒酶B和Caspase-3的活性的蛋白質(zhì)的堿基序列，上述堿基序 列可如下獲得以分別含有 SEQ ID NO. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQID No. 4, SEQ ID No. 5,SEQ ID NO. 6所示堿基序列的多核苷酸或其片段作為探針，通過(guò)集落雜交或噬菌斑雜 交或DNA印跡雜交方法，由cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得。本發(fā)明提供一類能在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)抗癌基因的核苷酸序列其構(gòu)建方法， 即該核苷酸序列能選擇性地在有能表達(dá)Survivin的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及表達(dá)，而在不能表 達(dá)Survivin的正常細(xì)胞內(nèi)基本不復(fù)制或基本不增殖，從而特異性抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。以 及利用這種方法構(gòu)建的核苷酸序列殺傷腫瘤細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如 轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響，當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子時(shí)會(huì)影響基因的 轉(zhuǎn)錄水平。Survivin啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性地與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而使該啟動(dòng)子控制 的基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明應(yīng)用Survivin啟動(dòng)子控制抗腫瘤基因，從而使抗腫瘤基因只能在 表達(dá)Survivin的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡，而不會(huì)誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生凋 亡。因此，將本發(fā)明構(gòu)建的核苷酸序列轉(zhuǎn)染到體外腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可使顆粒 酶B基因和caspase-3基因特異性表達(dá)，殺傷腫瘤細(xì)胞。這種核苷酸序列可通過(guò)多種途徑 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，例如病毒載體、非病毒載體等。本發(fā)明采用腫瘤細(xì)胞特異性的反應(yīng)元件是 Survivin基因啟動(dòng)子。本發(fā)明提出的能在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)抗癌基因的基因序列構(gòu)建方法如下，提 取腫瘤細(xì)胞DNA，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆Survivin啟動(dòng)子序列，并設(shè)計(jì)特異性 酶切位點(diǎn)，連接到質(zhì)粒中。提取人ra8+mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性上下游引物序列，通 過(guò)PCR，提取目的基因(活性型顆粒酶B基因和caspase-3基因)的片段，連接至Survivin 啟動(dòng)子的下游。將2條目的基因間的特異性酶切位點(diǎn)用IRES序列連接，形成特異性表達(dá) 抗癌基因的基因序列。將該序列轉(zhuǎn)錄到載體中，用載體感染腫瘤細(xì)胞，使顆粒酶B基因和 caspase-3基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，得到顆粒酶B蛋白和Caspase-3原蛋白。顆粒酶可激活 不依賴caspase的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，Caspase-3原蛋白可被顆粒酶或其他 Caspase蛋白激活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下主要特點(diǎn)及效果1、本發(fā)明的啟動(dòng)子具有在腫瘤 細(xì)胞中靶向性表達(dá)活性型人顆粒酶基因和caspase-3基因的功能。2、本發(fā)明的質(zhì)粒載體含 有由腫瘤特異性Survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)活性型人顆粒酶基因和caspase-3基因。4、本 發(fā)明利用IRES序列，使活性型人顆粒酶基因和caspase-3基因能在一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控下表 達(dá)，有較高的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。5、本發(fā)明的質(zhì)粒載體將置于Survivin啟動(dòng)子控制之 下，只有在表達(dá)Survivin蛋白的細(xì)胞環(huán)境中，才具有該啟動(dòng)子的激活因子，啟動(dòng)子才被激 活，目的基因才開(kāi)始復(fù)制及表達(dá)；而在正常的細(xì)胞中，不存在這樣的激活因子，目的基因?qū)?不能復(fù)制表達(dá)，這樣就造成了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，而不導(dǎo)致正常細(xì)胞的凋亡。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明采用由以下措施構(gòu)成的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明Survivin啟動(dòng)子調(diào)控人顆粒酶B基因和caspase-3前體基因的構(gòu)建方法， 包括以下工藝步驟(1) Survivin啟動(dòng)子擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物，以H印G細(xì)胞的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增 Survivin啟動(dòng)子片段；(2)人顆粒酶B基因和caspase-3前體基因提取提取人CD8+T細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。合成引物，以人CD8+T細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增活性型顆粒酶B基因和caspase-3 基因；(3)構(gòu)建由Survivin啟動(dòng)子啟動(dòng)熒質(zhì)粒Kpn I與Sacl消化雙酶切Survivin啟 動(dòng)子和PGL3-BasiC質(zhì)粒，膠回收酶切片段，連接片段并轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克 隆,命名為 PGL3-Sur-Luc ；(4)構(gòu)建含有Survivin啟動(dòng)子，活性型人顆粒酶B基因、人caspase-3基因和IRES 序列的質(zhì)粒載體；(5)檢測(cè)此質(zhì)粒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Survivin啟動(dòng)子基因的提取根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Survivin基因啟動(dòng)子序列，合成Survivin基因啟動(dòng)子 引物。上游引物5’ -CAGGTACCGCCATAGAACCA-3’，下劃線處為Kpn I酶切位點(diǎn)。下游引物 5，-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3，，下劃線處為Sac I酶切位點(diǎn)。以1 μ gHepG-2細(xì)胞基因組DNA 為模板，Pyrobest DNA聚合酶2. 5U，IOmM脫氧核苷三磷酸(dNTP) 10 μ 1，lOpmol/μ 1上下游 引物各5 μ 1，補(bǔ)水到100 μ 1，擴(kuò)增Survivin啟動(dòng)子基因片段。PCR儀循環(huán)參數(shù)-MV 4min, 60°C 1111士11，721908，30個(gè)循環(huán)。72°C延伸8min。產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠中電泳，Qiaquick 柱回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到Survivin啟動(dòng)子基因片段。細(xì)胞總mRNA提取在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人CD8+細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部后，倒出瓶?jī)?nèi) 液體，加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 2-3ml，沖洗2-3次，倒出PBS液。加TRIZOL試劑2ml。3_5min 后將瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞裂解液吸到經(jīng)DEPC處理過(guò)的1. 5ml EP管中，加新的氯仿0. 2ml，輕搖15s。 室溫靜置2-3min后，在冷凍離心機(jī)中，以4°C，12000轉(zhuǎn)/分離心15min。然后取上清無(wú)色液 體(約0. 6ml)到EP管(DEPC處理過(guò))，加0. 5ml異丙醇，室溫下靜置lOmin。在冷凍離心 機(jī)中，以4°C，12000轉(zhuǎn)/分離心lOmin。棄去上層液體，保留沉淀，加入75%乙醇1. Oml后， 在冷凍離心機(jī)中，以4°C，7500轉(zhuǎn)/分離心5min。棄去上層液體，5-10min后加入DEPC處理 后的純凈水20-30 μ 1，混勻，在水浴鍋內(nèi)，55-60°C放置lOmin，溶解總RNA。用QIAGEN公司 的 mRNA 提取試劑盒(Oligotex mRNA Mini Kit, Cat. no. 70022)提取細(xì)胞總 mRNA?；钚孕皖w粒酶B基因提取用TAKARA公司的cDNA合成試劑盒將人⑶/細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)。 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ 1做為模板，PCR擴(kuò)增顆粒酶B基因序列。上游引物5’-GCAACGCGTGAGATCA TCG-3’，下劃線處為Mlu I酶切位點(diǎn)。下游引物5’ -CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3，，下劃線 處為NheI酶切位點(diǎn)。10倍PfU酶緩沖液5μ 1，4倍dNTP200y 1/L，上下游引物各Ιμπιο /
9L，PfU DNA 聚合酶 3U，加水至 50 μ 1。PCR 循環(huán)參數(shù)-MV 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循 環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收活性型 顆粒酶B基因片段。caspase-3基因片段提取以人CD8+細(xì)胞cDNA為模板，提取caspase-3基因。上游引 物5，-GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’,下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)。下游引物 5，-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3’,下劃線處為 HindIII 酶切位點(diǎn)。10 倍 PfU 酶緩沖液 5μ 1，4 倍 dNTP200y 1/L，上下游引物各 1 μ mol/L，PfU DNA 聚合酶 3U，加水至 50 μ 1。PCR 循環(huán)參數(shù)95°C 40s, 57°C 30s, 70°C lmin，30 個(gè)循環(huán)，70°C延伸 lOmin。PCR 產(chǎn)物用 10%瓊 脂糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收caspase-3基因片段。質(zhì)粒制備將Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL_3Basic質(zhì)粒用Kpn I與Sac I雙酶37°C消 化3小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，回收片段，取消化后的Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL-3BasiC 質(zhì)粒(美國(guó)promega公司)，以1 3的比例，在16°C時(shí)，用T4DNA連接酶連接16小時(shí)，此 質(zhì)粒為PGL3-Sur-Luc。以相同方法用Mlu I與Nhe I雙酶消化活性型顆粒酶B基因片段 和PGL3-Sur-Luc，將活性型顆粒酶B基因片段連接到此質(zhì)粒中，命名為PGL3-Sur-顆粒酶 B-Luc。以相同方法用XhoI和HindIII雙酶消化caspase-3基因片段和PGL3_Sur_顆粒 酶B-LucJf caspase-3基因片段連接到質(zhì)粒中。構(gòu)成PGL3_Sur_顆粒酶B-caspase-3-Luc 質(zhì)粒。將該質(zhì)粒和pIRES-vector (Clontech公司)用Nhel和Xmal雙酶切，用相同方法將 IRES連接至該質(zhì)粒中，構(gòu)成PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及提取將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jml09。取10 μ 1連接產(chǎn)物，加入到100 μ 1 Jml09大腸 桿菌中，冰浴1小時(shí)，42°C熱休克2min，置冰水中2min，加入900 μ ILB培養(yǎng)液，37°C、250轉(zhuǎn) /分振搖1小時(shí)。取200 μ 1鋪于氨芐青霉素抗性的選擇性平板上，室溫平放30min后，倒置 培養(yǎng)14小時(shí)。挑取待測(cè)的單菌落于含有200mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩過(guò) 夜，Vitagene試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒。獲得的質(zhì)粒即為所需重 組質(zhì)粒。Western Blot 檢測(cè)顆粒酶 B、caspase-3 表達(dá)情況在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)人肝癌!fepG2細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱H印G2細(xì)胞)。轉(zhuǎn) 染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培 養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。細(xì)胞分為給藥組和對(duì)照組。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合，室溫孵育20min，用 無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入給藥組細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2中孵 育5小時(shí)，對(duì)照組加入空白脂質(zhì)體LipofectamindOOO。更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育72小 時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞用0. 5%胰酶消化。用Western Blot法檢測(cè)活性型顆粒酶B和caspase-3 表達(dá)情況。在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，冰浴30min，收集細(xì)胞裂解物于EP管中，4°C，12000 轉(zhuǎn)/分，離心20min。取5倍上樣緩沖液40 μ 1，加160 μ 1細(xì)胞裂解物，混勻，煮沸5min，將 此混合物加入加樣孔，每孔25 μ 1。濃縮膠電壓65V，分離膠電壓90V，直到藍(lán)色溴酚藍(lán)條帶 泳動(dòng)至距凝膠底部Icm處，停止電泳。切下分離膠部分，浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中15分鐘。剪裁與凝膠同大小的PVDF膜，濾紙16張，同樣浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液。將濾紙，凝膠和膜，按照濾 紙_凝膠-膜-濾紙的順序，從負(fù)極到正極依次鋪在轉(zhuǎn)移槽中，接通電源，穩(wěn)流狀態(tài)，60mA轉(zhuǎn) 膜2小時(shí)。取出PVDF膜，用1倍的TBST洗膜3次，每次lOmin。用5%脫脂奶粉封閉，4°C 過(guò)夜。鼠抗人顆粒酶B抗體和兔抗人caspase-3抗體用1倍TBST做1 250稀釋，將封閉 后的膜浸入一抗稀釋液，4°C過(guò)夜。用1倍TBST洗膜3次，每次lOmin。羊抗鼠IgG-HRP、羊 抗兔IgG-HRP用TBS做1 1000稀釋，將洗好后的膜浸入此溶液，室溫避光孵育50min。用 1倍TBST洗膜3次，每次lOmin。加入ECL液以顯色，將膠片底片曝光。曝光后的膠片進(jìn)行 掃描，用Bio Rad quantity-one 4. 1. O軟件分析密度積分。積分值越高，說(shuō)明該蛋白含量 越多。結(jié)果表明，給藥組顆粒酶B和caspase-3密度積分提高，說(shuō)明加入該重組質(zhì)粒后，細(xì) 胞內(nèi)顆粒酶B和caSpaSe3蛋白增加，該重組質(zhì)粒的顆粒酶B和caspase-3基因能在細(xì)胞中 表達(dá)。 表1顆粒酶B和Caspase-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)G士s) ^與對(duì)照組比較ρ < 0. 05實(shí)驗(yàn)例1 對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)H印G2細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)H印G2。轉(zhuǎn)染前2天，用0.5%胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融 合。取6yg質(zhì)粒和ΙΟμΙ Lipofectamine2000，各加入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液， 混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn) 染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加 Λ MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入150 μ 1DMS0， 振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié) 果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑 制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。表2PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)!fepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S) *與對(duì)照組比較ρ < 0. 05流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況
在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)!fepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶 消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞的凋 亡。表3 PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 G 士 S)
效與對(duì)照組比較ρ < 0. 01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)!fepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì) 胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融合。取 6yg質(zhì)粒和10 μ 1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合， 室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C， 5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶消化， 用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。結(jié)果表明，給 予PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性增加，對(duì)誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。表4 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 (；士 S) ^與對(duì)照組比較ρ < 0. 01實(shí)驗(yàn)例2 對(duì)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)A549細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱A549細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0. 5%胰酶消化細(xì)胞， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基 培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和IOyl LipofectamindOOO，各加 入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血 清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血 清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A 值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒后，A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。
表5PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)!fepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S)

*與對(duì)照組比較ρ < 0. 05流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和ΙΟμΙ Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰 酶消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒 酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋 亡。表6 PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 G 士 S)

※與對(duì)照組比較ρ< 0.01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì) 胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融合。取 6yg質(zhì)粒和10 μ 1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合， 室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C， 5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶消化， 用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。吸光度越高， 說(shuō)明Caspase-3活性越大。結(jié)果表明，給予PGL3_Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒 后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性增加，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。表7 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 G 士 S)

*與對(duì)照組比較ρ < 0. 05實(shí)驗(yàn)例3 對(duì)人宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱HeLa細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0. 5%胰酶消化細(xì)胞， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基 培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和IOyl LipofectamindOOO，各加 入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血 清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血 清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)， 吸棄上清液，每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A 值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒后，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。表8 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S)

*與對(duì)照組比較ρ < 0. 05流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰 酶消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒 酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋 亡。表9 PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 G 士 S)

※與對(duì)照組比較ρ< 0.01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì) 胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融合。取 6yg質(zhì)粒和10 μ 1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C， 5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶消化， 用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。結(jié)果表明，給 予PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性增加，對(duì)誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡有促進(jìn)作用。表 10 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 G 士 S)
實(shí)驗(yàn)例4 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2 培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱MCF-7細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0. 5%胰酶消化細(xì)胞， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基 培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和IOyl LipofectamindOOO，各加 入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血 清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血 清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)， 吸棄上清液，每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A 值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒后，MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。表11 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S)
*與對(duì)照組比較ρ < 0. 05流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血消培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶 消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋 亡。表12 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響G 士 S)

※與對(duì)照組比較ρ < 0.01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì) 胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融合。取 6yg質(zhì)粒和10 μ 1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合， 室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C， 5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶消化， 用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。結(jié)果表明，給 予PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性增加，對(duì)誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。表13 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 G 士 S)

※與對(duì)照組比較ρ< 0.01實(shí)驗(yàn)例5 對(duì)人前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)LNCap細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2 培養(yǎng)人前列腺癌LNCap細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱LNCap細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0.5%胰酶消化細(xì)胞， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基 培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和IOyl LipofectamindOOO，各加 入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血 清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血 清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)， 吸棄上清液，每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A 值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒后，LNCap細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)LNCap細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。表14 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)!fepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S)

*與對(duì)照組比較ρ < 0. 05
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)LNCap細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶 消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞的凋 亡。表15 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 G 士 S) ※與對(duì)照組比較ρ< 0.01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2培養(yǎng)LNCap細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì) 胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融合。取 6yg質(zhì)粒和10 μ 1 Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中，混合， 室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C， 5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶消化， 用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。結(jié)果表明，給 予PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性增加，對(duì)誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。表16 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 G 士 S) ※與對(duì)照組比較ρ< 0.01實(shí)驗(yàn)例6 對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT檢測(cè)人胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)情況為了分析本發(fā)明對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2 培養(yǎng)人胃癌BGC823細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱BGC823細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0. 5%胰酶消化細(xì)胞， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基 培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和IOyl LipofectamindOOO，各加 入250 μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血 清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)， 吸棄上清液，每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A 值)。A值越低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒后，BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。
表17 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)!fepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 G 士 S) *與對(duì)照組比較ρ < 0. 05流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)BGC823細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。 取6yg質(zhì)粒和ΙΟμΙ Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶 消化，形單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞凋亡率上升，說(shuō)明該重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞的凋 亡。表18 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 G 士 S) ※與對(duì)照組比較ρ< 0.01檢測(cè)Caspase-3 活性在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)BGC823細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前2天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 細(xì)胞用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85 %的融 合。取6yg質(zhì)粒和ΙΟμΙ Lipofectamine2000，各加入250μ 1無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中， 混合，室溫孵育20min，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37°C,5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48小時(shí)。培養(yǎng)的細(xì)胞分別用胰酶 消化，用CaSpaSe3活性檢測(cè)試劑盒(南京凱基Cat :KGA202)檢測(cè)CaSpaSe3活性。結(jié)果表 明，給予PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性增加，對(duì) 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。表19 PGL3-Sur-顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc 質(zhì)粒對(duì) Caspase3 活性的影響 G 士 S)
18
※與對(duì)照組比較ρ< 0.01實(shí)驗(yàn)例7 對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)腫瘤的抑制作用。將!fepG2細(xì)胞以3X 107ml的濃度，接種于BALB/c裸鼠腹外側(cè)皮下。待腫瘤長(zhǎng)至 直徑約Imm3時(shí)，分為給藥組、對(duì)照組和聯(lián)合用藥組，每組5只鼠。對(duì)照組每只小鼠瘤內(nèi)注射 空白質(zhì)粒懸液約0. Iml ；給藥組每只小鼠瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒0. 1ml，濃度500μ g/ml ；聯(lián)合用 藥組小鼠尾靜脈注射順鉬3mg/kg，藥物濃度0. 3mg/ml,同時(shí)小鼠瘤內(nèi)注射重組質(zhì)粒0. Iml, 濃度500yg/ml。每周2次，連續(xù)5周。試驗(yàn)結(jié)束，取出瘤塊，稱重。結(jié)果表明，給藥組和聯(lián) 合用藥組瘤重均低于對(duì)照組，說(shuō)明該質(zhì)粒單獨(dú)使用和聯(lián)合化療藥物使用，均能使瘤重減輕， 能抑制腫瘤生長(zhǎng)。表20 PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 (；士 S) ※與對(duì)照組比較ρ< 0.01實(shí)驗(yàn)例8 對(duì)正常細(xì)胞的作用為了分析本發(fā)明對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行MTT檢測(cè)。在培養(yǎng)箱中，37°C,5% CO2 培養(yǎng)人L-02細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱L-02細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染前2天，用0. 5%胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。 將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用2ml含血清，不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其 在轉(zhuǎn)染日能達(dá)到85%的融合。取6yg質(zhì)粒和10μ1 Lipofectamine2000，各加入250 μ 1 無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，混合均勻成500 μ 1培養(yǎng)液，室溫孵育20min。用無(wú)血清RPMI1640 培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將轉(zhuǎn)染液加入細(xì)胞，37°C，5% CO2中孵育5小時(shí)，更換含血清培養(yǎng)液繼 續(xù)孵育48小時(shí)。每孔加入MTT液(5mg/ml)20l·! 1，37°C孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，吸棄上清液， 每孔加入150μ 1DMS0，振蕩lOmin，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A值)。A值越 低，細(xì)胞生長(zhǎng)越差。結(jié)果表明，給予PGL3-Sur-顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒后，L-02 細(xì)胞的生長(zhǎng)未受到抑制。說(shuō)明該重組質(zhì)粒對(duì)L-02細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。表21 PGL3-Sur_顆粒酶B-IRES-caspase-3-Luc質(zhì)粒對(duì)L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 (；士 S) 本發(fā)明的核苷酸序列表如下一、可采用的survivin啟動(dòng)子序列
SEQ ID No. 1來(lái)自于GenBank編號(hào)U75285. 1的核苷酸序列第1824-2800位核苷酸。U75285. 1 (Homo sapiens apoptosis inhibitor survivin gene, complete cds) 編碼survivin的核苷酸序列。
0173]gccatag aaccagagaa gtgagtggat gtgatgccca0174]gctccagaagtgactccagaacaccctgttccaaagcagaggacacactgattttttttt0175]taataggctgcaggacttactgttggtgggacgccctgctttgcgaagggaaaggaggag0176]tttgccctgagcacaggcccccaccctccactgggctttccccagctcccttgtcttctt0177]atcacggtagtggcccagtccctggcccctgactccagaaggtggccctcctggaaaccc0178]aggtcgtgcagtcaacgatgtactcgccgggacagcgatgtctgctgcactccatccctc0179]ccctgttcatttgtccttcatgcccgtctggagtagatgctttttgcagaggtggcaccc0180]tgtaaagctctcctgtctgaCtttttttttttttttagactgagttttgctcttgttgcc0181]taggctggagtgcaatggcacaatctcagctcactgcaccctctgcctcccgggttcaag0182]cgattctcctgcctcagcctcccgagtagttgggattacaggcatgcaccaccacgccca0183]gctaatttttgtatttttagtagagacaaggtttcaccgtgatggccaggctggtcttga0184]actccaggactcaagtgatgctcctgcctaggcctctcaaagtgttgggattacaggcgt0185]gagccactgcacccggcctgcacgcgttctttgaaagcagtcgagggggcgctaggtgtg0186]ggcagggacgagctggcgcggcgtcgctgggtgcaccgcgaccacgggcagagccacgcg0187]gcgggaggactacaactcccggcacaccccgcgccgccccgcctctactcccagaaggcc0188]gcggggggtggaccgcctaagagggcgtgcgctcccgacatgccccgcggcgcgccatta0189]accgccagatttgaatcgcgggacccgttggcagaggtgg0190]SEQ ID No. 2來(lái)自于U75285第2541-2810位核苷酉I0191]cacgcgttctttgaaagcagtcgagggggcgctaggtgtg0192]ggcagggacgagctggcgcggcgtcgctgggtgcaccgcgaccacgggcagagccacgcg0193]gcgggaggactacaactcccggcacaccccgcgccgccccgcctctactcccagaaggcc0194]gcggggggtggaccgcctaagagggcgtgcgctcccgacatgccccgcggcgcgccatta0195]accgccagatttgaatcgcgggacccgttggcagaggtggCggCggCggC0196]SEQ ID No. 3來(lái)自于U75285第2211-2810位核苷酉I0197]ggtggcaccc0198]tgtaaagctctcctgtctgaCtttttttttttttttagactgagttttgctcttgttgcc0199]taggctggagtgcaatggcacaatctcagctcactgcaccctctgcctcccgggttcaag0200]cgattctcctgcctcagcctcccgagtagttgggattacaggcatgcaccaccacgccca0201]gctaatttttgtatttttagtagagacaaggtttcaccgtgatggccaggctggtcttga0202]actccaggactcaagtgatgctcctgcctaggcctctcaaagtgttgggattacaggcgt0203]gagccactgcacccggcctgcacgcgttctttgaaagcagtcgagggggcgctaggtgtg0204]ggcagggacgagctggcgcggcgtcgctgggtgcaccgcgaccacgggcagagccacgcg0205]gcgggaggactacaactcccggcacaccccgcgccgccccgcctctactcccagaaggcc0206]gcggggggtggaccgcctaagagggcgtgcgctcccgacatgccccgcggcgcgccatta0207]accgccagatttgaatcgcgggacccgttggcagaggtggCggCggCggC
二、采用的活性型GranzymeB序列來(lái)自于GenBank編號(hào)NM_004131. 4的核苷酸序 列的第124-810位核苷酸。NM_004131. 4為編碼顆粒酶B的核苷酸序列SEQ ID No. LI
gagatca tcgggggaca tgaggccaag ccccactccc gcccctacat ggcttatctt
atgatctgggatcagaagtctctgaagaggtgcggtggcttcctgatacgagacgacttc
gtgctgacagctgctcactgttggggaagctccataaatgtcaccttgggggcccacaat
atcaaagaacaggagccgacccagcagtttatccctgtgaaaagacccatcccccatcca
gcctataatcctaagaacttctccaacgacatcatgctactgcagctggagagaaaggcc
aagcggaccagagctgtgcagcccctcaggctacctagcaacaaggcccaggtgaagcca
gggcagacatgcagtgtggcCggCtgggggcagacggcccccctgggaaaacactcacac
acactacaagaggtgaagatgacagtgcaggaagatcgaaagtgcgaatctgacttacgc
cattattacgacagtaccattgagttgtgcgtgggggacccagagattaaaaagacttcc
tttaagggggactctggaggccctcttgtgtgtaacaaggtggcccagggcattgtctcc
tatggacgaaacaatggcatgcctccacgagcctgcaccaaagtctcaagctttgtacac
tggataaagaaaaccatgaaacgctactaa
三、采用的Caspase-3序列來(lái)自于GenBank編號(hào)NM_032991. 2的核苷酸序列
91-934位核苷酸。NM_032991. 2為編碼Caspase_3的核苷酸序列。SEQ ID No. 5
gtatccatggagaacactgaaaactcagtg
gattcaaaatC C 3.3.3.3.3.3.tttggaaccaaagatcatacatggaagcgaatcaatggac
tctggaatatccctggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtata
￡Ι ￡1￡Ι ￡1￡Ι ￡1ataagaattttcataaaagcactggaatgacatctcggtctggtacagat
gtcgatgcagcaaacctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaa
aatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatgtttctaaagaagatcac
agcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataattttt
ggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaa3. 3.3. C 3.3.3. C ttttcagaggggatcgttgt
agaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcaggcctgccgtggtacagaactg
gactgtggcattgagacagacagtggtgttgatgatgacatggcgtgtca 3.3.3.3. 3. C C 3.
gtggaggccgacttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaat
tcaaaggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgac
aagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgag
tccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatg
ctcacaaaagaactctatttttatcactaaagaa
四、可釆用的Caspase-3序列，來(lái)自于NM—004346. 3
SEQ ID No. 6
gta tccatggaga acactgaaaa ctcagtggat tcaaaatcca
3.3.3.3.3. ggaaccaaagatcatacatggaagcgaatcaatggactctggaatatccc
tggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtataata
agaattttcataaaagcactggaatgacatctcggtctggtacagatgtcgatgcagcaa
acctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaaaatgatcttacac
gtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatgtttctaaagaagatcacagcaaaaggagca
gttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataatttttggaacaaatggac
ctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcgttgtagaagtctaactg
gaaaacccaaacttttcattattcaggcctgccgtggtacagaactggactgtggcattg
agacagacagtggtgttgatgatgacatggcgtgtcataaaataccagtggaggccgact
tcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaattcaaaggatggct
cctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgacaagcttgaattta
tgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttg
acgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcacaaaagaac
tctatttttatcactaaagaaatggttggt
gcatgcatct agggcggcca attccgccccSEQ ID No. 7 釆用的 IRES 序列g(shù)et age ctcgagaatt cacgcgtcga tctcccccccccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt
gtgcgtttgtctatatgtga ccctgtcttcttgacgagca gtcgtgaaggaagcagttcc agcggaaccccccacctggc ggcggcacaaccccagtgcc gtattcaacaaggggctgaa gcacatgctttacatgtgtt tttcctttgaaaaacacgat gataagcttg ccacaacccg ggSEQ ID No. 8 最終合成的 Survivin 啟動(dòng)子-顆粒酶 B-IRES-caspase-3 序列g(shù)ccatag aaccagagaa gtgagtggat gtgatgcccagctccagaag tgactccaga acaccctgtt ccaaagcaga ggacacactg attttttttttaataggctg caggacttac tgttggtggg acgccctgct ttgcgaaggg aaaggaggagttgccctga gcacaggccc ccaccctcca ctgggctttc cccagctccc ttgtcttcttatcacggtag tggcccagtc cctggcccct gactccagaa ggtggccctc ctggaaacccaggtcgtgca gtcaacgatg tactcgccgg gacagcgatg tctgctgcac tccatccctcccctgttcat ttgtccttca tgcccgtctg gagtagatgc tttttgcaga ggtggcaccc
ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg
ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc
gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc
ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt
tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt
tgtaaagctc tcctgtctga cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcctaggctggag tgcaatggca caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaagcgattctcct gcctcagcct cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgcccagctaattttt gtatttttag tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttgaactccaggac tcaagtgatg ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgtgagccactgc acccggcctg cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtgggcagggacg agctggcgcg gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcggcgggaggac tacaactccc ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggccgcggggggtg gaccgcctaa gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccattaaccgccagat ttgaatcgcg ggacccgttg gcagaggtgg gagctcttac gcgtgagatca tcgggggacatgaggccaag ccccactccc gcccctacat ggcttatctt atgatctggg atcagaagtc tctgaagaggtgcggtggct tcctgatacg agacgacttc gtgctgacag ctgctcactg ttggggaagc tccataaatgtcaccttggg ggcccacaat atcaaagaac aggagccgac ccagcagttt atccctgtga aaagacccatcccccatcca gcctataatc ctaagaactt ctccaacgac atcatgctac tgcagctgga gagaaaggccaagcggacca gagctgtgca gcccctcagg ctacctagca acaaggccca ggtgaagcca gggcagacatgcagtgtggc cggctggggg cagacggccc ccctgggaaa acactcacac acactacaag aggtgaagatgacagtgcag gaagatcgaa agtgcgaatc tgacttacgc cattattacg acagtaccat tgagttgtgcgtgggggacc cagagattaa aaagacttcc tttaaggggg actctggagg ccctcttgtg tgtaacaaggtggcccaggg cattgtctcc tatggacgaa acaatggcat gcctccacga gcctgcacca aagtctcaagctttgtacac tggataaaga aaaccatgaa acgctactaa gctagccctcgagaatt cacgcgtcgagcatgcatct agggcggcca attccgcccc tctccccccc ccccctctcc ctcccccccc cctaacgttactggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtga ttttccacca tattgccgtcttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccctctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggccaaaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagttgtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtaccccattgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacgtctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataagcttg ccacaacccgggctcgaggtatccatgg agaacactga aaactcagtggattcaaaatC C 3.3.3.3.3.3.tttggaaccaaagatcatacatggaagcgaatcaatggac
tctggaatatccctggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtata
￡Ι ￡1￡Ι ￡1￡Ι ￡1ataagaattttcataaaagcactggaatgacatctcggtctggtacagat
gtcgatgcagcaaacctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaa
aatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatgtttctaaagaagatcac
agcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataattttt
ggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaa3. 3.3. C 3.3.3. C ttttcagaggggatcgttgt
agaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcaggcctgccgtggtacagaactg
gactgtggcattgagacagacagtggtgttgatgatgacatggcgtgtca 3.3.3.3. 3. C C 3.
gtggaggccgacttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaat
tcaaaggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgac
aagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgag
tccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatg
ctcacaaaagaactctatttttatcactaaagaa
2權(quán)利要求
由啟動(dòng)子調(diào)控兩種目的基因表達(dá)的重組載體，其特征在于構(gòu)建方法如下所述①提取survivin啟動(dòng)子基因，②提取人的細(xì)胞基因mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，③在cDNA中擴(kuò)增第一目的基因，④在cDNA中擴(kuò)增第二目的基因，⑤將內(nèi)切酶切開(kāi)的Survivin啟動(dòng)子基因片斷與基本載體分子用連接酶連接成第一中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第一目的基因片斷與第一中間載體分子用連接酶連接成第二中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第二目的基因片斷與第二中間載體分子用連接酶連接成第三中間載體，將用內(nèi)切酶切開(kāi)的IRES基因片斷和第三中間載體用連接酶連接成重組載體，⑥將重組載體引入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使重組載體分子隨受體細(xì)胞擴(kuò)增，篩選出含有重組載體分子的受體細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一目的基因?yàn)轭w粒酶A或顆粒酶 B或顆粒酶M或顆粒酶H或顆粒酶J或顆粒酶K或顆粒酶I或苷激酶，所述的第二目的基因 為 caspase2 或 caspase3 或 caspase6 或 caspase7 或 caspase9 或 CaspaselO0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的第一目的基因?yàn)轭w粒酶B，第二目的 基因?yàn)镃aspase3，構(gòu)建方法如下(1)Survivin啟動(dòng)子基因提取根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Survivin基因啟動(dòng)子序列，合成Survivin基因啟動(dòng)子引 物，上游引物5 ’ -CAGGTACCGCCATAGAACCA-3 ’，下劃線處為Kpn I酶切位點(diǎn)，下游引物 5，-CGGAGCTCCCACCTCTGCCA-3’，下劃線處為Sac I酶切位點(diǎn)，以H印G-2細(xì)胞基因組DNA為 模板，PCR擴(kuò)增Survivin啟動(dòng)子基因片段，(2)細(xì)胞總mRNA提取在37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人OT8+細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA，(3)活性型顆粒酶B基因提取用TAKARA公司的cDNA合成試劑盒將人CD8+細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)，取逆 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增顆粒酶B基因序列，上游引物5’ -GCAACGCGTGAGATCA TCG-3’，下 劃線處為Mlu I酶切位點(diǎn)，下游引物5，-CGGCTAGCCTTAGTAGCGTTTC-3，，下劃線處為Nhe I 酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收活性型顆粒酶B 基因片段，(4)CaSpaSe-3基因片段提取以人CD8+細(xì)胞cDNA為模板，提取caspase-3基因，上游引物 5’ -GCCTCGAGGTATCCATGGAG-3’，下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)，下游引物 5，-CCGTAAGCTTTTCTTTAGTGATAA-3，，下劃線處為 HindIII 酶切位點(diǎn)，PCR 產(chǎn)物用 10%瓊脂 糖凝膠電泳，Qiaquick柱回收試劑盒回收caspase-3基因片段，(5)質(zhì)粒制備將Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL-3Basic質(zhì)粒用Kpn I與Sac I雙酶37°C消化3小 時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳，回收片段，取消化后的Survivin啟動(dòng)子基因片段和PGL-3BasiC質(zhì)粒， 以1 3的比例，在16°C時(shí)，用T4DNA連接酶連接16小時(shí)，此質(zhì)粒為PGL3-Sur_Luc，以相 同方法用Mlu I與Nhe I雙酶消化活性型顆粒酶B基因片段和PGL3_Sur-Luc，將活性型顆粒酶B基因片段連接到此質(zhì)粒中，命名為PGL3-Sur-顆粒酶B_Luc，以相同方法用Xho I和 HindIII雙酶消化caspase-3基因片段和PGL3_Sur_顆粒酶Β-Luc，將caspase-3基因片段 連接到質(zhì)粒中，構(gòu)成PGL3-Sur-顆粒酶B-caspase-3-Luc質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和pIRES-vector 用Nhe 1和Xmal雙酶切，用相同方法將IRES連接至該質(zhì)粒中，構(gòu)成PGL3_Sur_顆粒酶 B-IRES-caspase-3-Luc Mf立，(6)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及提取將步驟5的最終連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jml09，Vitagene試劑盒 抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒即為所需重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體在治療肝癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌 的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物由重組載體與抗腫瘤物質(zhì)組成 的藥物，抗腫瘤物質(zhì)為順鉬、紫杉醇、喜樹(shù)堿中的一種或多種，藥物直接應(yīng)用于患部，或者通 過(guò)靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下注射，口服、使用飼管、血管內(nèi)給予等導(dǎo)入到生物體中，作用于 相應(yīng)細(xì)胞組織，藥物所含的重組載體和具有杭腫瘤物質(zhì)同時(shí)給予；或者通過(guò)先給予一方，然 后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后給予另一方的方法導(dǎo)入生物體，重組載體或者是病毒載體，或者是非病 毒載體或噬菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于重組載體包含的核苷酸可以是單鏈或雙 鏈的DNA/RNA或兩者的混合物，Survivin啟動(dòng)子、顆粒酶B和caspase-3基因除序列表中 SEQID NO. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID NO. 6 所示的 堿基序列之外，還可以是與 SEQ ID NO. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5,SEQID NO. 6的DNA互補(bǔ)的堿基序列DNA雜交、且編碼具有顆粒酶B和Caspase-3的活 性的蛋白質(zhì)的堿基序列，上述堿基序列可如下獲得以分別含有SEQ ID NO. USEQ IDNo. 2, SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID NO. 6所示堿基序列的多核苷酸或其片段 作為探針，通過(guò)集落雜交或噬菌斑雜交或DNA印跡雜交方法，由cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲 得。
全文摘要
本發(fā)明為由啟動(dòng)子調(diào)控兩種目的基因表達(dá)的重組載體，提高重組載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的釘傷功能。構(gòu)建方法如下所述①提取Survivin啟動(dòng)子基因，②提取人的細(xì)胞基因mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，③在cDNA中擴(kuò)增第一目的基因，④在cDNA中擴(kuò)增第二目的基因，⑤將內(nèi)切酶切開(kāi)的Survivin啟動(dòng)子基因片斷與基本載體分子用連接酶連接成第一中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第一目的基因片斷與第一中間載體分子用連接酶連接成第二中間載體，將內(nèi)切酶切開(kāi)的第二目的基因片斷與第二中間載體分子用連接酶連接成第三中間載體，將用內(nèi)切酶切開(kāi)的IRES基因片斷和第三中間載體用連接酶連接成重組載體，⑥將重組載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，使重組載體分子隨受體細(xì)胞擴(kuò)增，篩選出含有重組載體分子的受體細(xì)胞。提取重組載體，檢測(cè)其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101892255SQ20101002806
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者王瑋 申請(qǐng)人:王瑋